DE2019190A1 - Testplaettchen fuer diagnostische Zwecke - Google Patents

Description

"Testplättchen für diagnostische ", Zwecke" .

Die Erfindung betrifft Testplättchen (Objektträger), die sich für die Durchführung von immunochemischen Reaktionen an ihrer Oberfläche eignen. Diese immunochemischen Reaktionen sind allgemein übliche Laboratoriumsuntersuchungen mit dem Ziel, die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antigenen oder Antikörpern in Körperflüssigkeiten zu bestimmen und stellen damit eine Hilfe bei der Diagnose von gewissen physiologischen oder pathologischen Zuständen bei Men&ch und Tier dar. Je nach der betreffenden Kombination von Reagentien und angewandter Testflüssigkeit führt die Reaktion zur Bildung eines Präzipitats und ist dann als Präzipitationsreaktion bekannt. Verläuft die Reaktion zwischen in einem flüssigen Medium verteilten Substanzen, von welchen mindestens eine ein . Festkörper ist, der agglomeriert wird, so ist die Reaktion als Agglutinationsreaktion bekannt. Die Bildung von Präzipitaten oder die Agglutinierung bzw. die Verhinderung der Agglutinierung von besonders behandelten Teilchen wird hinsichtlich der Bildungsweise des Präzipitates bzw. der Art und Weise, in welcher sich die Teilchen nach der Reaktion anordnen, visuell

009844/1285 BAD

... ' · -1A-37 806

— 2 —
beobachtet.

Derartige immunochemische Untersuchungen, die "beispielsweise Blutgruppenuntersuchungen, Schwangerschaftstests u.a. Prüfungen umfassen, werden üblicherweise mit gewissen Eeagentien durchgeführt; so kann man beispielsweise eine Lösung eines geeigneten Antiserums, die sich in einem Teströhrchen befindet, mit Hilfe einer Pipette mit einer Suspension von sensitivieren Erythrocyten versebzen. Selbst wenn aber das Testreagens, wie die wäßrige Suspension von sensitivierten -Erythrocyten, sehr sorgfältig titriert wird, so ist doch die Verwendung von Pipetten und Reagensgläsern nicht nur aufwendig, sondern führt auch leicht zu fraglichen Resultaten, da bei gewöhnlichen Pipetten die Genauigkeit begrenzt ist. Derartige Pipetten oder Tropfröhrchen sind gewöhnlich nicht kalibriert und obgleich die Genauigkeit der Tropfengröße von besonderer Wichtigkeit ist, wird die verlangte Genauigkeit kaum je erreicht und die Größe der Tropfen sowie ihr Gehalt an Reagensmittel ist variabel und unzuverlässig.

Im Hinblick auf die Nachteile dieser Methoden, die mit Reagensglas und Pipette arbeiten, wurde schon vorgeschlagen, die Reaktionen zur Agglutination bzxir. zur Agglutinationsverhinderung derart durchzuführen, daß man einen Tropfen Testreagens auf die Oberfläche eines Glas- oder Pappeplättchens aufbringt, den Tropfen eintrocknen läßt und dann die Testflüssigkeit aufbringt und das Resultat beobachtet. So wird in der USA-Patentschrift 2 770 572 eine Karte zur Bestimmung der Blutgruppe beschrieben, die aus einer festen Folie besteht, bei der mindestens ein Bereich den trockenen Rückstand eines Testserums mit spezifischer Agglutination gegen rote Blutkörperchen trägt. In der USA-Patentschrift 3 074 853 ist eine Testkarte mit einem benetzbaren, jedoch wasserdichten Überzug beschrieben; diese Testkarte trägt einen einzigen trockenen.

- 2 —

009844/1285

BAD ORfGINAL

1A-37 806 .

Fleck aus entweder einem Antigen oder einem Antikörper, vermischt mit einer feinverteilten Substanz mit Kontrastfarbe,' wie Aktivkohle, gegen Vielehe die Bildung des Präzipitates verfolgt werden kann. Der Antikörper "bzw. das Antigen wird als Suspension mit Hilfe einer Pipette "bzw. eines Tropf- < röhrchens aufgebracht und dann getrocknet und das zu testende Serum wird, ebenfalls mit der Pipette, auf den getrockneten Testfleck aufgetropfti Auch diese Vorrichtung hat noch den Nachteil, daß die Testflecke mit Hilfe einer gewöhnliehen Pipette aufgebracht werden, was eine Ungenauigkeit der abgelagerten Menge zur Folge hat; ferner muß eine Kontrastfarbe anwesend sein.

Die USA-Patentschrift 3 272 319 beschreibt eine Packung für immunologische Untersuchungen, wobei eine Kontrollkarte vorgesehen ist, die eine relativ nicht-absorbierende Oberfläche, an welcher ein getrocknetes Serum oder Plasma abgelagert wird, aufweist. Die Packung enthält ferner eine korrespondierende Kontrollkarte mit Ablagerungen von aktivem und inaktivem Serum oder Plasma, um die verwendete Antigensuspension festzustellen. Eine Blutprobe wird dann gegen einen !"lecken getestet, von dem bekannt ist, daß er-mit dem Antigen der Krankheit, auf die geprüft wird, reagiert. Bei dieser Ausführung enthalten die Testflecke entweder das Antigen oder den Antikörper, jedoch niemals beide auf der gleichen Karte.

