DE2244689A1

DE2244689A1 - Peptide und verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE2244689A1
Application number: DE2244689A
Authority: DE
Inventors: George Rogelio Flouret
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1971-09-13
Filing date: 1972-09-12
Publication date: 1973-03-22
Also published as: JPS4911702B2; KR780000114B1; PH9563A; GB1374908A; DE2244689B2; AU461405B2; FR2153971A5; CH556824A; CA1082689A; ZA725775B; AU4594472A; JPS4836171A; US3826794A

Description

PATENTANWALT DR. HANS-GUNTHER EGGERT, DIPLOMCHEMIKER

5 KÖLN 51, OBERLÄNDER UFER 90

■ "■■ - : I

Abbott Laboratories, North Chicago/ Illinois 6oo64 / USA

Peptide und Verfahren zu ihrer Herstellung

Nachdem kürzlich die Aminosäuresequenz des Gonadotropin (Gn) freigebenden Hormons (RH) aufgeklärt worden ist, 1st es äußerst erwünscht, diese Substanz in einem praktischen Maßstab in einer solchen Reinheit herzustellen, daß sie therapeutisch in Fällen von Hormonmangel und möglicherweis© als Regulierungsmittel für den Ovulationszyklus bei weiblichen Warmblütern verwendet werden kann. Beispielsweise bewirken geringe Dosen dieses Gn-RH, das weiblichen Schafen im Anöstruszyklus intravenös injiziert wird, Ovulation.

Die Formel von Gn-RH wurde mit der Aminosäuresequenz Pyro-Glu-His-Trop-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ identifiziert. Um jedoch ein so großes Molekül aus einfachen einzelnen Aminosäuren herzustellen, ist eine erhebliche Anzahl von Stufen einschließlich mehrerer Kondensationsreaktionen erforderlich. Um zu gewährleisten, daß diese Kondensationen an den gewünschten Stellen stattfinden, müssen andere .funktioneile Gruppen am Molekül, die nicht an dieser Reaktion teilnehmen, vorübergehend durch Gruppen geschützt werden, die nach Belieben entfernt werden können.

Gegenstand der Erfindung ist ein verhältnismäßig einfaches Verfahren zur Herstellung der gewünschten Aminosäurekette in überraschend guter Ausbeute. Das neue Verfahren umfasst eine minimale Zahl von Reaktionen zum Schutz von Gruppen

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ORIGINAL INSPECTED

und von Entfernungsreaktionen für diese Schutzgruppen. Als Folge hiervon wird eine Anzahl von Zwischenprodukten verwendet, die bisher in der Literatur nicht beschrieben wurden und in der Natur nicht vorkommen.

Es ist zu bemerken, daß alle im Rahmen der nachstehend beschriebenen Erfindung verwendeten Aminosäuren mit Ausnahme von Glycin in ihrer optisch aktiven L-Porm vorliegen.

Die Erfindung ist insbesondere auf das Zwischendecapeptid Pyro-Glu-His-Trp - (O-R)Ser-(O-R' )Tyr-Gly-Leu-(N^w-R^tl)Arg-Pro-Gly-NHp gerichtet, das wenigstens die drei genannten Schutzgruppen R, R' und R" trägt, die zur Bildung des gewünschten Gn-RH nach einfachen Verfahren entfernt werden können. Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend genannten geschützten Deeapeptids sowie ein Verfahren zur Umwandlung dieses geschützten Peptids in das freie Decapeptid.

Die Aufgaben, die die Erfindung sich stellt, werden gelöst durch Herstellung des geschützten Decapeptlds der Formel Pyro-Glu-His-Trp-(0-R)Ser-(0-R¹)Tyr-Gly-Leu-(N^w-Rⁿ)-

Arg-Pro-Gly-NH₂ , (I)

worin R, R' und R" schützende Gruppen sind, die durch Hydrierung oder Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure entfernbar sind. Jedoch können auch andere in ähnlicher Weise entfernbare Schutzgruppen vorhanden sein, z.B. ein Substltuent am Iminostickstoff von Histidin. Gewöhnlich steht R für Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Acetyl, Benzyloxycarbonyl oder Benzyl, R¹ für Tetrahydropyranol, tert.-Butyl, Acetyl, Benzyloxycarbonyl, Benzyl, Triphenylmethyl oder '.Toeyl und R" für Nitro, Tosyl, Benzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl oder Tetrachlorisopropyloxyphthaloyl, die eines der Wasserstoffatome in den Aminogruppen der Guanidinkomponente in Arg substituieren. Gegebenenfalls kann der Iminostickstoff in der Histidylkomponente einen Benzylrest, Tosylrest, 2,4-Dinitrophenylrest oder andere

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Schutzgruppen, die auf dem Gebiet der Peptide bekannt sind, tragen.

