TWI703321B - 脂質微粒包覆化合物之水中成像方法及檢測方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供了一種脂質微粒包覆化合物之水中成像的方法。所述方法包括以下步驟：（a）提供水溶液樣品，其包含脂質微粒，所述脂質微粒含有所述化合物，其中所述水溶液樣品更包括硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）（b）以X光自由電子雷射照射所述水溶液樣品；（c）以影像感測器收集被照射的所述水溶液樣品的複數個同調繞射圖像；以及（d）以計算機重建所述同調繞射圖像，從而獲得含有所述化合物的所述脂質微粒的影像。本發明還提供了一種檢測微脂體包覆化學藥物在水中的品質的方法。

Description

脂質微粒包覆化合物之水中成像方法及檢測方法
本發明係關於一種成像方法，特別是關於一種使用自由電子雷射同調繞射的成像方法。
X光自由電子雷射（X-ray free-electron laser，X-FELs） 1-3正開始在次微米尺度上改變結構學的相關研究 4-7，其會產生個別粒子的詳細資訊。而在金屬奈米顆粒和相對大的病毒 7,8的相關研究上，其結果特別顯著。
微脂體是由脂質所組成的微粒，用於遞送營養品或藥物 17-19。基於其優異、尺寸依賴的傳遞性質，微脂體特別被用來攜帶阿黴素—一種被廣泛使用的抗癌藥物 17,20-24。對於醫療和其他健康相關應用來說，亟欲進一步改善其尺寸和同質性 25,26，更不用說還需符合醫藥品查驗登記的要求。然而，欲達到這些改進，必須透徹了解微脂體的結構特性，然而這並不容易。以普通的成像方法來識別微脂體的形狀、尺寸和是否包裹藥物相當困難，特別是在天然液體環境中進行識別時更不可行，而液體環境對藥物遞送來說是必要條件，且會對其最佳化產生實際影響。
然而，在天然液體環境中無法實施低溫電子顯微術（cryogenic electron microscopy，cryo-EM）。如本發明的情況，在液體溶液採用的常規小角度X光散射技術（SAXS）無法應用於尺寸分佈不勻的非等向奈米棒。這些是現有技術的一般限制，因為攜帶藥物的奈米顆粒的典型結構確實是非等向且不均勻的。類似的限制也會影響其他成像技術：舉例而言，動態光散射（dynamic light scattering） 31提供有用的資訊，但僅呈現多數顆粒的平均情況，且無法檢測到顆粒內部的棒狀藥物。
本發明所提供的方法有顯著的優點。本文顯示，X光自由電子雷射已能對尺寸約為100nm的單一個微脂體顆粒進行成像，且即使這些微脂體顆粒原則上包含弱散射的生物分子，本文的X光自由電子雷射也能在水中 9進行成像，，且也能對微脂體顆粒所攜帶的藥物成像 10-12。其繞射強度特別足以進行同調繞射影像重建（CDI reconstruction） 13-16，這種同調繞射影像重建會產生單一微脂體的量化資訊。此外，本文所提供的X光自由電子雷射同調繞射成像其量化結果與低溫電子顯微鏡（cryo-EM）的數據 27-30和繞射圖案的小角度X光散射（SAXS）的分析結果實質上一致。本文係基於X光自由電子雷射脈衝，藉由對溶液中單一奈米顆粒進行同調繞射成像來解決上述問題。所述實驗使用經特殊設計的樣品架來進行，以分析微脂體。
為了實現上述目的，本發明的一個實施例公開了一種脂質微粒包覆化合物之水中成像的方法。所述方法包括以下步驟：（a）提供水溶液樣品，其包含脂質微粒，所述脂質微粒含有所述化合物，其中所述水溶液樣品更包括硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）（b）以X光自由電子雷射（X-ray free-electron laser，X-FEL）照射所述水溶液樣品；（c）以影像感測器收集被照射的所述水溶液樣品的複數個同調繞射圖像；以及（d）以計算機重建所述同調繞射圖像，從而獲得含有所述化合物的所述脂質微粒的影像。
在一個實施例中，硫酸銨在水溶液樣品中的濃度為1M至6M。
