DE2237204A1

DE2237204A1 - Diagnostisches reagenz zum nachweis des australien-antigens und verfahren zur durchfuehrung des nachweises

Info

Publication number: DE2237204A1
Application number: DE2237204A
Authority: DE
Inventors: John Michael Leach; Brian John Ruck
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1971-07-31
Filing date: 1972-07-28
Publication date: 1973-02-08
Also published as: NO135801C; FR2148081B1; BR7205058D0; NL163877B; IE36589L; NO138394B; NO138394C; IL39991A0; FI55408C; DK144988C; AU472607B2; ZA725257B; JPS4829487A; DK144988B; NL7210503A; AU4502072A; DE2237204B2; NL163877C; FR2148081A1; BE787014A

Description

FAT Ξ N TA N WÄ LT £ 22372

DR. ING. A. VAN DER WERTH DR. FRANZ LEDERER 21 HAMBURG 90 3 MÖNCHEN 80

WIS.STORFER STR. 33 · TEL. Ί04ΙΙΙ 57 00 61

Müchen, 18. Juli 1972 PLC.177

Pfizer Corporation, Calle 15 1/2, Avenida Santa Isabel, Colon

Panama

Diagnostisches Reagenz, zum Nachweis des Australien-Antigens und Verfahren zur Durchführung des Nachweises

Die Erfindung betrifft diagnostische Reagenzien zum .Nachweis eines für Hepatitis verantwortlichen Antigens, das auch als Hepatitis B-- Antigen oder Australien-Antigen "bekannt ist, oder zum Nachweis des entsprechenden Antikörpers in Blutproben. Die Erfindung betrifft insbesondere diagnostische Reagenzien, die

schnelle und zuverlässige Tests zum. Nachweis dieses Antigais oder seines Antikörpers ermöglichen, sowie die Testverfahren selbst und Reagenzpackungen zur Durchführung dieser Tests.

Das von Blumberg et al. entdeckte Australien-Antigen (J. Amer. Med. Assoc, .191 (1965) 541; Ann. Int. Med., 66 (1967) 924 ) ist im Blut eines sehr kleinen Bevölkerungsanteils vorhanden; jedoch ist sein Nachweis durch schnelle und verläßliche Methoden von größter Wichtigkeit, damit die Transfusion von dieses Antigen enthaltende Blut, die zur sog. Serumhepatitis beim Empfänger führen kann, vermieden wird. Diese Hepatitis, die auch nach langer Inkubationszeit auszubrechen vermag, kann ernsthafte

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und in einigen Fällen fatale Folgen haben. Es ist weiterhin wichtig, daß man den gegen das Australien-Antigen gerichteten Antikörper bei Menschen oder Tieren nachweisen kann, die sich eventuell mit dem Australien-Antigen infiziert oder immunisiert haben.

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Es besteht somit ein Bedürfnis für diagnostische Untersuchungsmethoden, die schnell und empfindlich sind, routinemäßig bei einer großen Anzahl von Blutproben wiederholt 'werden können, minimale Mengen an diagnostischen Reagenzien verbrauchen und verläßlich sind, d.h., die Untersuchungsmethoden müssen eine Bestimmung des Antigens (oder seines Antikörpers) in jeder Blutprobe (sowohl Vollblut als auch Serum oder Plasma), in der es enthalten ist, gestatten und dürfen gleichzeitig nur eine minimale Anzahl falscher Positivanzeigen erbringen, d.h., Ergebnisse, die fälschlicherweise die Anwesenheit des Antigens (oder des Antikörpers) anzeigen.

Erfindungsgemäß besteht ein diagnostisches Reagenz zum Nachweis des Australien-Antigens oder seines Antikörpers im wesentlichen aus einer wäßrigen Suspension aus fein verteilten, synthetischen Harzteilchen von im wesentlichen gleicher Form und Größe, die mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper bzw. mit dem Australien-Antigen selbst überzogen sind. Vorzugsweise handelt es sich bei den Teilchen um kugelförmige Polystyrolteilchen mit einem Durchmesser von etwa 0,81 u. Es sind jedoch auch Teilchen aus Polystyrol oder anderen synthetischen Harzen, z.B. Acrylharzen, mit gleichmäßigen Abmessungen von 0,3 bis 2,0 u geeignet.

