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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Bildgebung von Einzelmolekülen, insbesondere Protein-Einzelmolekülen.
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Hintergrund der Erfindung
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Die meisten der heute verfügbaren Proteinstrukturinformationen wurden entweder aus Röntgenkristallographie-Experimenten oder aus Untersuchungen mittels Kryo-Elektronenmikroskopie durch Mittelung über viele in einem Kristall angeordnete Moleküle beziehungsweise über ein grosses Ensemble von Elektronenmikrographien mit niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis gewonnen10. Trotz der beeindruckenden Menge verfügbarer Daten ergibt sich aus guten Gründen ein starker Wunsch, Strukturdaten von gerade nur einem einzelnen Molekül zu erhalten. Die meisten der biologisch relevanten Moleküle weisen unterschiedliche Konformationen auf; die zugehörigen strukturellen Details bleiben jedoch unentdeckt, wenn eine Mittelung durchgeführt wird. Darüber hinaus kristallisiert eine grosse Untermenge der Gesamtheit der Proteine, insbesondere aus der wichtigen Kategorie der Membranproteine, überhaupt nicht aus. Wenn nur ein einzelnes Protein oder ein einzelner Proteinkomplex ausreichend genau analysiert werden kann, werden schliesslich auch solche Objekte zugänglich.
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Für einen bedeutsamen Beitrag zur Strukturbiologie muss ein Werkzeug für die Einzelmolekül-Bildgebung es ermöglichen, ein einzelnes Protein lange genug zu beobachten, um eine ausreichende Menge an Daten zu erfassen, um seine Struktur, idealerweise ohne sie zu zerstören, zu bestimmen. Der grosse inelastische Streuquerschnitt für Röntgenstrahlen wie auch für hochenergetische Elektronen, die im Stand der Technik bei der aberrationskorrigierten TEM verwendet werden, verhindert das Erfassen von ausreichenden elastischen Streuereignissen, welche erforderlich sind, um eine hochaufgelöste Rekonstruktion mit nur einem Molekül vorzunehmen. Zukünftige Freie-Elektronen-Laser im Röntgengebiet (XFELs) mit drastisch verbesserter Helligkeit und reduzierter Pulsdauer könnten letztlich das Ziel der Einzelmolekül-Bildgebung erreichen. Bis jetzt erfordert der derzeitige und vorhersehbare Stand der Technik in der XFEL-Leistungsfähigkeit jedoch immer noch eine Mittelung über mindestens 1 Million Moleküle. 1,11-13. Abgesehen von Proteinmolekülen gibt es auch viele andere Arten von anderen Molekülen, für die eine Einzelmolekülbildgebung wünschenswert wäre. Diese umfassen Moleküle mit einer Vielzahl von Molekülgrössen.
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Vor obigem Hintergrund ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung zur Bildgebung von Einzelmolekülen bereitzustellen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Es wurde nun gefunden, dass die obige Aufgabe durch eine Vorrichtung gelöst werden kann, wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
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Darüber hinaus wird ein Verfahren zur Bildgebung von Einzelmolekülen offenbart, das die folgenden Schritte umfasst:
- a) Bereitstellen einer Vorrichtung, umfassend ein Trägersubstrat mit einer Substratfläche mit einer Öffnung, wobei die Öffnung mit einer an der Substratfläche angebrachten Aufnahmeschicht bedeckt ist, wobei die Aufnahmeschicht für niederenergetische Elektronen mit einer kinetischen Energie von 5 bis 1'000 eV im wesentlichen durchlässig ist;
- b) Abscheiden von Einzelmolekülen auf der besagten Aufnahmeschicht mittels Elektrospray-Ionendeposition mit sanfter Landung, wobei eine mit Einzelmolekülen beladene Aufnahmeschicht gebildet wird;
- c) Erfassen eines Inline-Transmissionsmusters für niederenergetische Elektronen, welches die besagte mit Einzelmolekülen beschichtete Aufnahmeschicht aufweist; und
- d) Anwenden einer Rekonstruktionsprozedur auf das besagte Elektronentransmissionsmuster, um mindestens ein Bild eines auf der besagten mit Einzelmolekülen beschichteten Aufnahmeschicht befindlichen Einzelmoleküls zu gewinnen;
wobei die obigen Schritte a) bis c) unter Vakuumbedingungen durchgeführt werden.
