DE19983998T5

DE19983998T5 - Vorrichtung zur elektrooptischen Zellanalyse in einer Suspension und Verfahren zur Durchführung der Analyse

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Publication number: DE19983998T5
Application number: DE19983998T
Authority: DE
Inventors: Victor Dr. Bunin
Original assignee: BIOTRONIX GmbH
Current assignee: Elosystems Dr Angersbach & Dr Bunin GbR (ver De
Priority date: 1999-12-27
Filing date: 1999-12-27
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2019-12-28
Also published as: DE19983998B4; WO2001048143A1

Abstract

Einrichtung für elektrooptische Analyse der Zellen in Suspension, die enthält:
– eine elektrooptische Zelle (1), ausgestattet mit durchsichtigen gegenüberliegenden Fenstern (19) und neun Nadelelektroden (20, 21, 22, 25, 26, 27, 30, 31, 32), die in drei Reihen – je drei Elektroden in jeder Reihe – zwischen den genannten Fenstern (19) plaziert sind; die mittlere Elektrode (26) der mittleren Reihe ist dabei zentral;
– die optisch mit dem Photosensor (8) verbundenen und an die Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von Lichtstrahlen angeschlossenen Lichtquellen (2, 3);
– sowie dem in Reihe geschalteten Spannungsgenerator (12), Attenuator der elektrischen Spannung (13) mit der Steuerung der Spannungsabschwächung, Paraphasenverstärker (14) und Elektrodenkommutator (18), dessen zwei Ausgänge an die erwähnten Elektroden angeschlossen sind;
dadurch gekennzeichnet, dass
– sie mit zusätzlichen, in Reihe geschalteten Spannungsgenerator (15), Attenuator der elektrischen Spannung (16) mit der Funktion der Steuerung der Spannungsabschwächung, Paraphasenverstärker (17), dessen...

