DE2111518B2

DE2111518B2 - Hormonahnliche Substanz mit hypocalcamischer Wirkung und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2111518B2
Application number: DE19712111518
Authority: DE
Inventors: Jinnosuke Abe; Teizo Yokohama Higashi; Masaru Otani; Teruo Take; Susumu Watanabe
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1970-03-10
Filing date: 1971-03-10
Publication date: 1975-08-21
Also published as: CS194803B2; AT303954B; NL7103214A; SU423304A3; CH567420A5; DE2111518A1; FR2085693A1; CA965004A; BE764033A; FR2085693B1

Description

35 Gewebes verabreicht worden war, trat eine Senkung des Serumcalciumspiegels auf.

Außerdem wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß in der Perikardmembran des AaLs ein sekretierendes Gewebe vorkommt, das den gleichen, vorstehend erwähnten Wirkstoff enthält. Die Existenz dieser Substanz in diesem sekretierenden Gewebe konnte jedoch nicht durch den Test mit der Toluidinblau-Färbung nachgewiesen werden. Soweit bekannt, war die Existenz von sekretierenden Geweben im Endokard von Vögeln, Fischen oder Amphibien nicht bekannt, die diesen Wirkstoff enthalten.

Die Serumcalcium-Werte und die Aktivität des hypokalzämischen Hormons pro Einheit sekretierendes Gewebe von geschlechtsreif en, auf dem Weg zu den Laichplätzen befindlichen und jungen, noch nicht laichfähigen Aalen, die im November im Tone River gefangen worden waren, wurden bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß bei erwachsenen Aalen im Vergleich zu den jungen Tieren sowohl die Calciumwerte als auch die Hormonaktivität gering sind.

Nr.	Gewicht	Serum-	Aktivität,
		calcium-	MRC
		spiegel	U/Drüse
	(g)	(mg/100 ml)
1	115	13,3	4,3
Junge Aalt 2	159	13,0	3,1
3	140	14,2	5,6
4	192	11,4	1,5
Erwachsene Aale 5	200	12,4	0,9
6	205	12,8	2,8

Die Erfindung betrifft eine hormonähnliche Substanz mit hypokalzämischer Wirkung bei Säugetieren und Menschen, die duich Extraktion aus endokrinen Drüsen der Aale von Anguilla-Arten isoliert wird, und ein Verfahren zur Extraktion dieser Substanz.

Es ist bekannt, daß Schilddrüsen und Nebenschilddrüsen bei Säugetieren im Calciumstoffwechsel eine wichtige Rolle spielen. P. F. H i r s c h et al. berichteten in Endocrinology, Bd. 73 (1963), S. 244, über die Isolierung des Hormons Thyrocalcitonin, ein Hormon mit hypokalzämischer Wirkung bei Säugetieren, aus Rattenschilddrüsen. Es wurde festgestellt, so daß Thyrocalcitonin auch in Schilddrüsen anderer Säugetiere, wie Hunde, Affen, Schweine und Rinder, und auch beim Menschen vorkommt.

Vor kurzem wurden dein Thyrocalcitonin analoge Polypeptide auch in anderen Organen gefunden, d. h. in einem Ultimobranchialkörper genannten Gewebe bei Vögeln, Fischen und Amphibien. Diese Substanzen wurden klinisch zur Behandlung von Osteopetrose und Alterskrankheiten verwendet.

Auf Grund der Tatsache, daß alle sekretierenden Gewebe, in denen diese Substanzen vorhanden sind, eine positive ToJuidinblau-Reaktion zeigen (sie werden rötlich-purpurn gefärbt), wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß in den Blutgefäßwänden der Vena cava, die entlang des Oesophagus des Aals in Richtung zum Herzen verläuft und an der Wand des Oesophagus haftet, ein Gewebe mit positiver Toluidinblau-Reaktion existiert. Bei Ratten, denen ein Extrakt dieses Auf Grund dieser Tatsachen wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß der Hormongehalt im genannten sekretierenden Gewebe von Aalen in einem gewissen Wachstuirastadium zeitweise ansteigt, wenn die Aale in Seewasser oder in einer Salzlösung ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet werden. Pro Einheit sekretierendes Gewebe kann ein Hormon mit hoher hypokalzämischer Wirkung gewonnen werden, wenn als Rohmaterial zur Extraktion das genannte sekretierende Gewebe von Aalen in diesem Wachstumsstadium verwendet wird.

F i g. 1 zeigt in einem Diagramm die Beziehung zwischen der Züchtungszeit (Tage) der Aale in mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünntem Meerwasser zum Serumcalciumspiegel und zum osmotischen Druck des Serums;

F i g. 2 zeigt die Beziehung zwischen Züchtungszeit (Tage) von Aalen in mit Wasser im Verhältnis 1:1 verdünnten Seewasser zur hypokalzämischen Aktivität pro Einheit sekretierendes Gewebe; die

F i g. 3 und 4 zeigen IR (in KBr)- und UV-Spektren der Substanz (199 μg/ml, λ £₀° = 277 ηιμ EXi_x. = 8,04) mit 70 MRC U/mg;

F i g. 5 zeigt ein Elutionsdiagramm einer Gelfiltration an vernetzten! Dextran (Sephadex ® G-75); vgl. Beispiel 2.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Substanzen sind Polypeptide, die insofern eng verwandt zum Thyrocalcitonin sind, als sie in der Lage sind, den Serumcalciumspiegel bei Saugetieren und Menschen zu senken.