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Der gegenüber dem Australien-Antigen spezifische Antikörper wird vorzugsweise aus Serum gewonnen, das von Säugern, z.B. von Menschen,.Schafen, Ziegen oder Meerschweinchen, die den Antikörper enthalten oder mit hochgereinigtem Australien-Antigen aus menschlichem Blut immunisiert worden sind, erhalten wird. Das Antiserum wird gereinigt, um restliche, gegen; Humanserumproteine gerichtete Antikörper sowie andere Substanzen zu entfernen, die die Verwendung der diagnostischen Reagenzien zum Nachweis des Australien-Antigens stören würden.

Das Australien-Antigen selbst wird aus Serum hergestelltρ das von Menschen, deren Blut das Antigen enthält, gewonnen wird_e Das Antigen wird aus dem Serum extrahiert und gereinigt, so daß keine bestimmbaren Serumproteine oder andere Komponenten zurückbleiben, die bei der Verwendung der diagnostischen Reagenzien zur Bestimmung des gesgen das Australien-Antigen gerichteten Antikörpers stören könnten.

Die wäßrige Suspension enthält vorzugsweise etwa 0_s5 Prozent (Gewicht/Volumen) der Harzteilchen, könnte jedoch auch 0,1 bis 3 Prozent (Gewicht/Volumen) der Harzteilchen enthalten. Zur Herstellung der diagnostischen Reagenzien für das Australien-Antigen enthält die Suspension vorzugsweise etwa 0,05 Prozent (Gewicht/ Volumen) des entsprechenden Antikörpers, der an den Harzteilchen adsorbiert ist. Nach.Maßgabe der Konzentration der Teilchen läßt sich dies jedoch auch variieren. Der Anteil der Antikörper soll gerade ausreichend sein, um eine Autoaggregation der Harzteilchen zu verhindern. I¹Ur kugelförmige Polystyrolteilchen mit 0,81 ju Durchmesser beträgt der Anteil etwa ein Zehntel des

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Gewichts der Teilchen. Es zeigt sich, daß bei einem Anteil von weniger als 1/20 des Gewichts der 0,81 μ - Harzteilchen Autoaggregation stattfindet. Anteile von über etwa ein Zehntel führen zu einer Erniedrigung der Sensibilität des diagnostischen Reagenz', wenn dieses zum Nachweis der Anwesenheit dee Antigens verwendet wird. Es können jedoch auch Anteile von bis zum Doppelten des Gewichts der 0,81 ja - Harzteilchen verwendet werden.

Die Suspension enthält vorzugsweise einen Stabilisator, der nach der Adsorption des Antigens oder des Antikörpers an die Teilchen zugesetzt wird, z.B. ein inertes Protein, wie Serumalbumin, in einer Konzentration von z.B. 0,1 Prozent (Gewicht/Volumen). Es kann auch ein Konservierungsmittel, wie Natriumazid, in einer Konzentration von 0,1 Prozent (Gewicht/Volumen) anwesend sein.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält das diagnostische Reagenz auch normales Serum (d.h. Serum, das weder den für das Australien-Antigen spezifischen Antikörper noch das Australien-Antigen selbst enthält), das von den gleichen Säugerarten gewonnen wird, aus denen auch das den Antikörper oder das Antigen enthaltende Serum erhalten worden ist. Die Gegenwart von normalem Serum verringert beträchtlich die Anzahl der falschen positiven Ergebnisse, wenn das diagnostische Reagenz zur Bestimmung des Australien-Antigens (oder des Antikörpers) in Blutproben verwendet wird. Vorzugsweise ist in 20 bis 50, z.B. 35, Volumteilen der wäßrigen Suspension der Harzteilchen, die mit dem Antikörper oder dem Antigen überzogen sind, etwa 1 Teil normales, Serum enthalten.