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Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Bildgebung von Einzelmolekülen, die folgendes umfasst:
- a) eine Vakuumkammer, enthaltend ein Trägersubstrat mit einer Substratfläche mit einer Öffnung, wobei die Öffnung mit einer an der Substratfläche angebrachten Aufnahmeschicht bedeckt ist, wobei die Aufnahmeschicht für niederenergetische Elektronen mit einer kinetischen Energie von 5 bis 1'000 eV im wesentlichen durchlässig ist;
- b) Mittel zum Abscheiden von Einzelmolekülen auf der besagten Aufnahmeschicht mittels Elektrospray-Ionendeposition mit sanfter Landung, um eine mit Einzelmolekülen beladene Aufnahmeschicht zu bilden; und
- c) Mittel zum Erfassen eines Inline-Transmissionsmusters für niederenergetische Elektronen, welches die besagte mit Einzelmolekülen beschichtete Aufnahmeschicht aufweist.
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Im vorliegenden Zusammenhang werden unter dem Begriff „niederenergetische Elektronen“ Elektronen mit einer kinetischen Energie im Bereich von 5 bis 1'000 eV bezüglich der Aufnahmeschicht, auf die sie gerichtet sind, verstanden.
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Im Prinzip kann das Verfahren der vorliegenden Offenbarung auf eine grosse Vielzahl von Molekülen, die von kleinen anorganischen oder organischen Molekülen bis hin zu sehr grossen Biomolekülen reichen, angewendet werden. Es ist auch auf Molekülgruppierungen wie Dimere, Oligomere und Cluster anwendbar.
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Es versteht sich, dass es im Falle von sehr kleinen, vergleichsweise flüchtigen Molekülen, wie dreiatomigen oder sogar zweiatomigen Molekülen notwendig sein kann, die Aufnahmeschicht auf Temperaturen deutlich unterhalb der Umgebungstemperatur zu kühlen, um eine ausreichend stabile Anordnung von Einzelmolekülen auf der Aufnahmeschicht zu erreichen.
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Der Begriff „Elektrospray-Ionendeposition mit sanfter Landung“ wird verstanden als eine Implementierung der allgemein bekannten Methodik der Elektrospray-Ionendeposition, wobei sich „sanfte Landung“ auf eine Deposition bezieht, die mit einer genügend geringen Ionenaufprallenergie durchgeführt wird, um unerwünschte Effekte zu vermeiden. Die entsprechende Energieschwelle hängt von der jeweiligen Anwendung ab. In vielen Fällen muss die Aufprallenergie genügend niedrig sein, um eine Dissoziation von Molekülbindungen zu vermeiden. Es ist jedoch klar, dass die Untersuchung von schwach gebundenen Molekülaggregaten besonders sanfte Abscheidungsbedingungen erfordert.
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Vorteilhafte Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen und in der Beschreibung weiter unten definiert.
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Gemäss einer Ausführungsform umfasst die Abscheidung von Einzelmolekülen die Ionisierung von Einzelmolekülen unter Bildung von Einzelmolekülionen, die elektrostatische Extraktion und Massenfilterung der besagten Einzelmolekülionen und die elektrostatische Führung von massengefilterten Einzelmolekülionen auf die besagte Aufnahmeschicht.
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Gemäss einer Ausführungsform sind die Einzelmoleküle Proteinmoleküle.
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Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Aufnahmeschicht eine Graphenmonoschicht. Ultrareines freistehendes Graphen kann durch das Pt-Metall-Katalyseverfahren hergestellt werden, das an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde
6 (siehe auch:
WO 2014/064057 A2 ).
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Im Prinzip können verschiedene Arten von Elektronentransmissionsmustern verwendet werden, um die gewünschte Information über die interessierenden Einzelmoleküle zu erhalten. Beispielsweise kann ein Verfahren mit Beugungsmustern niederenergetischer Elektronen verwendet werden. Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform ist das Elektronentransmissionsmuster ein Hologramm.
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Gemäss einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform besteht die Substratfläche aus einem Platinmetall, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Pt, Pd und Rh, vorzugsweise Pt.
