DE2252815B2

DE2252815B2 - Verfahren zur herstellung von l-asparaginsaeure auf fermentativem wege

Info

Publication number: DE2252815B2
Application number: DE19722252815
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka; Tosa Tetsuya Kyoto; Sato Tadashi Takatsuki Osaka; Chibata (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1971-10-28
Filing date: 1972-10-27
Publication date: 1976-08-05
Also published as: FR2158330B1; JPS5617073B2; JPS4849988A; FR2158330A1; US3791926A; GB1388670A; DE2252815A1

Description

coli ATCC 11303, Pseudomonas aerugmosa OUT Kaliumfuinarat und einem organischen Ammonium-

8252, Sen-atmraarc^m OUT 8259, Proteus vulgarh salz enthält, mit einer geeigneten Geschwindigkeit

OUT 8226 (FERM-P 526) Bacterium succinium IAM leitet. Als Ablauf wird eine wäßrige Lösung erhalten,

1017 oder Alcaligenes faecahs OUT 8030. Diese die L-Asparaginsäure enthält. Der Ablauf wird mit

Stämme stellen lediglich Beispiele dar. Die Erfindung ₅ konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von

ist nicht auf den Einsatz dieser spezifischen Mikro- 2,8 bis 3,0 eingestellt Auf diese Weise kann man

Organismen beschrankt vielmehr können alle Aspar- L-Asparaginsäure in Form eines kristallinen Nieder-

tat-ammoniak-lyase bildenden Mikroorganismen ein- Schlags erhalten. Bei der Durchführung der enzy-

gesetzt werden. Durch die durchgeführte Polymerisa- matischen Reaktion hängen die Umwandlungsge-

tionsreaktion werden die Mikroorganismen eng in ₁₀ schwindigkeiten von Ammoniumfumarat zu L-Aspara-

das Gitter des Polymeren eingefügt, wodurch über ginsäure hauptsächlich von der enzymatischen Wir-

1 .nge Zeitspannen hinweg eine hohe enzymatische kung der unbeweglich gemachten Mikroorganismen,

Aktivität erreicht wird. _der Temperatur und der Reaktionszeit ab. Wird die

L-Asparagmsaure wird in der Weise hergestellt, Säulenmethode angewendet, dann können die optidaß der unbeweglich gemachte Mikroorganismus mit _l5 malen Reaktionsbedingungen zur vollständigen Um-Ammoniumfumarat oder einem Gemisch aus einem Wandlung des Ammoniumfumarats zu L-Asparaginancrganischen Ammoniumsalz und Fumarsäure oder säure durch eine Einregulierung der Fließgeschwindig-Njfriumfumarat oder Kaljumfumarat bei 25 bis 45°C keit der Substratlösung eingestellt werden,
und einem pH-Wert von 7 bis 9 in Berührung Die erfindungsgemäß eingesetzten unbeweglich gegebracht wird. Beispiele für anorganische Ammo- ₂₀ machten Mikroorganismen behalten insbesondere in niumsalze sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat Gegenwart von zweiwertigen Metallionen einen hohen und Ammoniumphosphat. Beim Einsatz eines Gemi- enzymatischen Aktivitätswert bei. Außerdem ist durch sches aus Fumarsäure oder Natriumfumarat oder die lang andauernde enzymatische Aktivität der unbe-Kaliumfumarat und einem anorganischen Ammo- weglich gemachten Mikroorganismen eint wiederholte niumsalz liegt der bevorzugte Anteil des anorga- _a5 Verwendung derselben möglich,
nischen Ammoniumsalzes in dem Gemisch zwischen Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 1,5 und 2 Mol pro Mol Fumarsäure oder deren Unter ^Niedrigalkylen« sind Alkylengruppen mit 1 bis Salz. Die Zugabe eines zweiwertigen Metallions zu 5 Kohlenstoffatomen zu verstehen,
der Lösung, in welcher die enzymatische Reaktion

durchgeführt wird, bedingt einen hohen enzymatischen ₃₀ B e i s ρ i e 1 1

Aktivitätswert der unbeweglich gemachten Mikro- 4,8 g der Mikrobenzellen von Escherichia coli