Das geschützte Decapeptid der Formel I wird hergestellt durch Umsetzung des geschützten Nonapeptids His-Trp-(O-R)Ser-(O-R')Tyr-Gly-Leu-(N⁶M*")Arg-Pro-Gly-NH₂ mit einem aktiven Ester oder einem gemischten Anhydrid von Pyroglutaminsäure oder anderen bekannten Derivaten der letzteren in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels. Der Ausdruck "aktiver Ester" wird hier gebraucht, um auszudrücken, daß die Carbonsäuregruppe der Pyroglutaminsäure mit einer Gruppe verestert ist, die sich durch Umsetzung des Esters mit einem Amin leicht ersetzen läßt und, wenn sie ersetzt wird, in das gewünschte Amid und ein inertes · Nebenprodukt übergeht. Ein geeigneter "aktiver Ester" für die vorstehend genannten Reaktionen ist der Pentachlorphenylester, jedoch sind auch der p-Nitrophenylester, der 2,4,5-Trichlorphenylester, der 2,4-Dinitrophenylester, das N-Hydroxysuccinimid, die 2-, 3- oder 4-Fluorphenylester oder ähnliche bekannte Ester von Pyroglutaminsäure ebenso gut geeignet.

Das geschützte Decapeptid der Formel (I) kann durch Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure in das freie Decapeptid (oder Gn-RH) umgewandelt werden. Während dieser Reaktion werden die Schutzgruppen R, R' und R" sämtlich durch Wasserstoff ersetzt. Es ist auch möglich, die Schutzgruppen durch Hydrierung unter Verwendung eines Palladiumkatalysators zu entfernen.

Bei einer spezielleren Ausführungsform wird das vorstehend genannte geschützte Nonapeptid, in dem R und R¹ Benzylreste sind und R" eine N0₂-Gruppe ist, in Dimethylformamid in hoher Konzentration, vorzugsweise bei einer Molarltät zwischen 0,1 und 1,0, gelöst, und der Pyroglutaminsäurepentachlorphenylester in einem Überschuß von 50 bis 200$ über die äquimolare Menge bei einer Temperatur zwischen

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0° und 30°C zugesetzt. Nach einigen Stunden wird die Reaktionslösung durch Chromatographie aufgearbeitet, wobei Chloroform, das zunehmende Mengen Methanol enthält, für die Elution verwendet wird. Die gewünschten Fraktionen des Eluats werden vereinigt und kristallisiert, wobei das reine Decapeptid, das die drei oben genannten Schutzgruppen oder äquivalente Schutzgruppen enthält, erhalten wird.

Zur Herstellung von Gn-RH wird das vorstehend genannte Material in ein gegen Fluorwasserstoff beständiges Reaktionsgefäß gegeben und Anisol zugesetzt, um die durch die einsetzende Reaktion gebildeten NOp- und Benzylcarboniumionen aufzunehmen. Das Gemisch wird dann bei einer Temperatur zwischen 0° und 30⁰C mit überschüssigem Fluorwasserstoff behandelt. Der etwa vorhandene überschüssige Fluorwasserstoff wird nach ungefähr einer Stunde entfernt. Das Produkt wird getrocknet und gereinigt. Das auf diese Weise hergestellte Gn-RH ist in biologischen Tests äußerst aktiv und zeigt Aktivität in Bezug auf Freisetzung des luteinisierenden Hormons und des die FoIlikeIreifung und den Follikelsprung auslösenden Hormons bei Warmblütern.

