DE2128640A1

DE2128640A1 - Verfahren zum nachweis von enzymen in roten blutzellen

Info

Publication number: DE2128640A1
Application number: DE19712128640
Authority: DE
Inventors: Ernest Dr Beutler
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1971-06-09
Filing date: 1971-06-09
Publication date: 1973-01-04

Description

Verfahren zum Nachweis von Enzymen in roten Blutzellen Sie erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Enzymen in roten Blutzellen in Blutproben, Es handelt sich dabei um ein neuartiges Verfahren zur Mengenuntersuchung zum Zwecke des Nachweises von Enzymmangel, der rote Blutzellen betrifft.
In der Vergangenheit sind bereits verschiedentlich Farbstoffe dazu herangezogen worden, Enzymmangel aufzudecken. So erfolgt beispielsweise der nachweis eines Mangels an glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase mittels einer Entfärbungstechnik, die jedoch unter anäroben Bedingungen stattfinden muß. Anirobe Bedingungen sind jedoch schwierig aufrechtzuerhalten und für Nengenuntersuchungen ungeeignet. Andere Untersuchungen erfordern frische Blutproben oder die Trennung des Hämoglobins von dem enzym oder ein spezielles Papier.
Wenn als Enzymmangel ein Mangel an Galactose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase vermutet wird, kommt auch Methylenblau (ils Rezeptorfarbstoff zur Anwenüung. Auch hier werden jedoch .mirobe Bedingungen nach dem Gasen mit Kohlenmonoxyd erforderlich. Die sich abwickelnde Reaktion ist etwas lichtempfindlich und es ist notwendig, für die Untersuchung ein illuminiertes Wasserbad zu verwenden.
Piir die Untersuchung des r,angels in Glutathionreduktase sind dem Anmelder derzeit keine Meßverfahren bekannt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, ein einfaches Verfahren zum Nachweis von Enzymen in roten Blutzellen vorzuschlagen, das-eine Mengenuntersuchung erlaubt, und unter denkbar einfachen Verfahrensbedingungen, z.B. bei Zimmertemperatur und mit einer geringen Blutmenge, durchgeführt werden kann. Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung ein Verfahren vor, bei dem ein Teil der Blutprobe mit 5 bis 20 Teilen einer gepufferten wassrigen Lösung, die ein für das festzustellende Enzym spezifisches Enzymsubstrat, ein hämolysierendes Mittel und ein Pyridinnukleotid in oxydiertem oder reduziertem Zustand enthält, zur Reaktion gebracht wird und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligen UV-Licht bestrahlt wird, wobei bei Vorhandensein eines gesuchten Enzyms in der Blutprobe, das. das Pyridinnukleosid in den reduzierten Zustand überftUirt, eine anhaltende Fluoreszenz der getrockneten Testlösung auftritt, während eine solche bei Vorhandensein eines Enzyms, das das Pyridinnukleotid in oxydierten Zustand überführt, unterbleibt.
Bei einem Fehlen einer Fluoreszenz wird somit angezeigt, daß ein angel an dem gesuchten Enzym in der Blutprobe vorliegt Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Enzymen ist außerordentlich einfach, da es weder anärobe Bedingungen noch frische Blutproben erfordert, lediglich eine sehr kleine Menge einer Blutprobe notwendig macht und bei Zimmertemperatur oder bei 370C durchgeführt werden kann. Darüberhinaus ist das Ergebnis sehr leicht zu interpretieren.
j)a erfindungsgemäße Verfahren umfaßt eine völlig neuartige prozedur zum Nachweis verschiedenartiger Enzymdefekte in roten Blutzellen. Die zu untersuchende Probe, die entweder aus Blut selbst oder allein aus den roten Blutzellen besteht, wird einer Xeaktionsmischung zugegeben, die Pyridinnukleotid, einen Puffer, ein hämolysierendes Mittel und ein Enzymsubstrat enthält. Je nach der Art des Anzyms, dessen Mangel untersucht werden soll, liegt das Pyridinnukleotid in der Reaktionsmischung entweder in reduzierter oder oxydierter Form vor.
Die Testlösung wird in Fleckenform auf gewöhnliches Filterpapier, unmittelbar als Basis oder als Kontrollfleck aufgebracht, und zwar in verschiedenen Zeitabständen. Die Testlösung kann bei Raumtemperatur gehalten oder bei 3700 inkubiert werden. Wenn die Flecken auf dem Filterpapier eingetrocknet sind, werden sie mit langwelligem UV-Licht, vorzugsweise mit einer Wellenlänge von 340 bis 370 Millimikron bestrahlt.
Flecken, die das reduzierte Pyridinnukleotid enthalten, entfalten eine anhaltende Fluoreszenz unter langwelligem ultraviolettem Licht. Die Fluoreszenz bleibt mehrere Tage lang bei Raumetemeratur stabil. Wenn in der Reaktionsmischung reduziertes l'yridinnukleotid verwendet wird und dieses in der sich ergebenden Testlösung oxydiert wird, tritt ein Verlust an Fluoreszenz auf, da das oxydierte iyridinnukleotid unter der L'inwirkung von langwelligem ultraviolettem Licht nicht fluoresziert.
Insbesondere lassen sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren das Vorhandensein bzw. der Mangel in roten Blutzellen an Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, anschließend abgekürzt als G-6-1>D, "yruvat-Kinase, anschließend abgekürzt als PK, Glutation-Reduktase, anschließend als GSSG-R, und Galactose-1 -Phosphat-Uridyl-Transferase, anschließend abgekürzt mit Transferase, nachweisen.
Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich einfach an die Untersüchung vieler anderer Enzymabnormalitäten anpassen, wie z.ß. an den Mangel an Phosphoglukonik-Dehydrogenase und Triose-Phosphat-ISomerase.
Theoretisch kann mittels des erfindungsgemä.ßen Verfahrens jeder Enzymmangel, der eine Reduktion von Pyridinnukleotid oder eine Oxydation von reduziertem Pyridinnukleotid in einer Testlösung zur Folge hat, nachgewiesen werden. Die genaue Diagnose von Störungen im Gesundheitszustand, die aus derartiges Enzymmangel resultieren, ist von großem medizinischem Wert, sowohl vom Standpunkt einer genetischen Beratung aus als auch im Hinblick auf die zu wählende Therapie.
Alle diese Enzyme mittels bisher bekannter Verfahren nachzuweisen, ist außerordentlich teuer, zeitaufwendig und erfordert darüberhinaus kostspielige und spezialisierte Laboreinrichtungen und -möglichkeiten. Der Bedarf nach einem einfachen und schnell durchzuführenden Verfahren, das die häufigeren Enzymmängel in roten Blutzellen voneinander differenliest, kann daher kaum bezweifelt werden. Die spezielle, der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe liegt somit darin, ein Verfahren zum Nachweis von G-6-1'D, GSSG-R, PK und Transferase in roten Blutzellen zu entwickeln.
Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand einiger Beispiele näher erläutert.
Für alle Untersuchungen wird im wesentlichen die gleiche Verfahrensweise eingehalten. Im allgemeinen wird ein Teil an Blut oder nn einer Suspension roter Blutkörperchen, gewöhnlich 0,02ml zu 10 Teilen der Reaktionsmischung, gewöhnlich 0,2 ml, augegeben. Unrnittelbar nach dieser Zugabe knn ein leck der daraus resultierenden Testlösung auf Filterpapier als Kontroll-oder Basisfleck gemacht werden. Nach nachfolgend noch näher angegebenen Inkubationsintervallen in der Testlösung werden weitere Flecken der Testlösung auf das Filterpapier aufgebracht. Nach dem Bintrocknen dieser Flecken wird das Filterpapier in einem abgedunkelten Raum unter einer Lichtquelle für langwelliges UV-Licht inspiziert.
Der Nachweis des Enzymmangels bzw. des Enzyms beruht auf der Tatsache, daß bereits relativ geringfügige Mengen an reduziertem Pyridinnukleotid intensiv unter der Einwirkung von langwelligem UV-Licht bei einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron fluoreszieren.
Bei dem Nachweis eines G-6-PD- oder eines Transferase-Mangels beruht die Testwirkung auf der Reduktion des Pyridinnukleotids. beim Nachweis des Mangela an PK oder GSSG-R beruht die Testwirkung auf der Oxydation des reduzierten l'yridinnukleotids.
Obwohl bei Gegenwart von Hämoglobin im Blut eine gewisse Fluoreszenzunterdrückung auftritt, wird diese Unterdrtickung durch zwei Effekte auf ein Minimum herabgesetzt. In erster Linie trägt hierzu bei, daß die erregende Uv-Wellenlänge, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, unterhalb des maximalen Absorptionsbandes von Hämoglobin liegt, welches der Soret-Bereich ist. Hinzu kommt, daß das Emissionsmaximum in dem erfindungsgemäßen Verfahren bei 465 Millimikron liegt, was sogar nahe an einem Absorptionsminimum von Hämoglobin ist. In zweiter Linie tritt jedoch beim Aufbringen der resultierenden Testlösung auf gewöhnliches Filterpapier eine gewisse chromatografische Trennung des Bluthämoglobins von den Pyridinnukleotiden auf, was eine beträchtliche Intensivierung der Fluoreszenz zur Folge hat.
In allen Untersuchungen kann das Volumen der zu untersuchenden Blutprobe relativ zu dem der Reaktionsmischung über einen weiten Bereich von einem Minimalverhältnis von einem Teil Blutprobe zu 20 Teilen der Reaktionsmischung bis zu einem maximalen Verhältnis von 1 Teil der Blutprobe zu 5 Teilen der Reaktionsmischung variiert werden. Wo ein Inkubator nicht unmittelbar zur Verfügung steht, wie beispielsweise bei einer Felduntersuchung, kann die Testreaktion auch bei Raumtemperatur ablaufen.
Nachfolgend wird ein Untersuchungsbeispiel für den Nachweis von G-6-2D in roten Blutzellen erläutert, aus dem die Anwendung des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens hervorgeht.
Beispiel 1 Eine zur Untersuchung geeinete Blutprobe wird in saurer Zitratdextrose (ACD), in Hearin, in Linatriumäthylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) oder einem sonstigen geeigneten Antikoagulans verwendet. Die Blutprobe braucht nicht frisch zu sein. Selbst mehrere Wochen alte Blutprben, die in saurer Zitratdextrose bei 4°C aufbewahrt worden sind, sind für die Untersuchung noch geeignet.