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Gemäss einer vorteilhaften Ausführungsform umfasst die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung überdies Mittel zum Anwenden einer Rekonstruktionsprozedur auf das besagte Elektronentransmissionsmuster, um mindestens ein Bild eines auf der besagten, mit Einzelmolekülen beschichteten Aufnahmeschicht befindlichen Einzelmoleküls zu gewinnen.
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Figurenliste
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Die oben erwähnten und andere Merkmale und Aufgaben der vorliegenden Erfindung sowie die Art, diese umzusetzen, werden besser erkennbar, und die eigentliche Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beschreibung von verschiedenen Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung unter Heranziehung der begleitenden Abbildungen besser verständlich, welche zeigen:
- 1: Schematischer Prozessablauf zur Bildgebung eines Einzelproteins. Von oben nach unten: Herstellung und Charakterisierung von ultrareinem freistehenden Graphen. Abscheiden von Proteinen auf freistehendes Graphen in einem m/z-gefilterten ES-IBD-System. Bildgebung der Proteine innerhalb der zuvor charakterisierten Region mittels Holographie mit niederenergetischen Elektronen. Während des gesamten experimentellen Prozessablaufs wird die Probe mit Hilfe eines UHV-Koffers für den Transfer zwischen den beiden Experimentierkammern unter strikten UHV-Bedingungen gehalten (siehe Zusatzinformation für weitere Details).
- 2: Bilder von einzelnen, auf freistehendem Graphen abgeschiedenen BSA-Proteinen. a, Massenspektrum des BSA-Ionenstrahls. Ionenstrahlen von vornehmlich ungefaltetem BSA (Sigma A4919) wurden hergestellt durch Elektrosprühen von Lösungen von 0.4mg/mL in einem 1:1-Gemisch von Wasser und Ethanol gelöstem BSA, zu dem 2%-ige Ameisensäure zugegeben wurde. Bei einer Flussrate von 30µL/hr wurde ein Ionenstrom von 2nA am TOF-MS gemessen. Das Massenspektrum über 1000u/e zeigt die charakteristische Peak-Gruppe mehrfach geladener Proteine (z = +35 ... +60). Der niedrige m/z-Bereich (<1000u/e) wie auch der hohe m/z-Bereich (>2000 u/e) sind frei von jeglichen Peaks, was auf einen reinen Strahl ohne Verunreinigungen und unspezifische Agglomerationen hinweist. b, Übersichtsbild der abgeschiedenen BSA-Proteine mit hohem Ladungszustand auf Graphen. Wie aus dem Massenspektrum erwartet, befindet sich die überwiegende Mehrheit der Proteine in einem entfalteten Zustand. Zwei Bilder hoher Vergrösserung von BSA in einer gefalteten Struktur sind in c und d dargestellt. Die Grössenbalken entsprechen 50nm in b und 5nm in c und d. Das Atommodell von BSA aus der Proteindatenbank (pdb id: 3V03) in den entsprechenden Orientierungen ist in e und f zum Vergleich angezeigt.
- 3: Mit niederenergetischen Elektronen gemessene Hologramme von Cytochrom C und deren Rekonstruktionen. a, Drei Hologramme von CytC, die bei kinetischen Elektronenenergien von 142 eV (links), 132 eV (Mitte) und 117 eV (rechts) aufgenommen wurden. b, Numerische Rekonstruktionen, die das Protein in verschiedenen Orientierungen auf Graphen zeigen. Die Grössenbalken entsprechen 2nm. c, Vorschläge für mögliche, auf der gemittelten Proteinstruktur beruhende Orientierungen, die aus Röntgenkristallographiedaten abgeleitet und in der Proteindatenbank (pdb id: 1HRC) dokumentiert wurden.
- 4: Freistehendes Graphen vor (a) und nach (b) der Abscheidung von 30pA/h nativem CytC. In b werden einzelne kugelförmige Objekte mit einer Grösse von 2-5 nm oder Agglomerate davon beobachtet. Eine derartige Agglomeration wurde zuvor auf einer Au(111) Oberfläche nach Abscheidung von nativem CytC in niedrigen Ladungszuständen beobachtet14. c, Nach der Annäherung der Elektronenpunktquelle an die globulären Objekte können deren Abmessungen gemessen werden, wobei sie der Grösse einzelner gefalteter CytC-Moleküle entsprechen. Die Grössenbalken entsprechen 50 nm in a und b sowie 5 nm in c.
