DE202017007491U1

DE202017007491U1 - Dichtungsverstärker

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Publication number: DE202017007491U1
Application number: DE202017007491.5U
Authority: DE
Original assignee: Sophion Bioscience AS
Current assignee: Sophion Bioscience AS
Priority date: 2016-12-02
Filing date: 2017-12-04
Publication date: 2022-01-07
Anticipated expiration: 2027-12-05
Also published as: US11692994B2; JP2020513242A; US11215606B2; JP7086072B2; US20220107304A1; EP4209783A1; US20190383792A1; EP3548888A1; EP3548888B1

Abstract

Patch-Clamp-System, das eine Patch-Clamp-Vorrichtung (102), eine interne Lösung (124) und eine externe Lösung (122) umfasst,
wobei die interne Lösung (124) ein oder mehrere Anionen umfasst, die aus Phosphat (PO₄ ^3-)-Ionen, Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen und Fluorid (F^-)-Ionen ausgewählt sind, und wobei die externe Lösung (122) ein oder mehrere Metallionen umfasst, die aus Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺ oder Kombinationen davon ausgewählt sind; und
wobei die Konzentration der Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺-Metallionen in der externen Lösung (122) zwischen 4 und 17 mmol/L liegt.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Es wird ein Dichtungsverstärker zur Verbesserung der Patch-Clamp-Dichtung in einem/einer Patch-Clamp-Verfahren oder -Vorrichtung bereitgestellt.
HINTERGRUND
Ein kritischer Schritt bei einem planaren Patch-Clamp-Experiment ist die Bildung einer Versiegelung, d. h. die Bildung einer festen Verbindung zwischen der Zellmembran und dem Substrat des planaren Patch-Clamp-Chips. Diese Versiegelung stellt eine Barriere für Ladungsträger wie Ionen dar, und eine gute Versiegelung kann daher als hoher Versiegelungswiderstand gemessen werden. Der genaue Mechanismus, durch den diese Verbindung zustande kommt, ist noch nicht vollständig geklärt, es ist jedoch bekannt, dass kleine Lücken zwischen der Zelle und dem Substrat durch Ausfällung eines Salzes geschlossen (versiegelt) werden können. Um diesen Effekt auszunutzen, ist es wichtig, dass die beiden Komponenten dieses Salzes (d. h. Anionen und Kationen) in der inneren und äußeren Lösung getrennt sind; andernfalls würde das Salz bereits vor dem Aufbringen der Zelle beginnen auszufallen, was zu einer veränderten Ionenstärke der Lösung führen würde. Die Löslichkeit einer Lösung wird durch das Löslichkeitsprodukt K_sp definiert. Je kleiner K_sp, desto weniger Ionen sind frei verfügbar und desto mehr liegen als festes Salz vor. In der Vergangenheit wurde die R_membrane durch die Verwendung von Fluorid in der internen Lösung und Ca²⁺ in der externen Lösung verbessert. CaF₂ hat einen K_sp-Wert von 3,58 × 10^-11 (McCann, 1968), so dass sich CaF₂ an der Grenzfläche zwischen innerer und äußerer Lösung abscheidet und die Dichtungsbildung fördert (Vargas, Yeh, Blumenthal, & Lucero, 1999). Es gibt jedoch bestimmte Anwendungen, die Ca²⁺ in der internen Lösung und in der externen Lösung erfordern (z. B Ca²⁺-aktivierte K⁺- und Cl^--Kanäle), und F^- kann in diesen Lösungen ist aufgrund des niedrigen K_sp-Wertes nicht verwendet werden.
In der Regel liegt die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung im Bereich von 50 bis 100 mM, vgl. EP1775586 . Zu hohe Metallionenkonzentrationen können jedoch möglicherweise die Funktion der Ionenkanäle negativ beeinflussen, was zu fehlerhaften Reaktionen und ungenauen Reaktionen auf die Wirkstoffe führt.
Es besteht ein Bedarf an einem Dichtungsverstärker für ein Patch-Clamp-System, der mit anderen Komponenten interner oder externer Lösungen kompatibel ist. Unter bestimmten Umständen wird der Gehalt an F^--Ionen reduziert oder sogar eliminiert.
ZUSAMMENFASSUNG
Es wird ein Patch-Clamp-System bereitgestellt. Das Patch-Clamp-System umfasst eine Patch-Clamp-Vorrichtung, eine interne Lösung und eine externe Lösung. Die interne Lösung umfasst ein oder mehrere Anionen, die aus Phosphat (PO₄ ^3-)-Ionen, Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen und Fluorid (F^-)-Ionen ausgewählt sind, und die externe Lösung umfasst ein oder mehrere Metallionen, die aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺ oder Kombinationen davon ausgewählt sind. Die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung liegt zwischen 1 und 20 mmol/L.
Die Verwendung eines oder mehrerer Anionen, die aus Phosphat- (PO₄ ^3-), Sulfat-(SO₄ ^2-) und Fluorid- (F^-) Anionen ausgewählt sind, in Kombination mit einem oder mehreren Metallionen, die aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺ ausgewählt sind, oder Kombinationen davon, als Dichtungsverstärker in einem Patch-Clamp-System ist ebenfalls vorgesehen, wobei die Anionen in einer internen Lösung und die Metallionen in einer externen Lösung des Patch-Clamp-Systems vorhanden sind. Die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung liegt zwischen 1 und 20 mmol/L.
Ein Verfahren zum Bereitstellen eines Gigaseals in einem Patch-Clamp-System wird ebenfalls bereitgestellt, wobei das Patch-Clamp-System eine Patch-Clamp-Vorrichtung, eine interne Lösung und eine externe Lösung umfasst. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a. Einbringen einer Lösung von einem oder mehreren Anionen, ausgewählt aus Phosphat- (PO₄ ^3-), Sulfat- (SO₄ ^2-) und Fluorid- (F^-) Anionen, in die interne Lösung;
b. Einbringen einer Lösung von Zellen in die externe Lösung und Einfangen der Zellen in der Patch-Clamp-Vorrichtung;
c. Einbringen einer Lösung von einem oder mehreren Metallionen, ausgewählt aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺ oder Kombinationen davon, in die externe Lösung, wobei die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung zwischen 1 und 20 mmol/L liegt,