Eine geeignete Reaktionsmischung zur Untersuchung der Blutprobe auf Gegenwart von G-6-PD besteht aus folgenden Komponenten: Zugabe in wässrige Lösung Konzentration Menge in ml G-6-PD 0,01 M 0,10 Triphosphopyridinnukleotid 0,0075 M 0,10 Digitonin, gesättigte Lösung 0,20 Kaliumphosphatpuffer 0,25 M 0,)0 pH 7,4 Wasser 0,30 Total 1,00 ml Die Grundlage für die Untersuchung besteht darin, daß bei Vorhandensein von G-6-PD in der Blutprobe Clukose-6-Phosphat während der Reaktionsdauer zu 6-Phosphoglukonat oxydiert wird und daß Triphosphopyridinnukleotid, das nachfolgend abgekürzt als TPN bezeichnet wird, zu reduziertem Triphosphopyridinnukleotid reduziert wird. Letzteres wird im folgenden mit TPNH abgekürzt. Da die Blutprobe außerdem 6-Phosphoglukon-Dehydro genase enthält, wird das 6-Phosphoglukonat, das in der Reaktion entsteht, durch 6-Phosphoglukon-Dehydrogenase oxydiert und dabei zuscitzliches TPN zu TPNH reduziert. Bei Aktivierung durch langwelliges UV-Licht fluoresziert das TPN1I deutlich.
In dem Untersuchungsverfahren wird 1 Volumteil an Blut, gegewöhnlich eine Blende von 0,02 ml, zu 10 Volumteilen der Reaktionsmischung, gewöhnlich 0,2 ml, zugegeben und die resultierende Tesblösung wird 5 bis 10 Minuten lang bei 370C inkubiert. Von der daraus resultierenden Testlösung wird auf jedes geeignete Filterpapier, z.B. Whatman NrO 1, ein Fleck erzeugt. Wenn die auf das normale Vorhandensein von G-6-PD zurückgehende, vorstehend erläuterte Aktivität vorliegt, fluoresziert der Fleck auf dem Filterpapier bei Aktivierung durch langwelliges UV-Licht deutlich. Liegt ein Mangel an G-6-PD im Blut vor, dann erscheint keine merkliche Pluoreszenz bei der Einwirkung von langwelligem UV-Licht in einem Bereich von 340 bis etwa 370 Millimikron.
Ist. erst einmal auf das Pilterpapier ein Fleck aufgebracht und getrocknet worden, so läßt sich die Pluoreszenz mehrere Tage danach leicht feststellen.
Der Untersuchungsablauf für die Gegenwart von G-6-PD kann auf mancherlei Art variiert werden, ohne daß dadurch das Ergebnis beeinträchtigt würde. So kann beispielsweise anstelle einer Inkubation der resultierenden Testlösung bei 37 0C die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen, wobei man nach einer Zeitdauer von 10 bis 15 Minuten aquivalente Ergebnisse erhält. Anstelle von Filterpapier kann auch jedes sonstige geeignete Absorptionsmaterial verwendet werden, auf das die Flecke mit der Testlösung aufgebracht werden, so weit dieses Absorptionsmaterial eine merkliche Trocknung der Flecke zum Zwecke des Anhaltens der Testreaktion zuläßt. Weiterhin können anstelle der Dinatriumäthylendiamin-Tetraessigsäure die freie Säure sowie sonstige Alkali salze dieser Säure als Antikoagulans eingesetzt werden.
Da die Reaktion solbst bei O°C rasch verläuft, kann die zugestandene Reaktionszeit vor dem Aufbringen der Flecken zwischen einem Minimum von 2 Minuten bis zu einem Maximum von 10 bis 15 tlinuten bei 370C schwanken. Diese Reaktionszeiten sind mit einem Faktor voll etwa 1, 5 zu multiplizieren, wenn die Reaktion bei Raumtemperatur abläuft.
Wird beispielsweise anstelle von 0,2 ml einer gesättigten L sung an Digitonin eine lunge von 0,2 ml einer 1 %igen Lösung an Saponin verwendet, dann braucht die iesultierende Testlösung lediglich 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert zu werden.
Die Konzentrationen von TPN und Glukose-6-Phosphat können vermindert werden, ohne daß dadurch die in dem Untersuchungsverfahren erhaltenen Ergebnisse wesentlich verändert werden.
So kann beispielsweise die Konzentration des Glukose-6-Phosphats in der Reaktionsmischung über einem Bereich von 1/5 bis zum 30-fachen der in Beispiel 1 angegebenen Konzentration schwanken, wobei sich entsprechend der Bereich der TPN-Konzentration von 1/4 bis zum 10-fachen der in Beispiel 1 angegebenen Konzentration erstreckt.
Der pH-Wert des Kaliumphosphatpuffers kann von 6,5 bis 8 variieren und auch dessen Konzentrationsbereich kann sich von 1/10 bis zum 5-fachen der in Beispiel 1 angegebenen Konzentration erstrecken. Es können auch andere geeignete Phosphatpuffer anstelle des Kaliumphosphats eingesetzt werden.
Die Digitoninlösung braucht nicht gesättigt zu seine solange genügend Digitonin in der Reaktionsmischung vorhanden ist, um effektiv das Austreten des Hämoglobine aus den roten Blu-tzellen zu bewirken. Die konzentration des Digitonins karni von 1/10 einer gesättigten Lösung, bis zu einer voll gesättigten Lösung gewählt werden. Wird Saponin verwendet, so kann dessen Konzentration bei 1/10 % einer Lösung bis zu einer 20 %igen Lösung liegen. Andere geeignete hämolysierende Mittel können ebenfalls eingesetzt werden, wenn sie die Testreaktion nicht beeinflussen oder beeinträchtigen.
im folgenden wird ein Beispiel für den Nachweis des Fehlens des Enzymes Galactoso-1-Phosphat-Uridyl-Transferase gegeben.
Das Fehlen dieses Enzyms im Blut erzeugt Galactosemia, die bei fehlender Behandlung Leberzirrhose, Blindheit und geistiels Nachlassen zur Folge hat. Wenn dieser Enzymmangel frühzeitig entdeckt wird, kann eine galactosefreie Diät diese Mangelerscheinungen verhindern.
Beispiel 2 Eine zu untersuchende Blutprobe wird in Heparin gesammelt.