Die Substanzen werden als weiße Pulver erhalten und haben folgende Eigenschaften.

L Löslichkeit:

Löslich in Wasser, aber unlöslich in verschiedenen organischen Lösungsmitteln.

2. Dialysierbarkeit, Filtration durch Membranfilter (Nihon Shinku Gijutsu K. K.):

Die Substanz geht durch ein für Subatanzen mit einem Molekulargewicht von 10 000 oder darunter durchlässiges Filter, aber nicht durch ein für Substanzen mit einem Molekulargewicht von 1000 oder darunter durchlässiges Filter.

3. Molekulargewicht:
3000 bis 4500.

Bestimmungsverfahren:

Rinderserumalbumin (MolekulargewicLt 67 000) und Bacitracin (Molekulargewicht 1423) werden als Vergleichsubstanzen verwendet Die Molekulargewichte der Substanzen der Erfindung werden durch Gelfiltration an vernetzten Dextranen (Sephadex® G-75, G-50 und G-25) je nach ihrer Elutionsgeschwindigkeit bestimmt.

4. Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion, Sakaguchi-Reaktion, Diazoreaktion und Crieg-Liebig-Reaktion positiv.

5. Fällungsmittel:

Die Substanzen sind durch Zugabe von Fällungsmitteln für Proteine, wie Trichloressigsäure und Perchlorsäure, ausfällbar.

6. Die Substanzen werden durch proteolytische Enzyme, wie Nagdse und Chymotrypsin, inaktiviert. Bedingungen der Inaktivierung:

Die Substanzen der Erfindung werden in 0,01 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 2 Stunden bei 37° C mit dem Enzym in einem Gewichtsverhältnis von 1: umgesetzt.

7. Aminosäurenzusammensetzung:

Eine Probe von 150 g mit einer Aktivität von MRC U/mg wird 24 Stunden bei 110⁰C mit η-Salzsäure hydrolysiert.

Aminosäure μΜοΙ

ΐ5 Lysin 0,063

Histidin 0,0041

NH₃ 0,0816

Arginin 0,0256

Asparaginsäure 0,0638

Threonin 0,0229

Serin 0,0384

Glutaminsäure 0,0792

Prolin 0,0207

Glycin 0,0846

«5 Alanin 0,0760

Halbcystin (—)

Valin 0,0807

Methionin —

Isoleucin 0,0312

3» Leucin 0,0641

Tyrosin 0,0052

Phenylalanin 0,0192

8. Laufstrecken der Produkte der Erfindung (es wurden die nachstehend in Beispiel 7 aufgeführten Produkte verwendet) bei der Disk-Elektrophorese sind in folgender Tabelle wiedergegeben:

	Probe	Β(50μ₈)	Ο(150μ₈)	ϋ(150μ₈)	Ε(150μ₈)
	Α(100μ₈)	8 mA, 435 min	6 mA, 80 min	6 mA, 40 min	6 mA, 40 min
' lektro- phorese- bedingungen	3 mA, 60 min	saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)	saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)	saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)	saures Gel mit 6-m Harnstoff (pH-Wert 4,4)
Gel	Standardgel (pH 8,9 bis 9,0)	Natriumacetat- Püffer (pH-Wert 4,7)	/3-Alanin-Essig- säure-Puffer (pH-Wert 5,0)	/3-Alanin-Essig säure-Puffer (pH-Wert 5,0)	/S-Alanin-Essig- säure-Puffer (pH-Wert 5,0)
Entwick lungslösung	Tris-Glycin- Puffer (pH-Wert 8,6)	Amidoschwarz	Ponceauxrot	Ponceauxrot	Ponceauxrot
Färbemittel	Ponceauxrot	Rm.g. = 0,4-0,45	Rm.g. = 0,5	Rm.g. = 0,5	R_H.G, = 0,5
Laufstrecke	0 (Aufsetzstelle)

[λ] '<? = -20° (c == 0,4%, H₂O) (123 MRC U/mg

9. Wurde die Substanz der Erfindung an Testtiere

(männliche Ratten) verabreicht, so wurde zusätzlich ⁿ· Spezifische Drehung:

zur Senkung des Blutcalciumspiegels eine Verminde- [«

rung des Phosphor- und Magnesiumgehaltes des Bluts Probe)

beobachtet. _Λ - „... , . , ^ , _x , .

12. Dunnschichtchromatographie:

10. Die in der Verbindung der Erfindung enthaltenen Probe (61 MRC U/mg). Laufmittel: n-Butanol zu Disulfidbrücken sind nicht oxydationsbeständig und

unter stark alkalischen Bedingungen instabil. Pyridin zu Wasser zu Essigsäure = 15:10:12:3. Träger: Abizel® (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki

5 6

Kaisha). Entwicklungsmittel: Daidon-Smith-Reagens. gewonnen werfen. Um Spurenmengen von Metall-Laufstrecke: Rj = 0,48 bis 0,71. ionen, einschließlich Calciumionen, zu beseitigen, ist

es wünschenswert, bei diesem Verfahren Äthylen-Verfahren zur Extraktion der Substanz der Erfindung diamintetraessigsäure enthaltendes Aceton zu ver-1 Rohmaterial ^{5 wen<}^^en· Zum Beispiel wird das genannte Gewebe des

