JP6203056B2 - 白金ナノ粒子の物理蒸着を用いたイメージング質量分析方法 - Google Patents

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Description

本発明は、白金ナノ粒子の物理蒸着を用いたイメージング質量分析方法に関する。
具体的には、イメージング質量分析に供する試料の表面にイオン化支援マトリックスとして白金ナノ粒子を物理蒸着するサンプル調製方法、並びに、当該サンプルを用いたイメージング質量分析方法に関する。
生化学、医療、ゲノム創薬等の分野においては、生体組織及び細胞内のタンパク質等の構造解析を行いたいという要求が強い。かかる要求に応える分析手段として、質量分析が挙げられる。この質量分析は、試料にレーザーを照射し、その試料に含まれる生体分子等をイオン化し、発生したイオンの質量を分析するものである（非特許文献１）。
生体組織における目的物質の局在を解明することは、疾患時における異常物質の探索、薬物動態追跡等の分野で非常に価値がある。目的物質を直接発見し、同定する手法の一つが質量分析であるが、近年、二次元的に生体組織中の目的物質の同定、局在の解明を行うイメージング質量分析（ＩＭＳ：imaging mass spectrometry）が提案されている（特許文献１〜４、非特許文献２〜３等）。
二次元的に生体組織中の物質の分布の可視化及び同定が行えれば、病変部位の特定及び疾患関連物質（中間体含む）の解明など、in vivoでの情報が直接得られるため社会的貢献が大きい。また、近年、著しい高機能化が進む材料・ナノテク分野においても、高機能化をもたらす物質の分布・局在状態を分析することは、性能発現、製造条件、劣化状態等に大きな影響を及ぼすため、ＩＭＳにより得られる情報は極めて有用である。
ところで、質量分析を行うには、試料をイオン化する必要があり、イオン化法として、イオン化支援剤（マトリックス）フリーの二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、マトリックスを用いることにより高分子物質も分析可能なマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）等の利用が知られている。
従来のＩＭＳでも、これらのイオン化法が採用されているが、ＳＩＭＳで質量分析できる範囲は、質量電荷比（ｍ／ｚ）がたかだか１０００程度であり、しかも試料の大部分はイオン化過程で壊れてしまい（いわゆるフラグメント化）、混合物試料の場合にはスペクトルが複雑になり解析が困難となる問題がある。そのため、ＩＭＳにおけるイオン化法としては試料のフラグメント化が少ないＭＡＬＤＩが一般的であるが、既存のＭＡＬＤＩを用いたＩＭＳには次のような問題がある。
既存のＭＡＬＤＩでは、イオン化を支援するマトリックスとして、化学合成物質（有機マトリックス）、金属酸化物や金属ナノ粒子を溶媒に分散したもの（無機マトリックス）が知られている。そして、有機マトリックスとしては、1,8-dihydroxy-9(10H)-anthracenone (Dithranol)、2-(4-hydroxy phenylazo) benzoic acid (HABA)、2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB)、α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)、sinapinic acid (SA)等があり、解析物質（タンパク質、ペプチド、合成高分子等）に応じて選択して使用されている。
従来のＩＭＳでは、全て既存のＭＡＬＤＩ用の有機マトリックスが使用されているが、元来これらの有機マトリックスはＩＭＳ用に開発された物ではないため、イオン化効率は高いが、塩が混在するとマトリックス能が低下するか又は失われる。そのため、塩を含む生体組織のような生の試料を解析するＩＭＳには不適である。また、有機マトリックス由来のイオンピークが低分子量域（ｍ／ｚ：７００以下）に強く現れるため、目的物質が低分子量の薬物、添加剤等である場合には、正確な解析が困難である。
また、既存の有機マトリックスをＩＭＳで使用する際は、マトリックスは液体（溶液）状態で滴下又は噴射されて試料上に付着し、分析対象物質を取り込む。そして、乾燥されると分析対象物質を含んだ結晶粒が形成される。このときのマトリックスの結晶粒のサイズは一般に５０μｍ程度以上である（非特許文献４）。分析対象物質はこのマトリックスの結晶粒中に分散しているため、イオン化のためのレーザー光の照射径を小さくしても、マトリックスの結晶粒径よりも高い空間分解能を得ることはできない。
更に、液体のマトリックスを試料に付着させると、用いた液体により目的物質の物理的移動（いわゆるマイグレーション）が起こり、分析対象物質の分布情報が失われていく。しかも、液体のマトリックスを試料に付着させると、結晶粒が組織を被覆するために視覚情報が失われ、試料中の部位を特定し難くなる。ＩＭＳを行う際は、解析中に試料の像をＣＣＤカメラ又は顕微鏡で観察できることが望ましいが、マトリックスの結晶粒が試料を被覆していると、どこの部位をイメージングしているのか判別が困難である。また、解析後にどこの部位から目的物質が得られたかを確認することも困難である。
他方、金属ナノ粒子を溶液で分散した無機マトリックスを用いたとしても、ヘキサン、アルコール等の分散媒を使用するため、有機マトリックスの溶液を用いる場合と同様に、目的物質のマイグレーションが起こり、局在を正確に解析することは困難である。
最近、液体のマトリックスを用いない手法として、金蒸着を用いたＩＭＳが提案されている（非特許文献５）。この方法は、イオン化を支援するために試料の表面に金蒸着させることを特徴としている。しかしながら、この方法では、ナノ粒子化した金を蒸着するには特別な装置が必要な点、金由来のイオンピークがスペクトルに強く現れることで目的物質のピークが小さくなるか又は検出できなくなる点で更なる改善の余地がある。
よって、試料のイオン化支援のためのマトリックスを用いるイメージング質量分析方法であって、イオン化効率が高く、マイグレーションや視覚情報の低減が抑制されており、マトリックス由来の妨害ピークがなく、高い空間分解能で解析が可能な、改善されたイメージング質量分析方法の開発が望まれている。