Organismen während der Reaktion. Bei der Durch- ATCC 11303 werden in 48 ml einer physiologischen

führung der enzymatischen Reaktion in Gegenwart Kochsalzlösung suspendiert. Zu dieser Suspension

von zweiwertigen Metallionen ist die enzymatische werden 9 g Acrylamid, 480 mg N.N'-Methylenbis-

Wirkung der unbeweglich gemachten Mikroorganis- ₃₅ (acrylamid), 6 ml 5%ige Lösung von £-(Dimethyl-

men selbst nach einem aufeinanderfolgenden Gebrauch amino)-propionitril und 6 ml 2,5%ige Lösung von

ν ährend einer Zeitspanne von 1 Monat nicht wesent- Kaliumpeisulfat gegeben. Sodann wird die Suspen-

lich vermindert. Beispiele für geeignete zweiwertige sion 10 Minuten bei 37° C stehengelassen. Auf diese

Metallionen sind Calcium-, Magnesium-, Mangan(II)- Weise werJen 120 ml einer unbeweglich gemachten

und Strontiumionen. Bevorzugte Konzentrationen ₄₀ Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303

der zweiwertigen Metallionen in der Reaktions- erhalten,

lösung liegen zwischen 0,1 und 10 mMol/1. 120 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von

Die Konzentration des eingesetzten Substrats ist Escherichia coli ATCC 11303 werden in eine Säule

nicht kritisch. Dies bedeutet, daß Ammoniumfumarat mit Abmessungen von 2,1 cm χ 34,8 cm gegeben. In

oder ein Gemisch aus Fumarsäure oder Natrium- 45 900 ml Wasser werden 150 g Ammoniumfumarat

oder Kaliumfurmarat mit einem anorganischen Am- aufgelöst. Die wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert

moniumsalz in Wasser in jeder beliebigen Konzentra- von 8,5 mit wäßrigem Ammoniak eingestellt und mit

tion aufgelöst werden können. Der pH-Wert der Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 1 verdünnt.

Lösung wird dann auf 7 bis 9 eingestellt. Die unbe- Hierauf wird die wäßrige Lösung kontinuierlich durch

weglich gemachten Mikroorganismen werden in die 50 die Kolonne mit 37⁰C bei einer Fließgeschwin-

Lösung eingetaucht, worauf das Gemisch bei Tem- digkeit von 20 ml/Stunde geleitet. Der Abstrom wird

peraturen von 25 bis 45°C unter Rühren über einen mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert

ausreichenden Zeitraum inkubiert wird, um die von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag

Reaktion zu beenden. Nach beendeter Reaktion wird wird durch Filtration gesammelt und mit Methanol

das Gemisch abfiltriert oder zentrifugiert, um die 55 gewaschen. Auf diese Weise werden 126,3 g (94,8 %

unbeweglich gemachten Mikroorganismen für den der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten,

nachfolgenden Gebrauch zu gewinnen. Aus dem (λ)? + 24,8^C (C - 2, 6 NHCI).

Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit wird die Diesen Drehwert weist auch die gemäß Beispiel 4, 5,

L-Asparaginsäure gewonnen. Die erfindungsgemäße 6. 7, 10, 11 und 12 isolierte L-Asparaginsäure auf.

enzymatische Reaktion kann wahlweise auch als 6c . . _Ί

Säulenverfahren durchgeführt werden, das die Durch- B e 1 ;> ρ 1 e 1 ~

führung der Reaktion auf kontinuierliche Weise Nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 wird eine

ermöglicht. Man kann beispielsweise in der Weise unbeweglich gemachte 2'ubeieitung von Escherichia

vorgehen, daß man den unbeweglich gemachten col: ATCC L13O3 hergestellt. 50 ml der unbeweglich

Mikroorganismus in eine Säule einfüllt und durch die 65 gemachten Zubereitung werden in eine Säule mit

Säule bei 30 bis 45°C eine wäßrige Lösung mit einem Abmessungen von 2,1 cm ;·■ 14,5 cm gegeben. Durch

pH-Wert von 8 bis 9, die Diammoniumfumarat oder die Säule wird eine 1 M wäßrige Ammoniumfumarat-

ein Gemisch aus Fumarsäure oder Natrium- oder Lösung (pH 8,5) kontinuierlich mit 37"C und den in

der Tabelle I angegebenen Flieögeschwindigkeiten geleitet

Die Konzentration der L-Aspara ginsäure im Abstrom wird biologisch bestimmt, wozu Leuconostoc mesenterioides P-60 als empfindlicher Mikroorganismus verwendet wird. Daraus wird das Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparapnsäure berechnet Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle ΐ zusammengestellt

