JP4965518B2 - 透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドおよびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド（ｇｒｉｄ）およびその製造方法に関する。より詳細には、上部構造を保護するシートメッシュと、シートメッシュ上に具備してナノ粒子が分散している支持膜とを含む、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドおよびその製造方法に関する。

透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）は、ナノ規模で材料や医生物を研究するのに最も普遍的な研究装備として認識されている。

一般的に透過電子顕微鏡は、試料を透過した電子によって形成される２次元のイメージを観察するため、空間分解能が約０．１ｎｍ程度と優秀である。

しかし、試料の厚さ方向の情報には、電子の進行方向上の上部に位置した物体の影が下部の物体と重なったり、上部に位置した物体の情報と下部に位置した物体の情報とが互いに重畳したりするなどの問題が発生するようになり、重畳した情報を正確に把握することが難しい。

このような問題点を解決したり補ったりするために最近では、医薬分野のＣＴ（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈ）技術を応用したＴＥＭトモグラフ（Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）またはＳＴＥＭトモグラフなどが開発されている。前記技術を使用して非晶質材料、高分子材料（化学材料）、および医生物の３次元構造解析を含めた半導体の故障解析など、応用範囲が拡大している。

前記のＴＥＭトモグラフまたはＳＴＥＭトモグラフ技術を使用して試料の３次元映像を得る過程を、下記に簡略に説明する。

まず、透過電子顕微鏡観察が可能になるように薄膜試料を準備する。薄膜試料の試料準備は超薄切片法、分散法、およびＦＩＢ法（Ｐｉｃｋ−ｕｐ法、Ｍｉｃｒｏ−ｓａｍｐｌｅｉｎｇ法など）などのうちからいずれか一つの方法を使用できる。超薄切片法で準備する医生物や高分子薄膜試料の場合、染色を進行させる場合がある。

そして薄膜試料をグリッドに付着し、更に標式を付着する。

そして、薄膜試料と標式が付着したグリッドを、ＴＥＭトモグラフまたはＳＴＥＭトモグラフが可能な透過電子顕微鏡の試料支持台に入れて撮影することによって、２次元映像を得る。薄膜試料を連続的に傾斜させることによって、複数の２次元映像を得る。

そして、２次元イメージをコンピュータ処理することによって、３次元イメージに再構築する。

２次元イメージから３次元イメージに再構築する時、付着した標式を基準点に使用して再構築することになる。
米国特許出願公開第２００４／００５７５５６号公報 米国特許第７，１９４，１２２号明細書 米国特許第７，３６６，２７９号明細書

従って前記標式は、２次元イメージを３次元イメージに再構築する際に重要な役割をする。付着した標式の大きさ、数量および分布の適切性の有無は、ＴＥＭトモグラフまたはＳＴＥＭトモグラフの分解能だけではなく、ＴＥＭトモグラフまたはＳＴＥＭトモグラフの成敗を左右し得る。

薄膜試料によっては、標式付着のための条件設定に多くの時間と努力を要する。場合によっては標式付着に失敗する場合もある。すなわち、前記標式を過多に付着するなどの理由によって、薄膜試料が覆い隠されたり、標式が付着しない標式付着失敗が発生したりする場合もある。

このような作業は、効率的なＴＥＭトモグラフまたはＳＴＥＭトモグラフの作業に大きな障害になっており、不必要な時間浪費の主要原因である。よって、標式付着過程の高効率化のために標式付着過程の改善が求められている。

以上のことに鑑みて、本発明は、このような従来技術の諸般の短所と問題点を解決するための研究の結果、上部構造を保護するシートメッシュと、シートメッシュ上に具備されナノ粒子が分散している支持膜とを含むことを特徴とする、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを製作する。該グリッドが、試料準備過程で別途の標式付着工程を行なわずに効率的に３次元イメージを得ることができることを確認して、本発明を完成した。

本発明の目的は、別途の標式付着工程を行なわずに効率的に３次元イメージを得ることができるようにする、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを提供することにある。