Zur Herstellung des als Ausgangsmaterial für die Zwecke der Erfindung verwendeten Nonapeptids wird nach der folgenden Reaktionsfolge vorgegangen: Der N-Benzyloxycarbonylprolin-p-nitrophenylester wird mit Glycinamid, das vorzugsweise im Überschuß über die äquimolare Menge verwendet wird, umgesetzt. Das erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-prolylglycinamid wird durch Hydrierung oder Säurebehandlung in das ungeschützte Dipeptid umgewandelt. Das Prolylglycinamid wird dann mit N^a-Benzyloxycarbonyl-N^w-nitro-arginin zum doppelt geschützten Tripeptid umgesetzt, aus dem die Benzyloxycarbonylgruppe durch Säurebehandlung entfernt wird, wobei N^w-Nitro-arginyl-prolylglycinamid, nachstehend als (N»-N0₂)Arg-Pro-Gly-NH₂ bezeichnet, erhalten wird. Das letztere wird mit N-tert.-Butyloxycarbonyl-leucin-p-nitrophenylester zum zweifach geschützten Tetrapeptid umgesetzt,

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aus dem die tert.-Butyloxycarbonylgruppe durch Behandlung mit einer Säure entfernt wird, wobei Leu-(N^-NO₂)Arg~Pro-GIy-NHp erhalten wird. Dieses N0₂-geschützte Tetrapeptid wird mit N-tert.-Butyloxycarbonylglycin-p-nitrophenylester zu einem zweifach geschützten Pentapeptid umgesetzt, aus dem die Butyloxycarbonylgruppe wie im Falle des Tetrapeptide entfernt wird, wobei GIy-Leu-(N⁰^NQg)Arg-Pro-Gly-NHp gebildet wird. Dieses Pentapeptid wird wiederum mit N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-tyrosin-p-nitrophenylester zu einem Hexapeptid mit drei Schutzgruppen umgesetzt. Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wird durch Behandlung dieses Materials mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (1:1) entfernt, wobei das zweifach geschützt© Hexapeptid (0-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^a>-N0₂)Arg-Pro-Gly-NH₂ erhalten wird.

Das vorstehend genannte zweifach geschützte Hexapeptid wird mit N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyl-serin-p-nitro= phenylester zu einem Heptapeptid umgesetzte das vier Schutzgruppen trägt. Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wird wie im Falle des Hexapeptids entfernt, wobei das dreifach geschützte Heptapeptid (O-Bzl)-Ser-(O-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^ü)-N0₂)Arg-Pro-Gly-NH₂ gebildet wird. Das letztere wird mit N-tert.-Butyloxycarbonyl-tryptophan-p-nitrophenylester umgesetzt. Die anschließende Entfernung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Trifluoressigsäure/Methylenchlorid (1:1), das eine geringe Menge Mercaptoäthanol enthält, ergibt das dreifach geschützte Octapeptid Trp-(O-Bzl)Ser-(0-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^w-N0₂)Arg-Pro-Gly-NH₂. Abschließend wird dieses Material mit N-tert.-Butyloxycarbonylhistidin (das wahlweise eine zusätzliche Schutzgruppe am Imidazolstickstoff enthält und nachstehend als (N -X)HIs'bezeichnet wird) und einem Aktivierungsmittel zum entsprechenden Nonapeptid umgesetzt, aus dem die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wie in der vorhergehenden Stufe entfernt wird. Das drei (oder vier) Schutzgruppen enthaltende Nonapeptid hat die folgende Aminosäuresequenz: (N^Im-X)His-Trp-

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(O-Bzl)Ser-(O-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^NO₂)Arg-Pro-Gly-₂

Durch Elementaranalysen und das NMR-Spektrum wurde nachgewiesen, daß diese Peptidzwischenverbindung die zugeordnete Struktur hatte und, wie die Dünnschichtchromatographie ergab, sich als Einzelverbindung verhielt.