Es "besteht demnach ein Bedarf an einem vereinfachten Plättchen oder einer Karte für immunologische Tests, worauf sämtliche für einen gegebenen Test notwendigen Eeagentien vorhanden sind und worauf die zu untersuchende Körperflüssigkeit aufgebracht werden kann, so daß das Eesultat durch die Person, die den Test durchführt, sofort festgestellt v/erden kann.

' - 4 -009844/1 285 \

1A-37 806

Bei dem erfindungsgemäßen Testplättchen, das auch die Form einer Karte haben kann, sind sämtliche zur Durchführung von immunochemischen oder diagnostischen Untersuchungen des oben beschriebenen Typs notwendigen Eeagentien vorhanden, und zwar in Form von festen, trockenen, stabilen fleckenformigen Ablagerungen, die hinsichtlich ihres Gehaltes an Einheiten genau sind und eine vorbestimmte Menge an immunochemischem Testreagens enthalten, die optimale Resultate ergibt. Diese fleckenformigen Ablagerungen sind nahe aneinander angeordnet und beim Befeuchten entwickeln sich aus ihnen wieder die betreffenden Testreagentien, die mit der zu untersuchenden Flüssigkeit reagieren, d.h. sich mit ihr zu einem größeren Tropfen Reaktionsgemisch vereinigen.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Plättchen oder Karten ist billig und praktisch und verlangt keine besondere Ausrüstung, so daß sie mit den üblichen Mitteln im großen Maßstab erfolgen kann. Die Reagentien für diagnostische Untersuchungen sind damit in praktischer Form auf einem Plättchen oder einer Karte verfügbar, wobei gleichzeitig die Genauigkeit der Menge, in der die Reagentien vorhanden sind, sichergestellt ist, so daß man verläßliche Testresultate erhält. Auf diese Weise kann jede beliebige Person einen diagnostischen Test mit Hilfe einer einfachen Karte bzw. eines Plättchens durchführen, worauf die Reagentien nahe beieinander vorhanden sind, so daß der Test in situ durchgeführt und die Karte als Beleg aufgehoben werden kann.

Das erfindungsgemäße Testplättehen und seine Herstellung werden im folgenden beschrieben im Hinblick auf Reagentien für einen immunochemischen oder diagnostischen Test zwecks' Feststellung der Anwesenheit von menschlichem Choriongonadotropin (HCG) im Urin, einen Test, der zur Schwangerschafts-

_ 5 _ "009844/128 5.

1A-37 806

- 5■■-

.diagnose angewandt wird. Selbstverständlich ist die Erfindung grundsätzlich nicht auf diese Ausführungsform beschränkt und die erfindungsgemäßen Testplättchen und -karten können alle möglichen immunochemischen und Testreagentien enthalten.

Das erfindungsgemäße Testplättchen bzw. die erfindungsgemäße Testkarte eignet sich zur Durchführung und Beobachtung von immunochemischen oder diagnostischen Tests an ihrer Oberfläche und besteht aus einem praktisch ebenen Streifen eines Substratmaterials mit mindestens einer Testfläche, die in Wasser praktisch unlöslich, jedoch damit benetzbar ist und durch die das Wasser weder hindurchdringt noch von der es absorbiert wird. An dieser Oberfläche des Testplättchens ist mindestens ein Testbereich durch eine Linie umsehrieben, in welchem mindestens zwei wäßrige immunochemische Reagentien in festem, trockenem Zustand abgelagert sind, in denen eine vorbestimmte Menge eines an einem Träger adsorbierten Antigens und ein Antiserum oder ein Antikörper vorhanden ist, welchletztej^Deim Benetzen mit der zu testenden Flüssigkeit wieder in Testreagentien übergeführt und dann vereinigt werden_T so daß sie einen großen Tropfen Eeaktionsgemisch bilden.

Die Art und die Herstellung der erfindungsgemäßen Testplätt-. chen oier-karten sei nun unter Bezugnahme auf die Zeichnung erklärt, in der eine bevorzugte Ausführung dargestellt ist, die jedoch die Erfindung nicht einschränken soll.