本発明の他の目的は、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドの製造方法を提供することにある。

前記目的を達成するために本発明は、上部構造を保護するシートメッシュと、シートメッシュ上に具備されてナノ粒子が分散している支持膜とを含む透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを提供し、ナノ粒子は２次元イメージを３次元イメージに再構築時の基準点になることを特徴とする。

本発明の目的は、支持膜形成用パウダとクロロホルムを混合して支持膜形成用混合溶液を製造する工程（工程１）と、前記混合溶液に一定量のナノ粒子を混合して超音波を使用して分散させる工程（工程２）と、ナノ粒子が分散した前記混合溶液にガラス基板を浸漬させる工程（工程３）と、前記混合溶液に浸漬してナノ粒子が沈積したガラス基板を一定速度で引き上げた後に自然乾燥させることによって、基板ガラス表面にナノ粒子が分散した支持膜を形成する工程（工程４）と、および、前記支持膜をガラス基板から分離してそ
して支持膜にシートメッシュを積層させることによって３次元観察専用グリッドを形成する工程（工程５）とを含む、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドの製造方法を提供する。

本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドは、従来の３次元観察のための試料準備過程を単純化して、効率的な観察を可能にする。更に、試料を付着する前に標式を具備している。よって従来のグリッドとは異なり、標識を付着することが難しくて３次元イメージを得にくかった試料の３次元観察を可能にする。

本発明は、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを提供する。
本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドは、上部構造を保護するシートメッシュと、シートメッシュ上に具備されてナノ粒子が分散している支持膜とを含むことができる。

ナノ粒子は、以後、透過電子顕微鏡で獲得した２次元イメージを３次元に再構築する時、基準点または標式として使用される。従ってナノ粒子の平均粒径は３〜２００ｎｍで、透過電子顕微鏡の２次元イメージに標式として残ることができる大きさおよび物質からなることが好ましい。

たとえばナノ粒子は、球形および８面体のような多面体などで形態が一定で、マグネシウムの密度（１．７８３ｇ／ｃｍ^３）よりも大きな非晶質または結晶質物質でありさえすれば使用できる。またナノ粒子に使用され得る物質は、具体的には非晶質シリカ、結晶金粒子、銀、白金、アルミナおよびα−Ｆｅ_２Ｏ_３などがある。この理由として、ナノ粒子は２次元イメージで一定形態の標式として残っていさえすれば良いからである。

本発明は、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドの製造方法を提供する。
本発明の製造方法は、支持膜形成用パウダとクロロホルムを混合して支持膜形成用混合溶液を製造する工程（工程１）と、前記混合溶液に一定量のナノ粒子を混合して超音波を使用して分散させる工程（工程２）と、ナノ粒子が分散した前記混合溶液にガラス基板を浸漬させる工程（工程３）と、前記混合溶液に沈積されたガラス基板を一定速度で引き上げた後に自然乾燥させることによって、基板ガラス表面にナノ粒子が分散した支持膜を形成する工程（工程４）と、および、前記支持膜をガラス基板から分離して支持膜にシートメッシュを積層させることによって３次元観察専用グリッドを形成する工程（工程５）とを含む。

前記方法で製造した本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドは、以下の問題点を解決できる。従来では試料準備工程、グリッド準備工程、グリッド上に試料付着工程、試料が付着したグリッド上に標式付着工程、多角度イメージ獲得工程、および３次元再構築工程の順に、透過電子顕微鏡３次元観察を進行した。つまり従来では、多角度イメージ獲得前に、グリッド上に試料と標式を順次に付着した。よって従来では、試料によっては標式付着工程のための条件設定に多くの時間と努力を要した。つまり従来では、場合によっては標式付着に失敗する場合もあり、非効率的な実験進行が行なわれていた。しかし本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを使用することによって、このような問題点を解決できる。

本発明の目的と技術的構成およびそれによる作用効果に関する詳しい事項は、本発明の好ましい実施例を図示している図面を参照した以下詳細な説明によって、より明確に理解
されるだろう。明細書全体にわたって同一な参照番号は、同一構成要素を示している。

図１は、本発明の一実施例による透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を示した斜視図である。

図１に示すように、本発明の一実施例による透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００は、シートメッシュ１１０と支持膜１２０を含む。