在一個實施例中，脂質微粒為一微脂體（liposome）或一微胞（micelle）。
在一個實施例中，微脂體的尺寸為70 nm至250 nm。
在一個實施例中，微脂體在該水溶液樣品中的濃度為0.5個微脂體/μm 3至1個微脂體/μm 3。
在一個實施例中，X光自由電子雷射（X-FEL）為3.9613 keV光子脈衝。
在一個實施例中，X光自由電子雷射（X-FEL）平均為425.4 μJ/脈衝。
在一個實施例中，水溶液樣品係藉由該X光自由電子雷射（X-FEL）以10 -15秒的持續時間、10Hz的重複頻率所照射。
在一個實施例中，化合物為一化學藥物。
在一個實施例中，化學藥物為阿黴素（doxorubicin）。
在一個實施例中，在以一計算機重建該同調繞射影像圖案的過程中，該方法更包括以下步驟：（d-1-1）將該同調繞射圖像旋轉180度；（d-1-2）在逐像素地旋轉之後移動該同調繞射圖像以識別一原點；以及（d-1-3）在識別該原點之後，將旋轉之前和旋轉之後的各同調繞射圖像進行平均化。
在一個實施例中，在進行平均化的步驟之後，該方法更包括一步驟：（d-2）裁剪經平均的該同調繞射圖像。
在一個實施例中，在進行裁剪的步驟之後，該方法更包括：（d-3-1）將引導混合輸入-輸出（Guided Hybrid Input-Output，GHIO）法應用於各同調繞射圖像以獲得第一初步重建圖像；（d-3-2）使用一傅里葉變換以排除各第一初步重建圖像的中心缺失斑點，接著進行一反向傅里葉變換以填充各第一初步重建圖像的缺失像素，以獲得第二初步重建圖像；（d-3-3）將該第二初步重建圖像旋轉180度，並將經旋轉的該第二初步重建圖像以0.1像素×0.1像素的方式逐像素地移動以識別一原點；以及（d-3-4）在識別該原點之後，將旋轉之前和旋轉之後的各第二初步重建圖像進行平均化。
在一個實施例中，在旋轉之前和旋轉之後對各第二初步重建圖像進行平均化的步驟之後，該方法更包括一步驟：（d-4）藉由將引導混合輸入-輸出（GHIO）法與收縮包覆演算法（Shrink wrap algorithm，SW）合併以進行一最終重建，以獲得含有該化合物的該脂質微粒的該影像。
為了實現上述目的，本發明的另一個實施例公開了一種檢測微脂體包覆化學藥物在水中的品質的方法，該方法包括以下步驟：（a）提供一水溶液樣品，其中該水溶液樣品包含該微脂體及硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）；（b）以X光自由電子雷射（X-FEL）照射該水溶液樣品；（c）以一影像感測器，收集被照射的該水溶液樣品的複數個同調繞射圖像；（d）以一計算機重建該同調繞射圖像，從而獲得一重建影像；以及（e）檢測該重建影像中該化學藥物的結構和尺寸，以決定該水溶液樣品中該化學藥物的該品質。
在一個實施例中，其中硫酸銨在該水溶液樣品中的濃度為1M至6M。
在一個實施例中，其中微脂體的尺寸為70 nm至250 nm。
在一個實施例中，微脂體在該水溶液樣品中的濃度為0.5微脂體/μm 3至1微脂體/μm 3。
在一個實施例中，X光自由電子雷射（X-FEL）為3.9613 keV光子脈衝，且該水溶液樣品係藉由該X光自由電子雷射（X-FEL）以10 -15秒的持續時間、10Hz的重複頻率所照射。
在一個實施例中，化學藥品為阿黴素。
因此，本文係利用X光自由電子雷射來實現水中單一微脂體顆粒的同調繞射成像，不論其有無包覆奈米棒狀結構的阿黴素。儘管橫截面較低，但空白（無藥物）微脂體的繞射強度足以進行空間重建，而產生量化的結構資訊。當顆粒含有阿黴素時，可以測量到奈米棒狀結構的結構參數。在這兩種情況下，所得資訊已遠遠超過小角度X光散射（SAXS）和電子顯微鏡所能得到的資訊。這對於潛力藥物的效率最佳化來說是重要的，並且一般來說對於低橫截面單一奈米顆粒的X-FEL分析也是重要的。