Description

Anwendungsbereich
Der Anwendungsbereich der Erfindung liegt in der Biotechnologie, Mikrobiologie und Medizin. Es betrifft eine Einrichtung zur elektrooptischen Analyse der Zellsuspension und Verfahren, die in dieser Einrichtung verwirklicht werden und zur Bestimmung der morphologischen und elektrophysikalischen Zellparameter, der Viskosität des Zellinhaltes und der damit verbundenen physiologischen Eigenschaften der Zellen dienen.
Stand der Technik und Entwicklung
In der Mikrobiologie, Lebensmittelindustrie, Medizin und anderen Industriezweigen, die biotechnologische Prozesse verwenden, besteht die Aufgabe, verschiedene Merkmale des Zellzustandes, die auf die Qualität und Wirksamkeit des biotechnologischen Prozesses hinweisen, zu bestimmen. Herkömmliche mikrobiologische Verfahren wie die Bestimmung von morphometrischen Zellparametern mittels Mikroskopanalyse, Bestimmung von physiologischen Eigenschaften wie Vitalität mittels der Ausplatierung auf Nährmedien, Ermittlung der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit mittels der periodischen Zählung der Zellen in der Zählkammer entsprechen den modernen Anforderungen nicht, weil sie nicht operativ sind.
Die elektrooptische Analyse der Zellsuspensionen, welche die Erfassung der Lichtstreuung bei der Orientierung der Zellen in einem elektrischen Feld zu Grunde liegt, ermöglicht die Bestimmung des physiologischen Zustandes der Zellen und gleichzeitig deren morphologischen Parameter. Die elektrooptische Analyse basiert auf dem s.g. Kerr-Effekt. Das Prinzip dieses Effektes besteht in der Veränderung der optischen Eigenschaften der Suspension (zum Beispiel bei Zellsuspension) durch Wirkung eines elektrischen Feldes.
Das an die Zellsuspension angelegte elektrische Feld induziert eine Polarisation der elektrischen Ladungen in den suspendierten Zellen. Das Ausmaß und die Verteilung der induzierten Polarisationsladungen werden durch den effektiven Polarisationsmechanismus bestimmt [Dukhin, Elektrooptik von Kolloiden, Verlag: Naukowa Dumka, Kiew, 1975]. Bei dem volumen-räumlichen Polarisierbarkeitsmechanismus entstehen induzierte Ladungen an der Phasengrenze von zwei Medien mit den unterschiedlichen komplexen dielektrischen Eigenschaften. Phasengrenzen der Zellstrukturen sind beispielsweise Kontaktflächen der Doppelelektronenschicht und der Zellwand, der Zellwand und der zytoplasmatischen Membran, der zytoplasmatischen Membran und des Zytoplasmas. Die Menge der auf der Phasengrenze induzierten Ladungen ist proportional der Stärke des elektrischen Feldes und ist von dem Verhältnis der dielektrischen Permeabilität der Zellstrukturen abhängig. Als Integralwert, der die Polarisierbarkeit charakterisiert, gilt der Tensor der Polarisierbarkeit der Zelle α. Der Tensor der Polarisierbarkeit unsphärischer Zellen besitzt wenigstens zwei unterschiedliche Komponenten. Die Längskomponente ist der langen Zellenachse entlang, die Querkomponente liegt orthogonal zur langen Zellenachse. Die in der Zelle verteilten induzierte elektrische Ladungen mit den verschiedenen Vorzeichen bilden einen Dipol. Der Dipol wirkt mit dem elektrischen Feld zusammen und ruft die Bildung eines Drehmomentes hervor. Es entsteht eine dominante Richtung der Zellorientierung, die den wahrscheinlichen Charakter der Verteilung der Zellen im Orientierungswinkel (wird durch Bolzmann-Funktion beschrieben) verändert. Den Orientierungswinkel der Zelle zählt man von der Richtung des fallenden Lichtstrahles zu der Richtung der langen Zellachse.
Dabei entsteht eine Veränderung aller optischen Charakteristika der Suspension: der Größe der Lichtdoppelbrechung, des Charakters der Lichtstreuung und der Größe der optischen Dichte der Suspension, infolge der Veränderung des Streuungsschnittes G(t) der Zellen. Im Bereich der schwachen Zellorientierung hat die Abhängigkeit der Veränderung der optischen Dichte der Suspension von dem Quadrat der Stärke des elektrischen Feldes E einen linearen Charakter.
Abhängig von der Frequenz des elektrischen Feldes und den elektrischen Eigenschaften der Zellen kann die Richtung der dominanten Zellorientierung mit der Richtung des Vektors des elektrischen Feldes übereinstimmen oder orthogonal dazu sein. Die Zellorientierung mit der langen Achse entlang des Lichtstrahls führt zur Vergrößerung des Zerstreuungsschnittes und zur Reduzierung der Intensität des Lichtstrahles. Die Orientierung quer zum Lichtstrahl führt dabei zur Reduzierung des Streuungsschnittes und dementsprechend zur Zunahme des Lichtstrahlintensität.
Es ist eine Einrichtung für elektrooptische Analyse der Zellen in Suspension bekannt (SU, A, 469748), die folgende Teile enthält: eine Messzelle mit der Zellsuspension, eine Lichtquelle die den Lichtstrahl, der durch die Zelle durchgeführt wird, erzeugt, einen Photosensor, einen Generator für harmonischen Spannungsfelder und eine Einrichtung zur Steuerung dieser Elemente. Die Einrichtung enthält ein System zur Zugabe und zur Entnahme der zu untersuchenden Suspension.