Die Reaktionsmischung für diesen Test umfaßt folgende Komponenten: Zugabe in wassriger Lösung Konzentration Menge in ml Uridin-Diphosphoglukose $9,5 x 10-3 m 0,2 Alpha-Calaktose-1-Phosphat 2,7 x 10-2 M 0,4 TPN 6,6 x 10-3 X 6,6 Tris-Azetat-Puffer, pH 8,0 0,75 M 2,0 Digitonin, gesättigte Lösung 0,8 EDTA 2,7 x 10-2 M 0,03 Wasser Total Die Grundlage für diesen Nachweis besteht darin, daß bei der Zugabe von vollem Blut zur Reaktionsmischung die Uridin-Diphosphoglukose (UDPG) und das Alpha-Galactose-1-Fhosphat (Gal-1-P) reagieren und in Gegenwart der Transferase Alpha-Glukose-1-Phosphat bilden. flas Alpha-Glukose-1-Phosphat wird durch Phosphoglukomutase, die im Hämolysat vorhanden ist, zu Alpha-Glukose-6-Phosphat umgewandelt, das seinerseits wieder spontan und mit Hilfe der Fhosphohexose-Isomerase zum Beta-Glukose-6-phosphat umgewandelt wird. Die Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, die ebenfalls im Ilämolysat vorhanden ist, oxydiert das Beta-Glukose-6-Phosphat zu 6-Phosphoglukonat, das seinerseits wieder zu Ribulose-5-Phosphat oxydiert wird. Beide diese Reaktionsschritte resultieren in der Reduktion des TPN zu TPNH, das unter der Einwirkung von langwelligem Licht fluoresziert. Bei Blutproben, in denen keine Transferase vorgelegen hat, tritt keine merkliche Fluoreszenz auf.
Bei der Durchführung des Testes wird 1 Volumteil an heparinisiertem Vollblut, gewöhnlich 0,02 ml, zu 10 Volumteilen, gewöhnlich 0,2 ml, der Keaktionsmischung zugegeben. Die zur Zugabe des Blutes verwendete Pipette wird im Kolben belassen und die resultierende Testlösung wird unter äroben Bedingungen bei 3700 inkubiert. Nach Ablauf von 2 Stunden wird mittels weniger ml der Testlösung auf Whatman Nr. 1-Filterpapier ein Fleck erzeugt und dieser bei Raumtemperatur eintrocknen gelassen. Das Eintrocknen benötigt gewöhnlich etwa 5 Minuten. Der Fleck wird-innerhalb von 24 Stunden nach dem Eintrocknen unter langwelligem UV-Licht mit einer Wellenlänge von 340 bis etwa 370 Millimikron untersucht. Unter diesem langwelligen Licht fluoreszieren Flecken, die aus Blut proben mit normalem Blut erzeugt worden sind sehr deutlich, während l'lecken, denen blut mit einem Transferasemangel zu Grunde liegt, keine merkliche Fluoreszenz ergeben. Nach (iem trocknen bleiben die Flecken bis zu einer Zeitdauer von 1 Woche bei Raumtemperatur relativ stabil.
Der Testablauf kann in verschiedener Hinsicht variiert werden, ohne daß dadurch die Ergebnisse nachteilig beeinflußt werden.
Mit kapillarem Blut können Streifen auf Filterpapier oder sonstiges geeignetes Absorptionsmaterial gemacht und eingetrocknet werden und das Absorptionsmaterial anschließend in einen Behälter mit geeignetem Volumen, nämlich etwa dem 10-fachen des Blutvolumens, mit der Reaktionsmischung eingebracht werden. Die Reaktionsmischung wird 2 bis 3 Stunden lang bei 370C inkubiert, während das Filterpapier darin untergetaucht ist. Nach derInkubation wird von der sich daraus ergebenden Testlösung auf Filterpapier oder einem sonstigen geeigneten Absorptionsmaterial, das das Eintrocknen von Flecken zuläßt, ein Fleck erzeugt. Dieser Fleck wird bei Raumtemperatur eingetrocknet, was in der Regel 5 Minuten dauert. Anschließend wird er unter langwelligem UV-Licht untersucht, um festzustellen, ob Fluoreszenz auftritt.
Solange es noch nicht koaguliert ist, kann anstelle von heparinisiertem Blut für den Test auch Tisches volles Blut verwendet werden. Der Test kann bei Raumtemperatur ausgeführt werden, wobei allerdings ein entsprechender Abfall in der Reaktionsgeschwindigkeit auf etwa die Hälfte oder 1/3 der Geschwindigkeit bei 37°C in Kauf genommen werden muß. Die Inkubationszeit bei 3700 kann von 1 bis 3 Stunden variiert werden, ohne daß dadurch das Ergebnis beeinträchtigt wird. Anstelle von vollem Blut kann auch eine 50 7o'ige Suspension roter Zellen in einer 0,9 %igen Kochsalzlösung verwendet werden, wobei man ähnliche Ergebnisse erheilt wie unter Verwendung von vollem Blut.
In der Reaktionsmischung kann EDTA als Bestandteil weggelacsen werden? da es lediglich dazu dient, die Entwicklung der Fluoreczenz in der Testlösung zu intensivieren. Wenn das zu untersuchende Blut in EDTA gesammelt wird, um die Koagulation zu verhindern, mull sogar auf EDTA in der Reaktionsmischung verzichtet werden.
Blutproben, die in Heparin gesammelt sind, können bis zu einer Woche bei Raumtemperatur aufbewahrt werden und bringen bei anwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren Ergebnisse, die denen mit frischen Blutproben äquivalent sind.
Die Digitoninlösungakonzontration kann von 1/10 der Sättigung bis hinauf zur Sättigung variiert werden, sofern genügend Digitonin vorhanden ist, um effektiv die roten Blutzellen zum Auftritt von Hämoglobin anzuregen. anstelle von Pigitonin kann eine 1 %ige Saponinlösung mit gleichem Ergebnis verwendet werden. die Konzentration des Saponins kann ihreraeits von 1/1G bis 20 ß ohne nachteiligen Einflu auf das Testergehnis verändert werden. Auch andere geeignete hämolysierende Nittel können eingesetzt werdon, solange sie die Testreaktion nicht beeinflussen.