Fig. 1 ist eine Draufsicht auf die Oberfläche eines Testplättchens , auf welchem zwei immunochemische Reagentien in Form von festen, getrockneten Flecken abgelagert sind;

2 ist eine Draufsieht auf das Testplättchen nach Fig. 1_t das jedoch in diesem Fall in eine Schutzhülle

. - 6 ' 0 0984 4/1285

.· ' ■ 1A-37 806

•. eingeschlossen ist;

Pig. 3 ist ein Querschnitt durch das Plättchen und die Hülle von Fig. 2 entlang der Linie 3-3·

Das in Fig. 1 'dargestellte Testplättchen ist bestimmt zur Durchführung eines Schwangerschaftstestes. Das Plättchen besteht aus einem im wesentlichen rechteckigen Stück oder Streifen von.Substratmaterial 11, das die oben erwähnte Undurchlässigkeit für Wasser aufweist, jedoch benetzbar ist. Das Substratmaterial kann beispielsweise Glas, glaciertes Porzellan oder ein synthetischer Stoff, z.B. ein Kunststoff, wie ein Phenol-Formaldehydharz sein, wobei dann die Oberfläche, z.B. mit Hilfe des Sandgebläses oder durch Abschleifen so behandelt ist, daß sie benetzbar wird; es kann sich auch um einen transparenten Kunststoff handeln, wie Nitrocellulose oder Methylmethacrylat.

Bei der in Pig. 1 dargestellten Ausführung ist das Substrat ein dünnes Blatt Pappe, die auf einer oder beiden Seiten überzogen ist mit einem für Wasser undurchdringlichen, jedoch benetzbaren Überzug 15 aus weichgestellter Nitrocellulose, dessen Dicke etwa 0,05 cm beträgt, so daß die Biegsamkeit der Pappe nicht beeinträchtigt ist. Selbstverständlich muß die Oberfläche des Substrates, welches das Testreagens trägt, stets wasserunlöslich sein.

Auf der überzogenen Oberfläche der Pappunterlage 10 ist ein Kreis 12 mit Kontrastfarbe eingezeichnet, welcher dazu dient, den Bereich abzugrenzen, der die Testreagentien enthält. Bei der dargestellten Ausführungsform sind zwei Testreagentien anwesend. Das erste davon, 13» ist ein fester, eingetrockneter Fleck einer Antigensuspension, z.B. einer eingetrockneten wäßrigen Suspension von Trägerteilchen, wie.

— 9 —

009844/1285

1A-37 806

— 7 —

Polystyrollatex, Bentonitteilchen, Cholesterol, Quarz- · kristalle, Erythrocyten und Stroma (Zellwände) davon, sensibilisiert mit menschlichem Ghoriongonadotropin. Das zweite Testreagens, 14, ist ein eingetrockneter Antikörper, z.B. eingetrocknetes menschliches Gonadotropinantiserum. Diese Flecke von Testreagentien haben zweckmäßigerweise einen mittleren Durchmesser zwischen etwa 5 und 15 mm und sind nahe beieinander aufgebracht, damit beide durch die;-zu untersuchende Flüssigkeit benetzt werden, wenn diese auf das Testplättchen aufgebracht wird. Gegebenerfalls kann der Überzug 15 mit einem dunklen Pigment, wie Büß, pigmentiert sein, so daß er einen Hintergrund von Kontrastfarbe darstellt, gegen welchen die Testresultate besser beobachtet werden können, wobei sich die.Farbe des Hintergrundes natürlich von der Farbe des Umgrenzungskreises unterscheidet, so daß der letztere sichtbar bleibt. .

Bei einer anderen Ausführungsform, die in der Zeichnung nicht dargestellt ist, können die abgelagerten Reagentien bzw. die Flecke üb ereinanderliegen. Wenn dies der Fall ist, ist es zweckmäßig, eine Zwischenschicht aus inertem Material, wie Sucrose oder Mannitol zwischen den beiden Ablagerungen vorzusehen*

Ist die Unterlage ein Glasplättehen, so können die Testresultate als solche unter entsprechender Vergrößerung studiert werden.

In den Fig. 2 und 3 ist eine Anordnung dargestellt, bei welcher das Testplättchen von Fig. 1 in eine Schutzumhüllung 20 eingeschlossen ist, um die aufgebrachten Eeagentien gegen Feuchtigkeit und Beschädigung während des Lagerns und vor Gebrauch zu schützen. Die Hülle kann von beliebiger Art seinj geeignet ist beispielsweise ein Säckchen oder ein Um-

- 8 - • 0 09 8A4/1285

1A-37 806

schlag aus Kunststoff. Bei der dargestellten Ausführungsform enthält die Umhüllung als Unterlage ein Blatt aus einem Laminat von Aluminiumfolie und Papier 21 und ein Deckblatt 22, das vorzugsweise aus dünnem durchsichtigem Kunststoff gefertigt und abziehbar längs der Kanten der Unterlage mit der Aluminiumflache des Laminates verbunden ist, wie bei 23 gezeigt wird. Zur Erleichterung des Ablösens und Abstreifens der Hülle ist ein Vorsprung 24 vorgesehen. Die Hülle 22 weist eine Prägung -auf, d.h. sie hat einen Mittelteil 25, welcher der Unterlage entspricht und in eine kreisförmige Wand 26 übergeht, die eine mittlere transparente Kreisscheibe 27 begrenzt, deren Durchmesser im wesentlichen dem oben erwähnten Umgrenzungskreis 12 entspricht.

