DE2251384A1 - Verfahren zum zuechten von aeroben mikroorganismen - Google Patents

Description

PATENrANWA^-LTE

DR. E. WIEGAND DIPL-ING. W. NIEMANN DR. M. KOKLER DiPL-ING. C. GERNHAFiDT

MÖNCHEN HAMBURG 2251384

TELEFON: 555476 8000 MÖNCHEN 2,

TELEGRAMME: KARPATENT MATH I LD E N STRAS S E 12

19. Oktober 1972 W. 41217/72

Mobil Oil Corporation New lork (Y.St.A.)

Verfahren zum Zueilten von aeroben Mikroorganismen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von aeroben Mikroorganismen in einem Kulturmedium, bei dem ein sauerstoffhaltiges Gas in das Kulturmedium eingeleitet wird.

Verfahren zum Züchten von aeroben Mikroorganismen in einem Kulturmedium unter Einleiten von Luft in das Kulturmedium sind bekannt. Im allgemeinen wird die zum Züchten der Mikroorganismen angewandte Luft bei hohem Druck in das Kulturmedium eingeleitet. Wie in der US-Patentschrift J 201 327 angegeben, werden Mikroorganismen auch dadurch gezüchtet, daß man einen Strahl des Kulturmediums mit einem Strom sauerstoffhaltigen Gases über der Oberfläche des Kulturmediums in Berührung bringt, während eine im Fermenter unterhalb der Oberfläche des Kulturmediums liegende Sauerstoffquelle zusätzlich Sauerstoff liefern kann. _Alk,_M

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Die Erfindung umfaßt das Züchten von Mikroorganismen durch Bebrüten in einem Kulturmedium, das aus einer wässrigen mineralischen Nährlösung und einer der Energie und dem Züchten dienenden Kohlenstoffquelle besteht. Ein sauerstoffhaltiges Gas wird zum Züchten der Mikroorganismen in das Kulturmedium eingeleitet, um eine Durchwirbelung und eine Verdunstungskühlung des Kulturmediums zu bewirken. Kin kleinerer Anteil des Gases wird in den unteren Teil des Kulturmediums bei einem Druck an der Einleitungsstelle eingeführt, der mindestens ausreicht, um den hydrostatischen Druck des Kulturmediums an der Einleitungsstelle zu überwinden. Ein größerer Anteil des Gases v/ird in den oberen Teil des Kulturmediums bei einem Druck an der· Einleitungsstelle eingeführt, der mindestens ausreicht, um den hydrostatischen Druck des Kulturmediums an der Einleitungsstelle zu überwinden. Vorzugsweise ist der Druck an der Einleitungsstelle des in den oberen Teil des Kulturmediums eingeleiteten Gases mindestens 0,035 atü (0,5 psig) geringer als der Druck an der Einleitungsstelle des in den unteren Teil des Kulturmediums eingeleiteten Gasesο

Die Zeichnung stellt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform des erfingungsgemäßen Verfahrens dar.

Das Züchten von aeroben Mikroorganismen ist im Hinblick auf die Fähigkeit vieler Species, wertvolle Produkte, wie z.B. innerzellulares Eiweiß,zu erzeugen, von großer Bedeutung. Diese Produkte können als Nährmittel für Vieh und andere Lebewesen, einschließlich des Menschen verwendet werden. Diese Mikroorganismen werden in einem Kulturmedium gezüchtet, das aus einer wässrigen mineralischen Nährlösung und einem kohlenstoffhaltigen Substrat besteht, wobei ein sauerstoffhaltiges Gas in das Kulturmedium eingeleitet wird. Die als Lieferant sowohl für das Wasser als auch für die Mineralien dienende

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wässrige mineralische' Nährlösung ist für das Züchten der Mikroorganismen erforderlich.. Aus dem kohlenstoffhaltigen Substrat erhalten die Mikroorganismen die für das Züchten erforderliche Energie,- während das Gas den für das Züchten der aeroben Mikroorganismen notwendigen Sauerstoff liefert.. Um ein wirksames Züchten der Mikroorganismen zu ermöglichen, muß das Kulturmedium gut durchgewirbelt werden, damit die Mikroorganismen sowohl mit der wässrigen mineralischen Nährlösung, als auch mit dem Substrat und dem Sauerstoff ständig in Berührung kommen. Die Durchwirbelung kann sowohl mittels mechanischer Geräte, wie z.B. Paddel—, Schaufel- und Propellerrührwerken, als auch durch Einleiten von sauerstoffhaltigem Gas oder durch eine Kombination beider Methoden erfolgen. Das Züchten der Mikroorganismen stellt eine exotherme Reaktion dar, deren Ausmaß vom Substrat abhängig ist.. Da die Mikroorganismen nur innerhalb begrenzter Temperaturbereiche^/wobei die Voraussetzung für eine zufriedenstellende Wachstumsrate ein noch weiter begrenzter Temperaturbereich ist, muß die Temperatur des Kulturmediums durch Kühlung geregelt werden. Die Kühlung des Kulturmediums kann durch Anwendung eines Kühlmittels oder durch Verdunstungskühlung unter Einsatz des in das Kulturmedium eingeleiteten sauerstoffhaltigen Gases oder durch Kombination beider Methoden erfolgen..