Die Konzentration des UDPG, des Gal-1-P und des TPN in der Reaktionsmischung kann verändert werden, ohne daß dadurch merklich die Ergebnisse des erfindungsgemäßen Verfahrens beeinflußt werden, So kann die Konzentration dieser Reaktanten über einen Bereich von 1/4 bis zum 10-fachen der in Beispiel 2 angegebenen Konzentrationen verändert werden.
Der pH-Wert des Tris-Azetat-Puffers kann von 6,2 bis 9,2 liegen und es kann ein Konzentrationsbereich von 1/10 bis zum 3-fachen der in Beispiel 2 angegebenen Konzentration gewählt werden.
Das Folgende ist ein Beispiel für den Nachweis des Pyruvat-Kinase-Mangels in roten Blutzellen: Beispiel 3 Antikoaguliermittel, wie z.B. Heparin, ACD, EDTA oder sonstige, können bei der Preparation der zu untersuchenden Blutprobe verwendet werden. Die nichtkoagulierte Blutprobe wird dann zentrifugiert und das Plasma sowie der Pufferfilm (buffy ooat) durch sogfältiges Absaugen oder sonstige Maßnahmen entfernt. Die weißen Blutkörperchen werden ebenfalls entfernt, da die Pyruvat-Kinaseaktivität der weißen Zellen auch dann norm ein kann, wenn die roten Blutzellen an einem Pyruvat-Kinasemangel leiden.
4 Volumtoile einer physiolog'ischen Salzlösung werden zu den roten Hlutzellen hinzugegeben, um eine 20 %ige Suspension der roten Blutzellen zu erzeugen. Die Suspension ist dann für die Untersuchung fertig Xxn folgenden wird eine geeignete Reaktionsmischung für die Untersuchung angegeben : Zugaben in wässriger Lösung Konzentration Nenge in ml Phospho-(enol)-Pyruvat 0,15 M (neutrali- 0,03 (Tricyklohexylammonium-Salz) siert) Adenosin-Diphoshat (ADP) 0,03 M " 0,10 DTNM 0,015 M " 0,10 Magnesiumsulfat 0,08 M " 0,10 Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 0,25 N 0,05 Wasser 0,62 Total 1,00 Die Grundlage dieser Untersuchung besteht darin, daß bei Vorhandensein von Pyruvat-Kinase in der Blutprobe eine Phosphat-Gruppe des Phospho-(enol)-Pyruvats zu Adenosin-Diphosphat (ADP) überführt wird, das Pyruvat und Adenosin-Trlphosphat (ATP) bildet. Die Lactatdehydrogenase in dem Hämolysat katalysiert die Reduktion des Pyruvats zum Lactat bei der Oxydation des reduzierten DiphospholJyridinnukleotids (DPNH) in der Reaktionsmischung zu dem Diphosphopyridinnukleotid (DPN).
Da das DPNH unter langwelligem UV-Licht fluoresziert, während das DPN dies nicht tut, tritt ein allmähliches Nachlassen der Fluoreszenz in einer aus normalem Blut hergestellten Testlösung auf.
Bei der Durchführung der Untersuchung wird 1 Volumteil der Suspension roter Blutkörperchen, gewöhnlich 0,02 ml, zu 10 Volunlteilen der Reaktionsmischung, gewöhnlich 0,2 ml, hinzugegeben und die resultierende Testlösung bei 3700 30 Minuten lang inkubiert. Danach werden mit der Testlösung Flecken auf Pilterpapier gemacht, wie dies bereits in den vorstehenden Beispielen erläutert worden ist, die getrocknet und unter langwelligem UV-Licht untersucht werden. Wenn die urslzrüngliche Blutprobe rote Blutzellen mit einem l'yruvat-Kinasem.+ngel enthalten hat, dann ist eine deutliche Fluoreszenz der aus dieser Blutprobe hergestellten Flecken zu erkennen, während auf normales Blut zurückgehende Flecken nach der Inkubation keine merkliche Fluoreszenz zeigen.
Die neutralisierten Bestandteile der Reaktionsmisohung gemäß Beispiel 3 können auf einen pH-Wert von 7 bis 8 unter Anwen-(lung eines plt-Papiers mit angenähert 0,2 N Kochsalz ncutralisiert werden.
Anstelle von Digitonin oder Saponin wird ein hypotonisches Lösungsmittel zur Freigabe des Enzyms aus den roten Blutzellen angewendet, um zu verhindern, daß merkliche Mengen von Enzym aus den weißen Blutkörperchen freigesetzt werden, die in der behandelten Blutprobe verbleiben könnten. Jedes andere geeignete Lösungsmittel kann ebenfalls verwendet werden, sofern es nicht die Testreaktion beeinflußt.
Die Konzentration der Bestandteile der Reaktionsmischung nach Beispiel 3 kann ohne nachteiligen Einfluß auf den Untersuchungsablauf variiert werden. So kann die Konzentration des Phospho-(enol)-Pyruvats (Tricyklohexylammoniumsalz) von 1/4 bis zum 3-fachen der in Beispiel 3 angegebenen Konzentration reichen, wobei ein entsprechender Konzentrationsbereich des ADP von 1/3 bis zum 10-fachen und des DPNH von 1/4 bis zum 2-fachen der in Beispiel*3 angegebenen Konzentration eingehalten wird.
Die Konzenträtion des Magnesiumsulfats kann das 0,25 bis das 5-fache der in Beispiel 3 angegebenen Konzentration betragen, wobei die Konzentrationsbereiche der übrigen Bestandteile in der Reaktionsmischung entsprechend eingestellt werden.
Der pH-Wert des Kaliuinphosphatpuffers kann zwischen 6,5 und 7,5 liegen und dessen Konzentration kann sich von 1/10 bis zum 5-fachen des in Beispiel 3 angegebenen Wertes erstrecken.
Die physiologische Salzlösung für die Suspension der roten Blutzellen kann so eingestellt werden, daß sie etwa 1/4 unter bis 1/4 über isotonischer Stärke liegt, solange Hämolyse der roten Blutzellen in der Testlösung auftritt.
Anstelle einer Inkubation der Testlösung bei 57°C kann die Reaktion auch bei Raumtemperatur ablaufen, wobei entsprechend die Reaktionsdauer auf das 1 1/2 bis 2-fache erhöht werden muß. Die Reaktionsdauer kann vor Beginn des eigentlichen Fleckenauftragens von einem Minimum von etwa 10 Minuten bis zu einem Maximum von etwa 30 Minuten bei 370 betragen.