Figurenliste

1 zeigt eine vereinfachte Ansicht einer Patch-Clamp-Vorrichtung 102 zur Verwendung bei der Patch-Clamp-Analyse einer Zelle 120, die auf dem Chip 102 versiegelt ist, um einen Gigaseal zu bilden. Die Vorrichtung 102 trennt eine äußere Lösung 122 auf einer ersten Seite der Vorrichtung von einer inneren Lösung 124 auf einer gegenüberliegenden Seite der Vorrichtung. Der Durchmesser a der Zelle beträgt etwa 5-20 µm, z. B. etwa 10 µm. In der Vorrichtung 102 ist ein Loch 108 ausgebildet, durch das ein Unterdruck angelegt werden kann, um die Zelle 120 über dem Loch 108 zu befestigen. An beiden Seiten der Vorrichtung können Elektroden (nicht dargestellt) angebracht werden, um einen elektrischen Widerstand, einen Ionenfluss oder eine Spannungsdifferenz über die Zelle und durch das Loch 108 zu bestimmen.

DETAILLIERTE OFFENLEGUNG
Der Ausdruck „externe Lösung“ bezieht sich hier auf eine „extrazelluläre physiologische Lösung“, wobei „extern“ außerhalb der Zelle bedeutet.
Der Ausdruck „interne Lösung“ bezieht sich auf eine „intrazelluläre physiologische Lösung“, wobei „intern“ das Innere der Zelle oder die Lösung bedeutet, die für die Bereitstellung des elektrischen und flüssigen Kontakts mit dem Inneren der Zelle bestimmt ist.
In einem ersten Aspekt wird ein Patch-Clamp-System bereitgestellt, wie in schematisch dargestellt. Das Patch-Clamp-System umfasst eine Patch-Clamp-Vorrichtung 102, eine interne Lösung 124 und eine externe Lösung 122.
Das Patch-Clamp-System kann zur Bestimmung oder Überwachung des Stromflusses durch lonenkanal-enthaltende Strukturen, wie z.B. Zellmembranen, mit hohem Durchsatz und hoher Zuverlässigkeit und unter Bedingungen, die im Hinblick auf die Einflüsse, denen die Zellen oder Zellmembranen ausgesetzt sind, realistisch sind, nützlich sein. So können die ermittelten Ergebnisse, z. B. Veränderungen der Ionenkanalaktivität als Ergebnis der Beeinflussung der Zellmembran mit z. B. verschiedenen Testverbindungen, als echte Manifestationen der tatsächlichen Einflüsse und nicht als vom Messsystem eingeführte Artefakte angesehen werden und können als valide Grundlage für die Untersuchung elektrophysiologischer Phänomene im Zusammenhang mit der Leitfähigkeit oder Kapazität von Zellmembranen unter gegebenen Bedingungen verwendet werden.
Der Strom durch einen oder mehrere Ionenkanäle wird direkt gemessen, wobei reversible Elektroden, wie unten beschrieben, typischerweise Silber/Silberhalogenid-Elektroden, wie z. B. Silberchlorid-Elektroden, sowohl als Messelektroden als auch als Referenzelektroden verwendet werden.