- 5: Mit niederenergetischen Elektronen gemessene Hologramme von zwei einzelnen Hämoglobinen und deren Rekonstruktionen. a, Zwei Hologramme von Hämoglobin, die bei kinetischen Elektronenenergien von 71 eV (links) beziehungsweise 69 eV (rechts) aufgenommen wurden. b, Numerische Rekonstruktionen, die den Proteinkomplex in zwei unterschiedlichen Orientierungen auf Graphen zeigen. Die Grössenbalken entsprechen 5nm. Die diffusen Ringe um das Objekt herum sind auf das Vorhandensein des unscharfen Zwillingsbildes zurückzuführen, das der In-Line-Holographie inhärent ist. c, Vorschläge für mögliche, auf der gemittelten Proteinstruktur beruhende Orientierungen, die aus Röntgenkristallographiedaten abgeleitet und in der Proteindatenbank (pdb id: 2QSS) dokumentiert wurden.
- 6: Zeitlicher Verlauf der Orientierung von CytC-Komplexen. Der Zeitabstand zwischen aufeinanderfolgenden Beobachtungen beträgt 30 Sekunden. Aus diesen Bildern ist ersichtlich, dass zumindest einige der abgeschiedenen Proteine auf dem freistehenden Graphen beweglich sind. Die Holographie mit niederenergetischen Elektronen scheint eine Methode zu sein, um auch die Diffusion von Proteinen auf Oberflächen zu untersuchen. Diese Beobachtung legt nahe, dass ein bei kryogenen Temperaturen arbeitendes Holographiemikroskop mit niederenergetischen Elektronen benötigt werden könnte, um das Protein im Raum zu fixieren und eine atomare Auflösung zu erreichen. Die Grössenbalken entsprechen 5nm.
- 7: Massenspektren von Cytochrom C (links) und Hämoglobin (rechts). Oben: Es sind die m/z-Spektren vor der Massenfilterung angezeigt. Unten: die entsprechenden massengefilterten Spektren.
- 8: UHV-Vakuumkoffer und seine Funktion. a, Dreidimensionale Darstellung des Transportkoffers, welcher den UHV-Transfer von ultrareinem freistehenden Graphen zwischen dem Mikroskop mit niederenergetischen Elektronen und der ES-IBD-Kammer ermöglicht. Projektionsbilder mit niederenergetischen Elektronen vor (b) und nach (c) einem vollständigen Transfer- und Transportzyklus ohne Proteinabscheidung. Im Verlauf des Übertragungsvorgangs zwischen den beiden Vakuumkammern baut sich keine relevante Kontamination des Graphens auf.
- 9: UHV-Vakuumkoffer und seine Funktion. a, Dreidimensionale Darstellung des Transportkoffers, welcher den UHV-Transfer von ultrareinem freistehenden Graphen zwischen dem Mikroskop mit niederenergetischen Elektronen und der ES-IBD-Kammer ermöglicht. Projektionsbilder mit niederenergetischen Elektronen vor (b) und nach (c) einem vollständigen Transfer- und Transportzyklus ohne Proteinabscheidung. Im Verlauf des Übertragungsvorgangs zwischen den beiden Vakuumkammern baut sich keine relevante Kontamination des Graphens auf
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Experimentelle Studien
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Das ultrareine freistehende Graphen wurde nah dem Pt-Metall-Katalyseverfahren hergestellt, das an anderer Stelle ausführlich beschrieben wurde6. Vor dem Transfer des ultrareinen Substrates von der UHV-Kammer des Holographiemikroskops mit niederenergetischen Elektronen in die UHV-Kammer der ES-IBD-Vorrichtung wird die Reinheit des Substrats charakterisiert und Referenzbilder zum Vergleich derselben Region des freistehenden Graphens vor und nach der Proteinabscheidung aufgenommen.
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Während des gesamten experimentellen Prozessablaufs werden die Proben mit Hilfe eines UHV-Koffers unter strikten UHV-Bedingungen für den Transfer zwischen den beiden Experimentierkammern gehalten.