Anstelle des Magnesiumsulfats können auch andere wasserlösliche Magnesiumsalze verwendet werden, solange sie die Reaktion nicht beeinträchtigen. Auch als Puffer können verschiedene wasserlösliche Kaliumphosphatsalze verwendet werden.
Frisches Blut kann solange verwendet werden, wie es noch nicht koaguliert ist. Anstelle der Dinatriumäthylendiamin-Tetraesaigsäure können sowohl die freie Säure als auch andere Alkalisalze der Äthylendiamin-Tetraessigsäure als Antikoagulans verwendet werden.
Nachfolgend wird ein Beispiel für den Nachweis eines QSSG-R-Mangels in roten Blutkörperchen erläutert.
Beispiel 4 Eine für die Untersuchung geeignete Blutprobe kann in AOD, EDTA oder in Heparin gesammelt werden. Derartige Blutproben können mindestens 3 Wochen lang ohne nachteiligen einfluß auf den Testverlauf aufgehoben werden.
Eine geeignete Reaktionsmischung für den Nachweis des GSSG-R-Mangels besteht aus folgenden Bestandteilen: Zugabe in wässriger Lösung Konzentration Menge in ml Glutathion (oxydiert) 0,033 M 0,1 TPNH Kaliumphosphatpuffer pH 7,4 0,25 iYt 0,6 Digitonin, gesättigte Lösung 0,2 Total 1,0 ml Die Grundlage für diesen Test besteht darin, daß bei Vorhandensein von Glutathion-Reduktase in dem Hämolysat oxydiertes Glutathion (GSSG) zu Glutation (GSH) reduziert und TPNH zu TPN oxydiert wird. Da das TPNH bei Aktivierung mit langwelliger UV-Strahlung fluoresziert, was das TPN nicht tut, tritt mit zunehmender Reaktion ein allmählicher Verlust an Fluoreszens ein, wenn die Blutprobe normal ist.
In der Untersuchung wird 1 Volumteil an Blut, gewöhnlich 0,02 ml, zu 10 Volumteilen der Reaktionamischung, gewöhnlich O,2 ml, hinzugegeben. Mit der resultierenden Testlösung werden Flecken auf geeignetes Filterpapier in Zeitabständen von 15 Ninuten aufgebracht und das Verschwinden der Fluoreszenz anhand einer Kontrollproben während einer bestimmten Zeitdauer bis zu 90 Minuten lang verglichen. Es wird wieder langwelliges UV-Licht mit einer sitellenlange von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron verwendet. Ein G-2G-R-Mangel ist dann nachgewiesen, wenn die Fluoreszez eines Flckes anhält.
Die Reaktion kann bei 37°C oder bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Unter Raumtemperatur beträgt die Reaktionsdauer etwa das 1 1/2 bis 2-fache der Reationsdauer bei 37°C.
Die Konzentration der Bestandteile der Reaktionsmischung im Beispiel 4 kann ohne nachteiligen Einfluß auf die Test er gebnisse variiert werden. Die Konzentration des GSSG kann bei 1/4 bis zum 20-fachen der in Beispiel 4 angegebenen Konzentration liegen, während die Konzentration des TPNH über einen entsprechenden Bereich von dem etwa 1/2-fachen bis zum Doppelten der in Beispiel 4 angegebenen Konzentration variiert werden kann.
Wie schon in den Beispielen 1 und 2, kamin anstelle des Digitonins Saponin eingesetzt werden, wobei dieselben Konzentrationsbereiche in Beispiel 4 Geltung haben, wie sie für Digitonin und Saponin bereits in den Beispielen 1 und 2 erläutert worden sind. Die Konzentration des Phosphatpuffers kann sich von 1/10 bis zum 10-fachen der in Beispiel 4 angegebenen Konzentration erstrecken. Darüberhinaus kann er einen pH-Wert von 6, 5 bis 9,5 entsprechend dem Konzentrationsbereich aufweisen. Auch hier können andere hämolysierende Mittel anstelle von Digitonin und Saponin verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie den Untersuchungsablauf nicht beeinträchtigen. Auch frisches Blut kann verwendet werden, solange es noch nicht koakuliert ist. Als Puffer können weiterhin verschiedene wasserlösliche Kaliumphosphatsalze eingesetzt werden und anstelle der Dinatriumäthylendiamin-Tetraessigsäure können sowohl die freie Säure als auch andere Alkalisalze der Äthylendiamin-Detraessigsriure als Antikoagulans eingesetzt werden. Schließlich kann anstelle von Pilterpapier jedes geeignete Absorptionsmaterial zum Auftragen der flecken aus der Testlösung eingesetzt werden, solange dieses Material eine merkliche Trocknung der Flecken zum Abstoppen der Testreaktion erlaubt.
Die Erfindung ist nicht' auf die erläuterten Beispiele beschränkt, sondern es können zahlreiche Abwandlungen davon vorgenommen werden. So kann beispielsweise jedes wasserlösliche Salz als Puffer eingesetzt werden, wenn es die Testreaktion nicht beeinträchtigt. Darüberhinaus ist der hier dargestellte Untersuchungsvorgang anwendbar für den Nachweis der Gegenwart oder des Fehlens verschiedener sonstiger Enzyme, die in roten Blutzellen enthalten sind und wobei die Gegenwart oder das Fehlen derartiger Enzyme in der Oxydation bzw. Reduktion eines Pyridinnukleotids, direkt oder indirekt, resultiert. Dabei muß lediglich dafür Sorge getragen sein, daß für das jeweils gesuchte Enzym das entsprechende Substrat zusammen mit sonstigen gegebenenfalls erforderlichen Kofaktoren oder Koenzymen verwendet wird.