なお、本発明に関連する他の従来技術として、特許文献５及び非特許文献６がある。これらの文献には、レーザー脱離イオン化法（ＬＤＩ：Laser Desorption Ionization）用のＬＤＩプレートであって、試料のイオン化を補助するイオン化補助粒子として白金粒子を有するＬＤＩプレートが開示されている。しかしながら、これらの文献には、白金粒子を分散した分散液を用いて白金粒子をプレートに担持させることは記載されているが、白金を試料の表面に物理蒸着することやイメージング質量分析に適用することについては全く示唆されていない。
特開２００８−２３２８４２号公報 特開２００７−３０９８６０号公報 特開２００７−１５７３５３号公報 特開２００９−０４２２０６号公報 特開２００８−２０４６５４号公報
内藤康秀、「生体試料を対象にした質量顕微鏡」、 J. Mass Spectrom. Soc. Jpn., Vol. 53, No. 3, 2005, pp.125-132. Ales Svatos、「Mass spectrometric imaging of small molecules」、Trends in Biotechnology、Vol. 28, 2010, pp.425-434. Yuki Sugiura & Mitsutoshi Setou, 「Imaging Mass Spectrometry for Visualization of Drug and Endogenous Metabolite Distribution:Toward In Situ Pharmacometabolomes」、J Neuroimmune Pharmacol 、Vol.5, 2010, pp.31-43. Yuki Sugiura, Shuichi Shimma, and Mitsutoshi Setou、「Two-Step Matrix Application Technique To Improve Ionization Efficiency for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization in Imaging Mass Spectrometry」、Anal. Chem. Vol.78, 2006, pp.8227-8235. Ho-Wai Tang, Wei Lu, Chi-Ming Che, and Kwan-Ming Ng、「Gold Nanoparticles and Imaging Mass Spectrometry: Double Imaging of Latent Fingerprints」、Anal. Chem. Vol.82, 2010, pp. 1589-1593. Tetsu YONEZAWA, Hideya KAWASAKI, Akira TARUI, Takehiro WATANABE, Ryuichi ARAKAWA, Toshihiro SHIMADA, and Fumitaka MAFUNE，「Detailed Investigation on the Possibility of Nanoparticles of Various Metal Elements for Surface-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry」、ANALYTICAL SCIENCES 、VOL. 25、2009，pp.339-346.
本発明は、試料のイオン化支援のためのマトリックスを用いるイメージング質量分析方法であって、イオン化効率が高く、マイグレーションや視覚情報の低減が抑制されており、マトリックス由来の妨害ピークがなく、高い空間分解能で解析が可能な、改善されたイメージング質量分析方法を提供することを主な目的とする。
本発明者は上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、イメージング質量分析に供する試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することによりサンプルを調製する場合には上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、下記のイメージング質量分析方法及びイメージング質量分析用のサンプル調製方法に関する。
１．イメージング質量分析に供する試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することによって調製されたサンプルを用いることを特徴とするイメージング質量分析方法。
２．前記白金ナノ粒子の平均粒子径は２〜２０ｎｍである、上記項１に記載のイメージング質量分析方法。
３．前記物理蒸着により形成される白金ナノ粒子層の厚さは２〜５０ｎｍである、上記項１又は２に記載のイメージング質量分析方法。
４．前記物理蒸着は、マグネトロンスパッタリングによる物理蒸着である、上記項１〜３のいずれかに記載のイメージング質量分析方法。
５．マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イメージング質量分析装置を用いる、上記項１〜４のいずれかに記載のイメージング質量分析方法。
６．イメージング質量分析に供する試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することを特徴とするイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
７．前記白金ナノ粒子の平均粒子径は２〜２０ｎｍである、上記項６に記載のイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
８．前記物理蒸着により形成される白金ナノ粒子層の厚さは２〜５０ｎｍである、上記項６又は７に記載のイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
９．前記物理蒸着は、マグネトロンスパッタリングによる物理蒸着である、上記項６〜８のいずれかに記載のイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