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Details des ES-IBD-Verfahrens und des Versuchsschemas für Holographie mit niederenergetischen Elektronen sind in der Zusatzinformation beschrieben
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Der Prozessablauf zur Bildgebung eines Einzelproteins umfasst mehrere Schritte, wie in 1 dargestellt. Eine Probe aus ultrareinem freistehenden Graphens wird mit dem kürzlich entwickelten Platinmetallkatalyseverfahren hergestellt6 und und im Holographiemikroskop mit niederenergetischen Elektronen charakterisiert (1 oben). Eine derartige Probe wird anschliessend unter permanenten UHV-Bedingungen mittels eines UHV-Koffers, der im Bereich von 10-11 mbar arbeitet, in ein ES-IBD-System (1 Mitte) übergeführt (siehe Zusatzinformation für ausführliche Details). Ionenstrahlen aus nativem Cytochrom -C-(CytC) und Hämoglobin (HG) werden durch Elektronensprayionisierung und Massenfilterung erzeugt. Für CytC werden die Ladungszustände z=5-7 ausgewählt15. Im Fall von HG ist bekannt, dass die Ladungszustände z=16 oder z=17 des intakten Komplexes von nativer Konformation sind16 und daher wird die entsprechende m/z Region ausgewählt (die entsprechenden Massenspektren sind in der Zusatzinformation dargestellt). In einem dritten Experiment wird Rinderserumalbumin (BSA) in hohen Ladungszuständen z=35-60 für die Abscheidung ausgewählt (siehe 2). In allen drei Fällen landen die Ionen mit einer kinetischen Energie von 2-5eV pro Ladung14 auf ultrareinem freistehendem Graphen, wodurch in eine 100nm dicke SiN-Membrane eingefräste Öffnungen von 500×500nm abgedeckt werden 2 6.
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Nach der Abscheidung werden die Proben unter Beibehaltung der UHV-Bedingungen wieder vom ES-IBD-System zurück in das Holographiemikroskop für niederenergetische Elektronen übergeführt, wo Niederenergie-Elektronenhologramme von einzelnen Proteinen aufgezeichnet werden13. Bei diesem experimentellen Schema, das von Dennis Gabors ursprünglicher Idee der Holographie inspiriert ist, werden die Proben einem hoch kohärenten Strahl von niederenergetischen Elektronen ausgesetzt, die von einer atomar scharfen Feldemitterspitze erzeugt werden, die so nahe wie 100nm vor der Probe plaziert ist (1 unten). Das von den gestreuten und den nicht gestreuten Elektronenwellen gebildete Interferenzmuster, das sogenannte Hologramm, wird an einem mehrere Zentimeter entfernten Elektronendetektor aufgezeichnet (für ausführliche Details siehe Zusatzinformation). Die anschliessende numerische Hologrammrekonstruktion mit Rückausbreitung der Wellenfront vom Hologramm zur Probenebene17-19 ergibt schliesslich die Proteinstruktur.
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Hologramme von einzelnen CytC-Proteine und ihre jeweiligen Rekonstruktionen sind in den 3 (a-b) dargestellt. Übersichtsbilder von freistehendem Graphen vor und nach der Abscheidung von CytC sind in 4 dargestellt. Die Formen der abgebildeten Proteine werden mit den Strukturdateninformationen verglichen, die aus röntgenkristallographischen Untersuchungen erhalten wurden und in der Proteindatenbank (pdb id: 1HRC) verfügbar sind. Die Gesamtgrösse des abgebildeten CytC entspricht den erwarteten Abmessungen, und die Niederenergie-Elektronenbilder können Proteinen in mehreren unterschiedlichen Orientierungen zugeordnet werden. Die Auflösung der Elektronenbilder ist ausreichend, um einzelne CytC sowie Agglomerate davon zu identifizieren (3b). Wie zuvor mit DNA8 gezeigt, werden keine Anzeichen für eine Zersetzung des Proteins während der Elektronenexposition beobachtet.