Die Patch-Clamp-Vorrichtung kann ein Array aus mehreren Chips auf einem einzigen Träger umfassen. Sie kann in einem Verfahren zur Bestimmung und/oder Überwachung elektrophysiologischer Eigenschaften von Ionenkanälen in lonenkanal-enthaltenden Strukturen, typischerweise Lipidmembran-enthaltenden Strukturen wie Zellen, verwendet werden, indem eine elektrophysiologische Messkonfiguration eingerichtet wird, in der eine Zellmembran eine hochohmige Abdichtung um eine Messelektrode bildet, die es ermöglicht, einen Stromfluss durch die Zellmembran zu bestimmen und zu überwachen. Das Patch-Clamp-System ist beispielsweise in einem Verfahren zur Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften einer Zellmembran, die eine Glykokalyx umfasst, nützlich. Das Patch-Clamp-System kann in einem Gerät zur Untersuchung elektrischer Vorgänge in Zellmembranen verwendet werden oder einen Teil davon bilden, wie z. B. ein Gerät zur Durchführung von Patch-Clamp-Techniken, die zur Untersuchung von Ionentransferkanälen in biologischen Membranen verwendet werden.
Die interne Lösung umfasst ein oder mehrere Anionen, ausgewählt aus Phosphat-(PO₄ ^3-), Sulfat- (SO₄ ^2-) und Fluorid- (F^-) Anionen, vorzugsweise Sulfat- (SO₄ ^2-) Ionen. Die Konzentration der Anionen, wie z. B. Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen, in der internen Lösung liegt zwischen 20 und 200 mmol/L, geeigneterweise zwischen 45 und 175 mmol/L, geeigneterweise zwischen 50 und 150 mmol/L, noch geeigneter zwischen 75 und 125 mmol/L, einschließlich, am geeignetsten um 100 mmol/L.
Nach unserem Kenntnisstand hemmt SO₄ ^2- keinen Ionenkanal oder einen relevanten vorgelagerten Signalweg.
Die meisten Sulfatsalze sind unter physiologischen Bedingungen gut in Wasser löslich. Dadurch kann ein relativ breites Spektrum von Anionen in die interne Lösung eingebracht werden. Typischerweise werden Sulfat-Ionen in der internen Lösung in Form von Mg²⁺-, Ca²⁺-, K⁺- oder Na⁺-Salzen, vorzugsweise K⁺- oder Na⁺-Salzen, bereitgestellt.
Damit die Sulfatsalze in der internen Lösung nicht ausfallen, bevor eine Ausfällung erforderlich ist, ist die interne Lösung im Wesentlichen frei von Ionen, die eine Sulfatausfällung verursachen können. Die interne Lösung ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von Ba²⁺-, Fe³⁺- oder Be²-Ionen und vorzugsweise vollständig frei von Ba²⁺-, Fe³⁺- oder Be²-Ionen.
Die externe Lösung enthält ein oder mehrere Metallionen, ausgewählt aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺, oder Kombinationen davon. Die Metallionen sind vorzugsweise Ba²⁺.
Die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung liegt zwischen 1 und 20 mmol/L, geeigneterweise zwischen 4 und 17 mmol/L, geeigneterweise zwischen 5 und 15 mmol/L, noch geeigneter zwischen 7,5 und 12,5 mmol/L, einschließlich, am geeignetsten um 10 mmol/L. Es ist bekannt, dass Ba²⁺ einige K⁺-Kanäle im µM- bis niedrigen mM-Bereich hemmt (Wulff & Zhorov, 2008). Soweit uns bekannt ist, hat Ba²⁺ jedoch keine Auswirkungen auf irgendeinen der Cl^--Kanäle. Sobald sich die Versiegelung gebildet hat, kann die Lösung mit dem hohen Ba²⁺-Gehalt wieder ausgewaschen werden und die hohe Versiegelung hält noch einige Zeit an. Daher ist der hier beschriebene Dichtungsverstärker auch für Patch-Clamp-Anwendungen nützlich, bei denen Ba²⁺ als Inhibitor wirkt (z. B. Einwärtsgleichrichter-K⁺-Kanäle).