以下、本発明のイメージング質量分析方法及びイメージング質量分析用のサンプル調製方法について詳細に説明する。
本発明のイメージング質量分析方法は、イメージング質量分析に供する試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することによって調製されたサンプルを用いることを特徴とする。
上記特徴を有する本発明のイメージング質量分析方法は、白金ナノ粒子が試料のイオン化支援のためのマトリックスとして作用し、高いイオン化効率と空間分解能が得られる。また、液体のマトリックスを使用しない点で試料のマイグレーションが抑制されている上、白金ナノ粒子の物理蒸着は試料表面の視覚情報の低減につながらないため、解析中にＣＣＤカメラや顕微鏡で試料表面を観察することもできる。更に、白金ナノ粒子に由来の妨害ピークが実質的に観測されないため試料由来のピークを高精度で解析することができる。このような優れた効果は、物理蒸着により粒径の揃った白金ナノ粒子を試料表面に付着させることができることに基づくものと推測されている。そして、本発明のイメージング質量分析方法は、生化学、医療、ゲノム創薬、材料・ナノテク分野におけるイメージング質量分析に幅広く利用することができる。
本発明のイメージング質量分析方法を適用できる試料は限定されず、例えば、生体組織又は細胞を含む生体標本が挙げられ、具体的には、動物や植物由来の組織切片や、平板上に付着培養された動物や植物や微生物の培養細胞などが挙げられる。例えば、植物であれば、樹木、草木、花、実、葉、根、茎等が挙げられる。また、動物であれば、臓器、脳、組織、皮膚、毛、細胞等が挙げられる。組織切片を作製する際は、生体組織を必要に応じて瞬間冷凍した後に薄くスライスし、真空乾燥後又はそのまま組織切片として用いることができる。培養細胞であれば、例えば、レーザーマイクロダイセクションを用いて準備することができる。そして、これらの生体標本に含まれる目的物質（分析対象物質）としては、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等の生体物質や、生体に投与された農薬、医薬品等の合成低分子化合物、合成ポリマー、これらが生体組織中で代謝されることで生じる外因性代謝物等が挙げられる。
また、試料として材料・ナノテク分野の試料を用いることもできる。当該試料としては、例えば、非鉄金属、セラミックス、機能性材料、電池材料、光学材料、炭素繊維、自動車材料、グラファイト、活性炭、層間絶縁膜、有機半導体材料、高分子材料、低分子材料、有機ＥＬ材料、添加剤、染料、インク等が挙げられる。
本発明のイメージング質量分析方法は、上記試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することによって調製されたサンプルを用いる。ここで、物理蒸着（ＰＶＤ：Physical Vapor Deposition）としては、真空容器中で白金を気化させて、基板上の試料表面に薄膜として堆積させる方法であれば限定されず、真空蒸着、分子線蒸着（ＭＢＥ）、イオンプレーティング、イオンビーム蒸着、コンベンショナルスパッタリング、マグネトロンスパッタリング、イオンビームスパッタリング、ＥＣＲスパッタリング等の方法が挙げられる。これらの物理蒸着法の中でも、本発明ではマグネトロンスパッタリングが好ましい。
マグネトロンスパッタリングは、従来、高分解能走査電子顕微鏡（ＨＲ−ＳＥＭ）観察のための前処理として、絶縁物試料表面に導電性を持たせる用途に利用されており、例えば、既報（I. STOKROOS, D. KALICHARAN, J. J. L. VAN DER WANT, W. L. JONGEBLOED、Journal of Micrscopy, Vol. 189, 1998, pp.79-79.）に記載された方法を本発明で用いるマグネトロンスパッタリングとして利用することができる。
物理蒸着により試料表面に堆積される白金ナノ粒子は、平均粒子径は２〜２０ｎｍであることが好ましく、２〜１０ｎｍであることがより好ましい。また、粒度分布は１〜１０であることが好ましく、１〜５であることがより好ましい。堆積層（白金ナノ粒子層）の厚さは２〜５０ｎｍであることが好ましく、１０〜３０ｎｍであることがより好ましい。そして、物理蒸着により堆積される上記白金ナノ粒子は、市販の白金ナノ粒子と異なり、粒子表面に保護剤（有機分子、高分子等）が付着していない純粋な白金ナノ粒子である。なお、本明細書における白金ナノ粒子の平均粒子径及び粒度分布並びに体積層の厚さは、電子顕微鏡観察により測定した値である。
本発明では、物理蒸着を用いることにより試料表面に粒径の揃った白金ナノ粒子を堆積させることができる。上記範囲のナノオーダーの微粒子の堆積であれば、試料表面の視覚情報を低減させるおそれがない。また、液体のマトリックスの使用と異なり、試料のマイグレーションを抑制することができる。白金ナノ粒子は試料のイオン化支援のためのマトリックスとして作用するわけであるが、白金ナノ粒子自体はレーザー照射によりイオン化されることなく効率的に試料のイオン化を支援することができるため、高いイオン化効率と空間分解能が得られるとともに、マトリックス由来の妨害ピークの発生を回避することもできる。よって、本発明では検出信号のＳ／Ｎ比や感度が向上し、試料由来のピークを高精度で解析することができる。
図１（ａ）はカーボン表面に物理蒸着法により白金を蒸着した際のＳＥＭ像であり、（ｂ）は磁気テープ表面に物理蒸着法により金を蒸着した際のＳＥＭ像であり、（ｃ）は従来のＭＡＬＤＩ用有機マトリックス（有機マトリックスはシナピン酸である）をスプレー法により付着させた際のＳＥＭ像である。これらのＳＥＭ像を比較すると、白金を物理蒸着した場合に極めて粒径の揃ったナノ粒子を均一に堆積させることができることが分かる。これに対し、金を物理蒸着した場合には白金を物理蒸着した場合よりも粒径が大きく更に粒径にバラツキが多いことが分かる。後述の実施例５及び比較例１の結果から明らかなように、白金蒸着によるマトリックスの方が金蒸着によるマトリックスと比較してイメージング質量分析の精度が高いが、かかる結果の違いは、物理蒸着により得られる微粒子の均一性の相違に基づくものであると推測される。また、金蒸着の場合には、金粒子に由来する妨害ピークの発生が認められるため、この点からも本発明の白金蒸着の優位性が認められる。