Die Herstellung eines Eiweißproduktes durch Züchten von Mikroorganismen steht im Wettbewerb mit anderen Eiweißherstellungsverfahren, insbesondere mit denen des Züchtens von pflanzlichem Eiweiß. ^TJm ein Eiweißprodukt durch Züchten von Mikroorganismen wirtschaftlich herstellen zu können,, müssen die mit dem Züchten verbundenen Kosten minimal gehalten werden. Erhebliche Kosten beim Züchten von Mikroorganismen verursacht die für die Durchwirbelung und Kühlung des Kulturmediums erforderliche Enex'gie. Durch Anwendung des erfindungs-

+) wachsen — 4 _

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gemäßen Verfahrens werden die mit der Durchwirbelung und der Kühlung des Kulturmediums verbundenen Energiekosten erheblich reduziert.

Die erfindungsgemäße wirtschaftliche Herstellung eines Eiweißproduktes erfolgt durch Einleiten des säuerst off haltigen Gases an verschiedenen Tiefen des Kulturmediums, Ein kleinerer Anteil des Gases wird in den unteren Teil-des Kulturmediums eingeführt. Dieser Gasanteil soll hauptsächlich das Kulturmedium durchwirbeln, als Quelle des für das Wachsen der Mikroorganismen erforderlichen Sauerstoffs dienen und gleichzeitig zu einer gewissen Verdunstungskühlung des Kulturmediums beitragen. Der größere Gasanteil wird iti den oberen Teil des Kulturmediums eingeführt und dient hauptsächlich zui" Verdunstungskühlung des Kulturmediums. Dieser das Kulturmedium in geringem Maße dur-chwirbelnde Gasanteil gibt Sauerstoff für das V/achson der Mikroorganismen frei. Die für die Verdunstungskühlung des Kulturmediums erforderliche Gasmenge ist weitaus größer als die für die Durchwirbelung" des Kulturmediums und für die Zuführung des für das Wachsen der Mikroorganismen erforderlichen Sauerstoffs. Darüber hinaus hängt die für das Einleiten des Gases in das Kulturmedium erforderliche Energie von dem zum Einleiten benötigten Druck ab. Je tiefer die Stelle, an der das Gas in das Kulturmedium eingeführt wird, umso höher muß der Druck sein. Will man ausreichendes Durchwirbeln erreichen, muß das Gas in den unteren Teil des Kulturmediums eingeleitet werden» Da das für das Durchwirbeln erforderliche Gas, das den kleineren Anteil der erforderlichen Gesamtgasmenge darstellt, nur in den unteren Teil des Kulturmediums und das für die Verdunstungskühlung erforderliche Gas, das den größeren Anteil der notwendigen GesaratgasmenG© darstellt, in den oberen Teil des Kulturmediums eingeleitet wird, liegt für den größeron Gosanteil gegenüber dem > kleineren ein niedrigerer Druck vor. Infolge-decson wird

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Energie nur für den im oberen Teil des Kulturmediums eingeleiteten Anteil der Gesaratgasmenge benötigt, wodurch erhebliche Energiekosten eingespart v/erden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zum Züchten vieler Gen.era von aeroben Mikroorganismen angewandt werden.' Zudem können erfindungsgemäß viele verschiedene Substrate verwendet werden, die den als Energiequelle für das Züchten der Mikroorganismen erforderlichen assimilierbaren Kohlenstoff liefern. Bevorzugt wird jedoch das Züchten Kohlenwasserstoff verbrauchender Mikroorganismen und die Verwendung von Kohlenwasserstoffen als Substrat für die Kohlenstoffquelle- Das Kulturmedium besteht somit aus mikroorganismischen Zellen, einem Kohlenwasserstoff und einer wässrigen mineralischen Nährlösung.

Das Kulturmedium liegt in Form einer Emulsion vor* Diese Emulsion kann z,B„. eine V/asser-in~Öl-Emulsion sein. Hierunter ist eine Emulsion zu verstehen, bei der Öl die kontinuierliche Phase (oil phase-continuous emulsion) darstellt und in der das OeI ein Kohlenwasserstoff ist. Das Kulturmedium kann auch eine Öl-in-Wasser-Emulsion sein, bei der Wasser die kontinuierliche Phase (waterphase-continuous emulsion) darstellt.

Zu den Mikroorganismen, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden können,; gehören Bakterien, Pilze, Hefen und Schimmelpilze... Bevorzugt werden "nicht wählerische" (non-fasUdious) Organismen, d.h.- Organismen, die in einfach dargestellten (simplified) wässrigen mineralischen Nährlösungen ohne Zugabe organischer Verbindungen wachsen. Aktive, für Mensch und Tier pathogene Organismen sind normalerweise ausgeschlossen. Werden letztgenannte Organismen jedoch aus irgendeinem Grund gewünscht, können sie auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gezüchtet werden. Sollen also Mikroorganismen für andere als Nahrungszwecke gezüchtet werden, läßt sich das erfindungsgemäße

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Verfahren auch für das Züchten pathogener Mikroorganismen anwenden.