Damit Metallsalze in der externen Lösung nicht ausfallen, bevor die Ausfällung erforderlich ist, ist die externe Lösung im Wesentlichen frei von Ionen, die eine Ausfällung von Metallionen verursachen können. Die externe Lösung ist vorzugsweise im Wesentlichen frei von Sulfat und vorzugsweise vollständig frei von Sulfat-Ionen. Das eine oder die mehreren Metallionen werden geeigneterweise in Form ihres Cl^--Salzes zugesetzt. Geeigneterweise sind alle Kationen in der externen Lösung Cl^-.
Insbesondere kann die interne Lösung eine Konzentration von Fluorid (F^-)-Ionen aufweisen, die weniger als 5 mmol/L, geeigneterweise weniger als 1 mmol/L und vorzugsweise Null beträgt. Fluoridionen können also reduziert und/oder eliminiert werden.
Ohne an die Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass in dem hier beschriebenen Patch-Clamp-System und -Verfahren Salze wie BaSO₄ an der Grenzfläche zwischen interner und externer Lösung ausfallen und dadurch eine Lücke zwischen Zelle und Patch-Loch schließen.
BaSO₄ hat eine Löslichkeitskonstante von K_sp= 1,1 × 10-10, und, was noch wichtiger ist, die Ksp von CaSO₄ beträgt 4,93 × 10^-5, was bedeutet, dass CaSO₄ eine viel geringere Tendenz hat, aus der internen Lösung auszufallen, wenn SO₄ ^2- in Anwesenheit von Ca²⁺ hinzugefügt wird. Daher kann die interne Lösung und/oder die externe Lösung zusätzlich Calcium (Ca²⁺)-Ionen enthalten.
In einem zweiten Aspekt wird die Verwendung eines oder mehrerer Anionen, ausgewählt aus Phosphat- (PO₄ ^3-), Sulfat- (SO₄ ^2-) und Fluorid-(F^-) Anionen, in Kombination mit einem oder mehreren Metallionen, ausgewählt aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺, oder Kombinationen davon, als Dichtungsverstärker in einem Patch-Clamp-System bereitgestellt. Insbesondere wird die Verwendung von Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen in Kombination mit einem Metallion, ausgewählt aus Ba²⁺, als Dichtungsverstärker in einem Patch-Clamp-System bereitgestellt. Die Anionen sind in einer internen Lösung vorhanden, und die Metallionen sind in einer externen Lösung des Patch-Clamp-Systems vorhanden. In ähnlicher Weise wie oben liegt die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung zwischen 1 und 20 mmol/L.
Alle Einzelheiten des ersten Aspekts sind auch für den zweiten Aspekt relevant.
In einem dritten Aspekt wird ein Verfahren zum Bereitstellen eines Gigaseals in einem Patch-Clamp-System bereitgestellt, wobei das Patch-Clamp-System eine Patch-Clamp-Vorrichtung, eine interne Lösung und eine externe Lösung umfasst. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a. Einbringen einer Lösung von einem oder mehreren Anionen, ausgewählt aus Phosphat- (PO₄ ^3-), Sulfat- (SO₄ ^2-) und Fluorid- (F^-) Anionen, in die interne Lösung;
b. Einbringen einer Lösung von Zellen in die externe Lösung und Einfangen der Zellen in der Patch-Clamp-Vorrichtung;
c. Einbringen einer Lösung von einem oder mehreren Metallionen, ausgewählt aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺, oder Kombinationen davon in die externe Lösung;