藉由以下的詳細描述以及附圖將使本發明實施例更臻顯著，其中相同的附圖編號表示相同的元件。本發明公開的具體結構及功能細節僅為說明性目的，用來描述本發明示例性實施例。然而，本發明可以透過許多替換來具體實現，並且不應被解釋為僅限於本發明公開的實施例。此外，這些及所有其他參考的外部材料藉由引用而將其整體併為本文揭露之一部份，其程度如同每個單獨的公開文獻被具體地且單獨地指明為以引用方式納入本文。當以引用方式併入本文的參考文獻其術語定義或使用與本文的術語定義不一致或是相牴觸時，以本文所提供的定義為準，不以參考文獻的定義為準。
應理解的是，在本發明的描述中，術語「中心（center）」、「橫向（transversal）」、「向上」、「向下」、「向左」、「向右」、「垂直」、「水平」、「頂部」、「底部」、「內部」及「外部」係代表基於附圖的方位或位置相對關係，其目的僅是為了描述本發明及簡化內容，而不是指示或暗示使用設備或元件一定要具有特定方位或者是要在特定方位上建構及操作，因此這些方位並不是對本發明的限制。此外，術語「第一」及「第二」僅為說明性目的，並不表示或暗示相對的重要性也不隱含指出所指示的技術特徵的數量。因此，由「第一」及「第二」限制的特徵可以明確地或隱含地包括一個或多個該特徵。在本發明的描述中，除非另有描述，否則「多個」的含義包括兩個或多於兩個。另外，術語「包括」及其任何同義詞係旨在涵蓋非排他性內含物。
在本發明的描述中，除非另有明確說明及限制，否則應當廣義地解釋術語「安裝（mount）」、「鏈接（link）」及／或「連接」（connect）。舉例而言，這些術語可以被代表固定連接（fixed connection）、可拆卸連接（detachable connection）或一體式整體（connecting integrally），或者可以代表機械式或電連接；或者，它們可以代表藉由中間介質或兩個元件之間的相互通信來直接連接或間接連接。對於本領域技術人員顯而易見的是，可以根據特定條件來理解本發明中的上述術語的具體含義。
本文所使用的術語僅用於描述特定實施例，並不旨在限制示例性實施例。除非上下文另外明確指出，用於本文中的術語「一個」（one）及「一」（a、an）進一步包括複數形式。還應該理解的是，術語「包括」（comprising）及／或「包含」（including）在本文中是用於描述特徵，以陳述特徵、整體構造（integer）、步驟、操作、單元及／或元件的存在，並不排除存在或增加一個或多個其他特徵、整體構造、步驟、操作、單元、元件及／或其組合。
請參考圖6A，其是根據本發明一實施例脂質微粒包覆化合物之水中成像方法的流程圖。脂質微粒包覆化合物之水中成像方法包括以下步驟S01至S04。所述化合物可以為奈米等級的化學藥物，較佳為阿黴素。步驟S01：提供一水溶液樣品，該水溶液樣品包含該脂質微粒，該脂質微粒含有該化合物，其中該水溶液樣品更包括硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）。步驟S02：以X光自由電子雷射（X-ray free-electron laser，X-FEL）照射該水溶液樣品。步驟S03：以一影像感測器，收集被照射的該水溶液樣品的複數個同調繞射影像。步驟S04：以一計算機重建該同調繞射圖像，從而獲得含有該化合物的該脂質微粒的一影像。
在這個方法中，水溶液樣品中硫酸銨的濃度範圍為1M至6M。水溶液樣品的硫酸銨濃度可以為1.0M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M、5.0M、5.5M、6.0M，或者介於1M和6M之間的任何有理數。脂質微粒可以為微脂體或微胞。當脂質微粒是微脂體時，這種微脂體的尺寸較佳為70nm至250nm，其可以為70nm、80nm、90nm、100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150 nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm、250nm、或70nm至250nm之間的任何整數。此外，水溶液樣品中的微脂體濃度可以為0.5個微脂體/μm 3至1個微脂體/μm 3。