Aals durch längeres Eintauchen in Äthylendiamin-

(a) Teil des Blutgefäßes der Vena cava des Aals, die tetraessigsäure enthaltendes Aceton entwässert und

entlang dem ■ Oesophagus zum Herzen verläuft und anschließend mit Chloroform entfettet. Das entstan-

an der Oesophaguswand haftet. dene Produkt wird wieder längere Zeit in Aceton

Vorzugsweise wird der Teil des Oesophagus vor io getaucht und dann an der Luft getrocknet,
und nach dem Herzen in gleicher Länge herausge- (b) Als Rohmaterial zur Extraktion können das schnitten, z. B. in einer Länge von etwa 2 cm in jeder Herz oder das Perikardmembran von Aalen direkt Richtung. Das so gewonnene Gewebe kann entweder ohne weitere Behandlung verwendet werden. Vorzugsdirekt oder in Form eines entfetteten und getrockneten weise werden sie jedoch in Form eines getrockneten Produktes verwendet werden. Das entfettete und ge- 15 Produktes verwendet. Diese erhält man auf die gleiche trocknete Produkt kann nach bekannten Verfahren Weise wie unter (a) angegeben.

Verteilung von Geweben im Aal, die den Wirkstoff enthalten

Gewebe Gewicht U/Gewebe mU/Gewebe mU/Protein (N)

(mg)

U/Gewebe	mU/Gewebe
	(mg)
1,6	9,4
6,6	61,5
9,6	40,1

(a) Gewebe mit der am Oesopha- 170,3 1,6 9,4 5,9
gus haftenden Vena cava

(b) Perikardmembran 107,7 6,6 61,5 26,5
(a) + (b) 239,6 9,6 40,1 38,7

Die hypokalzämische Aktivität der aus Aalen ge- Aus dieser Tabelle geht hervor, daß die aus dem

wonnenen hormonähnlichen Substanz, d. h. der nach sekretierenden Gewebe eines Aals extrahierte hormon-

dem nachstehend beschriebenen Verfahren bestimmte 35 ähnliche Substanz mit hypokalzämischer Wirkung

Wert der Calcitonin-Aktivität, ausgedrückt pro 1 kg eine sehr hohe Akt.vität zeigt, wenn man den erhal-

Körpergewicht, wurde mit den Werten von sekre- tenen Wert auf 1 kg Körpergewicht umrechnet. Man

tierenden Geweben anderer Tiere verglichen, die bei kann aus der Tabelle z. B. entnehmen, daß zur Ge-

D. H. C ο pp, CO. Parkins: »Pharathyroid winnung eines Wirkstoffes der Erfindung mit einer

Hormone and Thyrocalcitonin (Calcitonin)« Amster- 40 Calcitonin-Aktivität, die dem aus der Schilddrüse

dam Excerpta Media Foundation (1968), S. 78, ange- eines Schweines gewonnenen Thyrocalcitonin ent-

geben sind. Die Ergebnisse sind in der folgenden Ta- spricht, etwa 2 bis 4 Aale ausreichen,
belle wiedergegeben.

Sekretierendes Gewebe mU/Gewebe mU/Körper-

gewicht
dkg)

Ratte (rattus rattus)	Schilddrüse	100—300	200—800
Schwein (sas scrota)	desgl.	20000—40000	250—500
Hund (cams famfliaris)	desgl.	5000-20000	4©0-«00
Huhn (gaflus domestica)	Ultimobranchialdrüsen	200—700	SOO-SOO
Truthahn (meleagra gallapavo)	desgl.	2200	450—900
Wildente (pseodeaxys concinna	desgl.	4—10	5—9
snwaaiensis)
Frosch (rana catesbeiana)	desgl.	0,4	1—2
Lachs (oncorhynchas seta)	desgl.	1000-4 500	100—200
Hai (sqealos sockleyi)	desgl.	500—1000	250—500
Aal(aßgmllajapoeica)	Perikardmembran und Gewebe	9 550	39 750
	mit der am Oesophagus

pg haftenden Vena cava

λ fion

Die Bestimmung der hypokalzämischen Wirkung der hormonähnlichen Substanz, die aus dem sekretierenden Gewebe von Aalen gewonnen wurde, wurde nach dem nachstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Der Extrakt, der durch Behandlung eines ein Sekretionsorgan enthaltenden Gewebes eines Aals, im dem die hormonähnliche Substanz mit hypokalzämischer Wirkung vorhanden ist, mit 0,2 n-Salzsäure: erhalten wird, wird mit Natronlauge neutralisiert. Der Extrakt wird mit einer 0,1 n-Natriumacetat-0,1 %·· Albumin-Lösung auf das 2-, 4-, 6-, 8-, 10- und 20fache verdünnt. Männlichen Ratten werden jeweils einzeln 0,5 ml dieser Verdünnungen intramuskulär injiziert. Nach einer Stunde werden alle Ratten getötet, ihr Blut wird gesammelt, und der Wert des Serumcalcium·■ spiegeis im Blut wird flammenphotometrisch bestimmt. Zur Durchführung der Kontrollversuche wird ein Research Standard (Produkt mit 8 MRC U/mg der Armour Pharm. Co.), der durch Extraktion von Schweineschilddrüsen erhalten wird, so verdünnt, daß Lösungen mit 30, 60, 90, 150, 180 bzw. 240 mU/0,5 mil entstehen. Männlichen Ratten werden jeweils 0,5 ml dieser Lösungen intramuskulär injiziert. Auf die gleiche Weise, wie oben angegeben, werden die Werte des Serumcalciumspiegels im Blut bestimmt. Auf Grund der hypokalzämischen Aktivität des Research Standard werden die entsprechenden Werte der hormonähnlichen Substanz im genannten Aalextraki: bestimmt.