Alle vorstehend beschriebenen Kondensationsreaktionen werden in Gegenwart eines inerten Lösungsmittels wie Dirnethylacetarnid oder Dimethylformamid oder anderer organischer Flüssigkeiten durchgeführt, die weder mit den Ausgangsmaterialien noch Produkten, die in jeder Stufe vorhanden sind, reagieren. Natürlich kann die vorstehend beschriebene Reaktionsfolge durchgeführt werden, ohne die speziell genannten Schutzgruppen in Jeder beschriebenen Stufe zu verwenden. Beispielsweise können die zum Schutz der freien Hydroxylgruppen in Serin oder Tyrosin verwendeten Benzylreste durch Tetrahydropyranyl, tert.-Butyl, Acetyl, Benzyloxycarbony1, p-Methoxy-, p-Nitro- oder p-Halogen-benzyloxycarbonyl und im Falle von Tyrosin auch durch Triphenylmethyl oder Tosyl ersetzt werden. Die Nitrogruppe, die die Aminogruppe in der Guanidinkomponente von Arginin schützt, kann durch Umwandlung der Aminogruppe in eine Amidogruppe mit einer SuIfon- oder Carbonsäure, z.B. Tosyl, Benzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl oder Tetrachlorisopropyloxyphthaloyl, ersetzt werden. In allen Fällen müssen die Schutzgruppen natürlich so gewählt werden, daß sie durch eine oder mehrere einfache Behandlungen, die so mild sind, daß sie die Aminosäurekettenbindungen nicht beeinträchtigen, leicht entfernt werden können. Gegebenenfalls können die Schutzgruppen stufenweise entfernt werden. Wenn beispielsweise R und R¹ die üblichen Benzyläther oder substituierten Benzyläther sind, können diese Gruppen durch Hydrierung entfernt werden, und anschließend kann die Schutzgruppe am Arginylfragment durch eine geeignete Reaktionsstufe, die die Aminosäureglieder von Gn-RH nicht nachteilig beeinflußt, entfernt

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werden. Natürlich kann, falls gewünscht, eine solche Reaktionsfolge auch umgekehrt werden.

Die Herstellung des neuen Decapeptids wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.

Beispiel 1

Zu einer Lösung von 836 rag His-Trp-(O-Bzl)Ser(O-Bzl)-Tyr-Gly-Leu-(N^-NO₂)Arg-Pro-Gly-NH₂ (0,645 mMöl) in 2 ml Dimethylformamid wurden 755 mg Pyroglutamlnsäurepentachlorphenylester (2 Mol) gegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde dann abgedampft und das Produkt in etwa 4 ml eines yyfc Methanol enthaltenden Gemisches von Methanol und Chloroform gelöst. Diese Lösung wurde auf eine Chromatographiesäule ( 30 cm hoch, 2,4 cm Durchmesser) aufgegeben, die 45 g Kieselgel enthielt. Die Säule wurde zunächst mit 100 ml eines 5#Methanol enthaltenden Gemisches von Methanol und Chloroform, anschließend mit 15$ Methanol in Chloroform eluiert, und abschließend wurde das gewünschte Produkt mit 300 ml Methanol-Chloroform (1:2) eluiert. Kleine Fraktionen dieses Eluats wurden durch Dünnschichtchromatographie auf ihre Reinheit untersucht. Die das gewünschte Material enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels aus diesem Gemisch wurde der Rückstand in heißem Methanol gelöst und auf Raumtemperatur gekühlt, wobei 412 mg pGlu-His-Trp-(O-Bzl)Ser-(O-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^w-N0₂)Arg-Pro-Gly-NHg erhalten wurden, das hohe Reinheit, einen R_f-Wert in 33#igem CEUOH/CHCl-j von 0,3, einen [hj _D -Wert von -25,2° (c 1; AcOH) und einen Schmelzpunkt von I66 bis l69°C hatte. Sowohl die Elementaranalyse auf Stickstoff als auch das NMR-Spektrum bestätigten die erwartete Struktur.

Durch Ersatz des verwendeten His-Trp-(0-Bzl)Ser-(0-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^w-NOg)Arg-Pro-Gly-NHp durch andere Nonapeptide der gleichen Sequenz, jedoch mit anderen Schutzgruppen,

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können die folgenden Decapeptide in der gleichen Weise hergestellt werden:

pOlu-His-Trp-(O-TB)Ser-(O-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^-NO₂) Arg-PrO-OIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Z)Ser-(O-Bzl)Tyr-01y-Leu-(N^w-N0₂)Arg-PrO-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(0-THP)Ser-(0-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^it'-N0₂)Arg-PrO-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-MeOBzl)Ser-(O-Bzl)Tyr-01y-Leu-(N^-NO₂) Arg PrO-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Ac)Ser-(O-Bzl)Tyr-Gly-Leu-(N^-NO^Arg-PrO-OIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Bzl)Ser-(O-Z)Tyr-Gly-Leu-(N^-NO₂)Arg-Pro-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Bzl)Ser-(O-TRI)Tyr-Gly-Leu-(N"-N0₂)Arg-PrO-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Bzl )Ser-(O-Ac )Tyr-Gly-Leu-(N⁰^-NO₂)ArS-PrO-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Bzl)Ser-(0-Tos)Tyr-Gly-Leu-(N^-NO₂)Arg-Pro-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp-(O-Bzl)Ser-(O-THP)Tyr-Gly-Leu-(N^-NO₂)Arg-PrO-GIy-NH₂