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Das erfindungsgemäße Reagenz zum Nachweis des Australien-Antigens oder des Antikörpers kann so hergestellt werden, daß man eine Suspension der Harzteilchen, in geeigneter Weise verdünnt und gegebenenfalls filtriert, zu einer zweckmäßig verdünnten Lösung oder Suspension des gereinigten Antikörpers "bzw. Antigens hinzu- ' fügt und "bei Raumtemperatur solange rührt, "bis die Adsorption des Antikörpers oder Antigens an den Teilchen vollständig ist. Anschließend können Serumalbumin, normales Serum von denjenigen Säugetierarten, aus denen der Antikörper oder das Antigen erhalten worden ist (zur Vereinfachung der Handhabung gegebenfalls in ' verdünnter Form), sowie Natriumazid in geeigneten Mengen hinzugegeben werden. Es ist insbesondere wichtig, daß man die Suspension der Harzteilchen zu der Lösung oder Suspension des Antikörpers oder Antigens hinzufügt und nicht umgekehrt verfährt, da in letzterem Fall eine irreversible Autoaggregation der Harzteil·» ohen stattfinden kann.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis des'Australien-Antigens oder seines Antikörpers wird eine Testprobe Serum, Plasma oder Vollblut, gegebenenfalls mit einem wäßrigen Verdünnungsmittel vermischt, mit einem geeigneten (z.B. dem gleichen) Volumen des erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenz'.zum Nachweis des Australien-Antigens bzw. des Antikörpers vermischt. Das Vermischen wird mindestens 2 Minuten , vorzugsweise 5 bis 10 Minuten, fortgesetzt. Ist in der Testprobe das Australien-Antigen (oder der Antikörper hierzu) vorhanden, so findet eine Agglutination der Harzteilchen, z.B. der Polystyrolteilchen, unter Bildung sichtbarer Agglomerate statt. Werden innerhalb von 5 Minuten keine Agglomerate sichtbar, so bedeutet

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dies die Abwesenheit des Australien-Antigens (oder des Antikörpers hierzu) in der Testprobe.

Bei einer anderen erfindungsgemäßen Testmethode zum Nachweis des gegen das Australien-Antigen wirksamen Antikörpers wird die Testprobe mit einem Standardvolumen einer gereinigten Lösung oder Suspension des aus menschlichem Blutplasma gewonnenen Australien-Antigens gerührt. Nach der Zugabe des diagnostischen Reagenz¹ für das Australien-Antigen wird das Gemisch für eine ähnliche Zeitdauer gerührt. Die Agglutination,der Harzteilchen zeigt dann die Abwesenheit des Antikörpers in der Testprobe an. Findet innerhalb von 5 Minuten keine Agglutination der Harzteilchen statt, so be-r deutet dies die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe, wobei dieser Antikörper mit dem zugesetzten Antigen reagiert hat und auf diese Weise die anschließende Agglutination der Harzteilchen durch das Antigen gehemmt hat.

Wie bereits erwähnt, enthält das diagnostische Reagenz zum Nachweis des Antigens bzw. Antikörpers vorzugsweise normales Serum von den gleichen Säugerarten, wie diejenigen, aus denen der Antikörper oder das Antigen erhalten worden sind. Dies ist bei der Durchführung des Tests zum Nachweis des Antigens besonders wichtig, um die Anzahl der falschen Positiv anzeigen möglichst gering zu halten. Wird z.B. dem diagnostischen Reagenz, das den aus Meerschweinchen-Antiserura erhaltenen Antikörper enthält, kein normales Meerschweinchen-Serum einverleibt, so findet bei etwa 10 Prozent derjenigen Humanseren , die kein Australien-Antigen enthalten, eine Agglutination der Harztcilchen statt, die den gegen das Australien-Antigen gerichteten Antikörper adsorbiert

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enthalten. Dies ist vermutlich auf die Anwesenheit von Substanzen in solchen Humanseren zurückzuführen, die mit anderen Verbindungen reagieren, die von dem Meerschweinchen-Antiserum herrühren, aus dem der gegen das Australien-Antigen gerichtete Antikörper erhalten worden ist. Ist das normale Meerschweinchen-Serum jedoch enthalten, so findet nur bei etwa 1 bis 3- Prozent der Humanseren eine Agglutination der Harzteilchen in Abwesenheit des Australien-Antigens im Serum statt. Dies kann auf Bestandteile im normalen Meerschweinchen-Serum zurückzuführen sein, die mit solchen Substanzen in Humanseren reagieren können und auf diese Weise ihren auslösenden Effekt für die Agglutination der Harzteilchen zu verhindern vermögen.