Geeignete Genera unter den Bakterien sind: Pseudomonas, Bacillus_y Flavobacterium, Saroina usw. Als Beispiele für die Species dieser Genera gelten: P. aeruginosa, P. oleovorans, P. putida^ P. boreopolis, P. methanic3| P- fluorescens, P. pyocyanea; B aureus_y B. acidi, B. subtil Js₁, B. urici, B. cereus, B. coagulans, Β., mycoides, B. circulans, B. inegaterium· Flavobacterium aquatile; Sarcina alba und Sarcina lutea

Weitere bevorzugte Genera sind Ächromobacter und Nocardia und als Beispiele für die Species seien genannt :

A. xerosis, A«. agile, A, gut a tup, A. s u ρ e r f ici a 1 i s , A. parvulus. A", cycloclastes ; N. s a Im on idol or, N. asteroides, N. minimus, N. opaca _t N. corallina» N. rubra, und N.. paraffinae.

Nützlich ist auch das Genus Mycobacterium und insbesondere die Species, wie z.B..

M. parafficum, M. phlei, M. lacticola, M.. rhodochrous, M. smegmatis, M. rubrum, M. luteum, M. album und M. by— alinicum.

Andere Kohlenwasserstoff verbrauchende Bakterien sind: Methanomonas methanica und Methanomonas sp.; Micrococcus paraf f inae; B. aliphaticum, B.. hidiuni und B. benzoli vom Genus Bakterium sowie Species der Micromonospora. V/eitere nützlich Genera sind u.a. Brevibacterium,. Aerobacter und Corynebacterium.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich auf jeden Pilz der Klasse Eumycetes oder echter Pilze, vorzugsweise jedoch auf die Pilze der Klasse Fungi Irnperfecti

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oder der Klasse Phycomycetes anwenden. Bevorzugte Pilze der Klasse Fungi Imperfecti sind Species der genera Aspergillus und Penicillium, wie z.B. A. niger, A". glaucus,- A. oryzae, A.. flavus, A. terreus, A. itaco nieus; :P. notatum, P» chrysogenum, P.. glaucum,

E. griseofulvum, P.. expansum, P. digitatum, und P.~ italicum. Weitere geeignete Organismen sind. u. a.

verschiedene Species der Genera Honilia, Helmin— thosporium, Alternaria, Fusarium und Myrothecium...

Bevorzugte Pilze der Klasse Phycomycetes sind u.a.

Species der Genera.Rhizopus und Micor, wie z.B.

R. nigrieans, R. oryzae _v R.. delemar, R. arrhizus, R.. stolonifer» R. sp. ; M. niucedo und M, genevensis.

Einige der oben genannten Pilze sind auch als Schimmelpilze bekannt*. Hierzu gehören z.B. Aspergillus, Penicillium, RhizoxAis und Micor. Alle sind Q^edoch echte Pilze oder Eurnycetes.

Bei den Hefen gehören die bevorzugten Organismen der Familie Cryptococcaccae und isbesondere der Unterfamilie Cryptococcoidae an. Bevorzugte Genera sind Torulopsis (oder Torula), Candida und Pichia«, Bevorzugte Species sind Candida lipolytica, Candida pul— cherrima, Candida utilis, Candida utilis Variati ina.ior«, Candida tropicalis, Candida intermedia und Torulopsis colliculosa. Weitere geeignete Species sind Hansenula anomala, Oidium lactia und Neurospora sitophila.

Ber verwendete Kohlenwasserstoff befindet sich bei der Bruttemperatur in der flüssigen Phase und kann somit eine Emulsion bilden. Bevorzugt werden aliphatische Kohlenwasserstoffe, die gesättigt oder ungesättigt geradkettig oder verzweigt sein können und bis zu 20, 50, 4-0 oder mehr Kohlenwasserstoff atome aufweisen. Gesättigte geradkettige Kohlenwasserstoffe mit bis zu

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20 Kohlenstoffatomen, wie z.B. n-Hexadekan, sind besonders geeignet. Cyclische Kohlenwasserstoffe, die aromatische und alicyclische Verbindungen umfassen, sind ebenfalls brauchbar. Hierzu gehören alkylsubstituierte cyclische Verbindungen mit 1, 2 oder mehr Alkylsubstituenten geeigneter Länge, Kettenkonfiguration und Sättigungsgrad, in denen der cyclische Teil aromatisch oder cycloparaffinisch ist.. Zu den alkylsubstituierten aromatischen Kohlcnwasserstoffen gehören Toluol, verschiedene Xylole, Mesitylen, Äthylbenzol, p-Cymol, Diäthy!benzole sowie die isomeren Propyl-, Butyl-, Amyl-, Heptyl- und Octylbenzole. Unter den brauchbaren alkylsubstituierten Cycloparaffinen befinden sich Kethylcyclopentan, Di- und Trlmethylcyclopentane, /ithylcycloijentan, Diäthylcyclopentano, verschiedene Propyl-, Butyl-,. Amyl-, Ilexy]— und Octylcyclopentane sowie die Alky!cyclohexane, die in einer den oben genannten Alky !cyclopentanon entsprechenden Weise substituiert sind,- ferner Verbindungen, wie die verschiedenen Tetramethylcyclohexane, Hethyläthylcyclohexane, Methylpropylcyclohexane u. dgl.

Rohöle, verschiedene Erdö 11'raktionen, Rückstände und dgl. können verwendet werden.

Andere kohlenstoffhaltige Substrate, wie Z₀B. Kohlenhydrate, Zucker, Cellulose, Alkohole und Lignin können ebenfalls verwendet werden.