Je nach der Art der durchzuführenden immunochemischen Reaktion können selbstverständlich auch mehr als zwei Ablagerungen oder Flecken vorgesehen sein.

•Die Herstellung der Testreagentien, die nach dem Trocknen die Testablagerungen oder Flecken auf dem Plättchen bzw. der Karte bilden, ist in den Beispielen näher beschrieben.

Bei der Durchführung eines diagnostischen Testes, z.B. eines Schwangerschaftstestes mit der Ausführungsform nach Fig. 1, wird eine abgemessene Menge der zu untersuchenden Körperflüssigkeit, z.B. Urin, auf jeden der Flecken von eingetrockneten Reagentien oder auch zwischen diese Flecken aufgebracht. Die Flecken von getrockneten Reagentien werden dann in dem Urin gelöst oder suspendiert und durch Rühren mit einem Zahnstocher, einem Glasstab oder einem Kunststoffstäbchen vermischt, so daß sich die Reagentien zu einem einzigen Tropfen Reaktionsgemisch vereinigen, in welchem die immunochemische Reaktion stattfindet.

Die Anwesenheit oder Abwesenheit von menschlichem Chorion-

009844/128 5,

■...- ■ ·■ ' · " ' 1A-37 806

gonadotropin im Urin wird festgestellt durch Agglutination der Trägerpartikel bzw. durch die Verhinderung dieser Agglutination; die Reaktion verläuft innerhalb weniger Minuten. Eine entsprechende Agglutination bzw. Agglutinationsverhinderung oder ein Ausfallen ist auch im Fall von anderen immunochemischen Reagentien und Testflüssigkeiten zu beobachten. " ' ' .

Bei der Herstellung der Testplättchen oder -karten werden die Eeagentien als Lösungen oder Suspensionen in einem flüchtigen flüssigen Medium, vorzugsweise einem wäßrigen Medium, bereitet. Die Lösungen bzw. Suspensionen können außerdem Poten_zierungs- oder Eesuspendierungshilfsmittel enthalten. Im Zusammenhang mit der Erfindung wurde gefunden, daß eine Anzahl von Zusatzmitteln die Resuspension der getrockneten Reagentien erleichtern und dazu verhelfen, daß sich eine feste Bindung zwischen dem eingetrockneten Reagens und der ' Oberfläche des Testplättchens bildet. Diese Reagentien sind u.a. beispielsweise Rinderserumalbumin in Konzentrationen bis zu 5 % (Gew.-/Vol.), wobei 1 % der optimale Wert ist; Lactalbuminhydrolysat in Konzentrationen bis zu 5 %, vorzugsweise 1 %_rund Gummiarabicum in Konzentrationen von etwa 0,5 %.

Es wui*de ferner gefunden, daß der Zusatz eines Saccharides, z.B. von Sucrose oder Mannitol, zu dem Reagens bewirkt, daß nach dem Trocknen ein harter, glasartiger Überzug über dem eingetrockneten Testflecken entsteht, .der ihn gegen Abrieb und mechanische Beschädigung beim Packen und bei der Lagerung schützt/

Wie bereits bemerkt, ist· es ein wichtiger Aspekt der Erfindung, daß quantitativ genaue Mengen an Heagentien auf das Test- plättchtn aufgebracht werden, eo daß von vornherein eine opti-

: - 10 -

0098U/128S

.·■;". ' - - · 1Α-37 806

male Sensibilität des Tests sichergestellt ist. Hiermit ist dieUngenaugkeit der üblichen Testmethoden, bei welchen die Testreagentien mit der Pipette verteilt werden, überwunden.

Die Beispiele zeigen die Herstellung von verschiedenen Testreagentien, insbesondere von denjenigen, die für Schwangerschaft sunt ersuchungen verwendet werden.

Beispiel Λ_

Verhinderung der Latexagglutination

Polystyrol-Latexteilchen mit einer Teilchengröße von etwa 0,1 bis 1,5 /U (Durchschnitt 0,5 /u) als Träger werden sensibilisiert mit 100 I.E. je ml menschlichem Choriongonadotropin (HCG) und in einem Boratpuffer suspendiert, worauf Rinderserumalbumin bis zu einer Konzentration von 1 % (Gew.-/Vol.) zugefügt wird. Der Latex wird mit HCG sensibilisiert, indem , man ihn zunächst mit Rinderserumalbumin (etwa 90 /Ug je ml) behandelt, zentrifugiert und dann den Latex mit einer Lösung von HCG inkubiert. Das überschüssige HCG wird durch Zentrifugieren und Waschen entfernt, worauf der Latex in dem Puffer suspendiert wird. Zur Herstellung von 100 ml Latexsuspension verwendet man 24 ml 10%iger HCG-sensibilisierter Latexsuspension in einem Puffer, der je 100 ml Wasser folgende Zusätze enthält: 0,867 S Borsäure, 0,2 g NaCl, 0,648 ml ^h-NaOH und 4,0 g Sucrose; der pH-Wert wird mit NaOH oder HCl auf 8,2 eingestellt.