TabeUe I

Fließgeschwindigkeit	Bei spi	Umwandlungs
	verhältnis zu
	L-Asparaginsäure
(ml/h)	%
25	45
12,5	92
6,5	100
3,5	100
el 3

50 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden in eine Säule mit Abmessungen von 2,1 cm χ 14,5 cm gegeben. Durch die Säule wird kontinuierlich eine 1 M wäßrige Ammoniumfumarat-Lösung (pH 8.5) mit 37⁰C bei den in Tabelle II angegebenen Fließgeschwindigkeiten geleitet. Zu bestimmten Zeitpunkten wird die Konzentration von L-Asparaginsäure in dem Abstrom nach der Methode des Beispiels 2 bestimmt. Daraus wird das Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparaginsäure errechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Unter Zugrundelegung derselben Methode wurden auch die in den Tabellen III bis XII aufgeführten Zahlenwerte bestimmt.

Tabelle II

Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparaginsäure (%)

Betriebszeit (Tage)	Fließgeschwindigkcit	6,5 ml/h
	25 ml/h	100
3	45	100
6	46	100
9	44	100
12	47	100
15	45	100
18	46	100
21	46	100
24	45	100
27	46	100
30	45

Tabelle III Reaktionszeit

(h)

Umwandlungsverhältnis zu L-Asparaginsäure

Beispiel 4

Eine wäßrige Lösung von 112,5 g Ammoniumfumarat in 450 ml Wasser wird mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt. 60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden in die wäßrige Lösung eingegeben. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle TIT zusammengestellt.

3	15
5	30
10	82
24	100

Nach 24stündigem Rühren wird das Gemisch filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 89,7 g (90,6% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 5

2,4 g der Mikrobenzellen von Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 4,5 g Acrylamid, 240 mg N,N'-Meiiylenbis(acrylamid), 3 ml 5%ige Lösung von /?-(Dimethvlaminr>)-propionitril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 10 Minuten bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise werden 60 ml der unbeweglich gemachten Zub »«-Htung von Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 erhalten.

60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von

Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 werden in eine Säule mit Abmessungen von 2,1 cm X 17,4 cm gegeben. Durch die Säule werden 500 ml einer 1 M wäßrigen Ammoniumfumarat-Lösung (pH 8,5) mit 37⁰C mit einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/h geleitet.

Der Abstrom wird mit konzentrierter Schwefel-

4" säure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und mit Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 6,31 g (95,4 % der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 6

2,4 g der Mikrobenzellen von Serratia marcescens OUT 8259 werden in der Weise des Beispiels 5 behandelt. Es werden 60 ml einer unbeweglich

so gemachten Zubereitung von Serratia marcescens OUT 8259 erhalten. Ein Gemisch von 60 ml der unbeweglich gemachten Zuereitung, 58 g Fumarsäure und 37,1 g Ammoniumchlorid wird zu 450 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird mit einer wäßrigen 1 N-Natrium-

5' hydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und sodann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 37°C gerührt. Es wird sodann filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und mit Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 62,9 g (95,2%) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 7

Escherichia coli ATCC11303 wird in 11 eines Mediums (pH 7,0) inokuliert, welches 3% Ammoniumfumarat (Gewicht/Volumen), 0,2% Dikalium-

phosphat (Gewicht/Volumen), 0,05% Magnesiumsulfat · 7H₂O (Gewicht/Volumen), 4% Maisquellflüssigkeit (Gewicht/Volumen) und 0,05% Calciumcarbonat (Gewicht/Volumen) enthält. Das Nährmedium wird 20 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach der Kultivierung werden die Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 durch Zentrifugieren gesammelt. Die Mikrobenzellen werden in 40 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 7,5 g Acrylamid, 0,4 g N,N'-Methylenbis(acrylamid), 5 ml 5%ige Lösung von /?-(Dimethylamino)-propionitril und 5 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 10 Minuten bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise werden 110 ml der unbeweglich gemachten Zubereitungen von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.