Diese Einrichtung erlaubt ein Verfahren (SU, A, 469748) zu verwirklichen, welches darin besteht, dass durch die zu untersuchende Suspensionsprobe ein Lichtstrahl durchgelassen wird mit dem gleichzeitigen Anlegen eines Radioimpulses des elektrischen Feldes um die Suspension mit der fixierten Frequenz und Feldstärke. Die Feldlinien des Radioimpulses sind parallel zum Lichtstrahl gerichtet. Die Frequenz des elektrischen Feldes wird für jeden Messimpuls verändert. Bei jeder Frequenz wird die optische Dichte der Suspension in Anwesenheit und Abwesenheit des elektrischen Feldes gemessen. Aufgrund der Veränderung der optischen Dichte wird der Orientierungsgrad der Zellen bestimmt. Mit der Orientierungsgrad werden die elektrophysikalischen Eigenschaften der Zellen beurteilt, z.B. die Größe der Anisotropie der Polarisierbarkeit, die mit den komplexen dielektrischen Eigenschaften der einzelnen Zellstrukturen verbunden sind, und damit auch die physiologischen Zelleigenschaften bestimmt.
Die Anwendung dieser Einrichtung und des Verfahrens zur Analyse von dimensionsheterogenen Zellsuspension erlaubt es nur einen durchschnittlichen Wert der Anisotropie der Zellpolarisierbarkeit für die ganze Population zu bestimmen. Es gibt keine Möglichkeit in einer Population diesen Wert für einzelne Zellfraktionen mit unterschiedlichen Zellgrößen zu bestimmen.
Außerdem reduzieren die in der zu untersuchenden Suspension vorkommenden Sedimentationen und Agglomerationen der Zellen, sowie Schwankung der Suspensionsdichte wesentlich die Empfindlichkeit und die Genauigkeit der Messung durch Zunahme der optischen Dichte, welche für die Bestimmung der Anisotropie der Polarisierbarkeit benutzt wird. Diese Störfaktoren verursachen insbesondere bei dem geringen Niveau des Signals eine starke Störung. Dieser Effekt ist charakteristisch bei der Orientierung der Zellen im Hochfrequenzbereich des elektrisches Feldes. Die Entstehung dieser Störfaktoren ist damit verbunden, dass die Messungen mit einem einzelnen Lichtstrahl durchgeführt werden und die entstehende Dichtefluktuation, Sedimentation und Flockung nicht kompensiert werden. Die mit der Unstabilität der Lichtquelle und des Photosensors verbundenen Messfehler (s.g. Flicker-Rausch) sind dabei ebenfalls groß.
Diese Messfehler werden teilweise bei der Verwendung eines Doppelstrahlsystems zur Registrierung der Veränderung der optischen Dichte der Suspension mit der mechanischen Umschaltung des Lichtstrahles von dem Stützkanal auf den Messkanal beseitigt [Biotechnologie, 1989, No. 2, s. 214–215].
Höhere Präzision und Empfindlichkeit bei der Bestimmung der Zellorientierung im elektrischen Feld kann mit der Einrichtung (RU, 913169) erreicht werden, die folgende Teile enthält: zwei elektrooptische Messzellen mit zwei Flachelektroden in jeder Messzelle, die mit der zu untersuchenden Suspension gefüllt werden, eine Lichtquelle, die zwei Lichtstrahlen bildet, einer wird durch eine Zelle durchgeführt, der andere durch die zweite und, dementsprechend, zwei Photosensoren mit dem Differenzverstärker für die Bestimmung der Differenz zwischen der Intensität der Lichtstrahlen, sowie ein Spannungsgenerator. Die Richtung des Vektors des elektrischen Feldes in der einen Zelle ist dem Lichtstrahl parallel, die Richtung des Vektors des elektrischen Feldes in der anderen Zelle ist dem Lichtstrahl orthogonal.
Diese Einrichtung lässt ein Verfahren der elektrooptischen Analyse der Zellsuspension realisieren (RU, 913169). Dieses Verfahren besteht darin, dass der Lichtstrahl durch zwei Zellsuspensionsproben durchgelassen wird. Gleichzeitig wird um die Suspension ein Radioimpulses des elektrischen Feldes mit der fixierten Feldfrequenz und Feldstärke angelegt. Der Vektor des Radioimpulses ist für die eine Probe dem Lichtstrahl parallel und für die andere Probe dem Lichtstrahl orthogonal. Die Frequenz des elektrischen Feldes wird, wie in o.g. Beispiel, bei jeden Messimpuls neu variiert. Es werden die Intensitäten der durch die zu untersuchende Suspension ausgetretenen Lichtstrahlen gemessen, die gleichzeitig die optischen Dichten der Suspension für beide Proben bestimmen. Anhand der Differenz dieser Werte wird die Anisotropie der Polarisierbarkeit bestimmt, nach dem die elektrophysikalischen Eigenschaften der Zellen beurteilt werden.
Für Zellsuspensionen, die ähnliche Dimensionen der einzelnen Zellen haben, ist die Änderung der optischen Dichte bis zu einem bestimmten Schwellenwert proportional zu dem Quadrat der Stärke des elektrischen Feldes. Dieser Schwellenwert entspricht dem Übergang von einem schwachen Grad der Zellorientierung zu einem starken Orientierungsgrad. Die Messung im Bereich dieses Schwellenwertes garantiert eine ausreichende Messpräzision. Im Zusammenhang damit wird am Anfang der Messreihe experimentell die Feldstärke bestimmt, bei der die Zellen von einem schwachen zu dem starken Orientierungsgrad übergehen. Weiterhin werden alle Messungen ohne Veränderung der Stärke des elektrischen Feldes durchgeführt.
Die beschriebene Einrichtung und das Verfahren können nur für die Analyse von homogenen Zellsuspension verwendet werden, weil sie nur die Veränderung der summarischen optischen Dichte der Suspension und, dementsprechend, durchschnittlichen (nach der Zelldimension) Werte der Anisotropie der Polarisierbarkeit einschätzen lassen. Die Verwendung von zwei Messzellen und zwei Photosensoren kompensiert zum Teil die mit der Sedimentation und Flockung von Zellen verbundenen Messfehler, aber sie ruft zusätzliche Messfehler hervor, die mit der nicht identischen Ausführung der Messzellen und der Anwesenheit der nicht kompensierten Niederfrequenzgeräuschen der Photosensoren verbunden sind.
Es ist eine Einrichtung bekannt (RU, 2070919), die folgende Elemente enthält:

– eine elektrooptische Messzelle, ausgestattet mit vier durchsichtigen gegenüberliegenden Fenstern und neun Nadelelektroden, die in drei Reihen – je drei Elektroden in jeder Reihe – zwischen den genannten Fenstern eingebaut sind; die mittlere Elektrode der mittleren Reihe ist dabei zentral;
– zwei impulsartigen Lichtquellen, die gegenüber o.g. Fenster plaziert und optisch mit einem Photosensor gekoppelt sind; dabei ist der Photosensor mit der Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von Lichtstrahlen verbunden;
– in Reihe geschalteten a) Generator der elektrischen Spannungsimpulse, der mit den oben genannten Nadelelektroden verbunden ist, b) Attenuator der elektrischen Spannung mit Funktion der Steuerung der Spannungsabschwächung, c) Paraphasenverstärker und Elektrodenkommutator; dabei sind die am Außenrande der ersten und dritten Reihe plazierte Elektroden mit einem der Ausgänge des erwähnten Paraphasenverstärker verbunden, die o.g. zentrale Elektrode ist mit dem anderen Ausgang dieses paraphasen Verstärkers verbunden, und andere paarweise gegenüberplatzierte Elektroden sind mit den Ausgängen des Elektrodenkommutators verbunden.

Diese Einrichtung lässt das Verfahren der elektrooptischen Analyse der Zellsuspension (RU, 2070919) realisieren, welches darin besteht, dass man um die zu untersuchende Suspension ein elektrisches Wechselfeld aufbaut, welches durch folgende Werte gekennzeichnet ist: die Konstanten Feldstärke E und Feldfrequenz f und variabler Frequenz F der Änderung der Vektorrichtung der elektrischen Feldstärke; die Änderung erfolgt diskret um 90 ° von F_min bis F_max nach der Gleichung Fi±1 = Fi±1/2M, mit i(0, ... i–1), (j–1...0), j = 1/M*log2(Fmax/Fmin)
Gleichzeitig mit der elektrischen Einwirkung werden durch die zu untersuchende Suspension abwechselnd zueinander orthogonale Lichtstrahlen durchgelassen. Die Intensität der durch die Suspension gegangenen Lichtströme wird gemessen und deren Differenz wird als Größe des elektrooptischen Signals bestimmt, welches zur Bestimmung der Abhängigkeit der Anisotropie der Polarisierbarkeit der Zellen von der Frequenz f des elektrischen Feldes herangezogen wird. Dabei wird die Frequenz F der Veränderung der Richtungsänderung des elektrischen Feldstärkevektors konstant gehalten.
Die oben beschriebenen Verfahren und Einrichtungen (RU, 2070919) geben die Möglichkeit, die Anisotropie der Polarisierbarkeit für jede in der Zellgröße homogene Zellfraktion, welche die gesamte heterogene Zellpopulation bilden, korrekt zu bestimmen, und auf diese Weise den Grad der Populationsheterogenität anhand der Parameter „Anisotropie der Polarisierbarkeit" einzuschätzen.
Jedoch erlaubt diese Einrichtung und das damit realisierende Verfahren der elektrooptischen Analyse der Zellsuspension nicht die Viskosität des Inhaltes der zu untersuchenden Zellen zu bestimmen sowie eine selektive Analyse der Zellen, die heterogen nach ihren elektrophysikalischen Eigenschaften sind, durchzuführen, weil diese Einrichtung nur eine begrenzte Möglichkeiten bei der Veränderung der Parameter der elektrischen Einwirkung und, dementsprechend, deren Programmierung zulässt.
Beschreibung der Erfindung
Die Hauptaufgabe der Erfindung besteht in Gewährleistung der Möglichkeit einen breiteren Bereich der Parameter der elektrooptischen Einwirkung einzustellen und somit die ausführlicheren Informationen über den Zustand der zu untersuchenden Zellen mittels der Erweiterung der funktionellen Möglichkeiten dieser Einrichtung zu erhalten.
Weitere wichtige Aufgabe besteht in der Entwicklung eines Analyseverfahrens bei Zellsuspension, die die Möglichkeit gibt. Daten über die selektive Bestimmung der Konzentrationen von elektrophysikalisch homogenen Fraktionen zu erhalten. Eine andere Aufgabe besteht in der Bestimmung der Viskosität des intrazellularen Inhaltes.
Erfindungsgemäß werden die Aufgaben gelöst, indem eine Einrichtung für elektrooptische Analyse der Zellen in einer Suspension erfunden ist, die folgende Teile enthält:

– elektrooptische Messzelle, ausgestattet mit durchsichtigen gegenüberliegenden Fenstern und neun Nadelelektroden, die in drei Reihen – je drei Elektroden in jeder Reihe – zwischen den genannten Fenstern plaziert sind; die mittlere Elektrode der mittleren Reihe ist dabei zentral;
– Lichtquellen, die optisch mit einem Photosensor verbunden sind, dabei ist der Photosensor mit der Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von Lichtströmen verbunden;
– in Reihe geschalteten a) elektrischer Spannungsgenerator, b) Attenuator der elektrischen Spannung mit der Funktion die Spannungsabschwächung zu steuern, c) Paraphasenverstärker und Elektrodenkommutator, dessen zwei Ausgänge an die erwähnten Elektroden angeschlossen sind,

– zusätzlichen in Reihe geschalteten a) elektrischen Spannungsgenerator, b) Attenuator der elektrischen Spannung mit Funktion der Steuerung der Spannungsabschwächung, c) paraphasen Verstärker, dessen zwei Ausgänge an die Eingängen den erwähnten Elektrodenkommutator angeschlossen sind, d) die erwähnte elektrooptische Messzelle besitzt wenigstens vier zusätzlichen Nadelelektroden, die in zwei Reihen zwischen den erwähnten Elektrodenreihen angebracht sind und fünf Elektrodenreihen bilden, e) der erwähnte Elektrodenkommutator ist mit sechs zusätzlichen Ausgängen ausgestattet, dabei sind die äußeren Elektroden der ersten und fünften Reihen mit einem Ausgang des erwähnten Kommutator verbunden;
– die mittleren paarweise gegenüberliegenden Elektroden der ersten und fünften Reihen sind mit separaten Ausgängen (der für jede Elektrodenpaar vorgesehenen ist) des erwähnten Kommutator verbunden, und die zentrale Elektrode ist mit dem für ihm vorgesehenem separaten Ausgang des erwähnten Kommutators verbunden. Dadurch wird ein zusätzliches Elektrodensystem gebildet, das elektrisch mit einem der erwähnten Paraphasenverstärker verbunden ist, die anderen Elektroden sind einzeln an den separaten Ausgängen der erwähnten Elektrodenkommutator verbunden, was ein anderes Elektrodensystem bilden, das elektrisch mit dem anderen erwähnten Paraphasenverstärker verbunden ist.