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Aus den Daten, die in der rechten Spalte von 3 angezeigt sind, bleibt es unklar, ob sich das durch mehrere CytC gebildete Agglomerat vor oder nach der Abscheidung gebildet hat. Andererseits sind in 5 zwei Hologramme und ihre jeweiligen Rekonstruktionen von einzelnen Hämoglobinen gezeigt, die belegen, dass es mit unserer Methode nicht nur möglich ist, einzelne Proteine abzubilden, sondern auch ganze biologisch relevante Proteinkomplexe abzuscheiden und abzubilden. Wie es aus den kontrastreichen Bildern von individuellem Hämoglobin ersichtlich ist, werden nicht nur die globuläre Struktur mit den korrekten Gesamtabmessungen des Proteinkomplexes, sondern auch Details seiner Form in verschiedenen Orientierungen sichtbar gemacht. In 5(b rechts) können Strukturmerkmale mit einer Grösse von 0.7-0.8nm eindeutig identifiziert werden und als grobe Auflösungsschätzung für die Niederenergie-Elektronenbilder dienen. In einem Hologramm nimmt der Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Interferenzstreifen zu höheren Ordnungen hin allmählich ab. Dementsprechend sind Interferenzstreifen höherer Ordnung und folglich hoch aufgelöste strukturelle Details am anfälligsten für mechanische Schwingungen. Letztere limitieren derzeit die Auflösung, und es werden intensive Anstrengungen unternommen, um die mechanische Stabilität des Holographiemikroskops für niederenergetische Elektronen zu erhöhen, um diese Beschränkung zu überwinden und eine atomare Auflösung zu erreichen.
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Im jetzigen Stadium hat der Vergleich mit der Proteindatenbankstruktur den Charakter eines Kontrollexperiments. Das zukünftige Ziel besteht jedoch darin, die Struktur von unbekannten Proteinen und all ihrer möglichen Konformationen, die sich nur in der Position einer kleinen Anzahl von Atomen unterscheiden könnten, direkt zu ermitteln. Nichtsdestotrotz bleiben auf dem Weg zu diesem ehrgeizigen Ziel weitere grundlegende Fragen zu klären, wie beispielsweise: der Einfluss des Substrats, die Möglichkeit, unter UHV-Bedingungen eine Hydrathülle hinzuzufügen sowie transportbedingte Aspekte wie die Diffusion von Proteinen und die anschliessende Aggregation zu Proteinkomplexen. Erste Beobachtungen der Diffusion von gefalteten Proteinen auf freistehendem Graphen mittels Holographie mit niederenergetischen Elektronen sind in 6 dargestellt, welche zeigt, dass unser hier beschriebenes Verfahren auch fähig ist, auf dynamische Prozesse zuzugreifen.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, wie ein Einzelprotein durch Kombination der ES-IBD-Technologie und der Holographie mit niederenergetischen Elektronen abgebildet werden kann. Dies hat zum ersten Werkzeug geführt, das jemals Strukturdetails von nativen Einzelproteinen und Proteinkomplexen zeigen konnte, ohne diese zu zerstören. Mit den neusten Fortschritten bei der Elektronensprayionisierung von grossen Proteinkomplexen20 und insbesondere von Membranproteinen21,22 wird möglicherweise sogar die Struktur dieser biologisch wichtigen, aber nur schwer zu kristallisierenden Entitäten in naher Zukunft zugänglich werden.
Während unbedecktes, freistehendes Graphen bereits durch kohärente Beugung mit niederenergetischen Elektronen mit einer Auflösung von 2 Angström abgebildet wurde23, ist es nun eine Herausforderung, die hier beschriebenen Technologien anzupassen, um atomare Auflösung in der Strukturbiologie auf Einzelproteinniveau zu erreichen.
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Zusatzinformation
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Elektronenspray-Ionenstrahl-Deposition (ES-IBD)
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Elektrospray-Ionenstrahldeposition mit sanfter Landung erfolgt in einem selbstgebauten Gerät4,5. Der Ionenstrahl wird durch eine Nano-Elektrospray-Quelle mit einem optimierten hydrodynamischen Verhalten24 bei einer Flussrate von 20-30µL/h und einer Emitterspannung von ungefähr 3kV erzeugt. Die positiven Ionen treten durch eine erwärmte Metallkapillare in das Vakuum ein und werden in einem Ionentrichter sowie einem im nur-RF-Modus betriebenen Stosskollimationsquadrupol kollimiert. In der dritten Pumpstufe wählt ein Massenfilter-Quadrupol die interessierende m/z-Region aus, welche durch das Flugzeit-Massenspektrometer in der vierten Pumpstufe überwacht wird. Hier misst ein verzögernder Feldenergieanalysator die kinetische Energie der Ionen. Der Strahl wird dann in der sechsten Pumpstufe bei 2×10-10mbar durch elektrostatische Linsen in Richtung des Targets geführt, wo die Proteinablagerung stattfindet. Um ein sanftes Landen zu gewährleisten, wird die Kollisionsenergie durch Anlegen einer Vorspannung an das Target kontrolliert und dementsprechend die kinetische Energie der Proteinionen reduziert.