110 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm x 35 cm gegeben. In 1,81 Wasser werden 30Ug Ammoniumfuraarat und 0,4 g Mangan(II)-chlorid · 4 H₂O aufgelöst. Die wäßrige Lösung wird mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 21 verdünnt. Sodann wird die wäßrige Lösung kontinuierlich durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 55 ml/h geleitet. Der Abstrom wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit kaltem Wasser und Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 252,9 g (94,8% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 8

50 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303, hergestellt gemäß Beispiel 7, werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm χ 16 cm gegeben. Durch die Säule wird kontinuierlich eine wäßrige Lösung (pH 8,5), welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und die in Tabelle IV angegebenen Metallionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält, bei 37° C und einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h geleitet. Nach der Methode des Beispiels 2 wird die Konzentration von L-Asparaginsäure in dem nach einem bestimmten Zeitraum erhaltenen Abstrom bestimmt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt

Tabelle IV

Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparaginsäure (%)

Betriebs	Zugegebene Metallionen	Sr++	Ohne
zeit	Ca«. _Mgrf+ Mn⁺+		Zugabe von
			Metall
(Tage)		ionen

3	100	100	100	100	100
10	100	100	100	100	100
20	ioo	100	100	100	100
30	100	100	100	100	90
40	100	100	100	95	76
50	95	96	100	—	40
			90		27

Beispiel 9

50 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303, hergestellt gemäß Beispiel 7, werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm χ 16 cm gegeben. Durch die Säule wird eine wäßrige Lösung (pH 8,5), welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält, kontinuierlich bei 37°C mit den in Tabelle V angegebenen Fließgeschwindigkeiten geleitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V	3ei sp	Umwandlungs verhältnis zu L-Asparagin säure (%)
Fließgeschwindigkeit (ml/h)		55
90	60
60	81
40	100
30	100
25	iel 10

Eine wäßrige Lösung von 150 g Ammoniumfumarat und 0,2 g Mangan(II)-chlorid · 4 H₂O in 900 ml Wasser wird mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und sodann mit Wasser zu einem Gesamtvolumen von 11 verdünnt. 100 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303, hergestellt gemäß Beispiel 7, wird zu der wäßrigen Lösung gegeben. Das Gemisch wird einen bestimmten Zeitraum bei 37⁰C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Reaktionszeit	Umwandlungs
	verhältnis zu
	L-Asparagin
(h)	säure (%)

3	30
5	64
8	86
10	100

Nach lOstündigem Rühren wird das Gemisch filtriert Das Ffltrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure anf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit kaltem Wasser und Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 126,4 g (9^.8% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 11

Pseudomonas aeragmosa OUT 8252 wird in 11 eines Mediums (pH 7,0) iokuliert, welches 3 % Natriumfumarat (Gewicht/Volumen), 2% Ammoniumsulfat (Gewicht/Volumen), 0,2% Pepton (Gewicht) Volumen) und 0,5% Hefeextrakt (Gewicht/Volumen] enthält Das Medium wird unter Schütteln 20 Stunden

Reaktionszeit	Umwandlungs
	verhältnis zu
	L-Asparagin-
(h)	säure(%)

5	57
8	80
10	100
	Beispiel ]

bei 37°C kultiviert. Nach der Kultivierung werden die 30 Minuten bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise Mikrobenzellen von Pseudomonas aeruginosa werden 60 ml der unbeweglich gemachten Zuberei· OUT 8252 durch Zentrifugierung gesammelt. Die tung von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.
Mikrobenzellen werden in 48 ml physiologischer 60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung vor

Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension wer- 5 Escherichia coli ATCC 11303 werden zu 500 m den 9 g Acrylamid, 0,48 g N,N'-Methylenbis(acryl- einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, weicht amid), 6 ml 5%ige Lösung von /?-(Dimethylamino)- Ammoniumfumarat in einer Konzentration vor propionitril und 6 ml 2,5%ige Lösung von Kalium- 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentrapersulfat gegeben. Sodann wird die Lösung bei 37°C tion von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird übei 10 Minuten lang stehengelassen. Auf diese Weise io einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die werden 120 ml unbeweglich gemachte Zubereitung erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammenvon Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 erhalten. gestellt.