Die Aale werden vorzugsweise in Meerwasser oder einer Salzlösung mit ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet. Beispielsweise kann Meerwasser, künstliches Meerwasser oder Salzwasser verwendet werden Im allgemeinen können Aale sowohl in Meerwasser als auch in Süßwasser leben. Jedoch sterben in Süßwasser gefangene Aale leicht, wenn sie direkt in Meerwasser oder in Salzlösungen mit im wesentlichen ähnlicher Salzkonzentration wie Meerwasser gebracht werden. Es ist deshalb vorzuziehen, das Meerwasser zu verdünnen oder die Salzkonzentration in der wäßrigen Salzlösung so zu wählen, daß die darin gezüchteten Aale nicht sterben. Die Aale können also in einer wäßrigen Lösung mit einer Salzkonzentration, die etwa einem Drittel bis zwei Dritteln der Salzkonzentration von Meerwasser entspricht, gezüchtet werden.

Auf diese Weise steigt die Calcitonin-Aktivität im sekretierenden Gewebe zeitweise an, wenn die Aale in Meerwasser oder einer wäßrigen Salzlösung von ähnlicher Zusammensetzung gezüchtet werden. In F i g. 1 ist die Beziehung zwischen der Züchtungszeil: (Tage) von Aalen in auf die Hälfte mit Wasser verdünntem Meerwasser zum Serumcalcium-Wert und zum osmotischen Druck des Serums wiedergegeben Sowohl der Seramcalcium-Wert als aach der osmolische Druck steigen bis etwa 5 Tage nach Beginn der Züchtung und beginnen dann zu sinken. Wie in F i g. 2 gezeigt ist, steigt die Aktivität der wirksamen Substanz pro Einheit des sekretierenden Gewebes langsamer als. der Serumcalcium-Wert oder der osmotische Druck an and erreicht 10 bis IS Tage nach Züchtungsbeginn den maximalen Wen. Anschließend beginnt die Aktivität wieder zu fallen.

Demgemäß ist es wünschenswert, den Zeitpunkt, an dem der Calcitonin-Weri ein Maximum erreicht, zu bestimmen, and dann das sekretierende Gewebe aus dem Aal ze gewinnen. Die Züchtungszeit beträgt vorzugsweise etwa 10 bis 17 Tage, wobei unter den Aalen individuelle Unterschiede bestehen. Gewebe mit der am Oesophagus haftenden Vena cava aus der Nähe des Herzens und aus der Perikardrnembran von Aalen, die in Seewasser oder Salzlösung weiter gezüchtet worden waren, und von solchen, die nicht weiter gezüchtet worden waren, wurden gewonnen, und dann wurde deren Aktivität pro Einheit sekretierendes Gewebe, Körpergewicht und ProtcinstickstofT bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben. Daraus geht hervor, daß die Aktivität in jedem Fall auf das 2- bis 3fache angestiegen ist, was darauf zurückzuführen ist, daß die Aale in Meerwasser oder einer Salzlösung ähnlicher Zusammensetzung gehalten wurden.

MRC	MRC	MRC
U/Gewebe	mU/mg	mU/Protein
		(N), μ₈
		(Folin-
		Methode)

Süßwasser 2,2 — 4,1 8,0 — 29,8 1,6— 5,2

50% Meer- 6,6—9,2 29,7 — 53,0 7,6 — 11,5
wasser

Va Meer- 5,8 — 9,0 30,1 — 51,2 8,1 — 12,3
wasser

(Züchtungszeit: 13 Tage)

Da jedoch die extrahierte Flüssigkeit verschiedene Fremproteine enthält, wird die Flüssigkeit unter Anwendung üblicher Verfahren zur Entfernung der Fremdproteine weiter gereinigt. Ein Verfahren zur Entfernung dieser Fremproteine besteht in ihrer Fällung. Hierbei werden die ausgefällten Fremdproteine gleichzeitig mit anderen im Extrakt vorhandenen Feststoffen entfernt. Eine andere Möglichkeit besteht darin, daß dieses Verfahren auf einen flüssigen Extrakt angewendet wird, der nach dem Entfernen der Feststoffe aus dem Extrakt erhalten wird. Außerdem kann das genannte rohe Pulver diesem Reinigungsverfahren unterzogen werden. Es kann jedes übliche Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Proteinen herangezogen werden.

2. Extraktion

Die erwähnten Rohprodukte werden zuerst einer Extraktionsbehandlung unterzogen.
Als Lösungsmittel zur Extraktion können Gemische aus Wasser und hydrophilen organischen Lösungsmitteln verwendet werden, z. B. Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, Aceton, Phenol, Dioxan, Pyridin, Tetrahydrofuran, Methoxyäthanol, Dimethylformamid oder Dimetbylsulfoxid. Es können auch verdünnte Säuren,

SS z. B. Salzsäure, Essigsäure oder Oxalsäure, oder Wasser verwendet werden.