Es ist vorteilhaft, wenn das Kohlenwasserstoffsubstrat in der flüssigen Phase vorliegt, nicht nur, weil es einen geeigneten Schmelzpunt aufweist, sondern weil es auch in einem geeigneten Lösemittel gelöst ist. Die oben erwähnten Kohlenwasserstoffe sind normalerweise bei der Bruttemperatur flüssig. Unter normalen Bedingungen feste Kohlenwasserstoffe können jedoch als Kohlenstoffquelle verwendet werden, wenn

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sie in einem Kohlenwesserstofflösemittel oder einem anderen üblichen inerten ungiftigen Lösemittel gelöst sind.

Die wässrige mineralische Nährlösung enthält eine Stickstoffquelle, wie z.B. ein Nitrat oder Nitrit oder ein Ammoniumsalz oder Harnstoff, und Ione, wie z.B. Kalium,. Magnesium, Phosphat und Sulfat, sowie Ione von Spurenelementen, wie z.B.. Molybdän und Kobalt- Spaten von Mangan, Eisen und Calcium können ebenfalls vorliegen. Da die Nährlösung Wasser enthält, werden die meisten dieser Ione ausreichend in normalem Trinkwasser vorhanden sein.. Es ist jedoch wünschenswert, die Ione der Nährlösung zuzusetzen,, um zu gewährleisten,, daß sie in ausreichender Menge beim Züchten vorliegen*. In der Regel besteht die Nährlösung hauptsächlich aus* Wasser,, das 99 Gew.-$ oder mehr der Nährlösung ausmachen kanu. Der Wassergehalt kann jedoch bis auf 90 Gew.-^ reduziert , werden. Allgemein kann jeder beim mikrobiellen Züchten bisher verwendete Wasseranteil eingesetzt v/erden. Geeignete mineralische Nährlösungen setzen sich wie folgt zusammen, wobei die Mengen der verschiedenen Bestandteile in g pro Liter der Lösung angegeben sind:

Tabelle I

Kaliummonohydrogenphosphat 6,0

Natriumdihydrogenphosphat 9,0

Iiatriummolybdat 0,006

Kobalt Chlorid 0,.006

Magnesiumsulfat 0,6

Ammoniumsulfat 6,0

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Tabelle II

Natriummonohydrogenphosphat 9*0

Kaliumdihydrogenphosphat 6,0

Ammoniumsulfat 6,0

Magnesiumsulfat 0,6

Natriumcarbonat 0,3

Calciumchlorid 0,03

Eisen (Il)-Sulfat 0,015

Mangansulfat 0,006

Kobaltchlorid 0,006

Natriummolybdat 0,006

Wie bereits erwähnt, kann das Kulturmedium in Form einer Öl-in-Wasser-Emulsion oder einer V/asser-in-Öl-Emulsion vorliegen. Die Emulsionen können entweder durch alleiniges Durchwirbeln mit Gas oder vorzugsweise durch Kombination von Durchwirbelung mit Gas und Anwendung eines öl- oder wasserlöslichen Ernulgators hergestellt und stabil gehalten werden.- Der Emulgator kann ionisch oder nichtionisch sein. Das Verhältnis der wässrigen mineralischen Nährlösung zum Kohlenwasserstoffsubstrat ist derart, daß, gemäß dem Stand der Technik, die Wasser-in-Öl-Emulsion oder die Öl-in-Wasser-Emulsion hergestellt wird. In einer geeigneten Form liegen zwischen 35 und 90 Vol.-# oder mehr Kohlenwasserstoffsubstrat vor, während der Rest aus der wässrigen mineralischen Nährlösung besteht. Die Emulsion wird vorzugsweise im Fermenter hergestellt;, ihre Herstellung kann jedoch auch mittels eines üblichen Homogenisators erfolgen, woraufhin die Emulsion in den Fermenter gegeben wird.

Durch die Maßnahme, säuerstoffhaltiges Gas während des Züchtens in das Kulturmedium einzuleiten, wird Sauerstoff vom durch die Emulsion strömenden Gas in einer Menge freigegeben, die unter Gleichgewichtsbedingungen proportional der Löslichkeit des Gases in der Emulsion ist, die von etwa 6 Gewichtsteilen pro Million in der Wasserphase zu 80 Ge-

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wichtsteilen pro Million in der Kolilenwasserstoffphase reicht.

Der kleinere Anteil des in das Kulturmedium eingeleiteten sauerstoffhaltigen Gases wird, wie bereits,erwähnt, in den unteren Teil des Kulturmediums eingeleitet. Unter dem "unteren Teil" ist der unter dem Mittelpunkt des ruhenden Kulturmediums liegende Teil, zu verstehen. Dieser Anteil des sauerstoffhaltigen Gases dient, wie bereits vorstehend erwähnt, hauptsächlich dem Durchwirbeln des Kulturmediums.. Je tiefer die Stelle, an der das säuerstoffhaltige Gas in das Kulturmedium eindringt, umso wirksamer wird das Medium durchgewirbelt. Vorzugsweise wird dieser kleinere Gasantoil. an einer möglichst tiefen Stelle in das Kulturmedium eingeleitet. So kann dieser Gasanteil au einer Stelle nahe der untersten Schicht des Kulturmediums, beispielsweise in die aller— unterste Schicht eingeleitet werden. Unter "kleinerem Anteil" ist eine Menge zu verstehen, die 4-9 Vol.- % der sich aus dem kleineren und dem größeren Anteil zusammengesetzten Gesamtgasrnenge nicht übersteigt. Vorzugsweise beträgt der kleinere Gasanteil etwa 5 VoI,-# der in das Kulturmedium eingeleiteten Gesamtgasmenge.