120 ml unbeweglich gemachte Zubereitung von

Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 werden in eine Tabelle VII

Säule mit Abmessungen von 2 cm χ 38 cm gegeben. 15 Durch die Säule wird 11 einer wäßrigen Lösung (pH 8,5), welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol und Mangan(Il)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol enthält, kontinuierlich bei 37°C und einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h 20 geleitet.

Der Abstrom wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration

gesammelt und sodann mit kaltem Wasser und 25 B e i s ρ i e 1 14

Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 126,0 g 2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC

(94,6% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten. 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalz-

BeisDiel P lösung suspendiert. Zu der Suspension werden 4,5 e

^v " Acrylamid, 240 mg N,N' - Propylenbis(acrylamid),

Serratia marcescens OUT 8259 wird in 1 1 eines 3° 3 ml 5 %ige Lösung von /9-(Dimethylamino)-propio-Mediums (pH 7,0) inokuliert, welches 3% Natrium- nitril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat fumarat (Gewicht/Volumen), 2% Ammoniumsulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 30 Minuten (Gewicht/Volumen), 0,2% Pepton (Gewicht/Volumen) bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise werden und 0,5% Hefeextrakt (Gewicht/Volumen) enthält. 57 ml einer unbeweglich gemachten Zubereitung von Das Gemisch wird unter Schütteln 20 Stunden bei 35 Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.
37^CC kultiviert. Nach der Kultivierung werden die 57 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von

Mikrobenzellen von Serratia marcescens OUT 8259 Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml durch Zentrifugation gesammelt. Die Mikrobenzellen einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche werden in 32 ml physiologischer Kochsalzlösung Ammoniumfumarat in einer Konzentration von suspendiert. Zu der Suspension werden 6 g Acryl- 40 1 Mol/l und Mangan(ll)-ionen in einer Konzentraamid, 0,32 g N,N'-Methylenbis(acrylamid), 4 ml tion von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird einen 5%ige Lösung von /?-(Dimethy!amino)-propionitril bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt Die erhal- und 4 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat tenen Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengegeben. Sodann wird die Suspension 10 Minuten gestellt,
bei 37^CC stehengelassen. Auf diese Weise werden 45

100 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Tabelle VIII
Serratia marcescens OUT 8259 erhalten. ■

100 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung Reaktionszeit Umwandlungs-

von Serratia marcescens OUT 8259 werden zu 11 "

einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche 50 Qi)

160 g Natriumfumarat, 4,2 g Ammoniumchlorid und —

0,2 g Mangan(II)-ch]orid · 4 H₂O enthält. Das Ge- ₅

misch wird 24 Stunden bei 37° C gerührt. Das Gemisch

wird filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter 64

Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 55 ¹⁰ 89

eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch 15 loo

Filtration gesammelt und mit kaltem Wasser und Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 126,4 g B e i s ρ i e 1 15

(94,8% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten. 2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC

Beispiel 13 ⁶° ,^{11303 werden} in 24ml physiologischer Kochsalz-

.. , .... , „ τ- u · _L· ,· ^losune ^susPendiert. Zu der Suspension werden 4,5g

α^^Ε,Ϊ, ^Ϊ",Τ· fVf Acrylamid, 240mg Bis(_acrylamidomethyl) - äther, ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Koch- 3 ml 5%ige Lösung von ö-(Dimethylamino)-propiosaklösung suspendiert Zu der Suspension werden nitril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat 4,5 g Acrylamid, 240 mg N,N -Methylenbisiacryl- 65 gegeben. Sodann wird die Lösung 30 Minuten bei amid), 3 ml 5/„ige Losung von /?-(Dimethylammo)- 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 52 ml propionitnl und 3 ml 2,5/₀,ge Lösung von Kalium- unbeweglich gemachte Zubereitung von Escherichia persulfat gegeben. Sodann wird die Suspension coli ATCC11303 erhalten.

52 ml unbeweglich gemachte Zubereitung vor« Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX	Be	Umwandlungs verhältnis zu L-Asparagin- säurc(%)
Reaktionszeit (h)		30
5	61
8	82
10	100
15	i s ρ i e 1 16

Tabelle X	Umwandlungs verhältnis zu !--Asparagin säure (%)
Reaktionszeit (h)	19
5	47
OO	76
10	92
15	100
20

0,2 ml 2,5 ",',ige Lösung von Ammoniumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 60 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 42 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.

42 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengestellt.