²⁺

In einem besonderen Fall umfasst das Verfahren die folgenden Schritte:

a. Einbringen einer Lösung von Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen in die interne Lösung;
b. Einbringen einer Lösung von Zellen in die externe Lösung und Einfangen der Zellen in der Patch-Clamp-Vorrichtung;
c. Einbringen einer Lösung von Ba²⁺-Metallionen in die externe Lösung, wobei die Konzentration der Ba²⁺-Metallionen in der externen Lösung zwischen 1 und 20 mmol/L liegt.

Bei diesem Verfahren können die Schritte a. und b. in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden, d. h. eine Lösung von Zellen kann in die externe Lösung eingebracht und in der Patch-Clamp-Vorrichtung eingefangen werden, bevor die Sulfatlösung in die externe Lösung eingebracht wird. Es ist jedoch vorzuziehen, dass Schritt a. vor Schritt b. durchgeführt wird.
Das Verfahren kann ferner den Schritt (d) der Durchführung von Patch-Clamp-Messungen an der/den Zelle(n) in der Patch-Clamp-Vorrichtung umfassen.
Was den ersten Aspekt betrifft, so liegt die Konzentration der Anionen, insbesondere der Sulfat-(SO₄ ^2-)-Anionen, in der internen Lösung zwischen 20 und 200 mmol/L, geeigneterweise zwischen 45 und 175 mmol/L, noch geeigneter zwischen 50 und 150 mmol/L, einschließlich.
Bei den Metallionen handelt es sich geeigneterweise um Ba²⁺. Die Konzentration der Metallionen in der externen Lösung liegt geeigneterweise zwischen 4 und 17 mmol/L, noch geeigneter zwischen 5 und 15 mmol/L, einschließlich.
Zellen zur Verwendung in dem Verfahren können aus CHO oder HEK293 ausgewählt werden.
Alle Einzelheiten des ersten und zweiten Aspekts sind auch für diesen dritten Aspekt relevant. Insbesondere hat SO₄ ^2- eine relativ hohe Löslichkeit mit Ca²⁺. Die Löslichkeitskonstante (Ksp) von CaSO₄ beträgt 4,93×10^-5. Die vorliegende Technik eignet sich für Anwendungen, bei denen die interne Ca²⁺-Konzentration über den gesamten Versuchsverlauf hinweg genau eingehalten werden soll. Bei dem Verfahren des dritten Aspekts kann daher die interne Lösung und/oder die externe Lösung zusätzlich Calcium (Ca²⁺)-Ionen enthalten.
BEISPIEL 1: Test von lonenpaaren als Dichtungsverstärker im Qube-Experiment

Zweck: Erprobung von drei Ionenpaaren (BaSO₄, SrF₂, Ca₃(PO₄)₂) als Dichtungsverstärker auf dem Qube.

Experimentelles

Zelllinie: TE671, die den Na_v-1.4-Kanal exprimiert
Getestete Ionenpaare: CaF₂ (Referenz), SrF₂, BaSO₄, Ca₃(PO₄)₂
Extrahierte Parameter: Zellwiderstand [MΩ], Na_v1.4-Strom I_Peak[pA]

Ergebnisse
Das Kation in den extrazellulären (EC) Lösungen wurde in niedriger Konzentration (2 mM) während der Zugabe und Positionierung der Zellen und in hoher Konzentration (10 mM) vor der Versiegelung und der Strommessung verwendet.

Das Priming wurde bei Metallionenkonzentrationen von 2 mmol/L durchgeführt. Anschließend wurden die folgenden Kationen- und Anionenkonzentrationen verwendet:

	Extrazellulär (EC) [mmol/L]	Intrazellulär (IC) [mmol/L]
CaF₂ (Referenz-Dichtungsverstärker)	10 Ca²⁺	140 F^-
SrF₂	10 Sr²⁺	140 F^-
BaSO₄	10 Ba²⁺	50 SO₄ ^2-
Ca₃(PO₄)₂	10 Ca²⁺	50 PO₄ ^3-

Der daraus resultierende gemessene Widerstand (allgemein als R_membrane bezeichnet) und der Na_v1.4-Strom (I_peak) sind aufgeführt:

	R_membrane pro Zelle [GΩ] (Mittelwert ± SD)	I_peak (nA) pro Zelle (Mittelwert ± SD)
CaF₂ (Referenz-Dichtungsverstärker)	2,3 ± 0,6	-2,4 ± 0,4
SrF₂	1,2 ± 0,3	-2,4 ± 0,5
BaSO₄	1,1 ± 0,3	-1,2 ± 0,5
Ca₃(PO₄)₂	0,4 ± 0,1	-0,9 ± 0,2

Schlussfolgerungen
Von den drei getesteten Ionenpaaren wurden die besten Dichtungs- und Stromstärken für SrF₂ erzielt, das ähnliche Eigenschaften wie CaF₂ aufwies. Die Dichtungs- und Stromstärken der drei Ionenpaare nahmen in dieser Reihenfolge ab: SrF₂> BaSO₄ > Ca₃(PO₄)₂. Es zeigt sich, dass mit niedrigen Konzentrationen von dichtungsverstärkenden Metallionen ausreichende Dichtungs- und Stromstärken erreicht werden können.
BEISPIEL 2: Untersuchung der Auswirkungen von Variationen der Metallionenkonzentration
Ausgehend von einem Beispiel, bei dem verschiedene interne und externe Lösungen untersucht wurden, bei denen die Konzentration des betreffenden Metallions (Ca²⁺, Sr²⁺ oder Ba²⁺) in der externen Lösung sorgfältig kontrolliert wurde. In einer weiteren Studie wurde BaSO₄ in Abhängigkeit von der Anionen- und Kationenkonzentration und als Alternative zu Lösungen auf Fluoridbasis charakterisiert.
Die Osmolalität der internen Lösungen wird mit KCI auf 350 mOsm eingestellt. Der pH-Wert der internen Lösungen wird mit KOH auf pH 7,0 eingestellt.
Testverfahren
Versuchsaufbau: Alle Experimente wurden mit dem automatischen Patch-Clamp-System Qube384 (Sophion A/S, Ballerup Dänemark) unter Verwendung von Einloch-QChips durchgeführt.
Zellen:

1. CHO-Zellen, die den hERG-Ionenkanal stabil exprimieren
2. HEK293-Zellen, die den hTMEM16A-Ionenkanal stabil exprimieren

Allgemeine Methode:
Die internen Lösungen (mit verschiedenen Sulfatkonzentrationen) werden an der Innenseite des Qube-Geräts bereitgestellt. Eine Priming-Lösung, die die angegebenen Zellen enthält, wird dann an der Außenseite der Qube-Vorrichtung bereitgestellt, und die Zellen werden eingefangen. Die externen Lösungen (mit verschiedenen Ba²⁺-Konzentrationen) werden dann an der Außenseite der Vorrichtung bereitgestellt.
Der Dichtungswiderstand (gemessen in GΩ) wird bestimmt, während Ba²⁺ an der Außenseite bereitgestellt wird, indem eine Spannungsimpulsfolge von V = -80mV bis - 110mV für 600ms verwendet wird.
Für jeden Zelltyp wurden alle vier Konzentrationen von Sulfat gegen alle vier Konzentrationen von Barium-Ionen getestet, um eine 4×4 Matrix der Ergebnisse zu erhalten.

Tabelle 3: Zusammenfassung von R_membrane aus 5 einzelnen Experimenten (QChips), gemessen an CHO-hERG-Zellen. Die statistische Signifikanz wurde mit einem A-NOVA-Test ermittelt. * zeigt die Signifikanz in Bezug auf die nächst niedrigere Bariumkonzentration und # bezieht sich auf die Signifikanz in Bezug auf die nächst niedrigere Sulfatkonzentration. * oder # bedeuten p<0,05; ** oder ## bedeuten p<0,01; *** oder ### bedeuten p<0,001. *

	SO₄ ^2-
		0 mM Mittelwert [GΩ]	50 mM Mittelwert [GΩ]	100 mM Mittelwert [GΩ]	150 mM Mittelwert [GΩ]
Ba²⁺	0 mM	0,08	0,09 #	0,04	0,01
	5 mM	0,11 **	0,71 ### ***	0,99 ## ***	0,82 ### ***
	10 mM	0,11	0,80 ###	1,70 ### ***	1,07 ### *
	15 mM	0,12	1,00 ### ***	1,84 ###	1,49 ### ***