Der größere Anteil des in das Kulturmedium eingeleiteten sauerstoffhal'tigen Gases wird in den oberen Teil des Kulturmediums eingeführt. Unter dem "oberen Teil" ist der zwischen dem Mittelpunkt und der Oberfläche des ruhenden Kulturmediums liegende Teil zu verst-ehen. Unter dem "größeren Anteil" sind mindestens 51 VoI,-% der in das Kulturmedium eingeleiteten Gesamt— gasmenge zu verstehen. Vorzugsweise beträgt der größere Gasanteil etwa 95 % der in das Kulturmedium eingeleiteten Gesamtgasmenge.

Die für das Einleiten des größeren Gosanteils erforderliche Energie sinkt mit abnehmender Tiefe an der

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Stelle, an der das Gas in das Kulturmedium eintritt. Der größere Gasanteil wird deshalb vorzugsweise so nahe wie möglich an der Oberfläche des Kulturmediums eingeführt, so z.B.. an einer knapp unter der Oberfläche liegen*- den Stelle. Bas Kulturmedium wird wirkungsvoll gekühlt, wenn der Eintritt des größeren Gasanteils 2,5 cm (1 inch) unterhalb der Oberfläche des Kulturmediums erfolgt. Die Eintrittsstelle kann jedoch bis zu 15 cm (6 inches) unter der Oberfläche des Kulturmediums liegen. Das Gas kann auch noch tiefer eingeführt werden, vorausgesetzt, daß die Einleitungsstelle nicht unter dem Mittelpunkt des ruhenden Kulturmediums fällt»

Die Temperatur und der Druck des in den oberen Teil des Kulturmediums eingeleiteten säuerstoffholtigen Gases wer-· den so eingestellt, daß eine wirksame Verdunstungakühlung des Kulturmediums erfolgt. Vorzugsweise liegt die Temperatur des eingeführten sauerstoffhaltigon Gases unter der des Kulturmediums; sie kann jedoch auch über der Temperatur des Kulturmediums liegen, vorausgesetzt,, daß der Wassergehalt des Gases derart ist, daß bej.m Erreichen der Temperatur des Kulturmediums das Gas mit V/asser untersättigt ist und somit Wasser aus dem Kulturmedium verdunsten kann. Das säuerstoffhaltige Gas kann auch mit Wasser gesättigt sein, vorausgesetzt jedoch, daß die Temperatur des Gases in ausreichendem Maße unter der des Kulturmediums liegt, so daß das Gas beim Erreichen der Temperatur des Kulturmediums mit Wasser untersättigt ist. Vorzugsweise liegt die Temperatur des Gases unter der des Kulturmediums. Bei dieser Temperatur ist das Gas mit Wasser untersättigt* Die Temperatur des Gases kann zwischen 0 und 26j67°C (32 und 80°F) betragen.

Das sauerstoffhaltige Gas wird,wie bereits erwähnt, in das Kulturmedium bei einem Druck eingeleitet, der mindestens ausreicht, um den hydrostatischen Druck des Kulturmediums an der K:inle:5 tungsstelle r.u überwinden. Unter dem "Druck der, eingeleiteten Gases" ist der Druck des

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Gases unmittelbar vor seinem Eintritt in das Kulturmedium zu verstehen, d.h. der Druck des Gases in der leitung, die das Gas zu einem mit Sprengvorrichtung ausgestattetem Injektor (sparger) oder einer anderen Vorrichtung führt. Der Druck des eingeleiteten Gases kanu über dem hydrostatischen Druck des Kulturmediums an der Einleitungsstelle liegen.. In der Regel ist jedoch ein Druck über dem hydrostatischen Druck als verschwendete Energie anzusehen.

Der Druck des größeren Gasanteiles an der Einleitungsstelle ist mindestens 0,035 atü (0,5 psig) geringer als dor des kleineren Gasanteils an der Einleitungsstelle. Durch den Druckunterschied zwischen den oberen und unteren Gasanteilen wird Energie eingespart. Beträgt der Druckunterschied mindestens 0.035 atü" (0,5 psig), erzielt man erine meßbare Energieeinsparung. Je höher der Druckunterschied, uiüsomehr wird Energie gespart» Vorzugsweise beträgt der Druckunterschied mindestens 0.35 atü (5 psig). Der bevorzugte Druck des größeren Gasanteils an der Einleitungsstelle beträgt nicht mehr als 0.35 atü (5 psig). Bei Drücken über 0.35 atü' (5 psig) steigen die Kosten der für die Zufuhr dieses Gasanteils erforderlichen Energie bis zu einem unwirtschaftlichen Niveau an. Darüber, hinaus.sind bei niedrigeren Drücken die Kosten der benötigten Geräte geringer,. da billigere Gebläse anstelle teurer Kompressoren zum Einleiten des Gases verwendet werden können.. Vorzugsweise beträgt der Druck des kleineren Gasanteils an der Einleitungsstelle nicht mehr als 2,11 atü (30. psig). Bei Drücken über 2,11 atü (30 psig) steigen die Kosten der für die Zufuhr des Gases erforderlichen Energie bis zu einem unwirtschaftlichen Niveau an.. Aus dem vorstehend Gesagten geht hervor, daß der größere Gasanteil für das Züchten vorzugsweise an einer Stelle eingeleitet wird, an der der hydrostatische Druck nicht mehr als 0,35 atü (5 psig) beträgt und daß der kleinere Gasanteil in das Züchtungsmedium vorzugsweise an einer Stelle eingeführt wird, an der der hydrostatische Druck nicht mehr als 2,11 atü (30 psig) beträgt.