本発明では、上記手法により調製したサンプルによりイメージング質量分析を行うが、本発明はイメージング質量分析方法だけでなく、上記手法によるイメージング質量分析用のサンプル調製方法についても包含する。
上記サンプルによりイメージング質量分析を行う際は、サンプルにレーザーを照射し、試料のイオン化を行う。レーザーの波長は２５０〜６００ｎｍ程度が好ましく、試料上での照射径が５０μｍ以下となるように集光光学系により調整されることが好ましい。具体的には、分析対象の試料が細胞の場合には、レーザー光の照射径を１０μｍ以下（数μｍ程度）にまで絞ることが望ましい。本発明では、白金ナノ粒子に微小径のレーザーが照射されると白金ナノ粒子がレーザーを吸収し、白金ナノ粒子と試料との相互作用（エネルギー転移）により試料分子がイオン化される。他方、白金ナノ粒子はイオン化されない。従って、本発明のイメージング質量分析方法によれば、分析対象物質に応じた既存のマトリックスの選択の手間を省いて、一律の方法で質量分析を実施することができるため、従来よりも操作が簡便である。
試料をイオン化した後は、イオン化された分子を検出する。本発明では、上記イオン化、検出及びイメージングを一つのイメージング質量分析装置（例えば、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置：装置名「AutoFlex III」：Bruker社製）により行うことができるが、この装置に限定されず、市販のＭＡＬＤＩとイメージング装置とを組み合わせて使用することもできる。
本発明では、サンプルの任意の位置で質量分析及び解析を行うことにより、目的物質のイメージング（２次元）質量分析を行うことができる。本発明では、試料表面に白金ナノ粒子を物理蒸着する手法であるため、試料のマイグレーションや視覚情報の喪失が回避されているため、分析中にＣＣＤカメラや顕微鏡で試料表面を観察することもできる。観察に用いるＣＣＤカメラや顕微鏡は、公知のものを常法に従って使用できる。
本発明のイメージング質量分析方法は、白金ナノ粒子が試料のイオン化支援のためのマトリックスとして作用し、高いイオン化効率と空間分解能が得られる。また、液体のマトリックスを使用しない点で試料のマイグレーションが抑制されている上、白金ナノ粒子の物理蒸着は試料表面の視覚情報の低減につながらないため、解析中にＣＣＤカメラや顕微鏡で試料表面を観察することもできる。更に、白金ナノ粒子に由来の妨害ピークが実質的に観測されないため試料由来のピークを高精度で解析することができる。このような優れた効果は、物理蒸着により粒径の揃った白金ナノ粒子を試料表面に付着させることができることに基づくものと推測されている。そして、本発明のイメージング質量分析方法は、生化学、医療、ゲノム創薬、材料・ナノテク分野におけるイメージング質量分析に幅広く利用することができる。
（ａ）はカーボン表面に白金を物理蒸着した際のＳＥＭ像であり、（ｂ）は磁気テープ表面に金を物理蒸着した際のＳＥＭ像であり、（ｃ）は従来のＭＡＬＤＩ用有機マトリックス（有機マトリックスはシナピン酸である）をスプレー法により付着させた際のＳＥＭ像である。 実施例１において、スライドガラスの上に指を押し付けた後、白金ナノ粒子を物理蒸着した際に指紋が明確に浮かび上がったことを示す図である。 実施例１において、基板領域のマススペクトル（ｍ／ｚ）と指紋領域のマススペクトル（ｍ／ｚ）とを比較した図である。 実施例１において、指紋領域に存在する質量電荷比（ｍ／ｚ）が１０００以上の物質のイメージングである。 （ａ）は実施例２において、帯状のカラー印刷（マゼンダ色）を行った領域と、ＵＶ照射により印刷を劣化させた領域（白く色抜け）とを示す図である。（ｂ）は白金ナノ粒子を物理蒸着した後の状態（サンプル）を示す図である。 実施例２において、印刷領域、印刷領域（ＵＶ照射後）、紙領域、紙領域（ＵＶ照射後）の各領域でのマススペクトル（ｍ／ｚ）を示す図である。 実施例２において、ＵＶ照射により消失した物質のイメージングである。 実施例２において、ＵＶ照射により生じた分解物のイメージングである。 実施例２において、ＵＶ照射により消失しない物質のイメージングである。 実施例２において、紙領域に分布している物質のイメージングである。 （ａ）は実施例３において、ＴＬＣ上で３種類の染料を展開させた状態を示す図である。（ｂ）は白金ナノ粒子を物理蒸着した後の状態（サンプル）を示す図である。 実施例３において、質量分析により３種類の染料が全て検出されていることを示すマススペクトル（ｍ／ｚ）である。 実施例３において、解析された３種類の染料のイメージングである。 （ａ）は実施例４において、ＴＬＣ上で３種類の糖を展開させた状態を示す図である。（ｂ）は解析された３種類の糖のイメージングである。（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）は、それぞれ質量分析により３種類の糖が全て検出された結果を示すマススペクトルである。 実施例４において、解析された３種類の糖の化学構造とＴＬＣ上で３種類の糖を展開させたイメージングである。 実施例５（白金蒸着）と比較例１（金蒸着）において、基板上に黒色インクで描いた“井”の字に由来するイオンピークの違いを相対的に示した図である。 実施例５（白金蒸着）と比較例１（金蒸着）において、白金蒸着の方が金蒸着よりもイメージング質量分析能が高いことを示す図である。 実施例６において、ＴＬＣ上に、各種濃度のメチレンブルー溶液を滴下し、その上から白金ナノ粒子を物理蒸着した状態を示す図である。 実施例６において、質量電荷比（ｍ／ｚ）が３７２の物質のイオンピーク分布を画像化したイメージングである。 実施例６において、検出された各濃度における質量電荷比（ｍ／ｚ）が３７２の物質のピーク強度値を示す図である。 （ａ）は実施例７において、インクスポット上に白金ナノ粒子（平均粒径５ｎｍ）のメタノール分散液を塗布して得られたサンプルのＩＭＳイメージングである。（ｂ）はインクスポット上に白金蒸着して得られたサンプルのＩＭＳイメージングである。 