pGlu-His-Trp(0-Bzl)Ser-(0-BTu)Tyr-Gly-Leu(N^<i;-N0₂)Arg-PrO-GIy-NH₂ pGlu-His-Trp (O-Bzl )Ser-(O-MeOBzl )Tyr-Gly-Leu(N^<t/-N0₂)Arg-PrO-GIy-NH₂

Hierin stehen Z für Benzyloxycarbonyl, THP für Tetrahydropyrane, TBu für tert.-Butyl, MeOBzI fUr p-Methoxybenzyl, Tos für Tosyl (= p-Toluolsulfonyl), Ac für Acetyl und TRI für Triphenylmethyl.

Als weitere blockierende Gruppen eignen sich beispielsweise

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die Trifluoracetylgruppe und andere substituiert? Alkyl- ' carbonylgruppen für Tyr und Ser und verschiedene Gruppen für das Imidazol-N in His, die abgespalten werden können, ohne die Peptidkette nachteilig zu beeinflussen. In allen Fällen kann das Ν^ω von Arg die Tosylgruppe oder eine andere Benzyloxycarbonylgruppe oder Tetrachlorisopropyloxyphthaloylgruppe anstelle der oben verwendeten Nitrogruppe tragen. In jedem Fall verläuft die vorstehend beschriebene Reaktion in der gleichen Weise, und alle aufgeführten Verbindungen können nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren oder einem ähnlich einfachen Verfahren in Gn-RH umgewandelt werden, so daß diese Verbindungen ebenso brauchbare und wertvolle Vorstufen für Gn-RH sind. Natürlich kann es notwendig sein, die Synthese zur Herstellung des beschriebenen geschützten Nonapeptids leicht zu modifizieren, wenn das Nonapeptid hergestellt wird, das andere Schutzgruppen an den Arginyl-M-u den Seryl- oder Tyrosylkomponenten trägt, ohne jedoch die beschriebene Synthese wesentlich zn verändern. Die einzelnen Aminosäuren, die die vorstehend genannten Schutsgruppen enthalten, sind bekannt, und alle werden häufig in Peptldsynthesen verwendet. Sie werden in der englischen Ausgabe des Handbuchs von Schröder und Mitarbeitern "The Peptides I" (Academic Press 1965) auf den Seiten 1Ö7 bis iy4 für Arginin, auf den Seiten 210 bis 212 für Serin und auf den Seiten 222 bis 225 für Tyrosin sowie in "Proceedings of . the 8th European Peptide Symposium", herausgegeben von Beyerman (North Holland Publishing Co.„ Amsterdam 1967), S. 50 ff., beschrieben.

Wenn der beim vorstehend beschriebenen Versuch verwendete Pyroglutaminsäureester durch eine äquivalente Menge des Esters ersetzt wird, der eine Schutzgruppe, z.B. eine N-Benzyloxycarbonyl-, N-tert.-Butyloxycarbonyl-, N-o-Nitrophenylsulfenyl- oder N-2-(Diphenyl)isopropyloxycarbonylgruppe oder andere bekannte blockierende Gruppen trägt,

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findet die gleiche Kondensation statt, aber das gebildete Decapeptid enthält eine zusätzliche Schutzgruppe, die getrennt nach bekannten Verfahren entfernt werden kann oder nach dem im folgenden Beispiel beschriebenen Verfahren entfernt wird.