Die Einrichtung kann mit zwei strobierbaren Frequenzzähler ausgestattet werden, dabei ist die Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von den Lichtstrahlen in der Form des Spannungs-Frequenz-Umwandlers ausgeführt, dessen Ausgang mit Eingängen von zwei strobierbaren Frequenzzähler verbunden ist.
Die Betriebsart der Lichtquellen kann impulsartig sein.
Die Einrichtung kann mit dem Computer mit einer gemeinsamen Schiene ausgestattet werden. Dadurch wird der erwähnte Computer mit den Steuereingängen der Generatoren, Attenuatoren, Elektrodenkommutator, impulsartigen Lichtquellen und Ausgänge der strobierbaren Frequenzzähler verbunden.
Erfindungsgemäß werden die oben beschriebenen Aufgaben auch damit gelöst, indem ein Verfahren der elektrooptischen Analyse der Zellen in Suspension erfunden wurde, welches in der beschriebenen Einrichtung realisiert wird, und folgendes einschließt:

Einwirkung auf die Zellsuspension mit einem Wechselfeld mit festgelegten Parametern der Feldstärke E, der Frequenz des Feldes f und Frequenz des Richtungswechsels des Feldstärkevektors F,
– das abwechselnde Durchlassen von orthogonalen Lichtstrahlen durch die Zellsuspension,
– Messung der Intensität der durch die Suspension durchgelassenen Lichtstrahlen, Bestimmung der Intensitätsdifferenz als Größe des elektrooptischen Signals in Abhängigkeit von der Veränderung wenigstens eines Parameters des beschriebenen elektrischen Feldes und nachfolgende Bestimmung der Parameter der zu untersuchenden Zellen auf der Basis dieser Abhängigkeit. Entsprechend der Erfindung wird in dieser Einrichtung für die Erzeugung der genannten Einwirkung ein elektrisches Wechselfeld angewendet, welches als eine Superposition von wenigstens zwei variablen elektrischen Feldern, orientierenden und steuernden, ist.

Zur Bestimmung der Viskosität des Zellinhaltes wird erfindungsgemäß in der Messzelle

– ein orientierendes elektrisches Feld erzeugt, die die räumliche Orientierung der zu untersuchenden Zellen induziert, für welches die Frequenz der Richtungsänderung des Feldstärkevektors F₁ auf Null eingestellt wird,
– die Richtung des erwähnten Feldstärkevektors parallel oder orthogonal zum jeweiligen erwähnten Lichtstrahl eingestellt,
– die Feldstärke E₁ und die Frequenz f₁ in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen eingestellt; und gleichzeitig wird
– ein steuerndes Feld, das die Veränderung der Zellgröße der zu untersuchenden Zellen steuert, erzeugt, für welches die Frequenz f₂ gleich der Frequenz f₁ eingestellt wird und diskret um 90° der Richtungsänderung des Feldstärkevektors ist;
– die Frequenz F₂ wird in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen eingestellt wird; und
– die Feldstärke E₂ wird so unter dem Wert E₁ eingestellt, dass bei der genannten Einwirkung des elektrischen Feldes die zu untersuchende Zellen ihre Dimensionen/Formen verändern, jedoch die räumliche Zellorientierung unverändert bleibt,

Zur Bestimmung der elektrophysikalischen Selektivität von dimensionseinheitlichen Zellen wird erfindungsgemäß in der Messzelle

– ein orientierendes elektrisches Feld erzeugt, für welche die Frequenz der Richtungsänderung des Feldstärkevektors F₁ auf Null eingestellt wird,
– die Richtung des erwähnten Feldstärkevektors parallel oder orthogonal zum jeweiligen erwähnten Lichtstrahl eingestellt,
– die Feldstärke E₁ und die Frequenz f₁ werden in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen eingestellt, und gleichzeitig
– ein steuerndes elektrisches Feld erzeugt, für welches die Feldstärke E₂₂ gleich der Feldstärke E₁ eingestellt wird,
– die Frequenz F₂ der Richtungsänderung des Feldstärkevektors auf Null eingestellt, dabei wird die Richtung des genannten Feldstärkevektors parallel der Richtung des Feldstärkevektors des orientierenden elektrischen Feldes eingestellt, und
– die Frequenz f₂ wird höher als f₁ auf den Wert δf eingestellt, welcher abhängig von den Dimensionen und dem Polarisierbarkeitsgrad der zu untersuchenden Zellen festgelegt wird,