Zur Erzielung des gleichen Zwecks muß das normale Serum nicht im diagnostischen Reagenz enthalten sein, sondern kann auf andere Weise mit der Testprobe in Berührung gebracht werden. Das normale Serum kann z.B. mit der Testprobe vor dem Vermischen des diagnostischen Reagenz* mit letzterer vermischt werden. Die Testprobe kann auch unter Verwendung eines Rührers gerührt werden, der mit den Eeststoffen aus dem normalen' Serum überzogen worden ist, z.B. indem man -ihn in das normale Serum eingetaucht und anschließend den Überzug zur.Trockne eingedampft hat. Die Testprobe kann auch auf eine Oberfläche aufgebracht werden, die in ähnlicher Weise mit den Feststoffen aus dem normalen Serum überzogen v/orden ist, z.B. auf die Oberfläche einer Glas- oder Kunststoffplatte.

Besteht die Testprobe aus Vollblut, so muß zunächst eine Behandlung zur Auflösung der Zellen und zur Verhinderung der Koagulation erfolgen, bevor die Probe auf die Anwesenheit des Australien-

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Antigens oder des entsprechenden Antikörpers geprüft werden kann. Für diesen Zweck kann die Probe mit einem wäßrigen Verdünnungsmittel behandelt werden, das ein nichtionogenes Netzmittel vom Typ der polyoxyäthylierten Alkylphenole, z.B. Isooctylphenoxypolyoxyäthyläthanol (Triton X-100, Herst. Rohm & Haas Co.), sowie Natriumeitrat enthält.

Handelt es sich bei der Testprobe um Blutplasma, so muß dieses ein Antikoagulans ,, z.B. ein beliebiges Standard-Antikoagulans , wie Natriumeitrat, enthalten. Es ist auch vorteilhaft, die Probe mit dem gleichen wäßrigen Verdünnungsmittel, das ein nichtionogenes Netzmittel wie für das Vollblut enthält, zu behandeln, um jegliche hierin enthaltenen restlichen Zellen aufzulösen.

Eine geeignete Reagenzpackung zur Durchführung der erfindungsgemäßen Tests zum Nachweis des Australien-Antigens oder des entsprechenden Antikörpers besteht vorzugsweise aus einer Reagenzampulle, die eine geeignete Menge des erfindungsgemäßen diagnostischen Reagenz¹ enthält, und einer Reagenzampulle, die eine ähnliche Menge einer Verdünnungslösung enthält, die ein Auflösungsmittel zusammen mit einem Antikoagulans zur Auflösung und Verdünnung der Testproben aus Vollblut und Plasma enthält. Die Packung kann auch schwarze Plättchen aus Glas oder Kunststoff enthalten, auf denen die Tests durchgeführt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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A. Herstellung der diagnostischen Reagenzien Beispiel 1

Eine 40-prozentige (Gewicht/Volumen) wäßrige Suspension aus Poly» styrolkügelchen von 0,81 ja (Hersteller Styrene Products Limited; Produkt Nr. 24 016; vertrieben durch BDH Chemicals limited) wird auf 5 Prozent (Gewicht/Volumen) mit einer boratgepufferten Salzlösung verdünnt und durch eine Membran mit 1,2 ja Porengröße filtriert. Die Suspension wird anschließend sofort zu 9 Volumteilen von gereinigtem Meerschweinchen-Antiserum, das den gegen das Australien-Antigen.gerichteten Antikörper enthält (verdünnt auf 0,05 Io Gewicht/Volum en) hinzugefügt und 30 Minuten gleichmäßig gerührt. Nach der Zugabe von 1 Volumteil Rinderserumalbumin (1 i» Gewicht/Volumen) wird schließlich mit Natriumazid versetzt, so daß man eine Konzentration von 0,1 % (Gewicht/Volumen) in dem Endprodukt erhält. Das Produkt wird bei 4⁰C gelagert, wobei es mindestens 3 Monate stabil ist.