如以下實驗例中所示，本方法中所使用的X光自由電子雷射（X-FEL）可以為3.9613千電子伏特（keV）光子脈衝，平均為425.4μJ/脈衝，持續時間為10 -15秒，重複頻率為10 Hz。
請參考圖6B，其為重建同調繞射影像圖案的較詳細步驟的流程圖。在步驟S04中，以計算機重建該同調繞射影像圖案可進一步包括以下步驟。步驟S041-1：將該同調繞射圖像旋轉180度。步驟S041-2：在逐像素地旋轉之後，移動該同調繞射圖像以識別一原點。步驟S041-3：在識別該原點之後，將旋轉之前和旋轉之後的各同調繞射圖像進行平均化。步驟S042：裁剪經平均化的該同調繞射圖像。步驟S043-1：將引導混合輸入-輸出（Guided Hybrid Input-Output，GHIO）法應用於各同調繞射圖像，以獲得第一初步重建圖像。步驟S043-2：使用一傅里葉變換以排除各第一初步重建圖像的中心缺失斑點，接著進行一反向傅里葉變換來填充各第一初步重建圖像的缺失像素，以獲得第二初步重建圖像。步驟S043-3：將該第二初步重建圖像旋轉180度，並將旋轉後的該第二初步重建圖像，以0.1像素×0.1像素的方式逐像素地移動，以識別一原點。步驟S043-4：在識別該原點之後，將旋轉之前和旋轉之後的各第二初步重建圖像進行平均化。步驟S044：藉由將引導混合輸入-輸出（GHIO）法與收縮包覆演算法（Shrink wrap algorithm，SW）合併以進行一最終重建，以獲得含有該化合物的該脂質微粒的該影像。細節將在以下實驗例中討論。
請參考圖7，其是根據本發明另一實施例的流程圖，其係顯示一種檢測微脂體包覆化學藥物在水中的品質的方法。檢測微脂體包覆化學藥物在水中的品質的方法主要採用前述實施例提供的成像方法，並包括以下步驟S01'至S05'。步驟S01'：提供一水溶液樣品，其中該水溶液樣品包含該微脂體及硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）。步驟S02'：以X光自由電子雷射（X-FEL）照射該水溶液樣品。步驟S03'：以一影像感測器，收集被照射的該水溶液樣品的複數個同調繞射圖像。步驟S04'：以一計算機重建該同調繞射圖像，從而獲得一重建影像。步驟S05'：檢測該重建影像中該化學藥物的結構和尺寸，以決定該水溶液樣品中該化學藥物的品質。
類似地，在這個方法中，水溶液樣品中硫酸銨的濃度可以為1M至6M。微脂體的尺寸可為70nm至250nm，且水溶液樣品中微脂體的濃度較佳為0.5個微脂體/μm 3至1個微脂體/μm 3。本文所使用的X光自由電子雷射（X-FEL）也可以為3.9613千電子伏特（keV）光子脈衝，持續時間為10 -15秒，重複頻率為10Hz。
前述方法的每個細節元件與其他元素的連接關係或其他變化可以參考前面的實施例，此處不再贅述。
為了說明前述實施例所提供的方法的功能和特徵，以下顯示幾個實驗實施例。
實驗例
材料和方法
以配有直接檢測裝置（direct detection device，DDD）的5K×4K像素相機和低溫樣品架的JOEL 2100fx儀器來進行低溫電子顯微鏡分析。樣品係用Leica EM GP儀器來製備，該儀器會快速凍結玻璃質冰中的微脂體顆粒。
同調繞射成像測試係以SACLA（SPring-8 Angstrom Compact free electron LAser）X光自由電子雷射進行，並使用3.9613千電子伏特（keV）光子脈衝，平均為425.4 μJ/脈衝，持續時間為10飛秒（fs），重複頻率為10Hz。使用柯克派屈克─貝茨型（Kirkpatrick-Baez，KB）鏡系統將脈衝聚焦在樣品上，並將範圍限制至1.3×1μm 2。
將含有顆粒的溶液置於具有24×24個間室的微液體間室陣列（micro-liquid enclosure array，MLEA）樣品晶片 4中，在兩側以厚度為100nm的氮化矽（SiN）膜密封。每個間室的體積為20×20×2μm 3。將微液體間室陣列置於SACLA多應用X光成像腔室（Multiple Application X-ray Imaging Chamber，MAXIC）儀器的真空系統中 33。