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 60 mg N,N'-Methylenbis(acrylamid), 1,8 ml 0,112%ige Lösung von Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin und 0,2 ml 2,5 %ige Lösung von Ammoniumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 60 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 36 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.

36 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(ll)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37 ⁰C gerührt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengestellt.

45

50

55

Beispiel 17

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 60 mg N,N'-Propylenbis(acrylamid), 1,8 ml 0,112%ige Lösung von Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin und

Tabelle XI	Umwandlungs verhältnis zu L-Asparagin- säure(%)	spiel 18
Reaktionszeit (h)	14
5	23
8	47
10	71
15	89
20	100
25
Bei

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 60 mg Bis(acrylamidomethyl)-äther, 1,8 ml 0,112%ige Lösung von Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin und 0,2 ml 2,5%ige Lösung von Ammoniumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 60 Minuten bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise werden 35 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.

35 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in ;iner Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37⁰C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XlI zusammengestellt.

Tabelle XII	Umwandlungs verhältnis zu L-Asparagin- säure (%)
Reaktionszeit OO	17
5	27
8	55
10	84
15	100
20

Claims

Patentansprüche: bindet, um einen im wesentlichen unlöslichen Kom-

1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparagin- plex zu bilden, worauf man Ammoniumfumarat mit säure auf fermentativem Wege unter Verwendung dem erhaltenen Aspartat-ammoniak-lyase-Komplex eines Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikro- zur Umsetzung bringt. Bei der Durchführung des in Organismus in Gegenwart von Fumarsäure oder 5 »Chem. Abstracts, 72, 129359 (1970)« beschriebenen eines Salzes davon, dadurch gekenn- Verfahrens wird L-Asparaginsäure in der Weise zeichnet, daß man Acrylamid, N,N'-Niedrig- hergestellt, daß man N.N'-Methylen-bisiacrylamid) alkylen-bis-(acrylamid) und/oder Bis-acrylamido- in einer wäßrigen Aspartat-ammoniak-lyase-Lösung methyl)-äther in einer wäßrigen Suspension des polymerisiert und die erhaltene wasserunlösliche Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikroorga- io Aspartat-ammoniak-lyase-Zubereitung mit Ammoninismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitia- urnfumarat einer enzymatischen Reaktion unterzieht, tors und eines Polymerisationsbeschleunigers bei Diesem Verfahren haftet der Nachteil an, daß, falls 10 bis 50⁰C polymerisiert, wodurch der Aspartat- der Einsatz einer aus einem Aspartat-ammoniak-lyase ammoniak-lyase bildende Mikroorganismus unbe- bildenden Mikroorganismus extrahierten Aspartatweglich gemacht wird, und anschließend Am- 15 ammoniak-lyase erforderlich ist, in unvermeidlicher moniumfumarat oder ein Gemisch aus einem Weise eine Denaturierung des Enzyms und/oder ein anorganischen Ammoniumsalz und Fumarsäure erheblicher Verlust der enzymatischen Aktivität wäh- oder Natriumfumarat oder Kaliumfumarat bei rend der Extraktion und der Konzentration des 25 bis 45°C und bei einem pH-Wert von 7 bis 9 Extrakts erfolgt.

einer enzymatischen Reaktion an dem unbeweg- 20 Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die Hch gemachten, Aspartat-ammoniak -lyase bilden- Nachteile der vorstehend bechriebenen Verfahren den Mikrooroganismus unterwirft. zu beseitigen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- bei einem Verfahren zur Herstellung von L-Asparaginzeichnet, daß man die enzymatisch Reaktion in säure auf fermentativem Wege unter Verwendung Gegenwart von 0,1 bis 10 mMol/1 eines zweiwer- 25 eines Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikrotigen Metallions durchführt. Organismus in Gegenwart von Fumarsäure oder eines