Für die oben dargestellten erfindungsgemäßigten Einwirkungen werden elektrische Felder in der Form eines Impulses, beispielsweise eines Radioimpulses angewendet.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Nachfolgend, unter Bezugnahme auf die beiliegende Figuren, wird die Erfindung näher erläutert.
1 stellt das Strukturdiagramm der Einrichtung dar.
2 zeigt die elektrooptischen Messzelle im Schnitt, der durch das durchsichtige Fenster verläuft und zu den Elektroden orthogonal ist;
3 zeigt das Schema des Elektrodenkommutators;
4 zeigt zeitliche Verläufe der elektrooptischen Signaländerung, die bei der Untersuchung einer Suspension der E. coli-Zellen aufgezeichnet wurden. Dabei wurde eine Superposition von zwei elektrischen Wechselfeldern eingesetzt: eines mit den Werten E₁ = 4000 V/m, f₁ = 3,2 MHz; ein anderes mit den Werten E₂ = 4000 V/m und der Frequenz f₂ = f₁ + δf, dabei wird δf Stufenweise von 0,6 bis 2,2 Hz, in Schritten von 0,2 Hz, erhöht. Die Phasendifferenz im Anfangszeitmoment ist Null.
a) zeitliche Veränderung δf ; b) Kurve, die bei der Probe 1 gemessen wurde (intakte Zellen); c) Kurve, die bei der Probe 2 gemessen wurde (inaktivierte Zellen); d) Kurve, die bei der Probe 4 gemessen wurde (Mischung von intakten und inaktivierten Zellen im Verhältnis 1:1); e) Kurve, die bei der Probe 5 gemessen wurde (Mischung von intakten und inaktivierten Zellen im Verhältnis 1:3); S-Amplitude des elektrooptischen Signals.
5 zeigt zeitliche Verläufe der elektrooptischen Signaländerung, die bei der Untersuchung der Viskosität des intrazellularen Inhaltes von Kaninchenerythrocyten gewonnen wurden. Dabei wurde für die Erythrocytensuspension eine Superposition von zwei elektrischen Wechselfeldern eingesetzt: eines mit den Werten E₁ = 50000 V/m, f₁ = 400 kHz, F₁ = 0; ein anderes mit den Werten E₂ = 2000 V/m, mit der Frequenz f₂ = 400 kHz, F₂ = 0,5 Hz. Die Phasendifferenz im Anfangszeitmoment ist Null.
a) Kurve, die bei der Probe 1 gemessen wurde (frisch vorbereitete Erythrozyten), b) Kurve, die bei der Probe 2 gemessen wurde (Erythrocyten nach 5 Tagen Lagerung), S-Amplitude des elektrooptischen Signals.
Einer der Gegenstände der Erfindung ist eine Einrichtung für die elektrooptische Analyse, die es ermöglicht die elektrische Einwirkung nicht nur nach der Feldstärke, der Frequenz des elektrischen Wechselfeldes und der Frequenz des diskret um 90° des Richtungswechsel des Feldstärkevektors, sondern auch nach der Anzahl der gleichzeitig angelegten Felder und den Phasenverhältnis dieser Felder zu programmieren. Die Einrichtung gewährleistet auch die Möglichkeit die Phase eines Feldes in Beziehung auf das andere zu verändern und den summarischen Feldstärkevektor zu drehen.
Diese Einrichtungsausführung erlaubt es experimentell solche Parameter der elektrischen Einwirkung zu finden, die die Möglichkeit bieten, mit Hilfe der elektrooptischen Analyse nicht nur die Anisotropie der Zellpolarisierbarkeit zu bestimmen, sondern auch andere Zellparameter, die früher mit Hilfe der elektrooptischen Analyse nicht bestimmt werden konnten.