以X光束掃描晶片位置，而每次掃描時，每個間室僅被一個X光自由電子雷射脈衝擊中。如果間室含有顆粒，則會在被破壞前產生繞射圖案。
該溶液的濃度相當於每1μm 3約有1個微脂體。這大大降低了每個脈衝探測時有多於一個微脂體的可能性，而多於一個微脂體的情況係不利於同調繞射影像重建 34,35。但是，應注意的是，濃度不能太低，以避免結果大部分是零繞射。本實驗例發現上述濃度是最佳的，並產生超過50％可用的繞射圖案，相當於於每個MLEA晶片成功重建超過100次。
繞射圖案是以多端口電荷耦合設備（multiport charge-coupled device，MPCCD）八進制感應器進行記錄，感應器的總面積為2399×2399像素（像素尺寸=50×50μm 2） 36。樣品至檢測器的距離為1.51公尺。
同調繞射成像數據分析和重建過程如下。第一，由於繞射圖案必須為中心對稱的（center-symmetric），因此將所得的圖案旋轉180度，並逐像素地移動圖像，以藉由最小化L1範數（norm）來找到原點。在辨識出原點後，將原始圖案和經旋轉的圖案進行平均化。第二，將分析圖像裁剪為471×471和601x601像素大小。所重建出的圖像其對應的像素解析度預計為20.0 nm和15.7nm。
第三，對每個圖像採用引導混合輸入-輸出法 16以得到初步重建圖像。然後對這些重建圖像進行傅立葉變換，排除中心缺失斑點，並使用反向變換以填充缺失像素。最後，重複第一步驟，但將圖像偏移限制在0.1像素，獲得強化後（refined）的圖案。藉由合併引導混合輸入-輸出和收縮包覆演算法（SW）對每個經強化的圖案進行最終重建。使用寬鬆支持（loose support）來確保使用支持約束（support constraint）時不會刪除相關信號。重建過程中的每次迭代，會隨機生成16個初始相位，以獲得16個不同的重建影像。為了生成下一次迭代的新支持，對16個圖像的平均值進行高斯平滑處理並除去背景。本實施例並非如同習知收縮包覆演算法的那樣找出收斂支持，而是迫使新支持小於前一個支持（小於10個像素）。
在20次迭代中監測16個重建影像的轉變。支持（support）從鬆散變為過度裁剪。16個重建圖像的分佈相應地從發散被修改為收斂，然後又改回發散。當大多數重建圖像一致時，得到最終支持。接著根據最終圖像和最終支持重複進行引導混合輸入-輸出法重建。當錯誤度量停滯時，停止重建。
結果和討論
圖1顯示空白和含有阿黴素的微脂體的低溫電子顯微圖像。應注意的是，只有某個嚴格尺寸範圍內被微脂體顆粒包覆，且為棒狀結構的藥物才有療效且經官方核可用於醫療用途。圖1（b）和圖1（c）顯示與此一標準的顯著偏差：所述標準即為，微脂體之尺寸約80nm至大於250nm（且在藥物的工業級生產過程中需要尺寸篩選）。此外，雖然一些微脂體含有具有正確形狀的阿黴素（即，棒狀—參見例如圖1b中的箭頭所標記的顆粒），但其他微脂體所含的阿黴素其形狀是不可接受的。此外，一些微脂體完全不含阿黴素，而其它微脂體則被包含在較大的微脂體中。這些特徵無法藉由粒子平均技術（如SAXS）所檢測—然而這些特徵對治療效果、藥物顆粒的最佳化和在人類用藥的工業級製程中的強制性管制來說至關重要。
圖2顯示了不含阿黴素的兩個微脂體其代表性同調繞射成像結果；圖2（a）是繞射圖案，圖2（b）是以引導混合輸入-輸出（GHIO）法 15處理後的圖案，圖2（c）是得到的重建結果。在這種被廣泛使用的影像處理技術中，圓形約束（circular constraint）改善了影像的外觀，但不會改變基本幾何特徵。圖2（d）和圖2（e）顯示了繞射圖案和另一個微脂體的重建結果。由重建結果中本文直接得知每個微脂體的尺寸，在兩種情況下均為約100±20nm。