実施例８及び比較例２で得られたマススペクトルを示す図である。 実施例９及び比較例３で得られたマススペクトルを示す図である。 実施例１０及び比較例４で得られたマススペクトルを示す図である。 実施例８〜１０及び比較例２〜４におけるマススペクトルの強度を比較したグラフである。 実施例８及び比較例２のアセフェートの分布を視覚化したものである。アセフェート由来のｍ／ｚ＝２０６のピークを採用した。点線の丸は滴下した領域を示す。 実施例１１及び比較例５で得られたマススペクトルを示す図である。 実施例１１及び比較例５におけるマススペクトルの強度を比較したグラフである。 実施例１２のアセタミプリドの分布を視覚化したものである。アセタミプリド由来のｍ／ｚ＝２４５のピークを採用した。点線の丸は滴下した領域を示す。 実施例１３で得られたマススペクトルを示す図である。 実施例１３の２種のアセタミプリドとチオファネートメチルの分布を視覚化したものである。アセタミプリド由来のｍ／ｚ＝２４５のピークとチオファネートメチル由来のｍ／ｚ＝３６５のピークを採用した。 実施例１４で得られたマススペクトルを示す図である。 実施例１４の葉のアセフェートの分布を視覚化したものである。アセフェート由来のｍ／ｚ＝２０６のピークを採用した。 実施例１４の茎のアセフェートの分布を視覚化したものである。アセフェート由来のｍ／ｚ＝２０６のピークを採用した。
以下に実施例及び比較例を示して本発明を具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されない。
実施例１（指の付着物のＩＭＳによる直接分析）
クロムコートしたスライドガラスの上に指を押し付けた。その上にマグネトロンスパッタリング装置（装置名「E-1030」Hitachi製）によって平均粒子径３ｎｍの白金ナノ粒子を厚さ２０ｎｍで薄く蒸着した。その結果、指紋が明確に浮かび上がった（図２参照）。
ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、指紋のＩＭＳ測定と解析を行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：６０％
・測定間隔：１００μｍ
その結果、白金を蒸着したガラスからは、指紋由来の強い多数のシグナル群が質量電荷比（ｍ／ｚ）＝１００〜３００の間で得られた（図３参照）。他方、白金を蒸着しないガラスからは、指紋由来のピークは観測されなかった。
測定されたピーク群は、１４Ｄａの間隔（ＣＨ２＝１４）で現れることから、指紋中の脂肪族系化合物であると判断するのが妥当である。得られたピーク群の内、特に質量電荷比（ｍ／ｚ）＝１６０．６のピークに注目してＩＭＳ分析したところ、指紋領域の分布と一致していた。一方、ガラス基板由来の質量電荷比（ｍ／ｚ）＝２１０．９のピークは、指紋領域では検出されなかった。また、指紋領域の質量電荷比（ｍ／ｚ）が１０００以上の高分子量物質（ｍ／ｚ＝１１１１、１１３５、１１８７の３種類）についても指紋由来のピークが観測され、ＩＭＳ分析したところ、指紋領域の分布と一致していた（図４参照）。
白金蒸着することにより、ガラスに押し付けた指紋領域を高精度で質量分析できた。本手法は、犯罪捜査などの科学捜査に有効であると期待される。
実施例２（印刷物のＩＭＳによる直接分析と劣化評価）
インクジェット印刷により、紙の上に２ｍｍの間隔で帯状のカラー印刷（マゼンダ色）を行った。次に、印刷物の劣化評価を行うために、印刷箇所のある一部分にＵＶ照射を３０分間行った。ＵＶ照射により、印刷物の劣化が生じて色が変色（白く色抜け）することが観察された（図５（ａ）参照）。
その上にマグネトロンスパッタリング装置（装置名「E-1030」Hitachi製）によって平均粒子径３ｎｍの白金ナノ粒子を厚さ２０ｎｍで薄く蒸着した（図５（ｂ）参照）。
ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、サンプルのＩＭＳ測定と解析を行った。一方、白金ナノ粒子を蒸着しなかったものをコントロールサンプルとした。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：７０％
・測定間隔：２００μｍ
その結果、ＵＶ照射していない箇所（印刷領域）からは、マゼンダ色の顔料成分であるｍ／ｚ＝６０２．８のピークが観察され（図６参照）、その分布は、帯状の印刷パターンと一致していた（図７参照）。
一方、ＵＶ照射によって変色した箇所（印刷領域・ＵＶ照射後）からは、マゼンダ色の顔料成分であるｍ／ｚ＝６０２．８のピークは観測されなかった（図６参照）。代わりに、ＵＶ照射の箇所（印刷領域・ＵＶ照射後）からは、ＵＶ照射によって生じた分解生成物に由来するピークがｍ／ｚ＝１８７．９に新たに現れ（図６参照）、その分布は、ＵＶ照射の円形パターンと一致していた（図８参照）。
更に、ＵＶ照射しても分解しないｍ／ｚ＝１７１．９の顔料成分（図９参照）、並びに紙領域に分布するＵＶ照射しても分解しないｍ／ｚ＝３９３．１の成分（図１０参照）が存在していることも判明した。
なお、白金ナノ粒子を蒸着しないサンプルからは顔料や紙の成分を検出できなかった。白金ナノ粒子を蒸着することにより、マゼンダ色の顔料成分、紙の成分の分布、光劣化で生じる物質の分布と分析ができた。本手法は、印刷部や塗料など成分分布や劣化解析に有効であると期待される。
実施例３（ＴＬＣ分離物のＩＭＳによる直接分析１）
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：Thin-Layer Chromatography）用のプレート上に、染料３種類（ローダミンＢ：緑色、ローダミン１２３：赤色、クリスタルバイオレット：紫色）の混合溶液をスポットし、ＴＬＣ上で展開させた。ＴＬＣプレート上で移動した染料スポットの目視観察では、３種類の染料のうち２種類（ローダミン１２３：赤色とクリスタルバイオレット：紫色）は確認できたが、残り１種類の染料（ローダミンＢ：緑色）は確認できなかった（図１１（ａ）参照）。
その上にマグネトロンスパッタリング装置（装置名「E-1030」Hitachi製）によって平均粒子径３ｎｍの白金ナノ粒子を厚さ２０ｎｍで薄く蒸着した（図１１（ｂ）参照）。一方、白金ナノ粒子を蒸着しなかったものをコントロールサンプルとした。
ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、サンプルのＩＭＳ測定と解析を行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：４０％
・測定間隔：２００μｍ
その結果、ＴＬＣ上の染料スポットから、ローダミンＢ、ローダミン１２３、クリスタルバイオレットが３種類全て検出された（図１２参照）。
ＩＭＳによるイメージング分析により、目視では判別できなかった染料であるローダミンＢが、他の染料のスポットと一部重なって存在することが確認できた（図１３参照）。このため、目視ではローダミンＢが確認できなかったことが判明した。
なお、白金ナノ粒子を蒸着しなかったＴＬＣプレートからは、いずれの染料成分も検出できなかった。白金ナノ粒子を物理蒸着することにより、ＴＬＣ上で分離した試料の同定を行えるだけでなく、試料成分のスポットの重なりにより目視では判別できない試料の同定にも有効であることが実証できた。
実施例４（ＴＬＣ分離物のＩＭＳによる直接分析２）
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ：Thin-Layer Chromatography）用のプレート上に、３種類の糖（グルコース、マルトース、マルトトリオース）の混合溶液をスポットし、ＴＬＣ上で展開させた。ＴＬＣプレート上で移動した糖のスポットは、目視はできなかった（図１４（ａ）参照）。その上にマグネトロンスパッタリング装置（装置名「E-1030」Hitachi製）によって平均粒子径３ｎｍの白金ナノ粒子を厚さ２０ｎｍで薄く蒸着し、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、サンプルのＩＭＳ測定と解析を行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：５０％
・測定間隔：３００μｍ
ＩＭＳによるイメージング分析により、ＴＬＣ上に３種類のスポットＡ，Ｂ，Ｃが確認され（図１４（ｂ）参照）、それぞれの箇所のマススペクトルから、スポットＡ，Ｂ，Ｃがそれぞれグルコース、マルトース、マルトトリオースであることが判明した（図１４（ｃ）（ｄ）（ｅ）、及び図１５参照）。
ＩＭＳによるイメージング分析により、目視では判別できなかった糖の存在を確認できた。一般的に糖は有色でないため、ＴＬＣ上で移動したスポットの位置を、糖の酸化や糖の化学修飾により発色させてスポット位置の確認を行う。ＩＭＳによるイメージング分析では、発色させるための操作をすることなく、糖を確認できることが判明した。
なお、白金ナノ粒子を物理蒸着しなかったＴＬＣプレートからは、いずれの糖成分も検出できなかった。白金ナノ粒子を蒸着することにより、ＴＬＣ上で分離した試料の同定を行えるだけでなく、有色でないために目視では判別できない試料の同定にも有効であることが実証できた。
実施例５及び比較例１（白金蒸着と金蒸着との相違）
インクジェットプリンターに使用される黒色インクで基板に“井”の字を描いた。その基板上に白金を物理蒸着したサンプル（実施例５）と金を物理蒸着したサンプル（比較例１）の二種類を用意した。これらの基板のイメージング質量分析を行った。イメージング質量分析は、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AXIMA-CFRプラス」島津製作所製）により行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：窒素レーザー（３３７ｎｍ）
・加速電圧：２０ｋｖ
・リニアーモード測定(正イオンモード)
・レーザー半径：約１００μｍ
・レーザー強度：６０（装置の読み）
・測定間隔：１００μｍ
金蒸着に比べて、白金蒸着した基板で黒色インク由来のイオンピークが強く観測された（図１６参照）。黒色インク成分由来のｍ／ｚ＝３５９と３７５のイオンピーク分布を画像化してイメージング像を作成すると、白金蒸着した基板では、”井”が映し出されたが、金蒸着した基板では、黒色インクで描かれた字のイメージング像は得られなかった（図１７参照）。これは、金に比べて白金の高い検出感度によるものであると考えられる。
実施例６（白金蒸着の濃度依存性）
ＴＬＣプレート上に、メチレンブルー（濃度：１ｍＭ、０．５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０１ｍＭの５種類）を滴下し、更に白金の物理蒸着を行った（図１８参照）。次いで、イメージング質量分析を行った。イメージング質量分析は、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AXIMA-CFRプラス」島津製作所製）により行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：窒素レーザー（３３７ｎｍ）
・加速電圧：２０ｋｖ
・リニアーモード測定(正イオンモード)
・レーザー半径：約１００μｍ
・レーザー強度：６０（装置の読み）
・測定間隔：１００μｍ
ｍ／ｚ＝３７２のイオンピーク分布を画像化してイメージング像を作成すると、１〜０．２５ｍＭの濃度では濃度に応じてピーク強度が減少し、０．１ｍＭは局在的に検出され、０．０１ｍＭは検出されなかった（図１９参照）。また、検出された各濃度におけるｍ／ｚ＝３７２のピーク強度値を図２０に示す。
以上の結果から、白金蒸着を行った本発明のサンプルでは、目的物質の濃度に応じてピーク強度及びイメージング像の濃さが段階的に推移することが分かる。
実施例７（白金蒸着と白金ナノ粒子分散液との相違）
紙上に、黒色インクを用いて球状のインクスポットを描いた。インクスポット上に白金ナノ粒子のメタノール分散液を塗布したサンプルと白金を物理蒸着したサンプルの二種類を用意し、これらのイメージング質量分析を行った。イメージング質量分析は、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AXIMA-CFRプラス」島津製作所製）により行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：窒素レーザー（３３７ｎｍ）