Salzes davon dadurch gelöst, daß man Acrylamid,

N,N'-Niedrigalkylen-bis-(acrylamid) und/oder Bis-

Aspartat-ammoniak-lyase besitzt die Fähigkeit, (acrylamidomethyl)-äther in einer wäßrigen Suspen-Ammoniumfumarat in L-Asparaginsäure umzuwan- 30 sion des Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikrodeln. Es sind bereits verschiedene Methoden be- Organismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitiakannt, durch welche L-Asparaginsäure durch enzy- tors und eines Polymerisationsbeschleunigers bei 10 bis matische Reaktion mit Aspartat-ammoniak-lyase her- 50⁰C polymerisiert, wodurch der Aspartat-ammoniakg 'stellt wird. So kann beispielsweise L-Asparaginsäure lyase bildende Mikroorganismus unbeweglich gemacht durch Züchten von Aspartat-ammoniak-lysase bil- 35 wird, und anschließend Ammoniumfumarat oder ein denden Mikroorganismen in einem Nährmedium Gemisch aus einem anorganischen Ammoniumsalz und hergestellt werden, das Fumarsäure und Ammoniak Fumarsäure oder Natriumfumarat oder Kaliumenthält (vgl. die US-PS 3214 345). Nach einem fumarat bei 25 bis 45⁰C und bei tinem pH-Wert von anderen Verfahren kann man L-Asparaginsäure 7 bis 9 einer enzymatischen Reaktion an dem erzeugen,, indem man Aspartat-ammoniak-lyase aus 4° unbeweglich gemachten, A spartat-an moniak-lyase bileinem Mikroorganismus extrahiert und das Enzym denden Mikroorganismus unterwirft,
mit Ammoniumfumarat umsetzt (vgl. »Journal of Durch dieses Verfahren werden gegenüber den in

Agricultural Chemical Society of Japan«, Bd. 34, der, vorstehend genannten »Chemical Abstracts«- S. 44 bis 48 [I960]). Referaten beschriebenen Verfahren folgende Vorteile

Diese Methoden sind jedoch für eine technische 45 erzielt:

Herstellung von L-Asparaginsäure nicht geeignet, da Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unbe-

die auf diese Weise hergestellte L-Asparaginsäure mit weglich gemachten Mikroorganismen gestatten eine dem Enzym, mit groben Zellen, Nährquellen des wirksamere Ausnützung des Enzyms Aspartat-am-Mediums und/oder Protein verunreinigt ist. moniak-lyase (das in den Zellen der Aspartat-

Es sind daher zusätzliche Maßnahmen zur Besei- 5° ammoniak-lyase bildenden Mikroorganismen enthalten tigung des Enzyms und anderer Verunreinigungen ist) bei der enzymatischen Reaktion mit einem aus der L-Asparaginsäure erforderlich, um diese mit Fumarsäuresalz und behalten eine höhere Enzymhoher Reinheit herzustellen. Nachteilig ist ferner, aktivität über einen längeren Zeitraum hinweg, daß nach Beendigung der enzymatischen Reaktion Die erfindungsgemäße Polymerisationsreaktion wird

die Reaktionslösung zum Sieden erhitzt und/oder 55 in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines angesäuert wird, um das Enzym oder den Aspartat- Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt. Als PoIyammoniak-lyase bildenden Mikroorganismus zu zer- merisationsinitiatoren kann man beispielsweise Kastören, wobei der erhaltene Niederschlag abfiltiert liumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B₂ oder wird. Dies bedeutet, daß man die Aspartat-ammoniak- Methylen-Blau verwenden. Beispiele für geeignete PoIylyase oder den Aspartat-ammoniak-lyase bildenden 60 merisationsbeschleuniger sind /?-(Dimethylamino)-pro-Mikroorganismus nur einmal verwenden kann. pionitril sowie Ν,Ν,Ν',Ν',-Tetnimethyläthylendiamin.

In »Chem. Abstracts, 73, 86574 (1970)« und »Chem. Die Reaktion wird bei Temperaturen von 10 bis 5O⁰C Abstracts, 72, 129359 (1970)« werden Methoden be- und vorzugsweise \on 20 bis 40⁰C durchgeführt, schrieben, denen nicht mehr die vorstehenden Nach- Die Reaktion kann innerhalb von 10 bis 60 Minuten teile anhaften. So geht man beispielsweise bei dem 65 zu Ende geführt werden. Beispiele für Aspartat-Verfahren gemäß »Chem. Abstracts, 73, 86574 (1970)« ammoniak-lyase bildende Mikroorganismen, die zur so vor, daß man die Aspartat-ammoniak-lyase an ein Durchführung des. erfindungsgemäßen Verfahrens Anionenaustauscher-Polysaccharid-Adsorptionsmittel eingesetzt werden können, sind folgende: E cherichia