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Unter einem "sauerstoffhaltigen Gas" ist jedes Gas zu verstehen, das freien Sauerstoff für das Züchten der Mikroorganismen, jedoch keine das Wachsen der Mikroorganismen wesentlich hemmende Bestandteile enthält. Als bevorzugtes sauerstoffhaltiges Gas wird Luft verwendet. Ein mit Sauerstoff angereichertes Gas, wie z.B. mit Sauerstoff angereicherte Luft kann jedoch auch verwendet werden.. Außerdem kann reiner Sauerstoff eingesetzt werden. Da jedoch der aus dem größeren Gasanteil stammende Sauerstoff nur beiläufig dem Züchten der Mikroorganismen dient, stellt die Verwendung einer mit Sauerstoff angereicherten Luft,eines anderen mit Sauerstoff angereicherten Gases oder reinen Sauerstoffs eine Verschwendung on Gas dar. Luft, deren Sauerstoffgehalt z.T. herabgesetzt wird, kann sowohl für den größeren als auch für den kleineren Gasanteil verwendet v/erden. Das Abgas aus dem Kulturmedium kann nach entsprechender Behandlung, d.h. bei

r, -, . .der-.,Teriipeijatur , ., , _, .. , „ ■ Regulierung/und /oder des Wassergehaltes als sauerstoffhaltiges Gas in dos Kulturmedium zurückgeführt werden.

Sowohl die größeren als auch die kleineren Anteile des sauerstoffhaltigen Gases können jeweils nur in einer Tiefe des oberen bezw.. des unteren Teils des Kulturmediums eingeleitet werden, wobei der Eintritt jeden Anteiles dieses Gases an verschiedenen Tiefen des Kulturmediums erfolgen kann. Mit anderen Worten, man kann den größeren Anteil an zwei oder mehr Stellen des oberen Teils, den kleineren Gasanteil an zwei oder mehr Stellen des unteren Teils des Kulturmediums eintreten lassen.

Die beiliegende Abbildung veranschaulicht ein Verfahren für die Herstellung von jährlich 60 000 t Eiweiß aus n-Alkanen. Die Reaktionswärme beträgt etwa 5544- kcal (22,000 British Thermal Units (BTU)per pound) Eiweiß bezw» 32?6 kcal (13,000 BTU per pound) verbrauchten Kohlenwasserstoffs. Im Fermenter dient sauerstoffhaltiges Gas als Sauerstoffquelle zum Durchwirbeln des Kulturmediums und zum Abführen der Reaktionswärme durch Ver—

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dunstungskühlung . Die "treibende Kraft" (driving force) für die Verdunstungskühlung ist proportional der Differenz im Wassergehalt des ausströmenden und einströmenden Gases. Das Gas wird im Fermente!¹ gleichzeitig durch mehrfache Eintrittsstellen an verschiedenen Tiefen eingeführt, die von knapp unter der Oberfläche der Flüssigkeit bis zum Boden eines Fermenterbehälters reichen. Der Fermenter kann beliebig hoch sein;· die Hohe beträgt vorzugsweise 61 bis 9CO cm (2 to 30 feet), Bas Gas kann durch Sprenger (spargers) oder Höhren für die erforderlichen Sauerstoff-Übertragung, Kühlung und Flüssigkeitsumwälzung eingeleitet werden.

Gemäß der Abbildung beträgt die an der feuchten Kugel gemessene Temperatur (wet bulb temperature) des einströmenden Gases 22,22⁰O (72⁰F), wobei der austretende Gasstrom im wesentlichen bei 36,67°C (98°F) mit Wasser gesättigt ist (Betriebstemperatur des Fermenters). Bei diesen Bedingungen verdunsten 0,-11 kg (0,024- pound) Wasser für 0,454 kg (1 pound) des den Fermenter durchströmenden Gases, wodurch etwa 6,05 kcal (24 BTU) an Wärme durch Verdunstung und etwa 1,5 kcal '(6 BTU) als Eigenwärme entzogen v/erden,- Das aus dem Fermenter austretende Gas kann über Kopf durch einen üblichen Kühlturm und anschließend in den Fermenter zurückgeleitet oder in die Atmosphäre freigegeben werden. Frische Luft oder Luft aus den Produkttrocknern ersetzt das in die Atmosphäre freigegebene Gas.

'Zur Erläuterung der Abbildung wird der Fermenter 11, der ein Fassungsvermögen von 10*1-46,6 nr (2,?6 million (MM) gallons) aufweist, zunächst mit 157,08 m⁵ (41,500 gallons) n-Hexadekan gefüllt. JBie restliche Füllung besteht aus der in Tabelle 1 aufgeführten wässrigen mineralischen Nährlösung. Der Inhalt des Fermenters wird mit Piclna-Hef e geimpft^ er weist einen pli-Wei't von etwa 3,5 auf. Eine flüssige Beschickung wird durch

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die Leitung 10 in einer Menge von etwa 17 4-11 1 (4600 gallons per minute/gpm) in den Fermenter 11 eingebracht. Die Beschickung umfaßt n-Hexadekan und Nährlösung vorzugsweise in einem solchen Verhältnis, daß der Ansatz der Bestandteile der ursprünglichen Beschickung de*s Fermenters unverändert aufrechterhalten wird. Die durch die Leitung 10 strömende Beschickung braucht keine Pichia-Hefe zu enthalten.