Beispiel' 2

Eine 40-prozentige (Gewicht/Volumen) Suspension der gleichen PoIystyrolkügelchen wie in Beispiel 1 wird auf 5 i° mit glycingepufferter Salzlösung verdünnt und durch Zusa-tz von /5 -Propiolacton unter pH-Kontrolle sterilisiert. Die Suspension wird dann zu 9 Volumteilen eines zweckmäßig verdünnten, gereinigten Meerschweinchen-Serums von mit dem Australien-Antigen immunisierten Tieren hinzugefügt. Die Zugabe der Polystyrolsuspension erfolgt langsam unter Rühren und das Rühren wird 30 Minuten fortgesetzt. Die PoIy-

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styrolkügelchen werden zentrifugiert, einmal auf der Zentrifuge mit gepufferter Salzlösung gewaschen und zu dem ursprünglichen Volumen in gepufferter Salzlösung erneut suspendiert.^JNach Zugabe von Rinderserumalbumin (1 $, Gewicht/Volumen) zur Stabilisierung ■der Suspension der Polystyrolkügelchen wird das Rühren 30 Minuten fortgesetzt. Nach Zugabe von 1/10 Volumteil verdünntem, normalem Serum von nicht-imraunisierten Meerschweinchen (verdünnt 1 : 3,5 mit glycingepufferter Salzlösung) wird das Gemisch erneut 30 Minuten gerührt. Schließlich wird das Gemisch heftig geschüttelt, um jegliche Teilchenagglomerationen zu zerteilen* Alle verwendeten Lösungen werden durch Filtration sterilisiert und enthalten 0,1 % Natriumazid als Konservierungsmittel. Das Produkt wird bei 4⁰C gelagert, wobei es mindestens 3 Monate stabil ist.

Die Eignung einer Charge des diagnostischen Reagenz¹ wird so überprüft, daß man eine Reihe von mindestens 50 Humanseren, die verschiedene bekannte Titer an Australien-Antigen aufweisen, testet. Diese Eignung wird verglichen mit der Eignung von Standardtests zum Nachweis des Australien-Antigens (Geldiffusion und Gegenstrom-Immunoelektrophorese), wobei ebenfalls unter Verwendung der 50 Proben getestet wird. Die Prüfung sollte mindestens die gleiche Empfindlichkeit ergeben. Die Selektivität ist gegeben, wenn bei mindestens 100 Humansera- und-blutproben, die kein Australien-Antigen enthalten, nicht mehr als 3 °fa der Proben eine Reaktion ergeben.

Die in den Beispielen 1 und 2 verwendeten gereinigten Meerschweinchen-Antiseren werden wie folgt hergestellt:

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Meerschweinchen v/erden mit Australien-Antigen immunisiert, das in gereinigter Form aus Humanplasma durch isopyknisch.es ""banding" in einem Caesiumchlorid- oder Kaliumbromidgradient in einer "zonal centrifuge" und anschließendes "rate zonal centrifugation" in einem Saccharosegradient erhalten worden ist. Einer primären Immunisierung mit Antigen in Freunds vollständigem Hilfsstoff (complete adjuvant") in die Fußballen schließen sich zwei intraperitoneale Impfungen mit Antigen ohne Hilfsstoff an. Nach dem Vereinigen der aus den Meerschweinchen erhaltenen Seren werden restliche, gegen Humanserumproteine gerichtete Antikörper gegebenenfalls dadurch entfernt, daß man das Antiserum mit unter Verwendung von Äthylchloröformiat polymerisiertem normalem Humanserum in Berührung bringt. Das Serum wird anschließend durch Ausfällung mit 14-prozentigem wäßrigem Natriumsulfat gereinigt, gegen wäßrige, phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert und gegebenenfalls zur Zerstörung von Komplement 30 Minuten auf 56 G erhitzt. Hierauf wird Natriumazid (0,1 $) als Konservierungsmittel zugegeben. Bei der Verwendung zur Herstellung des diagnostischen Reagenz'wird das Antiserum zweckmäßig verdünnt. Die optimale Verdünnung wird so bestimmt, daß man kleine Ansätze des diagnostischen Reagenz' mit verschiedenen Verdünnungen des Antiserums herstellt und diese gegen eine Reihe von Humansera prüft, die Australien-Antigen enthalten. Diejenige Verdünnung, die nach dem Aufbringen auf Harzteilchen das beste Testergebnis zeigt, wird zur Herstellung des diagnostischen Reagenz' ausgewählt. Normalerweise' liegt die optimale Verdünnung zwischen 1 : 20 und 1 : 100.