本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００において、支持膜１２０には、内部および表面に均一にナノ粒子１３０が分散されていることができる。ナノ粒子１３０は、透過電子顕微鏡で観察する時、一定の大きさで均一に表示される。

ナノ粒子１３０は、平均粒径が３〜２００ｎｍ、好ましくは観察倍率によって２０〜１００ｎｍであることが好ましい。

ナノ粒子１３０は、２次元イメージで一定形態の標式として残っていさえすれば良い。よってナノ粒子１３０は、球形や８面体のような多面体などであり、そして形態一定で、大きさ一定であれば如何なる物質を使用しても構わない。ナノ粒子１３０は、このような条件を満足し、かつマグネシウムの密度（１．７８３ｇ／ｃｍ^３）よりも大きな非晶質または結晶質物質でありさえすれば使用できる。またナノ粒子１３０に使用され得る物質は、具体的には非晶質シリカ、結晶金粒子、銀、白金、アルミナ、およびα−Ｆｅ_２Ｏ_３などである。ナノ粒子１３０の大きさ、形態および材質は、試料によって変化させることができる。

本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００において、支持膜１２０は、フォームバー（Ｆｏｒｍｖａｒ）、コロジオン（Ｃｏｌｌｏｄｉｏｎ）およびビューツバル（Ｂｕｔｖａｒ）のうちの一フイルムからなることができる。

本発明の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００において、シートメッシュ１１０は、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を支える構造物である。シートメッシュ１１０の大きさは試料の大きさによって決定できる。

一般的にシートメッシュ１１０のメッシュ（＃）の大きさは、５０、７５、１００、１５０、２００等の多様な大きさであることができる。シートメッシュ１１０のメッシュ（＃）の大きさを選択する際、試料の大きさよりも小さく、ナノ粒子１３０の大きさよりも大きなメッシュ（＃）の大きさを選択して使用することが好ましい。この理由は、試料中の被観察領域に対して多角度で２次元観察イメージを得る時、視野が遮られることが起きないようにする大きさでなければならないからである。

ここでシートメッシュ１１０の外径は、多様な大きさ（たとえば２ｍｍまたは３ｍｍ）にすることができるが、透過電子顕微鏡試料支持台（ＴＥＭ ｈｏｌｄｅｒ）の試料設置部分の内径に相応しい大きさで使用する。必要な場合には、シートメッシュ１１０を２等分または２／３に切断して使用したりする。

シートメッシュ１１０の材質は、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｕ、ＰｔおよびＭｏなどからなり得る。

従って本発明の一実施例による透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００では、支持膜１２０の内部および表面にナノ粒子１３０が均一に分散している。このため、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００上（正確には支持膜１２０表面上）に試料を付着
して、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を透過電子顕微鏡に装入して多角度で観察すると、試料とナノ粒子１３０がそれぞれ試料イメージと標式によって表示される多数個の２次元イメージを獲得できる。よって標式を基準点にして、２次元イメージを３次元イメージに再構築できるようになる。

透過電子顕微鏡内に装入された透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００上の試料について、所定の角度範囲（たとえば＋６０゜〜−６０゜）内で角度を変化させながら多数個の２次元イメージを獲得する。

図２（ａ）〜図２（ｉ）は、本発明の一実施例による透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００の製造方法を示す。

図２（ａ）に示すように、まず第１ビーカ２１０などに支持膜形成用パウダとクロロホルムを混合して、支持膜形成用混合溶液２２０を製造する。

支持膜形成用パウダは、フォームバーパウダ、コロジオンパウダおよびビューツバルパウダのうちのいずれか一つであり得る。

ここで本発明では、フォームバーパウダを使用して支持膜形成用混合溶液２２０を製造した。支持膜形成用混合溶液２２０を製造する方法としては、フォームバーパウダとクロロホルムを混合して、０．３％のフォームバー支持膜形成用混合溶液を製造した。