・加速電圧：２０ｋｖ
・リニアーモード測定(正イオンモード)
・レーザー半径：約１００μｍ
・レーザー強度：６０（装置の読み）
・測定間隔：１００μｍ
白金ナノ粒子のメタノール分散液に比べて、白金蒸着したインクスポットでは、黒色インク由来の球状のイメージング像が映し出されたが（図２１（ｂ）参照）、白金ナノ粒子分散液した場合では、黒色インクがメタノールに溶解したため、インクスポットの形状が得られなかった（図２１（ａ）参照）。これは、白金ナノ粒子分散液の塗布に比べて白金蒸着の方が高い検出感度を発揮することに基づくものと考えられる。
以上の結果から、白金蒸着を行った本発明のサンプルでは、溶媒による試料の位置変化をおこすことなく、イメージング像が得られることが分かる。
実施例８〜１０及び比較例２〜４（白金蒸着と既存の有機マトリックスとの相違）
（実施例８：アセフェート、白金蒸着）
アセフェート（農薬）の水溶液をビオラの葉に滴下し、乾燥した後に、マグネトロンスパッタリング装置（E-3010:日立製作所製）で白金ナノ粒子を１０ｎｍの厚さで蒸着してサンプルを調製した。
（実施例９：アセタミプリド、白金蒸着）
アセタミプリド（農薬）の水溶液をビオラの葉に滴下し、乾燥した後に、マグネトロンスパッタリング装置（E-3010:日立製作所製）で白金ナノ粒子を１０ｎｍの厚さで蒸着してサンプルを調製した。
（実施例１０：ポリエチレングリコール、白金蒸着）
ポリエチレングリコール（合成ポリマー）の水溶液をビオラの葉に滴下し、乾燥した後に、マグネトロンスパッタリング装置（E-3010:日立製作所製）で白金ナノ粒子を１０ｎｍの厚さで蒸着してサンプルを調製した。
（比較例２：アセフェート、既存の有機マトリックス）
白金蒸着の代わりに、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析用のマトリックス噴霧装置（TM-sprayer：HTX Imaging製）を用いて2,5-Dihydroxybenzoic acid（ＤＨＢ）の有機マトリックス層を形成した以外は、実施例８と同様にしてサンプルを調整した。
（比較例３：アセタミプリド、既存の有機マトリックス）
白金蒸着の代わりに、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析用のマトリックス噴霧装置（TM-sprayer：HTX Imaging製）を用いて2,5-Dihydroxybenzoic acid（ＤＨＢ）の有機マトリックス層を形成した以外は、実施例９と同様にしてサンプルを調整した。
（比較例４：ポリエチレングリコール、既存の有機マトリックス）
白金蒸着の代わりに、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析用のマトリックス噴霧装置（TM-sprayer：HTX Imaging製）を用いて2,5-Dihydroxybenzoic acid（ＤＨＢ）の有機マトリックス層を形成した以外は、実施例１０と同様にしてサンプルを調整した。
ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、各サンプルのＩＭＳ測定と解析を行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：５０％
・測定間隔：３００μｍ
（解析結果）
実施例８及び比較例２の結果を図２２に示す。実施例９及び比較例３の結果を図２３に示す。また、実施例１０及び比較例４の結果を図２４に示す。
図２２〜２４の結果からは、有機マトリックス層を形成した比較例２〜４と比べて、白金蒸着を行った実施例８〜１０の方が、高感度に目的成分のピークが観測された。
実施例８〜１０及び比較例２〜４のピーク強度を図２５に示す。白金蒸着を行った実施例８〜１０の方が、有機マトリックス層を形成した比較例２〜４と比べて、３〜１００倍の感度増強効果が確認された。
実施例８及び比較例２のアセフェートの分布を解析した結果、実施例８では、滴下した領域にアセフェートのピークが強く観測されているのに対して、比較例２では、観測されるアセフェートのピークが弱いことが示された（図２６）。更に、比較例２では、有機マトリックス層の形成に使用した溶媒のマイグレーション効果により、滴下していない領域からもアセフェートのピークが観測された。葉の表面は、形状に凹凸があり、ワックス層が存在しているため、切片試料と比べて溶媒をはじきやすく、マイグレーション効果が発生しやすいが、実施例で用いた白金蒸着では、滴下した領域のみにピークが確認され、マイグレーション効果が抑制されていることが判明した。
実施例１１及び比較例５（白金蒸着と既存の有機マトリックスとの相違）
（実施例１１：ＤＯＰ及びＤＮＰ、白金蒸着）
ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）製の壁紙に、マグネトロンスパッタリング装置（E-3010:日立製作所製）で白金ナノ粒子を１０ｎｍの厚さで蒸着してサンプルを調製した。ここで、ＰＶＣの中には、添加剤（可塑剤）としてフタル酸ジオクチル（ＤＯＰ）及びフタル酸ジノニル（ＤＮＰ）が含有されている。
（比較例５：ＤＯＰ及びＤＮＰ、既存の有機マトリックス）
白金蒸着の代わりに、ＭＡＬＤＩイメージング質量分析用のマトリックス噴霧装置（TM-sprayer：HTX Imaging製）を用いて1,8-dihydroxy-9(10H)-anthracenone （Dithranol）の有機マトリックス層を形成した以外は、実施例１１と同様にしてサンプルを調製した。
ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、各サンプルのＩＭＳ測定と解析を行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：７０％
・測定間隔：３００μｍ
（解析結果）
実施例１１及び比較例５の結果を図２７に示す。
図２７の結果からは、有機マトリックス層を形成した比較例５と比べて、白金蒸着を行った実施例１１の方が、高感度に目的成分（ＤＯＰ及びＤＮＰ）のピークが観測された。