關於空間解析度，同調繞射成像受到最大可檢測散射向量的限制（即受限於可測量到繞射的最大角度）。本實驗裝置可以在最佳化的條件下達到10nm的解析度。然而，以小角度X光散射法（類似SAXS），實際所能達到的解析度預計為約20nm。當然，這不是最終的性能。隨著訊號雜訊的改善，解析度還能更好。應注意的是，本文的時間解析度（見下文）為10飛秒（fs），因此不受旋轉或擴散運動等因素的影響。其他例如奈米粒子聚集等因素被重建圖像所排除，符合低溫電子顯微鏡的結果。
為了證實從同調繞射成像所導出的顆粒尺寸，在所有方向上對每個q值的強度（q=動量轉移量）進行積分，而從繞射圖案計算出似SAXS曲線（SAXS-like curves）。圖5顯示了五種不同顆粒所得到的曲線。與真實SAXS曲線的關連僅是近似的，因為本文的同調繞射成像圖案不對不同粒子進行平均。然而，似SAXS曲線與標準程序 32的擬合合理地證實了將結果限定於100-200nm範圍內而從同調繞射成像所推導出來的尺寸。
圖2的結果產生了一個有趣的問題：若成分的標稱散射能力弱，要如何檢測同調繞射成像圖案？本文的微脂體的實際組成可解答這個問題。實際上，這些微脂體是用與含微脂體的藥物相同的工業級製程所生產的。因此，這些微脂體可能因前驅溶液（precursor solution）而包含大量殘留的硫酸銨(NH 4) 2SO 4。估計該化合物在2M溶液（遠低於電子密度比水高30-50％的飽和濃度（~6M））中的繞射強度可以產生本文微脂體圖像中所檢測到的對比度。圖3顯示了在液體環境中四個含阿黴素的微脂體其同調繞射成像結果。重建結果清楚地顯示了阿黴素的棒狀結構顆粒。在重建圖像中看到的長度和寬度必然對應棒狀結構的二維投影。投影大小在40-80nm（寬度）和120-200nm（長度）的範圍內，長寬比為0.25-0.6。鑑於低溫電子顯微分析的數據，這樣的結果是非常符合的。
須注意的是，圖3的繞射圖案僅顯示與棒狀結構相關的特徵，但沒有顯示像微脂體所預期的圓形特徵。為了解釋這一點，必須再次考慮前驅溶液中(NH 4) 2SO 4的作用。圖4顯示了模擬結果。具體來說，圖4（c）顯示了含有藥物的微脂體其模擬繞射圖案，此模擬繞射圖案是將由微脂體的(NH 4) 2SO 4所造成的模擬圓形繞射圖案納入而從圖4（a）修改而得。圖4（d）顯示了對應的重建圖像，其顯示球形微脂體，這在圖4（b）的真實重建圖像中是看不見的。圖4（e）和圖4（f）顯示了類似於圖4（c）和4（d）系統的模擬圖案和重建結果，但在濃度降至500 mM的硫酸鹽水溶液中，已不再看到與微脂體相關的特徵了。
舉例而言，本實驗例的數據顯示空白脂質體中的(NH 4) 2SO 4濃度為約2M；而若是具有藥物的棒狀結構，則濃度則降低至小於1M。因此，測量結果（包括空白脂質體的測量）提供關於溶液且難以藉由其他方式獲得的重要化學訊息，特別是在含有帶藥微脂體的液體中其硫酸銨濃度。測得的硫酸銨濃度降低現象證實了先前的假設，硫酸鹽在棒狀結構的形成期間被納入棒狀結構中，而使其從溶液中被消耗掉。
結論
SACLA X光自由電子雷射的性能足以讓利用同調繞射影像重建所進行的單一奈米顆粒成像技術，從高X光吸收系統擴展至弱吸收體的應用。空白微脂體的結果與低溫電子顯微分析的量化結果是一致的。此外，X光自由電子雷射同調繞射成像技術會檢測到包裹在微脂體中的阿黴素奈米棒狀結構，並量測出它們的結構特性。
本發明結果的重要性在於將藥物裝載於微脂體奈米顆粒中的工業級製程進行最佳化，如同人類用藥官方審查程序中所要求的。更廣泛地說，本文結果證明，目前X光自由電子雷射同調繞射成像可以在液體環境中，以小於100nm的尺寸對具有標稱低繞射截面的單一奈米顆粒進行成像，因此其有比先前技術的建議適用範圍更廣。
因此，本發明的結果十分重要，特別是因為微脂體奈米載體是目前最廣泛使用的載體。而由本文結果可以預想到諸如奈米金載體等其他載體系統的未來發展，因為相較於其他載體的情況，微脂體的情況已是非常困難。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本創作之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