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- 12 B. Testmethoden zum Nachweis von Australien-Antifren .

Beispiel 3

1 Tropfen (etwa 25 ul) einer Testprobe Humanserum wird auf einem Objektträger mit einem ähnlichen Tropfen von verdünntem (1 : 20) normalem Meerschweinchenserum versetzt. Dann wird mit einem kleinen Holzstäbchen einige Sekunden vorsichtig gerührt. Nach Zugabe eines Tropfens des gemäß Beispiel 1 hergestellten diagnostischen Reagenz¹ wird das Gemisch mit dem Holzstäbchen gerührt, bis der Durchmesser des Tropfens etwa 2 cm beträgt. Der Objektträger wird dann auf einer schwarzen Platte 2 Minuten vorsichtig hin- und hergeschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt sich bei einer Australien-Antigen enthaltenden Serumprobe eine bestimmte Agglutination, während eine stark positive Probe innerhalb von 15 bis 30 Sekunden zu einer Agglutination mit den Polystyrolteilchen führt. Negative Seren erzeugen innerhalb von 2 Minuten keine sichtbare Agglutination.

Beispiel4

1 Tropfen (40 ul) einer Testprobe Humanserum wird auf einer schwarzen Glas(oder Kunststoffplatte mit einem Tropfen des gemäß Beispiel 2 hergestellten diagnostischen Reagenz¹ versetzt. Das Gemisch wird mit einem kleinen Holzstäbchen gerührt, bis der Durchmesser des Tropfens etwa 2 cm beträgt. Die Platte wird dann 5 Minuten vorsichtig hin- und hergeschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt eine Australien-Antigen enthaltende Serumprobe eine bestimmte Agglutination, während eine stark positive Probe iruu:r-

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ORiQtNAL

halb von 15 bis 30 Sekunden zu einer Agglutination mit den Polystyrolteilchen führt. Negative Seren erzeugen innerhalb von 5 Minuten keine sichtbare Agglutination.

'Beispiel. 5

1 Tropfen (etwa 40 μΐ) menschliches venöses Blut oder kapillares Blut aus der Fingerspitze wird in ein Röhrchen gegeben, das 200 ul eines Verdünnungsmittels folgender Zusammensetzung enthält; 0,1 fo Trinatriumcitrat, 0,1 % Natriumazid und 0,02 $ nichtionogenes Netzmittel (Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol, Triton X-100, Herst, Rohm & Haas Co.) in destilliertem Wasser. Nach dem Vermischen durch vorsichtiges Schütteln und 10-minütigem Stehenlassen zur Zerstörung der in dem Blut enthaltenen Zellen werden 2 Tropfen des Gemisches zusammen auf eine schwarze Glas(oder Kunststoff)-platte gegeben. Nach Zugabe eines Tropfens des gemäß Beispiel 2 hergestellten diagnostischen Reagenz' v/ird der in Beispiel 4 beschriebene Test durchgeführt.

Beispiel 6

Etwa 50 W.1 Verdünnungsmittel (Zusammensetzung wie in Beispiel 5) werden auf einer schwarzen Glas(oder Kunststoff)platte mit 20 ul Blut (venöses oder kapillares Blut) versetzt. Nachdem Blut und Verdünnungsmittel mit einem Holzstäbchen gerührt worden sind, läßt man-das Gemisch 5 bis 10 Minuten stehen, um eine vollständige

von j Tropfen zu gewährleisten«'Nach Zugabefdes gemäß Beispiel 2

hergestellten diagnostischen Reagenz¹ wird der in Beispiel 4 beschriebene Test durchgeführte

ORIGINAL INSPECTED

- 14 Beispiel 7

Blutproben, die beliebige Standard-Antikoagulantia, z.B. Citrat, enthalten, v/erden zentrifugiert, um die Hauptmenge der Zellen zu entfernen. Die von den abgesetzten Zellen abgetrennten Plasmen werden nach den Methoden der Beispiele 5 oder 6, genau wie für Vollblut, auf Australien-Antigen getestet.

Bei der Durchführung einer Testreihe gemäß den Beispielen 3 "bis 7 ist es von Vorteil, in jeder Testreihe für Vergleichszwecke ein bekanntes Positivserum bzw. Negativserum zu verwenden.