Claims

Patentansprüche

1.) Verfahren zum Nachweis von Enzymen in roten Blutzellen in Blutproben, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Blutprobe mit 5 bis 20 Teilen einer gepufferten wässrigen Lösung, die ein für das festzustellende Enzym spezifisches Enzymsubstrat, ein hämolysierendes Mittel und ein Pyridinnukleotid in oxydiertem oder reduziertem Zustand enthält, zur Reaktion gebracht wird und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht bestrahlt wird, wobei bei Vorhandensein eines gesuchten enzyms in der Blutprobe, das das Pyridinnukleotid in den reduzierten Zustand iiberffihrt, eine anhaltende Pluoreszenz der getrockneten Testlösung auftritt, während eine solche bei Vorhandensein eines Enzyms, das das Pyridinnukleotid in oxydierten Zustand iiberführt, unterbleibt.

2. Verfabren zum Nachweis von Glukose-6-Phosphat-Dehydro genase in roten Blutzellen einer Blutprobe, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Blutprobe mit 5 bis 20 Teilen einer mittels Phosphatgepufferten wässrigen Lösung, die Glukose-6-i>hosphat, Triphosphopyridinnukleotid und ein hämolysierendes Mittel enthält, zur Reaktion gebracht wird und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Sintrocknen auf Absorptionsmaterial mit lctnwelligem UV-Licht bestrahlt wird, wobei bei Vorhandensein von Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase in der Blutprobe eine anbaltende Fluoreazenz in der getrochneten Testlösung auftritt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als himolysierendes mittel Digitonin oder Saponin verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Phosphatpuffer ein Phosphatsalz eines Alkalimetalls verwendet wird.

50 Verfahren nach Anspruch 2; dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Blutprobe mit 10 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 1 Teil einer 0,01-molaren wässrigen Lösung von Glukose-6-Phosphat, 1 Teil einer 0,0075-molaren wässrigen Lösung von Triphosphopyridinnukleotid, 2 Teilen einer wässrigen Lösung eines hämolysierenden mittels, 3 Teilen einer 0,25-molaren wässrigen Lösung eines Kaliumphosphatpuffers mit einem p-Wert von 7,4 und 3 Teilen Wasser besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das hinolysierende Mittel eine gesättigte Lösung von Digitonin oder eine 1 %ige Lösung von Saponin ist.

7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blutrobe mit 10 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 1 Teil einer wässrigen Lösung ton Gluose-6-Phosphat mit einer Molarität von 0,002 bis 3, 1 Teil einer wässrigen Lösung ton Triphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 0,001875 bis 0,075, 2 Teilen einer wässrigen Lösung eines hämolysierenden mittels, 3 Teilen eines Kaliumphosphatpuffers mit einer Molarität von 0,025 bis 1,25 und einem pH-Wert von 6,5 bis 8 und 3 Teilen Wasser besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Sintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als wässrige Lösung eines hämolysierenden Mittels eine wässrige Digitonin-Lösung in einem Konzentrationsbereich von 1/10 einer gesättigten bis zur voll gesättigten Lösung oder eine wässrige Saponin-Lösung mit einem Konzentrationsbereich von einer 1/10 %igen bis zu einer 20 %igen Lösung verwendet wird.

9o Verfahren zum Nachweis von Galactose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase in roten Blutzellen in einer Blutprobe, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blut probe mit 5 bis 20 Teilen einer mittels Azetat gepufferten wässrigen Lösung, die Uridin-Diphosphoglukose, Triphosphopyridinnukleotid, Alpha-Galactose-1 -Phosphat una ein hämolysierendes Mittel enthält, zur Reaktion gebracht wird und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem Licht bestrahlt wird, wobei bei Vorhandensein von Galactose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase in der Blutprobe eine anhaltende Fluoreszenz der getrockneten Testlösung auftritt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß als hämolysierendes Mittel Digitonin oder Saponin verwendet wird.

110 Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekQnnzeichnet, daß der Azetat-Puffer ein Tris-Azetat-Puffer ist.

120 Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blutprobe mit 10 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 1/30 Teil einer wässrigen Lösung von Uridin-Diphosphoglukose mit einer Molarität von 9,5 x 10 3, 1/15 Teil einer wassrigen Lösung von Alpha-Galactose-1-lthosphat mit einer Molarität von 2,7 x i -2, 1/10 Teil einer wässrigen Lösung von Triphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 6,6 x 10 3, , 1/3 Teil einer wässrigen Lösung eines Tris-Azetat-Puffers mit einem pH-Wert von 8,0 und einer Molarität von 0,75, 2/15 Teilen einer wässrigen Lösung eines hämolysierenden Mittels und 1/3 Teil Wasser besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem AuSbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als wässrige Lösung eines hämolysierenden Mittels eine gesättigte Digitonin-Lösung oder eine 1 %ige Saponin-Lösung verwendet wird.

14. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blutprobe mit 5 bis 20 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 1/30 Teil einer wässrigen Lösung von Uridin-Diphosphoglukose mit einer Polarität von 2 x 10-3 ³ bis 9,5 x 10 2, 1/15 Teil einer wässrigen Lösung von AlpIia-Galactose-1-Phosphat mit einer Molarität von 0,7 x 102 bis 2,7 x 10 1, 1/10 Teil einer wässrigen Lösung von Triphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 1,6 x 10 ³ bis 6,6 x 10 2, 1/3 Teil einer wässrigen Lösung eines Tris-Azetat-Puffers mit einem pH-Wert von 6,2 bis 9,2 und einer Molarität von O,Q75 bis 7,2, 2/15 Teilen einer wässrigen Lösung eines hämolysierenden Mittels und 1/3 Teil Wasser besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß als wässrige Lösung eines hämolysierenden Mittels eine wässrige Digitonin-Lösung mit einer Konzentration von 1/10 der gesättigten bis zur voll gesättigten Lösung oder eine wässrige Saponin-Lösung mit einer Konzentration von einer ?/1Q %igen bis zu einer 20 %igen Lösung verwendet wird.