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S01~S04、S041-1~S041-3、S042、S043-1~S043-4、S044、S01'~S05'：步驟
藉由以下的詳細描述以及附圖將使本發明實施例更臻顯著，這些描述和附圖僅用於說明，而非用以限制本發明，其中：
圖 1為微脂體顆粒的低溫電子顯微鏡影像。（a）空白組和（b）含阿黴素的微脂體（（a）中的黑點是修飾微脂體的奈米金顆粒）。（c）經處理以符合人類治療要求的含阿黴素微脂體，其尺寸和形狀更為均勻。比例尺=200 nm。
圖 2為不含阿黴素的單一微脂體其同調繞射成像的代表性圖像。（a）至（c）顯示了單個微脂體的典型結果：（a）繞射圖像；（b）以引導混合輸入-輸出處理（初步重建）後的相同圖像；（c）真實空間中所對應的重建影像（誤差因子為0.1741）。比例尺=100nm。（d）和（e）為另一個不含藥物的微脂體的繞射圖像和重建影像。色標為任意單位。
圖 3為四個獨立的同調繞射成像圖像，各自顯示一個含有阿黴素的微脂體。（a）至（d）為繞射圖案；（e）至（h）為前述圖案所對應的重建影像。比例尺=200nm。
圖 4為含有阿黴素微脂體個別的同調繞射成像圖像的模擬結果及其所對應之重建圖像。（a）和（b）是實驗獲得的含有藥物的微脂體其繞射圖像和同調繞射影像重建結果。（c）和（d）是含有2M的(NH 4) 2SO 4溶液的結果，如同在生產過程中所用到的。這些模擬結果顯示，應該可以看到微脂體的相關特徵，然而在圖4中並非如此。（e）和（f）是將(NH 4) 2SO 4溶液濃度降至500mM的結果：微脂體的相關特徵消失。比例尺=200nm。
圖 5為自本文的同調繞射成像圖像所導出的似小角度X光散射曲線（SAXS-like curves）。如文中所解釋的，每條曲線係各自對應於一個微脂體。如此獲得的尺寸介於100至200nm的範圍內。
圖 6A為根據本發明的一個實施例的脂質微粒包覆化合物的水中成像的方法的流程圖。
圖 6B為根據本發明的一個實施例的脂質微粒包覆化合物的水中成像的方法的流程圖。
圖 7為根據本發明的一個實施例的檢測微脂體包覆化學藥物在水中的品質的方法的流程圖。
S01~S04：步驟

Claims (20)

  1. 一種脂質微粒包覆化合物之水中成像的方法，包括： 提供一水溶液樣品，該水溶液樣品包含該脂質微粒，該脂質微粒含有該化合物，其中該水溶液樣品更包括硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）； 以X光自由電子雷射（X-ray free-electron laser，X-FEL）照射該水溶液樣品； 以一影像感測器，收集被照射的該水溶液樣品的複數個同調繞射圖像；以及 以一計算機重建該同調繞射圖像，從而獲得含有該化合物的該脂質微粒的一影像。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該硫酸銨在該水溶液樣品中的濃度為1M至6M。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該脂質微粒為一微脂體（liposome）或一微胞（micelle）。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該微脂體的尺寸為70 nm至250 nm。