実施例１１及び比較例５のピーク強度を図２８に示す。白金蒸着を行った実施例１１の方が、有機マトリックス層を形成した比較例５と比べて、３〜４倍の感度増強効果が確認された。
実施例８〜１１及び比較例２〜５の結果からは、白金蒸着を行った実施例の方が、既存の有機マトリックス層（ＤＨＢ、Dithranol等）を形成した場合よりも高感度に目的成分のピークが観測されることが分かる。
実施例１２（アセタミプリド、白金蒸着）
実施例９において、ＩＭＳ測定条件を下記の通りに変更した。即ち、レーザー径を絞り、高空間分解能モードで測定をおこなった。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約５０μｍ（ＭＩＮＩＭＵＭモード）
・レーザー強度：５０％
・測定間隔：５０μｍ
測定間隔が５０μｍの高空間分解モードでアセタミプリドの分布を解析した結果、滴下した領域のみにアセタミプリドが存在していることが確認された（図２９）。白金蒸着を行う本発明の質量分析方法は、マイグレーション効果が抑制されて、高空間分解モードのＩＭＳ測定に有効であることが判明した。
実施例１３（園芸用のスプレータイプの殺虫・殺菌剤農薬、白金蒸着）
園芸用のスプレータイプの殺虫・殺菌剤農薬をアイビーの葉に散布し、乾燥した後に、マグネトロンスパッタリング装置（E-3010:日立製作所製）で白金ナノ粒子を１０ｎｍの厚さで蒸着してサンプルを調製した。使用した農薬中には、有効成分としてアセタミプリド及びチオファネートメチルが含有されている。
ＭＡＬＤＩイメージング質量分析装置（装置名「AutoFlex III」Bruker社製）により、サンプルのＩＭＳ測定と解析を行った。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：１００％
・測定間隔：１５０μｍ
マススペクトルを解析した結果、アセタミプリドが強く観測される領域とチオファネートメチルが強く観測される領域があることが判明した（図３０）。アセタミプリド由来のｍ／ｚ＝２４５のピークとチオファネートメチル由来のｍ／ｚ＝３６５のピークの分布図を作成した結果、アセタミプリドは広範囲に広がっているのに対して、チオファネートメチルは局所的に凝集していることが分かり、農薬の種類の違いにより、広がり方が異なることが判明した（図３１）。このことから、農薬の種類により、拡散が異なることが視覚的に理解でき、農薬製剤などの機能解析に有効であることを示している。
実施例１４（園芸用の粒剤タイプの殺虫剤農薬、白金蒸着）
園芸用の粒剤タイプの殺虫剤農薬をアイビーが植えてある土壌に散布し、４、８、１１、１４日後に土壌から約３０ｍｍの場所の葉を採取し、マグネトロンスパッタリング装置で白金ナノ粒子を１０ｎｍの厚さで蒸着して各サンプルを調製した。使用した粒剤の農薬中には、有効成分としてアセフェートが含有されている。
各サンプルのＩＭＳ測定をおこなった。また、４日後の茎について、根から近い下部の茎と遠い上部の茎について、同じ条件でＩＭＳ測定をおこなった。
ＩＭＳの測定条件を以下に示す。
・照射レーザー：Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（３５５ｎｍ）
・加速電圧：１９ｋｖ
・リフレクトロン電圧：２１ｋｖ
・レーザー半径：約１００μｍ（ＵＬＴＲＡモード）
・レーザー強度：１００％
・測定間隔：１５０μｍ
採取した葉のマススペクトルを解析した結果、４日後ではｍ／ｚ＝４００〜５５０の領域にワックス層のピークのみが確認されたのに対して、１１日後ではアセフェート由来のピークも観測された（図３２）。アセフェート由来のｍ／ｚ＝２０６のピークの分布図を作成した結果、４日後の葉はアセフェート分布が確認されなかったが、８日後には葉の付け根にアセフェートが確認され、１１日後、１４日後と経過するとアセフェートが葉の先端に広がっていく挙動が判明した（図３３）。
茎についてもＩＭＳでアセフェートの分布図を作成した結果、農薬が散布された土壌に近い下部茎の下側ではアセフェートのピークが強く観測され、上にいくにつれて、アセフェートのピークが徐々に弱くなる挙動が見られた（図３４）。
白金蒸着を行う本発明の質量分析方法は、散布した農薬が植物中で浸透して分布していく挙動を視覚的に理解でき、本手法が植物中の農薬などの作用機構の解明に有効であることを示している。

Claims (9)

  1. イメージング質量分析に供する試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することによって調製されたサンプルを用いることを特徴とするイメージング質量分析方法。
  2. 前記白金ナノ粒子の平均粒子径は２〜２０ｎｍである、請求項１に記載のイメージング質量分析方法。
  3. 前記物理蒸着により形成される白金ナノ粒子層の厚さは２〜５０ｎｍである、請求項１又は２に記載のイメージング質量分析方法。
  4. 前記物理蒸着は、マグネトロンスパッタリングによる物理蒸着である、請求項１〜３のいずれかに記載のイメージング質量分析方法。
  5. マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）イメージング質量分析装置を用いる、請求項１〜４のいずれかに記載のイメージング質量分析方法。
  6. イメージング質量分析に供する試料の表面に白金ナノ粒子を物理蒸着することを特徴とするイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
  7. 前記白金ナノ粒子の平均粒子径は２〜２０ｎｍである、請求項６に記載のイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
  8. 前記物理蒸着により形成される白金ナノ粒子層の厚さは２〜５０ｎｍである、請求項６又は７に記載のイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
  9. 前記物理蒸着は、マグネトロンスパッタリングによる物理蒸着である、請求項６〜８のいずれかに記載のイメージング質量分析用のサンプル調製方法。
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