Der Inhalt des Fermenters 11 wird zunächst auf etwa $6,67°C (98⁰J'') erhitzt. Sauerstoff haltiges Gas mit einem Druck, der ausreicht, um den hydrostatischen Druck des FermenterinhaIts zu überwinden, wird in den Fermente!· durch die Leitung 12 in einer Menge von etwa 3679 m (0.13 million standard cubic feet per minute (MM SCF/rnin. ) an einer Stelle nahe dem Boden des Fermenters 11, sowie durch die Leitung 12 a in einer Menge von 65 939 m (2.33 MM SCF/iiiin) an einer Stelle knapp unter der Oberfläche des flüssigen Ferinenterinhalts eingeleitet. Das Gas aus Leitung 12 a kann etwa 2,5 cm (1 inch) unter der Oberfläche des flüssigen Fermenterinhalts und das Gas aus Leitung 12 etwa 5 cm (2 inches) über dem Boden des Fermenters eingeleitet werden. Das in der Leitung 12 a befindliche Gas steht unter einem Druck,der mindestens ausreicht, um den hydrostatischen Druck des Fermenterinhalts zu überwinden. Der Druckunterschied zwischen dem Gas in der Leitung 12 und dem in der Leitung 12 a beträgt mindestens 0,035 atü (0,5 psig). Das Gas wird bei etwa 22,22⁰C (?2°F) mit Wasser gesättigt. Im allgemeinen schwanken die Temperaturen des Gases in den Leitungen 12 und 12 a von O bis 26,6⁰C (32 to 80°F). Das Gas in den Leitungen 12 und 12 a enthält etwa die 40-fache stöclii ometrische Sauerstoff menge, die für den vollständigen Verbrauch des n-Hexadekans erforderlich ist,

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— Λ¹? —

Der Druck des Gases' kann in-jeder herkömmlichen Weise, wie z.B.. mittels vorher eingestellter Druckregler (nicht gezeigt), in den leitungen 12 und 12 a aufrechterhalten werden.

Die sich im Fermenter 11 bildenden Gase (hauptsächlich CCL),sowie unverbrauchtes eingeleitetes Gas werden aus dem Fermenter durch die Leitung 13 als gasförmiges Produkt abgezogen. Das gasförmige Produkt ist mit Wasser bei etwa 36,67⁰G (98⁰I¹) gesättigt.

Die durch die Leitung 13 gasförmigen Produkte werden in die Leitung 14 und anschließend in einen unteren Abschnitt des Turms'15 geleitet, in dem man sie mit einem Temperaturen von 0 bis 26,7°C (32 to 80⁰P), vorzugsweise etwa 21,1⁰C (7O⁰P) auf v/eisend en, in den Turm aus der Ein— laßleitung 16 strömenden Kühlwasser im Gegenstrom neutralisiert. Die Temperatur des Kühlwassers kann je nach der im Fermenter herrschenden Bruttemperatur variiert werden. Bei thermophilen Mikroorganismen, die sich bei Temperaturen bis zu 48,89°C (i2o°F) züchten lassen, beträgt die Temperatur des^Kühlwassers bis zu 32,22⁰C (90⁰F).

Die durch die Leitung 16 in den Turm 15 fließende Kühlwassermenge beträgt etwa 112,4 nr (29₉7OQ gallons per minute) bei 21,1°C (70°F)_ Verhältnismäßig kleine Mengen eines oder mehrerer Wasserbehandlungsmittel, wie z.B. Calciumhydroxid und Natriumchlorid _r können dem Kühlwasser durch die Leitung 17 zugegeben v/erden. Gegebenenfalls kann das Wasser durch Chlorierung,; Ozonisierung oder sonstige chemische Methoden sterilisiert werden, um die Keimfreiheit des Umlaufgases aufrechtzuerhalten- Herkömmliche Sterilisiermittel können durch die Leitung 17 zugegeben werden.

Keimfreie Luft wird in einer Menge von 3679 m (0,13 MH SCF/min.) in die Leitung 14 über Leitung 18 ge-

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führt. Diese Luft kann durch Trockmmg (nicht gezeigt) derart erhalten v/erden, daß man die Luft über den Sterilisiertemperaturbereich, d.h. 176,67 bis 260⁰C (350 500 P)₁ erhitzt und anschließend bei der unten beschriebenen Trocknung des Zellprodukts verwendet.

Mit Wasser gewaschenes, im wesentlichen entfeuchtetes und auf etwa 22,2⁰G (72⁰F) gekühltes Gas wird über Kopf durch die Leitung 19 abgezogen und mittels der Pumpen

20 und 20 a in die Leitungen 12 bezw. 12 a gefördert. Ein Teil des in der Leitung 19 befindlichen Gases, der der Luftmenge, d.h. 3679 m⁵ (0,13 HM SCF/min.), im wesentlichen entspricht, kann aus dem System durch die Leitung

21 in die Atmosphäre freigegeben werden.