  5. 如申請專利範圍第3項所述的方法，其中該微脂體在該水溶液樣品中的濃度為0.5個微脂體/μm 3至1個微脂體/μm 3。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該X光自由電子雷射（X-FEL）為3.9613 keV光子脈衝。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的方法，其中該X光自由電子雷射（X-FEL）平均為425.4 μJ/脈衝。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的方法，其中該水溶液樣品係藉由該X光自由電子雷射（X-FEL）以10 -15秒的持續時間、10Hz的重複頻率所照射。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該化合物為一化學藥物。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該化學藥物為阿黴素（doxorubicin）。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在以一計算機重建該同調繞射影像圖案的過程中，該方法更包括： 將該同調繞射圖像旋轉180度； 在逐像素地旋轉之後移動該同調繞射圖像以識別一原點；以及 在識別該原點之後，將旋轉之前和旋轉之後的各同調繞射圖像進行平均化。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中在進行平均化的步驟之後，該方法更包括一步驟： 裁剪經平均的該同調繞射圖像。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的方法，其中在進行裁剪的步驟之後，該方法更包括： 將引導混合輸入-輸出（Guided Hybrid Input-Output，GHIO）法應用於各同調繞射圖像以獲得第一初步重建圖像； 使用一傅里葉變換以排除各第一初步重建圖像的中心缺失斑點，接著進行一反向傅里葉變換以填充各第一初步重建圖像的缺失像素，以獲得第二初步重建圖像； 將該第二初步重建圖像旋轉180度，並將經旋轉的該第二初步重建圖像以0.1像素×0.1像素的方式逐像素地移動以識別一原點；以及 在識別該原點之後，將旋轉之前和旋轉之後的各第二初步重建圖像進行平均化。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的方法，其中在旋轉之前和旋轉之後對各第二初步重建圖像進行平均化的步驟之後，該方法更包括一步驟： 藉由將引導混合輸入-輸出（GHIO）法與收縮包覆演算法（Shrink wrap algorithm，SW）合併以進行一最終重建，以獲得含有該化合物的該脂質微粒的該影像。
  15. 一種檢測微脂體包覆化學藥物在水中的品質的方法，包括： 提供一水溶液樣品，其中該水溶液樣品包含該微脂體及硫酸銨（(NH 4) 2SO 4）； 以X光自由電子雷射（X-FEL）照射該水溶液樣品； 以一影像感測器，收集被照射的該水溶液樣品的複數個同調繞射圖像； 以一計算機重建該同調繞射圖像，從而獲得一重建影像；以及 檢測該重建影像中該化學藥物的結構和尺寸，以決定該水溶液樣品中該化學藥物的該品質。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該硫酸銨在該水溶液樣品中的濃度為1M至6M。
  17. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該微脂體的尺寸為70 nm至250 nm。
  18. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該微脂體在該水溶液樣品中的濃度為0.5個微脂體/μm 3至1個微脂體/μm 3。
  19. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該X光自由電子雷射（X-FEL）為3.9613 keV光子脈衝，且該水溶液樣品係藉由該X光自由電子雷射（X-FEL）以10 -15秒的持續時間、10Hz的重複頻率所照射。
  20. 如申請專利範圍第15項所述的方法，其中該化學藥品為阿黴素。
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