続いて図２（ｂ）に示すように、支持膜形成用混合溶液２２０の中にナノ粒子１３０を混合する。ナノ粒子１３０は、平均粒径が３〜２００ｎｍで、形態が球形で比重が大きい非晶質粒子であることが好ましい。ナノ粒子１３０の材質としては、ナノ粒子１３０が透過電子顕微鏡のイメージにおいて標式になることができるように、透過電子顕微鏡で撮影され得る物質なら、何を使用しても構わない。本発明ではナノ粒子１３０には、非晶質でありかつ球形であるシリカを使用した。

そしてナノ粒子１３０が混合した支持膜形成用混合溶液２２０に超音波を加えて、ナノ粒子１３０が支持膜形成用混合溶液２２０中に均一に分散するようにする。超音波には、図示していないが超音波洗浄器を使用できる。すなわちナノ粒子１３０が混合した支持膜形成用混合溶液２２０が入っている第１ビーカ２１０を、超音波洗浄器に装入し、一定時間にわたって超音波を第１ビーカ２１０に加える。その結果、ナノ粒子１３０を支持膜形成用混合溶液２２０中に均一に分散できる。

次に図２（ｃ）に示すように、ナノ粒子１３０が分散した支持膜形成用混合溶液２２０中にガラス基板２４０を浸漬させる。

続いて図２（ｄ）に示すように、ガラス基板２４０を支持膜形成用混合溶液２２０外部に一定速度で引き上げる（矢印２４５方向）。ガラス基板２４０の引上げ速度は、分速１ｃｍ〜分速１０ｃｍの範囲にする。ガラス基板２４０は、表面に支持膜形成用混合溶液２２０と、支持膜形成用混合溶液２２０に分散しているナノ粒子１３０とが付着した状態で外部に出るようになる。

そしてガラス基板２４０を自然乾燥させることによって、ナノ粒子１３０が分散した支持膜母体２２５を製造する。支持膜母体２２５には、図３の写真のようにナノ粒子１３０が分散している。

続いて図２（ｅ）に示すように、支持膜母体２２５を剃刀刃またはナイフなどの切断部
材２５０で切断して、一定の大きさの支持膜１２０を形成する。

続いて図２（ｆ）に示すように、ガラス基板２４０を、蒸留水２６０を入れた第２ビーカ２７０に入れる。すると、一定の大きさの支持膜１２０はガラス基板２４０から分離して、蒸留水２６０の表面に浮かぶ。

次に図２（ｇ）に示すように、蒸留水２６０表面に浮かんでいる支持膜１２０上に、一つ以上のシートメッシュ１１０を積層させる。シートメッシュ１１０は、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を支える構造物であり、大きさは試料の大きさによって決定できる。すなわち、シートメッシュ１１０のメッシュ（＃）の大きさは、試料中の被観察領域に対して多角度で２次元観察イメージを得る時に視野が遮られることが起きない程度に大きくなければならない。

続いて図２（ｈ）に示すように、シートメッシュ１１０が積層された支持膜１２０上にパラフィルム２９０を積層させる。パラフィルム２９０は、シートメッシュ１１０と支持膜１２０を、蒸留水２６０から引き上げる時に保護する役割をする。

続いて、支持膜１２０とシートメッシュ１１０からなる透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド母体２００と、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド母体２００を保護するパラフィルム２９０とを、ピンセット３００などを使用して蒸留水２６０から引き上げる。

続いて図２（ｉ）に示すように、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド母体２００を蒸発皿４００などに移動させた後、自然乾燥させる。蒸発皿４００にはあらかじめ油紙４１０などを敷いておいて、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド母体２００から蒸留水が容易に流れ出るようにする。

続いて、図２では図示していないが、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド母体２００をパラフィルム２９０から分離することによって、図１の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を完成する。

図４は、本発明の一実施例によって製造された透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を使用して、透過電子顕微鏡で３次元立体映像を獲得する方法を示したフローチャートである。

図４に示すように、まず図２の上記方法で透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を製造する（ステップＳ１）。

続いて、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００上に試料を付着する（ステップＳ２）。透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００は、シートメッシュ１１０、ナノ粒子１３０が分散した支持膜１２０、および試料の順に積層されている。