HCG-Antiserum wird hergestellt durch Auflösen einer entsprechenden Menge (bestimmt durch vorherige Titrierung) von Anti-HCG-Serum (vom Kaninchen) in folgendem Puffergemisch (Je 100 ml): 0,4365 g Borsäure, 0,1g NaCl, 0,234 ml 5n~Na0H,

- 11 -009844/1281 . ■· '

1A-37 806*013190

6 g Sucrose, 0,5 g Binderserumaltumin,- IT-Kaninchenserum 0,5 ml, Natriumcitratdihydrat 4- g; der pH-Wert wird mit NaOH oder HCl auf 8,2 eingestellt. ' ^:

Nun wird .eine entsprechende Menge (0,03 ml) der einzelnen Reagentien genau abgemessen und, wie oben "beschrieben, innerhalb des umschriebenen Bereiches auf ein Testplättchen , aufgebracht, wo sie zv/ei getrennte, jedoch nahe beieinanderliegende Flecken bilden. Die Reagentien Pferden dann an der Luft bzw. mit Hilfe eines Luftstroms getrocknet.

Zur Durchführung eines Schwangerschaftstestes bringt man einen Tropfen (0,03 ml) Urin auf jeden der beiden Testflecken auf und löst bzw. suspendiert die Reagentien in dieser Flüssigkeit, worauf man das ganze zu einem Tropfen -zusammenmischt, in welchem die Reaktion stattfindet; man kann auf diese Weise visuell feststellen, ob eine Agglutination stattgefunden hat oder ob diese verhindert wurde. Durch Einstellen der Menge an getrockneten Reagentien kann die . Sensibilität dieses Testes auf jeden gewünschten Grad eingestellt werden, von etwa 500 I.E. HCG je Liter Urin aufwärts.

Zur genauen Einstellung der Menge an immunochemischen Reagentien,; die auf die Testplättchen aufgebracht werden, kann man erfindungsgemäß eine Meßpumpe eines geeigneten Typs, z.B. eine Lambdapumpe verwenden, wobei es sich um eine Solenoiä-betätigte Kolbenpumpe aus rostfreiem Stahl handelt, die jer-Hub 0,01 ml (10 lambda) bis 0,5 ml, vorzugsweise 0,03 ml.,, fördert» Der Druck der austretenden Suspension bzw* Lösung wird so eingestellt, daß kein Spritzen stattfindet, d.h. es wird z.B. je Hub ein Tropfen gefördert, wobei im allgemeinen je see 10 Hübe oder weniger, je "nach der gewünschten Ausstoßgeschwindigkeit, stattfinden. :■■■■·.-

Werden auf das Plättchen zwei Reagentien aufgebracht, so können

QO98 A4/1285

²⁰¹⁹¹⁹°

sie gleichzeitig Seite an Seite als jeweils einzelne genau abgemessene Tropfen verteilt werden. Das ganze wird dann einem Trockner zugeführt, wo die tropfen bei 20 bis 7O⁰G, je nach der Wärmebeständigkeit des betreffenden Beagensmittels, getrocknet werden. Zum Trocknen kann auch Vakuum angewendet werden. Gefriertrocknung ist unerwünscht, da sonst die Ablagerungen weich und brüchig werden. Uach dem Trocknen kann das Plättchen als solches verwendet oder mit der Schutzhülle versehen und gelagert werden.

Beispiel 2 Direkte Latexagglutination

Eheumatoide Faktoren können in menschlichem Serum mit Hilfe eines bekannten Testes nachgewiesen werden, bei welchem man menschliches γ—Globulin verwendet, das fest an einem Latexteilchen haftet. Bei diesem Test erfolgt eine Agglutination •des sensibilisierten Latexteilchens, wenn dieses mit mensch lichem Serum in Zontakt kommt, das rheumatoide Paktoren ent hält. Polys.tyrol-Latexteilchen, 1,5 % Feststoffe, werden suspendiert in einem Glycinpuffer (pH 8,6) der folgenden Zusammensetzung:

Glycin (Aminoessigsäure) 9 »45 g Natriumchlorid " 12,23 g

Das ganze wird in 800 ml destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert mit In-ITaOH auf 8,6 eingestellt, worauf man mit destilliertem Wasser auf 1 1 Gesamtvolumen auffüllt. Die Teilchen sind mit menschlichem Immunoglobulin (IgG) (siehe Singer und Plotz, Amer. J. Med. 21; 888, 1956) sensibilisiert und betragen 1 >ä, bezogen auf Rinderserumalbumin. Auf die Plättchen werden Tropfen von 0,03 ml aufgebracht und getrocknet.