Kühlwasser mit einer Temperatur von etwa 33,85°O (93°F) wird vom Turm 15 durch die Austrittsleitung 22 in den Abscheider 23 geleitet, in dem sich eine verhältnismäßig kleine Menge n-Hexadekan, das aus der Verdunstung im Permenter 11 stammt und im Turm 15 kondensiert, als obere Schicht bildet. Eine Schicht Wasser sammelt sich im unteren Teil des Abscheiders 23· ^i© n-Hexadekanschicht Wird vom Abscheider 23 durch die Leitung 24 abgezogen und in den Fermenter 11 zurückgeleitet. Das Wasser wird aus dem Abscheider 23 durch die Ausflußleitung 25 in einer Menge von 115,064 m^ (3o,400 gpm.) abgezogen.

Das flüssige Produkt wird aus dem Fermenter 11 durch die Ausflußleitung 26 in einer Menge von 17 411 1 (4,600 gpm) abgezogen. Das Hefezellen enthaltende flüssige Produkt kann zur Gewinnung der Hefezellen einem geeigneten Trennverfahren (nicht gezeigt), wie z.B. Filtrieren, Zentrifugieren, Absetzen, Trocknen u. dgl. unterworfen v/erden,

Die Ausbeute an Zellen entspricht etwa einer Menge von 10 g Zelltrockensubstanz pro 1 Kulturmediums.

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Bei einem Gasdruck von etwa 0,352 atü (5 psig) in der Leitung 12 und von etwa 0,007 B.tü (0,1 psig) in der Leitung 12 a werden 'etwa 4056 PS. (4000 horsepower (H.P.)) zur Förderung von 3679 nr⁵ (0,13 MM SCF/ min) durch die Leitung 12 und etwa 1521 PS (1500 H..P.) zur Förderung von 65 939 ^ (2,33 MM SCF/min.) durch die Leitung 12 a benötigt, woraus sich eine Gesamt—PS von etwa 5 577 (5500 H.P.) ergibt. Wenn die Gesamtgasmenge in dem Fermenter 11 durch die Leitung 12 bei einem Druck von 0,35 atü (5 psig) geleitet würde, benötigte man dagegen etwa 78 078 PS (77.000 H.P.). Somit gestattet das Mehrfach-Injektionssystem gemäß der Erfindung eine Ersparnis Tür die Pumpanlage von nahezu $ 7 Millionen im Vergleich zu einem Einfach-Injektionssystem. Zudem sind die täglichen Betriebskosten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren um etwa 0 13.000 geringer.

Es können mehr als zwei Leitungen (vgl. Leitungen 12 und 12 a in der Abbildung), verwendet werden, um das Gas dem Kulturmedium an verschiedenen Tiefen zuzuführen.

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Claims (1)

1. 22S1384

   Pat ent an sprue he

   1· Verfahren zum Züchten eines aeroben Mikroorganismus, bei.dem der Mikroorganismus in einem aus einer wässrigen mineralischen Nährlösung und einer der Energie und dem Züchten dienenden Kohlenstoffquelle bestehenden Kulturmedium bebrütet -wird, ein sauerstoffhaltiges Gas, das als Sauerstoffquelle für das Züchten des Mikroorganismus, dem Durchwirbeln und der Verdunstungskühlung des Mediums dient, in das Medium eingeleitet wird_r dadurch gekennzeichnet, daß man einen kleineren Anteil des sauerstoffhaltigen Gases in den unteren Teil und einen größeren Anteil des sauerstoffhaltigen Gases in den oberen Teil des Kulturmediums einleitet.

   2·. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als kleineren Gasanteil etwa 5 Vol.-# des gesaraten in das Kulturmedium eingeleiteten sauerstoffhaltigen Gases und als größeren Gasanteil etwa 95 Vol.-% des gesamten in das Kulturmedium eingeleiteten sauerstoff haltigen Gases Ginführt.

   3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den größeren Anteil des sauerstoffhaItigen Gases in das Kulturmedium an einer Stelle zwischen 25 und 150 πιπί unter der Oberfläche des Kulturmediums einleitet.

   4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3> dadurch gekennzeichnet, daß man den größeren Anteil des sauerstoffhaltigen Gases in das Kulturmedium mit einem Druck nicht über o, 35 atu einleitet.

   5. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 'i, dadurch gekennzeichnet, daß man den kleineren Antoi1 des sauer&toffhalti gen Gnses in dor. Kulturmedium mit einem Druck nicht über ■ 2,11 ;itü ei nie j tot. ^v

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   6. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 5»· dadurch gekennzeichnet, daß man den größeren Anteil des sauerstoffhaltigen Gases in das Kulturmedium mit einem Druck einleitet, der o,o35 atü niedriger liegt als der Druck, den man für den kleineren Anteil des säuerstoffhaltxgen,Gases beim Einleiten in das Kulturmedium benötigt.

   7.--Verfahren nach Ansprüchen Λ bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur des sauerstoffhaltigen Gases zwischen 0 und 27°C liegt.

   8. Verfahren nach Ansprüchen Λ bis 7»· dadurch gekennzeichnet, daß man das sauerstoffhaltige Gas abzieht und dieses Gas im Gegenstrom mit einem Wasserstrom in-Berührung bringt, dessen Temperatur niedriger als die des sauerstoffhaltigen Gases ist.

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