Der Wassergehalt dieser wäßrigen Lösungsmittel muß ausreichead sein, mn die vorhandene hormonähnliche Substanz (Molgewicht 3000 bis 4500) lösen zu können. Im allgemeinen genügen S bis IS Volumenprozent Wasser, doch kann die Menge in Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel variiert werden. Vorzugsweise wird eine 4- bis 8raolare Harnstoff lösung als Extraktionslösung verwendet. Vorzusse werden

6s diese Lösungen mit Reduktionsmitteln, wie Cystein oder Vitamin C, versetzt, um eine Oxydation während des Extraktionsvorganges ze vermeiden. Als ein bevorzugtes, typisches Beispiel set em Lösongsmittd-

509534/424

' 10

gemisch aus 8m Harnstoff, 0,1 n-Cystein und 0,2 η-Salz- gewonnen. Das Material wurde 3mal durch jeweils

säure erwähnt. 5stündiges Eintauchen bei 5⁰C in 3 Liter 90 mg

Zur Extraktion genügt es, das Rohmaterial bei Äthylendiamintetraessigsäure enthaltendes Aceton entnormaler Temperatur in das Extraktionslösungsmittel wässert. Das entwässerte Gewebe wurde anschließend zu geben und zu rühren. 5 durch dreimaliges, jeweils 2stündiges Eintauchen bei ... 5°C in 2 Liter Chloroform entfettet. Anschließend 3. Reinigung wurde der genannte Entwässerungsschritt unter Ver-

Der nach Abtrennung und Entfernung von aus Wendung von je 2 Liter Aceton 3mal wiederholt.

Gewebsfragmenten des Rohmaterials stammenden Das erhaltene entfettete Material wurde an der Luft

Feststoffen erhaltene flüssige Extrakt wird unter ver- io getrocknet. Man erhielt 110 g trockenes Pulver,

mindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. 110 g des so erhaltenen trockenen Pulvers wurden

Man erhält ein pulverförmiges Rohprodukt. der Extraktion unterworfen, wobei das Produkt bei

Man kann den bei der Extraktion (2) erhaltenen normaler Temperatur in 1 Liter 480 g Harnstoff und

Extrakt auch wie folgt reinigen: 17,5 g Cystein enthaltende 0,2 η-Salzsäure gegeben

a) Die verschiedenen Fremdproteine werden durch 15 und 2 Stunden gerührt wurde. Der entstandene flüssige Zusatz von hydrophilen organischen Lösungsmitteln, Extrakt wurde mit 2 Liter eines Gemisches aus Aceton z. B. Alkoholen mit 1 bis 4 C-Atomen, Aceton, Phenol, und Essigsäure (1:1) und außerdem mit einem Ge-Dioxan, Pyridin, Tetrahydrofuran, Methoxyäthanol. misch aus 28 ml 1 molarer Kochsalzlösung und 3 Liter Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid, aus dem Aceton versetzt und zur Ausfällung der Fremdpro-Extrakt ausgefällt. 20 teine gründlich gerührt. Sodann wurden die Fremd-

b) Lösliche anorganische Salze, z.B. Natrium- proteine 15 Minuten bei 9000 U/Min, abzentrifugiert. chlorid oder Ammoniumsulfat, können dem flüssigen Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde mit 5 Liter Extrakt zugesetzt werden. peroxydfreiem Äther versetzt und gründlich gerührt,

c) Durch Zugabe von Trichloressigsäure oder Per- wobei ein Niederschlag aus Proteinen niedrigeren chlorsäure zum flüssigen Extrakt wird ein Nieder- 25 Molekulargewichts auftrat, der hauptsächlich aus der schlag erhalten, der hauptsächlich aus der gewünschten gewünschten wirksamen Substanz bestand. Der Niederwirksamen Substanz besteht. Wird der Niederschlag schlag wurde durch 15minütiges Zentrifugieren bei in Wasser dispergiert, so löst sich der wirksame Be- 9000 U/Min, gewonnen. Er wurde 2mal mit 400 ml standteil in Wasser. Durch Entfernen des unlöslichen eines Gemisches aus Äther und Aceton (1:1) geRückstandes kann die Reinheit des wirksamen Be- 30 waschen und dann in 1 Liter 1,75 g Cystein enthaltenstandteils auf das 2- bis 5fache des vorhergehenden der 20prozentiger Essigsäure gelöst. Diese Lösung Reinheitsgrades verbessert werden. Ist der pH-Wert wurde mit 50 g Kochsalz versetzt. Die Endkonzendes Wassers zu niedrig, so werden verschiedene Fremd- tration betrug somit 5 %. Die Lösung wurde zur Ausproteine in unerwünschter Weise in Lösung gebracht. fällung von Verunreinigungen gründlich gerührt und Bei zu hohem pH-Wert werden die im wirksamen 35 der Niederschlag durch 15minütiges Zentrifugieren Bestandteil vorhandenen Disulfidbrücken aufgespalten. bei 9000 U/Min, entfernt.