- 13 -

0 0 9 8 A 4 / 1 2'8 5,

1A-37 806

- 13 -

Gleichzeitig mit der Verteilung des Tropfens Latexsuspension auf dem Plättchen wird ein Tropfen Glycinpuffer der gleichen Zusammensetzung wie oben auf das Plättchen aufgebracht und getrocknet und z\*ar auf eine Stelle unmittelbar neben dem Tropfen Latexsuspension, jedoch getrennt von diesem*

Bei dem Test auf rheumatoide Faktoren in menschlichem Serum wird das Serum mit 0,9%iger Kochsalzlösung oder mit dem oben beschriebenen Glycinpuffer auf 1:20 verdünnt und.ein Tropfen (0,03 ml)- auf den eingetrockneten Puffertropfen aufgebracht. Um das Reagens wieder herzustellen, wird auf den Latextropfen ein Tropfen (0,03 ml) Wasser aufgebracht. Das verdünnte, gepufferte Serum und der Latex werden gemischt und über den durch den Kreis umgrenzten Bereich auf dem Plättchen verteilt. Der Eheumatoidfaktor ist nachgewiesen durch Agglutination der Teilchen innerhalb 1 min.

Beispiel 3

Getrocknete, teilchenförmige Antigensubstanz

Ein bekannter Nachweis für durch infektiöse Mononucleose entstandene Antikörper (X, M·-Antikörper) im menschlichen Serum oder Blut wird wie folgt durchgeführt: I.M,-Antikörper reagieren mit Schaf-Erythrocyten und/oder dem speziellen Extrakt von Schaf-Erythrocyten und verursachen Agglutination. Wenn dieser besondere Extrakt auf einer geeigneten Oberfläche mit Zusätzen eingetrocknet wurde, kann er mit Wasser oder einer gepufferten Lösung oder unmittelbar mit dem Testserum wieder hergestellt werden. Eine sichtbare Agglutination mit im Serum _; anwesenden I.M.-Antikörper ist, falls sie auch in einem eingetrockneten Fleck von Meereclweinchengewebeextrakt auftritt, 'charakteristisch für infektiöse Mononucleose. Meerschweinchen- fpwebetxtrakt hat den Zweck, nicht-epezifische heterophile

" 00^44/1285

1A-37 806

-14 -

Antikörper des Forssman-Typs zu absorbieren, die sonst ebenfalls eine Agglutination in dem Schaf-Erythrocytenreagens bewirken würden.

Schaf-Erythrocytenextrakt wird bereitet durch Inkubation von frisch gezogenen, gewaschenen Schaf-Erythrocyten in einem Boratpuffer der folgenden Zusammensetzung:

Borsäure . : 30 g Natriumchlorid 12 g

foi-Natriumhydroxidlö*sung etwa 8 ml (pH 7»0) Destilliertes Wasser 1000 ml

Natriumazid ' 2g

Die resultierende Suspension wird mit Trypanblau gefärbt (0,2 g/l, gelöst in dem oben beschriebenen Puffer); dann wird das Gemisch auf 1 %, bezogen auf Rinderserumalbumin, gebracht .

Das Meerschweinchenantigen wird wie folgt bereitet: Ein an Forssman-Antigen reiches Meerschweinchengewebe (Niere, Milz, Lunge) wird in soviel 0,9/&ige Kochsalzlösung eingebracht, daß eine 18%ige Suspension entsteht. Die Suspension wird durch Zentrifugieren geklärt, 30 min bei 56⁰C inkubiert, nochmals zentrifugiert und auf 0,2 % in bezug auf Natriumazid gebracht. ■

Je ein Tropfen (0,03 ml) Schaf-Erythrocytensuspension und Meerschweinchengewebeextrakt werden nahe nebeneinander auf ei£ ,entsprechendes Plättchen aufgebracht und an der Luft getrocknet. Zur Durchführung des Tests wird ein Tropfen von 0,06 ml Serum, Plasma oder frisches Blut auf die eingetrockneten Reagentien aufgebracht und daa Gemisch leicht gerührt, um die Reagentien in dem Serum oder Blut zu lösen

. - 15 -

009144/USS .

iA-37 806

~ 15.-

zu suspendieren. Eine Agglutination, die durch das Auftreten von blauen Flecken in Erscheinung tritt, bedeutet einen positiven !Pest. Stattdessen kann das Schafreagens auch zuerst mit einem Tropf en Pufferlösung oder Wasser rekonstituiert werden, worauf ein !Tropfen Serum, Plasma oder Blut zugeführt wird. ' .

Hach einem .anderen Verfahren kann das' eine Reagens, vorzugsweise der Extrakt aus Meerschweinchengewebe, auf den eingetrockneten Tropfen Schaf-Erythrocytsuspension aufgebracht werden. Im zweiten darauf aufgebrachten Tropf en wird eine gewisse Auf lösung des eingetrockneten Schaf reagens auftreten. XIm dies zu verringern, kann dem ersten Reagens ein Zucker, z.B. Sucrose, in einer Menge von etwa 7 bis 10 % (Gew.— /Vol.) zugefügt werden. Dieser getrocknete Tropfen ergibt dann eine glatte, harte Oberfläche und wenn der darauf aufgebrachte . Tropf en rasch eingetrocknet wird, wird die Auflösung-der Beagentien von dem ersten Tropfen in den zweiten zurückgedrängt.