C. Testmethoden für den Nachweis des gegen Australien-Antigen gerichteten Antikörpers

Beispiele

Eine Anzahl von zweifach-Verdünnungen eines bekannten,Australien-Antigen enthaltenden Humanserums wird unter Verwendung von Normalhumanserum (d.h. frei von Australien-Antigen oder Antikörper hierauf als Verdünnungsmittel hergestellt. 1 Tropfen jeder dieser Verdünnungen wird mit dem diagnostischen Reagenz des Beispiels getestet. Die höchste Verdünnung, bei der noch eine maximale Agglutination stattfindet, wird bestimmt. Diese Verdünnung wird für den Test verwendet. 1 Tropfen (40 jal) einer Testprobe Humanserum wird auf einer schwarzen Glas( oder Kunststoffplatte mit 1 -Tropfen (40 ül) der ausgewählten Verdünnung des Antigen-enthaltenden Serums versetzt; die Tropfen werden mit einem HoIzstäbchtn vermischt. Man läßt 5 Minuten stehen, um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu ermöglichen, fügt 1 Tropfen (40 μΐ) des

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gemäß Beispiel 1 hergestellten diagnostischen Reagenz¹ hinzu und mischt kurz mit einem Holzstäbchen. Dann wird die Platte vorsichtig 5 Minuten hin- und hergeschüttelt. Zu dieser Zeit hat eine Agglutination stattgefunden, wenn das Testserum keinen Antikörper enthält. Findet keine Agglutination statt, so zeigt dies die. Anwesenheit des Antikörpers im Testserum an. Für Vergleichszwecke wird vorzugsweise ein Simultantest unter Verwendung eines Tropfens eines bekannten Serums durchgeführt, das frei von Austra* lien-Antigen oder des Antikörpers hierzu ist. Hierbei muß eine starke Agglutinationsreaktion auftreten.

Der Antikörpertiter in jedem Testserum kann so "bestimmt werden, daß man den Test, wie oben beschrieben, mit einer 2-fach-Verdünnung des Testserums in normalem Serum durchführt. Der Endpunkt ist gegeben durch die höchste Verdünnung des Testserums,. die keine Agglutination mit dem diagnostischen Reagenz nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Test ergibt.

Patentansprüche

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Claims

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D —

Patentansprüche

Diagnostisches Reagenz zum Nachweis des Australien-Antigens oder des Antikörpers hierzu, im wesentlichen "bestehend aus einer wäßrigen Suspension aus fein verteilten, synthetischen Harz teilchen von im wesentlichen gleichmäßiger Form und Größe, die mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper "bzw. mit dem Australien-Antigen selbst überzogen sind.
2. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich- , net, daß die Harzteilchen gleichmäßige Abmessungen von 0,3 bis 2,0 u besitzen.
3. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Harzteilchen aus Polystyrol bestehen.
4. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß die Harzteilchen kugelförmige Polystyrolteilchen mit einem Durchmesser von etwa 0,81 u sind.
5. Diagnostisches Reagenz zum Nachweis des Australien-Antigens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Harzteilchen mit dem Antikörper überzogen sind, der aus , dem Serum von Meerschweinchen, die mit hochgereinigtem Australien-Antigen aus Humanblut immunisiert worden sind, hergestellt worden ist.
6. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß das Serum, aus dem der Antikörper erhalten worden iat, frei von restlichen, ^o^c.-n Iiumarirjerumprotoi.no ijerichlotca Antikörpern ist.

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7. Diagnostisches Reagenz nach einem der vorhergehenden An- Sprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension 0,1 bis ' 3 Prozent (Gewicht/Volumen) der Harzteilchen enthält.
8. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension etwa 0,5 Prozent (Gewicht/Volumen) der Harzteilchen enthält.
9. Diagnostisches Reagenz zum Nachweis des Australien-Antigens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des auf den Harzteilchen adsorbierten Antikörpers gerade so hoch ist, daß eine Autοaggregation der Teilchen verhindert wird.
10. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Harzteilchen aus kugelförmigen Polystyrolteilchen, mit einem Durchmesser von etwa 0,81 u bestehen und das Gewicht des auf diesen Teilchen adsorbierten Antikörpers mindestens etwa 1/20 und weniger als das Doppelte des Gewichts der Teilchen beträgt. ·
11. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewicht des auf den Teilchen adsorbierten Antikörpers etwa 1/10 des Gewichts der Teilchen beträgt.
12. Diagnostisches Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension auch ein inertes Protein als Stabilisator enthält.
13«. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator ein Serumalbumin ist„