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Um Ionenstrahlen von nativem CytC (bovin, Fluka 30398) zu erhalten, wurde eine Lösung von 0,15 mg/ml in wässrigem 50 mM Ammoniumacetatpuffer hergestellt. Mit einer Sprühflussrate von 25µL/hr wird ein Ionenstrom von 1.1nA am TOF-MS nachgewiesen. Ungefilterte Massenspektren (7 links/oben) zeigen niedrige Ladungszustände von +5 bis +7, was gefaltetem CytC entspricht. Bei niedrigeren m/z-Werten werden Peaks, welche hoch geladenem (z>+8) ungefaltetem CytC entsprechen, sowie Peaks, welche von Fragmenten oder Verunreinigungen stammen, gefunden. Es ist zu beachten, dass aufgrund des begrenzten dynamischen Bereichs des TOF-MS die Detektorverstärkung sehr hoch eingestellt wurde, so dass die Peaks des nativen CytC verzerrt sind. Der m/z-selektive Quadrupol wurde so abgestimmt, dass durch Einstellen einer RF-Amplitude von 700V mit einer differentiellen Gleichspannung von 5% ein m/z-Fenster von 1250 u/e bis ungefähr 3500u/e ausgewählt wird. Dies führt zu einem Strahl aus überwiegend nativem CytC (7 links/unten), aus dem ungefaltete Proteine (niedrige m/z) und undefinierte schwere Aggregate (hohes m/z) entfernt werden.
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Hämoglobin (bovin, Sigma H2500) ist ein Proteinkomplex aus vier Myoglobin-Untereinheiten, und zwar zwei A und zwei B. Ionenstrahlen werden aus Lösungen von 0,3 mg/ml in 50 mM Ammoniumacetatpuffer hergestelltem HG erzeugt. Am TOF-MS wird ein Strom von 600pA nachgewiesen. Das Massenspektrum ist sehr komplex und aufgrund der begrenzten Leistungsfähigkeit bezüglich der Auflösung und des dynamischen Bereichs der selbstgebauten linearen TOF-MS nur teilweise aufgelöst. Nichtsdestotrotz erlaubt ein Vergleich mit Literaturspektren die Identifizierung von charakteristischen Peaks (7 rechts/unten), welche nach Entfernung der unspezifischen Agglomeration im hohen m/z-Bereich (> 5000u/e) durch Massenfilterung mit dem Quadrupol ausgeprägter werden. Der zur Abscheidung übertragene Strahl enthält native intakte HG-Komplexe (Q17+, Q16+) zusammen mit Dimeren (D) und Monomeren (HBA).
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Holographie mit niederenergetischen Elektronen
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Bei der Anordnung für Holographie mit niederenergetischen Elektronen3 ((8), die von Dennis Gabor's ursprünglicher Idee der In-line-Holographie inspiriert ist, 25,26, wirkt eine scharfe (111)-orientierte Wolframspitze als Elektronenpunktquelle (EPS), die einen divergenten Strahl hochkohärenter Elektronen liefert27,28. Der Elektronenemissionsgenerator von atomarer Grösse kann mit Hilfe eines 3-Achsen-Nanopositionierers bis auf 100 nm nah zur Probe gebracht werden. Ein Teil der Elektronenwelle wird elastisch vom Objekt gestreut und daher als Objektwelle bezeichnet, während der nicht gestreute Teil der Welle die Referenzwelle darstellt. Bei einem entfernten Detektor wird das Hologramm, d.h. das Muster, das sich aus der Interferenz dieser zwei Wellenfronten ergibt, aufgezeichnet. Die Vergrösserung des Abbildungssystems ist durch das Verhältnis zwischen Detektor-zu-Quelle-Abstand und Probe-zu-Quelle-Abstand gegeben und kann bis zu 105 betragen. Ein Hologramm enthält im Gegensatz zu einem Beugungsmuster die Phaseninformation der Objektwelle, und dementsprechend kann die Objektstruktur eindeutig rekonstruiert werden. Die numerische Rekonstruktion aus dem Hologramm wird im Wesentlichen durch Rückausbreitung in die Objektebene erreicht, was der Auswertung der Fresnel-Kirchhoff-Integraltransformation entspricht 17-19.