Beispiel 4

Direkte Agglutination eines Antikörpers durch eingetrocknetes, teilchenföraigeg Antigen -

Gut konservierte, mit Glutaraldehyd oder .Formaldehyd behandelte menschliche Erythrocyten einer bekannten Blutgruppe werden, wie oben beschrieben, auf einer benetzbaren, nicht absorbierenden ebenen !"lache getrocknet. Eine Agglutination mit menschlichem Serum oder Plasma 1st bezeichnend für die ■■-Blutgruppe der abgebenden Person. Frisch abgezogene menschliche Erythrocyten einer bekannten Blutgruppe werden mit O,153n-Uatriumchlorld gewaschen, durch Zentrifugieren verdichtet, auf 4⁰G abgekühlt und dann bis zu einem Gehalt von 1 bis 2.$»,.. suspendiert in einer lösung von 25 % (V/V) Glutaraldehyd, die • - 16 -

009844/1285

806 ²⁰¹⁹¹⁹°

auf 1 % verdünnt wurde mit einer Lösung aus 9 Volumina 0,15m-Natriumchlorid, 1 Volumen O,15m-Natriumphosphat (pH 8,2) und 5 Volumina destilliertem Wasser.

Die fixierten Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und 5mal mit 0,1^-Natriumchlorid gewaschen, worauf sie schließlich zu 30 % mit destilliertem Wasser und 1:10 000 Thimerosal suspendiert und gelagert werden (siehe BING, D.H. et al. Proc. "Soc. Exp. Biol. & Med. 124, S. 1166 - 1170'(196?)).

1 Tropfen (0,03 ml) menschlicher Α-Zellen, behandelt wie oben, und auf dem gleichen Plättchen daneben 1 Tropfen (0,03 ml) menschlicher B-Zellen werden in einem warmen Luftstrom getrocknet. Auf beide eingetrocknete Ablagerungen wird . je 1 Tropfen des auf die Blutgruppe zu testenden Serums oder Plasmas aufgebracht, worin die eingetrockneten Zellen unter gutem Durchmischen suspendiert werden. Die Agglutination dieser suspendierten Zellen von bekanntem Typ zeigt die Anwesenheit von Antikörpern zu dieser Blutgruppe an. Durch das Auftreten oder Nichtauftreten einer Agglutination mit entweder Α-Zellen und/oder B-Zellen läßt sich die Blutgruppe der das Serum (bzw. Plasma) abgebenden Person leicht bestimmen.

Beispiel 3

Direkte Agglutination eines teilchenförmigen Antigens durch getrocknetes Antiserum

Antiserum kann getrocknet werden auf einer benetzbaren, nicht-absorbierenden Fläche und wird dann gelöst in, bzw. gelöst und dann umgesetzt mit einem teilchenförmigen Antigen. Menschliche Antiblutgruppensubstanz kann getrocknet werden auf einem Glasplättchen oder einer anderen geeigneten Oberfläche und wird dann umgesetzt mit den entsprechenden Erythrocyten aus Menschenblut oder mit in Salzlösung gewaschenen und

- 17 0098 4 4/1285

1A-37 806

- 17 -

suspendierten menschlichen Erythrozyten, die" dadurch
agglutinieren.

Serum oder Plasma mit einem Gehalt an Antikörpern zu bekannten Blutgruppensubstanzen, d.h. handelsübliches Typisierungsserum, kann auf Plättchen getrocknet und als Reagens für die
Blutgruppenbestimmung verwendet werden.

1 Tropfen (0^03 ml) Antiserum zur Blutgruppensubstanz A und 1 Tropfen (0,03 ml) Antiserum zur Blutgruppensubstanz B werden nahe beieinander auf 1 Plättchen aufgebracht und mit Hilfe eines Warmluftstromes getrocknet. Auf die Ablagerungen bringt man je 1 Tropfen einer 1- bis 2%igen Suspension· der zu bestimmenden menschlichen Erythrozyten auf und bewegt die resultierende Suspension vorsichtig 2 min lang. Das Auftreten einer Agglutination ist ein Anzeichen dafür, daß die Erythrocyten von einem Typus sind, der demjenigen des Agglutinierungsantiserums entspricht.