続いて、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００を透過電子顕微鏡内部に装入して装着する（ステップＳ３）。

続いて、透過電子顕微鏡内部に装着された試料を多角度で観察して、多数の２次元イメージを獲得する（ステップＳ４）。２次元イメージは、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００上に付着している試料を＋６０゜〜−６０゜まで角度を変化させながら獲得する。獲得した２次元イメージには、試料のイメージだけではなく、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００の支持膜１２０に分散したナノ粒子１３０が標式として存在するようになる。

続いてコンピュータを使用して、獲得された２次元イメージを３次元イメージに再構築する（ステップＳ５）。２次元イメージを３次元イメージに再構築する時、２次元イメージに現われる標式を基準点にして再構築する。標式は、図３を参照して説明したナノ粒子１３０がイメージで現われたものである。

従って本発明は、シートメッシュ１１０と、ナノ粒子１３０が分散している支持膜１２０とを含む透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００と、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド１００の製造方法とを提供する。よって従来とは異なり、３次元の透過電子顕微鏡イメージを得にくかった非晶質試料、医生物試料および化学試料などのイメージを手軽に得ることができる。更に、標式に使用されるナノ粒子１３０が支持膜１２０内部に予め分散しているため、試料付着後に標式を付着する過程を省略できる。よって実験過程を単純化できる効果がある。

本発明は、以上で詳しくみたように好ましい実施例を挙げて図示して説明したが、前記の実施例に限定されず、本発明の精神を逸脱しない範囲内で当該発明が属する技術分野で通常の知識を有する者によって多様な変更と修正が可能だろう。

本発明の一実施例による透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを示した斜視図。 図２（ａ）〜図２（ｉ）は、図１の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドの製造工程を示した図。 本発明の一実施例による、ナノ粒子が分散した支持膜を透過電子顕微鏡で撮影した写真の図。 図１の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドを使用して、透過電子顕微鏡で３次元立体映像を獲得する方法を示したフローチャート。

１００：透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド
１１０：シートメッシュ
１２０：支持膜
１３０：ナノ粒子

Claims (8)

1. 上部構造を保護するシートメッシュと、
   前記シートメッシュ上に具備されナノ粒子が分散している支持膜と
   を備える透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドであって、
   前記ナノ粒子は２次元イメージを３次元イメージに再構築する時の基準点になることを特徴とする、透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッド。
2. 前記ナノ粒子の平均粒径は３〜２００ｎｍである、請求項１に記載のグリッド。
3. 前記ナノ粒子の形態は球形または多面体である、請求項１または２に記載のグリッド。
4. 前記ナノ粒子は、マグネシウムの密度（１．７８３ｇ／ｃｍ^３）よりも大きな非晶質または結晶質物質である、請求項３に記載のグリッド。
5. 請求項１に記載の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドの製造方法であって、前記製造方法は、
   支持膜形成用パウダとクロロホルムを混合して支持膜形成用混合溶液を製造する工程と、
   前記支持膜形成用混合溶液に一定量のナノ粒子を混合して超音波を使用して分散させる工程と、
   前記ナノ粒子が分散した前記支持膜形成用混合溶液にガラス基板を浸漬させる工程と、
   前記支持膜形成用混合溶液に浸漬してナノ粒子が沈積したガラス基板を一定速度で引き上げた後、自然乾燥させることによって前記基板ガラスの表面に前記ナノ粒子が分散した支持膜を形成する工程と、および
   前記支持膜を前記ガラス基板から分離して、前記支持膜にシートメッシュを積層させて３次元観察専用グリッドを形成する工程と
   を備える、請求項１に記載の透過電子顕微鏡３次元観察専用グリッドの製造方法。
6. 前記ナノ粒子の平均粒径は３〜２００ｎｍである、請求項５に記載の製造方法。
7. 前記ナノ粒子の形態は球形または多面体である、請求項６に記載の製造方法。
8. 前記ナノ粒子は、マグネシウムの密度（１．７８３ｇ／ｃｍ^３）よりも大きな非晶質または結晶質物質である、請求項６に記載の製造方法。

Images