Beispiel 2

Das gleiche geschützte Decapeptid wie in Beispiel 1 (500 mg) wurde in ein aus einem Chlortrifluoräthylenpolymerisat der Handelsbezeichnung "KeI-F" (Hersteller Kellogg Co.) bestehendes Reaktionsgefäß des Typs gegeben, der von Sakakibara in Bull. Chem. Soc. Japan 40, 2164 (1967) beschrieben wird. Darauf wurde 1,0 ml Anisol zugesetzt. Diesem Gemisch wurden 10 ml Fluorwasserstoff, der über Kobalttrifluorid getrocknet worden war und als Flüssigkeit aus einem HF-Behälter bei -20⁰C entnommen wurde, zugegeben. Das Gemisch wurde 1 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen, überschüssiger Fluorwasserstoff wurde mit Stickstoffgas aus dem Reaktionsgefäß gespült. Das Reaktionsprodukt wurde fünfmal mit Äther extrahiert, um das Anisol zu entfernen. Die Ätherlösung wurde über Phosphorpentoxyd und Kaliumhydroxyd 16 Stunden getrocknet. Das Produkt wurde dann in Wasser und Essigsäure gelöst und einmal mit Äther extrahiert und filtriert. Das wäßrige Filtrat wurde eingedampft und das Produkt in Eisessig gelöst und gefriergetrocknet.

Das rohe synthetische Material wurde in 0,IN-Essigsäure gelöst. Die Lösung wurde der Gelfiltration durch "Sephadex G-15" unterworfen. Die der Hauptkomponente entsprechenden eluierten Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Eine Probe des gereinigten synthetischen Materials zeigte identische Diagramme bzw. Chromatogramme, wenn sie der zweidimensionalen Dünnschlchtelektrophorese-Chromatographie auf Cellulose-Dünnschichtplatten mit dem DUnnschicht-Elektrophoresesystem Pyridin-Essigsäure p., 6,5

und dem Dünnschichtchromatographie-Lösungsmittel n-Butanol/

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Essigsäure/Wasser 4:1:1 unterworfen wurde. Eine Probe dieses synthetischen Präparats zeigte biologische Aktivität» die derjenigen der besten Proben des natürlichen HormonSj über die bisher berichtet wurde, entsprach, ermittelt durch den Test auf Ascorbinsäureverarrnung der Ovarien ("ovarian ascorbic acid depletion assay) (Parlow-"Human Pituitary Gonadotropins", S. JOO, I96l, Springfield, Illinois) für LH und durch den äußerst spezifischen Biotest (Steelman und Pohley, Andocrinology, Bd. 53, S. 6o4, 1953) für PSH. Die vorstehend beschriebene Aufarbeitung kann nach beliebigen verschiedenen bekannten Methoden geändert werden. Beispielsweise können andere Typen von Gelfiltrationssystem, die Gegenstromverteilungsmethode, die Verteilungschromatographie, lonenaustauschchromatographie, Elektrophorese und Adsorptionschromatographie angewendet werden.

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Claims

22U689 Patentansprüche

1. Dae Decapeptid Pyro-Glu-His-(N^Im-X)-Trp-(0-R)-Ser-(0-R¹ )Tyr-Gly-Leu(N^w-R")Arg-Pro-Gly-NH₂, worin X, R, R¹ und R" Schutzgruppen sind, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen, die die Decapeptidkette Pyro-Glu-Hie-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NHg nicht nachteilig beeinflussen, entfernt werden können.

2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R und R¹ Benzylreste, R^M die Nitrogruppe und X ein Wasserstoffatom sind.

3. Verfahren zur Herstellung des Decapeptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man daa geschützte Nonapeptid His-(N^Im-X)Trp-(O-R)Ser-(O-R·)Tyr-Gly-Leu-(N^w-R")Arg-Pro-Gly-NH₂, worin X, R, R' und R" Schutzgruppen sind, die durch eine oder mehrere chemische Behandlungen, die die Aminosäurekette nicht nachteilig beeinflussen, entfernt werden können, mit einem aktiven Ester von Pyroglutaminsäure in Gegenwart eines inerten polaren Lösungsmittels bei einer Temperatur zwischen 0° und 30 C für eine Zeit von wenigstens einer Stunde umsetzt und das gebildete Decapeptid aus dem Reaktionegemisch isoliert.

4. Verfahren nach Anspruch 3* dadurch gekennzeichnet, daß im eingesetzten Nonapeptid R und R¹ Benzylreste sind, R" die Nitrogruppe und X ein Wasserstoffatom ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß als aktiver Ester von Pyroglutaminsäure der Pentachlorphenylester verwendet wird.

6. Verfahren nach Antoruch 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der aktive Ester J**· Pyroglutaminsäure in einem Überschuß von 50 bis 200$ über die äquimolare Menge des Nonapeptids verwendet wird.

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