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UHV-Transfer
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Für den Transfer von Proben zwischen den zwei UHV-basierten Experimenten, der Elektronenholographie auf der einen Seite und der Elektrospray-Ionenstrahlabscheidung auf der anderen Seite, kommt ein Vakuumkoffer, 9(a) (Ferrovac GmbH, Zürich) zum Einsatz.
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Der Koffer ist mit einer SAES-Getter/Ionen-Getter-Pumpenkombination ausgestattet, die von einem batteriebetriebenen Netzteil betrieben wird. Der Druck wird zu jedem Zeitpunkt, mit Ausnahme der kurzen Dauer des Transfers (1-2 Minuten), wo er in den Bereich von 1×10-9mbar ansteigt, unter 2×10-10mbar gehalten. Die Leistungsfähigkeit dieses ursprünglich für STM-Experimente entwickelten Koffers ist aus verschiedenen Studien der Oberflächenwissenschaften bekannt29,30. Jedes Instrument ist mit einer Ladeschleuse ausgestattet, an der der Koffer befestigt werden kann. Die Ladeschleuse wird durch eine Turbomolekularpumpe gepumpt, die von einer kryogenen Aktivkohlefalle bei LN2-Temperatur unterstützt. Innerhalb weniger Stunden stellt sich ein Druck im Bereich von 10-9 mbar ein, der einen kontaminationsfreien Transfer der Proben gewährleistet. 9 zeigt Projektionsbilder mit niederenergetischen Elektronen der gleichen freistehenden Graphenregion vor (b) und nach (c) dem Transfer von dem in Zürich befindlichen Holographiemikroskop für niederenergetische Elektronen zu der ES-IBD-Kammer in Stuttgart und zurück zum Mikroskop in Zürich. Es ist kein relevantes Anzeichen für eine Kontamination infolge des Transfers und Transportes beobachtbar.
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Abschliessende Bemerkungen:
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Um das Ziel der Bildgebung von Einzelmolekülen zu erreichen, das hier beispielhaft für den Fall von Einzelproteinmolekülen demonstriert wurde, müssen drei Anforderungen erfüllt und kombiniert werden. Zunächst muss ein Verfahren zur Isolierung von einzelnen Proteinen zur weiteren Untersuchung verfügbar sein, was ganz im Gegenteil zur aktuellen Herausforderung steht, aus Proteinen einen Kristall für die Röntgenanalyse aufzubauen1,2. Darüber hinaus sind Technologien erforderlich, um ein Einzelprotein lange genug raumfest zu halten, um ausreichende Strukturinformationen aus einem Streuexperiment zu sammeln. Zu guter Letzt ist es entscheidend, für die Bildgebung eine sanfte Strahlung einzusetzen mit einer Wellenlänge, die klein genug ist, um strukturelle Details zu ermitteln und die gleichzeitig gewährleistet, dass Strahlenschäden das Protein während der Beobachtung nicht zersetzen, was mit der Holographie mit niederenergetischen Elektronen3 gelingt. Wir haben aufgezeigt, dass die Elektrospray-Strahlendeposition mit sanfter Landung4,5 eine spezifische Auswahl und zuverlässige Abscheidung5 von einzelnen Proteinen und Proteinkomplexen auf ultrareines freistehendes Graphen6 in einer Ultrahochvakuumumgebung ermöglicht. Aufgrund der Tatsache, dass Graphen für niederenergetische Elektronen durchlässig ist7 und dass letztere auf biologische Moleküle nicht schädigend wirken8,9, konnten Elektronenhologramme von einzelnen Proteinen (Cytochrom C und BSA) sowie von Proteinkomplexen (Hämoglobin) mit einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis erfasst werden. Die numerischen Hologramm-Rekonstruktionen ergeben die Gesamtform der einzelnen Proteine. Damit wurden erstmals Bilder von einzelnen gefalteten Proteinen und Proteinkomplexen erhalten, die nicht das Ergebnis eines Mittelungsverfahrens sind.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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