Der pH-Wert des Wassers wird deshalb am besten Die überstehende, klare Flüssigkeit wurde mit

auf 5,0 bis 7,0, vorzugsweise 6,0, eingestellt, um eine 170 ml 45%iger Trichloressigsäure versetzt. Die End-

Entfernung der verschiedenen Fremdproteine zu er- konzentration betrug somit 7,5%. Dabei begann die

reichen. 40 gewünschte wirksame Substanz auszufallen. Der

Die Entfernuno der Fremdproteine aus der rohen. Niederschlag wurde durch 15minütiges Zentrifugieren wirksamen Substanz kann durch Gelfiltration unter bei 9000 U/Min, gewonnen, mit 200 ml Äther geVerwendung von Polyacrylamidgelen oder durch waschen und in 500 ml 0,02 η-Salzsäure gelöst.
Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung Die den gewünschten Wirkstoff enthaltende salzvon Ionenaustauschern auf Basis von vernetzten Dex- 45 saure Lösung wurde auf eine mit Austauscherharz auf tränen mit funktionellen ionischen Gruppen erreicht Basis eines vernetzten Polystyrolgerüsts mit Trialkylwerden. Als Ionenaustauscher können auch Carboxy- ammoniumendgruppen beschickte Säule (2 χ 30 cm) methyl-Cellulose oder Diäthylaminoäthyl-Cellulose gegeben. Die Säule hatte eine Durchflußgeschwindigverwendet werden. keit von 150 ml/Stunde. An diesem lonenaustauscher-

Die nach dem Entfernen der verschiedenen Fremd- so harz wurden die verschiedenen, in der Lösung enthalproteine erhaltene Flüssigkeit enthält Salze. Sie wird tenen Salze absorbiert. Schließlich wurde die Säule daher üblicherweise unter Verwendung von Ionen- mit 50 ml destilliertem Wasser eluiert. Es wurde ein austauscherharzen oder nach anderen üblichen Ver- salzfreies, den gewünschten Wirkstoff enthaltendes fahren entsalzt. Die so behandelte Flüssigkeit wird Eluat erhalten. Das Eluat wurde eingedampft und geeingedampft und gefriergetrocknet. Man erhält ein 55 friergetrocknci. Es wurden 800 mg einer pulver-Pulver. das hauptsächlich aus der gewünschten förmigen Substanz mit hypokalzämischer Wirkung aktiven Substanz besteht. Die nach diesem Verfahren erhalten,
erhaltene Substanz kann weiter gereinigt werden, z. B. Stufe B
durch Gelfiltration, Elektrophorese, Gegenstromverteilung oder Dünnschichtchromatographie 60 Insgesamt 1,0 g pulverförmiger Substanz (6,5 MRC

_. „..,.- j c_c j U mg) aus mehreren Ansätzen der Stufe A wurden in

Die Be.sp.ele erläutern d.e Erfindung _m *, ^ ^„^^ _{aiR Butanot Εδ5ί85&1κ5} ««d

Beispiel 1 Wasser (60: 15 : 25) dispergiert und durch einstündiges

_ . _A Rühren bei 4⁰C extrahiert. Anschließend werde der

^5>nneA 6_S Extrakt mit 30 ml Butanol, 110 ml Wasser und

AiB 2000 Aaleo der Art Aegnfia japonica wurden 3.75 ml Pyridin versetzt. Das entstandene Gemisch

aas den Stück der an Qesoffcagas haftenden Vena wurde gerührt Had aascfaüeßead steheogeksseo, wobei

caro, das m der Wehe des iäerzeos fegt, 5OSg Gewebe sich die Lösung ia zwei Phasen trennte. Die obere

Butanolphase, in der der Hauptteil des gewünschten Wirkstoffes enthalten war, wurde von der unteren Phase abgetrennt. Die untere Phase wurde mit 100 ml der oberen Schicht eines Gemisches aus Butanol, Essigsäure, Wasser und Pyridin (6:1:9: 0,25) versetzt. Das Gemisch wurde umgerührt und stehengelassen. Das Gemisch trennte sich in zwei Phasen. Die obere Butanolphase wurde abgetrennt. Die untere Phase wurde weitere dreimal nach dem vorgenannten Verfahren behandelt. Die so abgetrennten oberen Phasen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das eingedampfte Produkt wurde mit Äther gewaschen und dann in 25 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Man erhielt 105 mg eines Pulvers.

Anschließend wurden 105 mg des so erhaltenen Pulvers in 5 ml 0,2-m Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 4,7 gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit einem Ionenaustauscher auf Basis vernetztes Dextrane beschickte Säule (2,0 X 80 cm), die mit 0,2-m Ammoniumacetatlösung vom pH-Wert 4,7 äquilibriert worden war, aufgesetzt und mit einer Geschwindigkeit von 12 ml/Stunde mit dem genannten Puffer eluiert. Das entstandene Eluat wurde in Fraktionen von 4 ml gesammelt. Die biologische Aktivität einer jeden Fraktion wurde an Ratten bestimmt. Es stellte sich heraus, daß der gewünschte Wirkstoff mit den Fraktionen Nr. 65 bis 85 eluiert wurde. Deshalb wurden diese Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet. Man erhielt 24 mg (98 MRC U/mg) pulverförmigen Wirkstoff.

Stufe C

Anschließend wurden 24 mg des Pulvers in 1 ml 0,01-m Ammoniumformiatlösung vom pH-Wert 4,37 gelöst. Die Lösung wurde auf eine mit Carboxymethylcellulose (CMC) beschickte Säule (1,0 χ 5,0 cm) gegeben und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 4,5 ml/Stunde schrittweise mit 70 ml 0,01 m Ammoniumformiatlösung vom pH-Wert 4,37, 60 ml 0,01-I i. 0,2-m Ammoniumformiatlösung, 30 ml 0,2-m Ammoniumformiatlösung und 40 ml 2,0-m Ammoniumformiatlösung eluiert. Das erhaltene Eluat wurde in Fraktionen von je 2 ml gesammelt. Die Fraktionen Nr. 50 bis 65, in denen die Substanz mit Calcitonin-Wirkung eluiert wurde, wie durch Bestimmung der biologischen Aktivität der einzelnen Fraktionen festgestellt wurde, wurden vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden unter vermindertem Druck eingedampft und dann gefriergetrocknet. Es wurden 12 mg (220 MRC U/mg) eines hormonähnlichen Wirkstoffes in Pulverform erhalten.