Aus einer Punktur der Fingerspitze entnommenes frisches Blut kann unmittelbar auf die trockenen Ablagerungen der Reagentien auf dem Plättchen aufgebracht und entsprechend mit 1 Tropfen Kochsalzlösung verdünnt werden. Wenn das Blut Erythrocyten enthält, die isolog zu dem eingetrockneten Antiserum sind, tritt rasch eine sichtbare Agglutination auf,' , ^: ■-■■----^v--, ....._ _

PATENTANSPRÜCHE

' - 18 -

1309844/128 5

Claims (16)

1. PATENTANSPRÜCHE

   Testplättchen zur Durchführung und Beobachtung eines immunochemisehen oder diagnostischen Tests auf seiner Oberfläche, gekennzeichnet durch einen im wesentlichen ebenen Streifen (10) aus Substratmaterial, der mindestens eine Testoberfläche aufweist, die in Wasser unlöslich und für Wasser undurchdringlich ist, Wasser nicht absorbiert, jedoch durch Wasser benetzbar ist, wobei der Teststreifen auf seiner Oberfläche einen durch einen Kreis markierten Testbereich aufweist, innerhalb dessen nahe beieinander mindestens zwei feste getrocknete wäßrige immunochemi'-sche Testreagentien (1.3, 14) abgelagert sind, von denen der eine eine vorbestimmte Menge eines an einen Träger adsorbierten Antigens und der andere ein Antiserum oder einen Antikörper enthält, und die beim Anfeuchten mit einer zu testenden Flüssigkeit zu den entsprechenden Testreagentien rekonstituiert werden, worauf sie zu einem Tropfen Reaktionsgemisch vereinigt werden.
2. 2) Testplättchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Testreagentien (13, 14) Seite an Seite nahe beieinander auf der Oberfläche (15) des Plättchens angeordnet sind.
3. 3) ' Testplättchen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß eines der Testreagentien (14) über dem anderen (13) angeordnet ist.
4. 4) Testplättchen nach Anspruch 1, 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet , daß die Testreagentien (13»14) einen mittleren Durchmesser von etwa 5 "bis 15 mm haben,
5. 5) Testplättchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

   0 0 9 8 U / 1 2 8 5

   1A-37 806

   - 19 -

   gekennzeichnet , daß das Substratmaterial Glas ist. .
6. 6) Testplättchen nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß das Substratmaterial ein im wesentlichen rechteckiges Kartonblatt (10) ist, das an einer Seite einen Überzug (15) aus einem für Wasser undurchdringlichen, jedoch mit Wasser benetzbaren Kunststoff aufweist.
7. 7) Testplättchen nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der Kunststoff eine dünne Schicht aus weich gestellter Nitrocellulose ist.
8. 8) Testplättchen nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet , daß der Testbereich, in dem die Testreagentien angeordnet sind, durch einen Kreis (12) aus Kontrastfarbe umschrieben ist.
9. 9) Ausführungsform des Testplättchens nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ e i c h η et' , daß das die Testreagentien tragende Substrat (10) eingeschlossen ist in eine Schutzhülle (21 bis 27), bestehend aus einem Grundblatt (21) aus mit Aluminiumfolie beschichtetem Papier,und einem Deckteil (22), bestehend aus einem geprägten dünnen transparenten Kunststoffblatt, das an den Kanten abziehbar mit der Aluminiumoberfläche des Grundblattes verbunden ist und einen erhöhten Mittelteil 25, der. nach Form und Größe dem Substrat (10) entspricht und in einen runden, aufwärtsstehenden Wandteil (26) übergeht, der seinerseits in einen kreisförmigen Mittelteil (27) übergeht.
10. 10) Testplättchen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet , daß innerhalb des Testbe-

    - 20 -

    . ■· ■ -

    009844/1285 '

    1A-37 806 '■ - 20 - .

    reiches eine feste Pufferkomposition unmittelbar neben einer Ablagerung eines Testreagenses angeordnet ist.
11. 11) Testplättchen nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet , daß das Substrat (10) ein Kartonblatt ist und daß im Inneren des Testbereiches ein erstes Testreagens (13) in Form von festen, getrockneten, mit einem Antigen sensibilisierten Trägerteilchen und als zweites Testreagens (14) eine getrocknete wäßrige Lösung eines Antikörpers angeordnet ist.
12. 12) Testplättchen nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet , daß die Beagentien ein Saccharid enthalten. '
13. 13) Testplättchen nach Anspruch 11, dadurch gekenn zeichnet , daß die Eeagentien einen Zusatz enthalten, der die Ablagerung mit der Oberfläche (10) verbindet und die Eesuspension nach Befeuchten beschleunigt.
14. Testplättchen nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß es entsprechend Anspruch 9 in eine Hülle eingeschlossen ist, bei welcher die mittlere Erhöhung (27) etwa dem Durchmesser des die Testfläche umschließenden Kreises (12) entspricht.
15. 15) Testplättchen nach Anspruch 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet , daß die"Testfläche Glas ist.
16. 16) Testplättchen nach einem der vorangehenden Ansprüche zur Schwangerschaftsuntersuchung, dadurch gekennzeichnet , daß die auf den Testbereich aufgebrachten Beagentien (13, 14) eine eingetrocknete wäßrige Sus-

    - 21 -

    009844/128 5,

    1A-37 806

    . ■ ' ■'■■'.- 21 -

    pension von mit menschlichem Choriongonadotropin sensibilisierten Trägerteilchen und eine eingetrocknete Lösung von menschlichem Choriongonadotropinantiserum sind.

    009844/1285

    Leerte