16. Verfahren zum Nachweis von Pyruvat-Kinase in roten Blutzellen in einer Blutprobe, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die roten Blutzellen aus der Blutprobe entfernt und durch ilinzufügen einer physiologischen Salzlösung in eine Suspension aus roten Blutkörperchen über Wnrt werden, daß 1 Teil der Blutkörperchen-Suspension mit 5 bis 20 Teilen einer mittels eines Phosphats gepufferten wässrigen Lösung, die neutralisiertes Phospho-(enol)-Pyruvat (Tricyklohexylammoniumsalz), neutralisiertes Adenosin-Diphosphat, neutralisiertes reduziertes Diphosphopyridinnuklcotid und eine anorganische Kaliumquelle enthält, zur Reaktion gebracht wird und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht bestrahlt wird, wobei bei Vorhandensein von Pyruvat-Kinase in der Blutprobe eine mit zunehmendem Ausreagieren der Testlösung abnehmende Pluoreszenz bis zum Fehlen jeglicher Fluoreszenz auftritt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß aus der Blutprobe die roten Blutzellen entfernt und durch Zugabe von 4 Volumteilen einer physiologischen Salzlösung eine 20 %ige Suspension roter Blutkörperchen erzeugt wird, daß 1 Teil der Blutkörperchen-Suspension mit 10 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 3 Teilen einer wässrigen Lösung von neutralisiertem Phospho-( enol)-Pyruvat (Tricyklohexylammoniumsalz) mit einer Molarität von 0,15, 10 Teilen einer wässrigen Lösung aus neutralisiertem Adenosin-Diphosphat mit einer Molarität von 0,03, 10 Teilen einer wässrigen Lösung aus neutralisiertem reduziertem Diphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 0,015, 1Q Teilen einer wässrigen Lösung aus Magnesiumsulfat mit einer Molarität von 0,08, 5 Teilen einer wässrigen Lösung eines Kaliumphosphatpuf-Sers mit einem pH-Wert von 7,4 und einer Molarität von X,25 sowie 62 Teilen Wasser besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeicJinet, daß der Blutprobe ein Antikoagulans hinzugefügt, diese darm zentrifugiert und das Plasma sowie der Pufferfilm (buffy coat) entfernt werden, daß die verbleibenden roten Blutzellen mit 3 bis 5 Volumteilen einer physiologischen Salzlösung zu einer Suspension überführt werden, daß 1 Teil der resultierenden Blutkörperchen-Suspension mit 5 bis 20 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht werden, die aus 3 Teilen einer wässrigen Lösung von neutralisiertem Phospho-(enol)-Pyruvat (Tricyklohexylammoniumsalz) mit einer Molarität von 0,04 bis 0,45, 10 Teilen einer wässrigen Lösung von neutralisiertem Adenosin-Diphosphat mit einer Molarität von 0,01 bis 0,3, 10 Teilen einer wässrigen'Lösung von neutralisiertem reduziertem Diphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 0,004 bis 0,03, 10 Teilen einer wässrigen Lösung von Magnesiumsulfat mit einer Molarität von 0,02 bis 0,4, 5 Teilen einer wässrigen Lösung eines Kaliumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,5 bis 9,5 und einer Molarität von 0,25 bis 1,25 und 62 Teilen Wasser besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird.

1 9. Verfahren zum Nachweis von Glutathion-eduktase in roten lutzellen in einer Blutprobe, nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blutprobe mit 5 bis 20 Teilen einer mittels eines hosphats gepufferten wässrigen Lösung, die oxydiertes Glutathion, reduziertes Triphos-Phopyridinnukleotid und ein hämolysierendes Mittel enthielt, zur Reaktion gebracht wird und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht bestrahlt wird, wobei bei Vorhandensein von Glutathion-Reduktase in der Blutprobe eine mit zunehmender Reaktion abnehmende und gegen Ende der Reaktion verschwindende Fluoreszenz der getrockneten Testlösung auftritt.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das hämolysierende Mittel Digitonin oder Saponin ist.

21. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Phosphatpuffer Kaliumphosphat ist.

22. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blutprobe mit 10 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 1 Teil einer wässrigen Lösung von oxydiertem Glutathion mit einer Molarität von 0,033, 1 Teil einer wässrigen Lösung von reduziertem 'l'riphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 0,015, 6 Teilen einer wässrigen Lösung eines Kaliumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 und einer Molarität von 0,25 und 2 Teilen einer wässrigen Lösung eines hämolysierenden mittels besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem Aufbringen und Eintrocknen auf Filterpapier mit langwelligem UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird. -

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß als wässrige Lösung eines hämolysierenden Mittels eine gesättigte Digitonin-Lösung oder eine 1 %ige Sapo-. nin-Lösung verwendet wird.

24. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß 1 Teil der Blutprobe mit 5 bis 20 Teilen einer wässrigen Lösung zur Reaktion gebracht wird, die aus 1 Teil einer wässrigen Lösung von oxydiertem Glutathion mit einer Molarität von 0,008 bis 0,66, 1 Teil einer wässrige gen Lösung von reduziertem Triphosphopyridinnukleotid mit einer Molarität von 0,004 bis 0,03, 6 Teilen einer wässrigen Lösung eines Kaliumphosphatpuffers mit einem pH-Wert von 6,5 bis 9,5 und einer Molarität von 0,025 bis 2,5 und 2 Teilen einer wässrigen Lösung aus einem hämolysierendem Mittel besteht, und daß die sich daraus ergebende Testlösung nach dem aufbringen und Eintrocknen auf Absorptionsmaterial mit langwelligem UV-Licht mit einer Wellenlänge von etwa 340 bis etwa 370 Millimikron bestrahlt wird.

25. verfahren nach Anspruch 24, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t, daß als wässrige Lösung des hämolysicrenden Mittels eine wässrige Lösung von Digitonin mit einer Konzentration von 1/10 der gesättigten bis zur voll g'es.ittigten Lösung oder eine wässrige Lösung von Saponin mit einer Konzentration von 1/10 °/0 bis zu 20 Vo verwendet wird.