Die Eigenschaften dieser Substanz sind:

1. Weißes Pulver. _S5

2. Löslichkeit:

Löslich ta Wasser, aber unlöslich in verschiedenen organischen Litteln, wie Benzol, Hexan und Tetrachlorhohlenstoff.

3. Molekulargewicht: 4000 bis 4500.

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Cobalaaiia (Molekulargewicht 1355), Glucagon (Molekulargewicht 3485), Thyrocalcitomin vom Schwein (Molekulargewicht 3600) und Cyto-

chrom C (Molekulargewicht 12 750) werden als Vergleichssubstanzen verwendet. Die Molekulargewichte der Substanzen der Erfindung werden durch Gelfiltration an vernetzten Dextranen (Sephadex® G-50) und je nach ihrer Elutionsgeschwindigkeit bestimmt.

4. Farbreaktion:

Ninhydrinreaktion, Sakaguchi-Reaktion, Diazoreaktion und Rydon-Smith-Reaktion positiv.

5. Die Substanzen werden durch proteolytische Enzyme, wie Subtilopeptidase A und Chymotrypsin, inaktiviert.

Bedingungen der Inaktivierung:

Die Substanzen der Erfindung werden in 0,01-m Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 2 Stunden bei 37⁰C mit dem Enzym in einem Gewichtsverhältnis von 1: 50 umgesetzt.

6. Aminosäurenzusammensetzung:

Eine Probe von 150 μg wird 24 Stunden bei HO⁰C mit 6 η-Salzsäure hydrolysiert.

Aminosäure μΜοΙ

Lysin 0,0636

Histidin 0,0041

Arginin 0,0256

Asparaginsäure 0,0638

Threonin 0,0229

Serin 0,0384

Glutaminsäure 0,0792

Prolin 0,0207

Glycin 0,0846

Alanin 0,0760

Halbcystin (Spuren)

Valin 0,0807

Methionin (Spuren)

Isoleucin 0,0312

Leucin 0,0641

Tyrosin 0,0052

Phenylalanin 0,0192

Tryptophan*) (Spuren)

*) Hydrolyse mit einer 4-m Ba(OH)i-Lösung 50 Stunden bei 110 C in einem geschlossenen Röhrchen.

7. Spezifische Drehung:

N V = -20° (c = 0,4% H₂O).

8. Disk-EIektrophorese:

Probe: 150 μ-g; Bedingungen: 6 mA 40 und 80 Minuten; Gel: saures Gel mit 6-m HamstcfF; Lauf puffer: /S- Alanin-Essigsäurepuffer; Anfärbe mittel: Ponceauxrot; Laufstrecke: RMethyigron = 0,f

9. Dünnschichtchronia'ographie:

Lauf mittel: n-ButanoI zu Pyridin zu Wasser zt Essigsäure = 15:10:12:3; Träger: Abize (Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisba); Ent wicklungsmittel: Rydon-Snsth-Reageas; Lauf strecke. Rf = 0,46bis0,71.

Beispiel 2

Aale der Art AnguiBa japonka 12 Tag bei 20 C in könstScfa hergestelltem Meerwasser atf einer Meerwasseaton von 50% (Vast HoSi künstliches Meerwasser) gehalten. Anscoüeßeod ward« das Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der

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des Heizens and die Perikardmembran entfernt. Das so gewonnene Rohmaterial wurde zweimal entwässert. Dabei wnrde es 5 Stunden bei 5° C in ISOO mL 30 mg Äthylendiamiatetraessigsäure enthaltendes Aceton getaucht· Anschließend wurde das entwässerte Produkt zweimal entfettet, wobei es 2 Stunden bei S⁰C in 1200 ml Chloroform getaucht wurde. Dann wurde weitere zweimal unter den gleichen Bedingungen, aber unter Verwendung von 1200 ml Aceton entwässert. Das entwässerte Produkt wurde an der Luft getrocknet Es entstanden 75 g (Aktivität: 235 MRC U/mg) getrocknetes Produkt. 75 g getrocknetes Produkt wurden durch Dispergieren in einem Gemisch aus 225 ml Butanol, 150 ml Pyridin, 45 ml Essigsäure und 180 ml Wasser unter Rühren 24 Stunden bei 50⁰C extrahiert

Das erhaltene Gemisch wurde durch Gaze und Filterpapier filtriert Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 50⁰C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde in 200 ml Wasser aufgenommen und zur Entfernung der unlöslichen Bestandteile 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gefriergetrocknet. Es wurden 400 mg pulverförmiger Wirkstoff (9 MRC U/mg) erhalten.

400 mg des oben hergestellten Wirkstoffes wurden in 50 ml 0,2 n-Ammoniumazetatlösung (pH 4,7) gelöst. Diese Lösung wurde auf eine mit der genannten Ammoniumazetatlösung gepufferte Säule (7,5 χ 90 cm) mit vernetzten! Dextran (Sephadex G-75) gegeben. Die Elution wird mit der genannten Ammoniumazetatlösung bei einer Geschwindigkeit von 127,5 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml gesammelt.

Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde an Ratten bestimmt. Die Fraktionen Nr. 205 bis 225 wiesen eine hohe Aktivität bezüglich der Senkung des Serumkalziumspiegels auf. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wurden 12 mg (160 MRC U/mg) des Wirkstoffes erhalten.

Die Eigenschaften der erhaltenen Substanz sind die gleichen wie im Beispiel 1 unter den Punkten 1 bis 5 und 7 bis 9, jedoch wurden unter Punkt 6 die folgenden Mengen an Aminosäuren gefunden:

45 Aminosäure μΜοΙ/mg

Lysin 6,97

Histidin 1,62

Arginin 5,35

Asparaginsäure 6,74

Threonin 3,96

Serin 5,58

Glutaminsäure 8,60

Prolin 17,20

Glycin 23,20

Alanin 11,10

Halbcystin 0,46

Valin 4,42

Methionin (Spuren)

Isoleucin 4,20

Leucin 6,32

Tyrosin 0,69

Phenylalanin 2,32

Tryptophan*) (Spuren)

*) Hydrolyse mit einer 4-m Ba(OH),-Lösung 50 Stunden bei ^6s 110⁰C in einem geschlossenen Röhrchen.

Beispiel 3

Aus etwa 1000 Aalen (AnguiOa anguilla) wurden aus dem Stück der am Oesophagus haftenden Vena cava, das in der Nähe des Herzens und des Endocardiums liegt, Gewebestücke herausgeschnitten. Das derart erhaltene Rohmaterial wurde den gleichen Entfettungs- und Entwässerungsstufen wie im Beispiel 1 angegeben unterworfen. Man erhielt 75 g trockenes Pulver.

Das derart eriialtene trockene Pulver wurde in 750 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Butanol-Essigsäure-Wasser im Verhältnis 5:1:2 dispergiert. Durch 24stündige? Rühren bei 50⁰C wurde der Wirkstoff extrahiert. Das erhaltene Gemisch wurde durch Gaze und Filterpapier filtriert Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 50⁰C konzentriert. Der erhaltene Rückstand wurde zweimal mit je 50 ml Aceton und dreimal mit je 50 ml Chloroform gewaschen und darm in 75 ml 2 η-Salzsäure gelöst. Zur Abtrennung von Feststoffen wurde die Lösung 10 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert Der Überstand wurde mit 36 g Harnstoff versetzt und dann auf eine Säule (7,5 χ 90 cm) mit veraetztem Dextran (Sephadex G-75) gegeben und mit einer 0,1-m wäßrigen Ameisensäurelösung behandelt. Die Elution wurde mit der genannten Ameisensäurelösung bei einer Geschwindigkeit von 127,5 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 15 ml gesammelt.

Die biologische Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde an Ratten bestimmt Die Fraktionen Nr. 205 bis 223 wiesen eine hohe Aktivität bezüglich der Senkung des Serumkalziumspiegels auf. Diese Fraktionen wurden vereinigt und gefriergetrocknet. Es wurden 75 mg (60 MRC L'/ng) des Wirkstoffes erhalten.

Die Eigenschaften der erhaltenen Substanzen sind die gleichen wie im Beispiel 1 unter den Punkten i bis 5 und 7 bis 9, jedoch wurden unter Punkt 6 die folgenden Mengen an Aminosäuren gefunden:

Aminosäure

μΜοΙ/mg

Lysin 5,18

Histidin 1,05

Arginin 6,60

Asparaginsäuie 4,77

Threonin 4,10

Serin 4,67

Glutaminsäure 6,70

Prolin 14,50

Glycin 26,30

Alanin 12,60

Halbcystin 0,45

Valin 3,84

Methionin (Spuren)

Isoleucin 2,15

Leucin 5,20

Tyrosin 0,50

Phenylalanin 1,66

Tryptophan*) (Spuren)

*) Hydrolyse mit einer Ba(OH),-Lösung 50 Stunden bei 110°C in einem !geschlossenen Röhrchen.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

21 Π Patentansprüche:

1. Hormonähnliche Substanz mit hypokalzämischer Wirkung, die durch Extrahieren mit einem S Lösungsmittelgemisch aus hydrophilen organischen Lösungsmitteln 'and Wasser oder mit einer verdünnten Säure oder mit Wasser aus dem Heizen, insbesondere der Perikardmembran und/oder aus dem Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der Nähe des Herzens der Aale von Anguilla-Arten oder aus den daraus erhaltenen entfetteten Trockenprodukten und durch Entfernung der Fremdproteine aus dem entstandenen Extrakt oder aus einer durch Entfernen von Feststoffen aus dem Extrakt enthaltenen Flüssigkeit hergestellt worden ist.

2. Verfahren zur Herstellung einer hormonähnlichen Substanz mit hypokalzämischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß man das Herz, insbesondere die Perikardmembran und/oder das Vena-cava-Gewebe am Oesophagus in der Nähe des Herzens der Aale von Anguilla-Arten oder daraus erhaltene entfettete Trockenprodukte mit einem Lösungsmittelgemisch aus hydrophilen organischen Lösungsmittel und Wasser oder mit einer verdünnten Säure oder mit Wasser extrahiert und die Fremdproteine aus dem entstandenen Extrakt oder aus einer durch Entfernen von Feststoffen aus dem Extrakt erhaltenen Flüssigkeit entfernt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Aale 10 bis 17 Tage in Meerwasser oder einer Salzlösung von ähnlicher Zusammensetzung gehalten worden sind.