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14. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daC das Serumalbumin Rinderserumalbumin ist.
15. Diagnostisches Reagens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension auch ein Konservierungsmittel enthält.
16. Diagnostisches Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Konservierungsmittel Natriumazid ist.
17. Diagnostisches Reagenz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension auch normales berum, wie hier beschrieben enthält, das- von den gleichen Säugerarten herrührt, wie diejenigen,von &nen das den Antikörper oder das Antigen enthaltende Serum erhalten worden ist.
18. Diagnostisches Reagenz nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension etwa 1 Volumteil des normalen Serums pro 20 bis 50 Teile der Suspension enthält.
19. . Verfahren zur Herstellung eines diagnostischen Reagenz' gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension der Harzteilchen zu einer Lösung oder Suspension des gereinigten Antikörpers oder Antigens hinzufügt, das Gemisch bei Raumtemperatur rührt, bis die Adsorption des Antikörpers oder Antigens an den Harzteilchen vollständig ist und das erhaltene Gemisch gegebenenfalls mit dem Stabilisator, normalem Serum und Konservierungsmittel versetzt.

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20. Verfahren zur Prüfung der Anwesenheit des' Australien-Antigens oder des Antikörpers hierzu in einer Blut-Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testprobe mit einem geeigneten Volumen einer wäßrigen Suspension vermischt, die fein verteilte, synthetische Harzteilchen von im wesentlichen gleichmäßiger Form und Größe, überzogen mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper bzw. dem Australien-Antigen selbst, enthält, und das Vermischen mindestens 2 Minuten fortsetzt, wobei das Auftreten sichtbarer Agglomerate die Anwesenheit des Antigens bzw. des Antikörpers in der Testprobe anzeigt.
21. Verfahren nach Anspruch2O» dadurch gekennzeichnet, daß die Testprobe während des Mischens mit normalem Serum, wie hier beschrieben, in Berührung gebracht wird.
22. Verfahren nach Anspruch^., dadurch gekennzeichnet, daß das normale Serum in der Suspension der Harzteilchen enthalten ist.
23. Verfahren nach Anspruch 22» dadurch gekennzeichnet, daß das normale Serum mit der Testprobe vermischt' wird, bevor das Vermischen der Testprobe mit der Suspension der Harzteilchen erfolgt.
24. Verfahren nach Anspruch"22, dadurch gekennzeichnet, daß die Testprobe mit einem Rührer gerührt wird, der mit den Feststoffen aus dem normalen Serum überzogen worden ist.

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25. Verfahren nach Anspruch22, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Testprobe auf einer Oberfläche befindet, die mit den Feststoffen aus narmalem Serum überzogen worden ist.
26. Verfahren zur Prüfung der Anwesenheit des gegen Australien-Antigen gerichteten Antikörpers in einer Blut-Testprobe, dadurch gekennzeichnet, daß man die Testprobe mit einem Standafdvolumen einer gereinigten Lösung oder Suspension des aus Humanblutpläsma gewonnen Australien-Antigens versetzt, hierzu ein geeignetes Volumen einer wäßrigen Suspension aus fein verteilten, synthetischen Harzteilchen von im wesentlichen gleichmäßiger Form und Größe, die mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper überzogen sind, hinzufügt und mindestens 2 Minuten mischt, wobei das Nicht-Auftreten von Agglomeraten innerhalb von 10 Minuten die*Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe anzeigt.
27. Verfahren nach Anspruch 20 bis 26 zur Prüfung von Vollblut oder Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß die Testprobe zunächst mit einer Lösung verdünnt wird, die ein Auflösungsmittel und ein Antikoagulans enthält.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Auflösungsmittel ein nichtionogenes polyoxyäthyliertes Alkylphenol-Netzmittel ist.
29. Verfahren nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, daß das Antikoagulans Natriumeitrat ist.

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