Tabelle 4: Zusammenfassung von R_membrane aus einem Experiment (QChips), gemessen an HEK-hTMEM16A-Zellen. Die statistische Signifikanz wurde mit einem ANOVA-Test ermittelt. * zeigt die Signifikanz in Bezug auf die nächst niedrigere Bariumkonzentration und # bezieht sich auf die Signifikanz in Bezug auf die nächst niedrigere Sulfatkonzentration. * oder # bedeuten p<0,05; ** oder ## bedeuten p<0,01; *** oder ### bedeuten p<0,001. *

	SO₄ ^2-
		0 mM Mittelwert [GΩ]	50 mM Mittelwert [GΩ]	100 mM Mittelwert [GΩ]	150 mM Mittelwert [GΩ]
Ba²⁺	0 mM	0,03	0,20	0,11	0,03
	5 mM	0,12	2,90*	1,53	1,44#
	10 mM	0,09	2,57	4,71	0,69###
	15 mM	0,1	3,62	2,86	0,58##

Die Daten sind ein deutlicher Beweis dafür, dass BaSO₄ in automatisierten Patch-Clamp-Experimenten als Dichtungsverstärker verwendet werden kann. Dieser Effekt scheint universell zu sein, da die Ergebnisse von verschiedenen Wirtszelllinien, die von unterschiedlichen Organismen stammen (Chinesischer Hamster (CHO) und Mensch (HEK293)), das gleiche Ergebnis zeigten.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 1775586 [0003]

Claims

Patch-Clamp-System, das eine Patch-Clamp-Vorrichtung (102), eine interne Lösung (124) und eine externe Lösung (122) umfasst, wobei die interne Lösung (124) ein oder mehrere Anionen umfasst, die aus Phosphat (PO₄ ^3-)-Ionen, Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen und Fluorid (F^-)-Ionen ausgewählt sind, und wobei die externe Lösung (122) ein oder mehrere Metallionen umfasst, die aus Ca²⁺, Sr²⁺, Ba²⁺ oder Kombinationen davon ausgewählt sind; und wobei die Konzentration der Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺-Metallionen in der externen Lösung (122) zwischen 4 und 17 mmol/L liegt.
Patch-Clamp-System nach Anspruch 1, wobei die Konzentration der Anionen, insbesondere der Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen, in der internen Lösung (124) zwischen 20 und 200 mmol/L, geeigneterweise zwischen 45 und 175 mmol/L, geeigneter zwischen 50 und 150 mmol/L, noch geeigneter zwischen 75 und 125 mmol/L, einschließlich, am geeignetsten um 100 mmol/L liegt.
Patch-Clamp-System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Metallionen Ba²⁺, Sr²⁺, vorzugsweise Ba²⁺ sind.
Patch-Clamp-System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Anionen Sulfat (SO₄ ^2-)-Ionen sind.
Patch-Clamp-System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzentration der Metallionen zwischen 5 und 15 mmol/L, noch geeigneter zwischen 7,5 und 12,5 mmol/L, einschließlich, am geeignetsten um 10 mmol/L liegt.
Patch-Clamp-System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die interne Lösung (124) zusätzlich Calcium (Ca²⁺)-Ionen umfasst.
Patch-Clamp-System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die interne Lösung (124) eine Konzentration von Fluorid (F^-)-Ionen aufweist, die weniger als 5 mmol/L, geeigneterweise weniger als 1 mmol/L und vorzugsweise Null ist.
Verwendung eines oder mehrerer Anionen, ausgewählt aus Phosphat- (PO₄ ^3-), Sulfat- (SO₄ ^2-) und Fluorid- (F^-) Anionen, in Kombination mit einem oder mehreren Metallionen, ausgewählt aus Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺ , oder Kombinationen davon als Dichtungsverstärker in einem Patch-Clamp-System, wobei die Anionen in einer internen Lösung (124) und die Metallionen in einer externen Lösung (122) des Patch-Clamp-Systems vorhanden sind und wobei die Konzentration der Ca²⁺, Sr²⁺ und Ba²⁺-Metallionen in der externen Lösung zwischen 4 und 17 mmol/L liegt.