Die Grundlage des Verfahrens der elektrooptischen Analyse der Zellen in der Suspension ist die Wirkung des elektrischen Feldes auf die zu untersuchenden Zellen mit diskreten oder kontinuierlichen Richtungswechseln des elektrischen Feldstärkevektors. Dabei wird der diskrete Richtungswechsel des Feldvektors durch Kommutierung einiger Elektroden erreicht (äußere Elektroden der ersten und fünften Reihe, mittlere paarweise gegenüberliegende Elektroden der ersten und fünften Reihe und die zentrale Elektrode), die ein Mehrelektrodensystem bilden; die kontinuierliche Richtungsänderung des Feldvektors (Drehung) wird mit Hilfe aller vorhandenen Elektroden erreicht, die zwei Mehrelektrodensysteme bilden und durch den Elektrodenkommutator an zwei Generatoren des elektrisches Feldes angeschlossen sind. Dabei erzeugen die Generatoren elektrische Felder mit unterschiedlichen Parametern.
Wenn die Frequenz f beider Felder gleich eingestellt wird, hat die Einwirkung des zweiten Elektrodensystems einen degenerativen Charakter und es ist nur eine diskrete Veränderung der Richtung des elektrischen Feldvektors möglich.
Zur Bestimmung der Viskosität des intrazellularen Inhaltes und der elektrophysikalischen Eigenschaften der Zellstrukturen wird eine Arbeitsweise verwendet, bei der die Frequenzen f₁ und f₂ gleich sind und im Anfangszeitmoment die Phasendifferenz beider elektrischen Spannungsfelder Null ist. Die Richtung des Vektors des von einem Elektrodensystem gebildeten elektrischen Feldes bleibt konstant, die Richtung des Vektors des von dem anderen Elektrodensystem gebildeten elektrischen Feld wird diskret um 90° mit der Frequenz F verändert. Der Frequenzwert F ist von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen abhängt.
Dabei ruft die Wirkung des von einem Elektrodensystem gebildeten Feldes die Zellorientierung hervor (orientierendes Feld) und die Wirkung des anderen Elektrodensystems regt ein elektrisches Feld (steuerndes Feld) an, welches die Zellen abwechselnd in die eine oder in die andere Richtung (der vorherigen Richtung orthogonal) deformiert.
Das Ausmaß der Zelldeformation wird aus dem Verhältnis der optischen Signale "Antwort", die für zwei orthogonale Lagen des Vektors des steuernden (deformierenden) Feldes gemessen wird, ermittelt. Die Viskosität des intrazellularen Inhaltes der Zellen, die gleiches Volumen haben, hat dabei eine lineare Abhängigkeit vom Deformationsgrad.
Für die Erhöhung der Messgenauigkeit kann die Richtung des Vektors des orientierenden elektrischen Feldes nach der Durchführung eines Messzyklus diskret um 90° verändert und der Messzyklus wiederholt werden. Die Differenz der Messergebnisse gibt eine Möglichkeit die Messfehler, die mit dem möglichen asymmetrischen Aufbau des Meßsystems oder der Zellsedimentation verbunden sind, auszuschließen.
Zur selektiven Bestimmung der Konzentrationen der elektrophysikalisch homogenen Fraktionen (d.h. der elektrophysikalischen Selektivität der nach ihren Dimensionen ähnlichen Zellen) lässt man auf die zu untersuchende Suspension ein elektrischen Feld einwirken, welches durch eine Superposition von zwei Feldern, die konstante und gleiche Feldstärke E haben, erzeugt wird. In diesem elektrischen Feld wird, da die Frequenz eines Feldes f₂ um δf höher als die Frequenz f₁ eines anderen Feldes ist, keine diskrete Veränderung der Richtung des Vektors der Feldstärke hervorgerufen, sondern eine kontinuierliche Drehung des Feldvektors (die Drehungsfrequenz dessen F' wird der auf 2π(F' = δf·t/2π) normierten Differenz der Frequenzen f₂-f gleich). Synchron mit dem Feld werden sich dabei nur solche Zellen drehen, für die die induzierte Orientierungskraft höher ist als die Reibungskraft.
Bei der Untersuchung der Zusammensetzung der nach ihren elektrophysikalischen Eigenschaften heterogenen Zellsuspension, z.B. einer Mischung vitaler und letaler Zellen, wird durch eine Superposition von zwei Feldern, die annähernd gleiche Frequenzen, f₁ und f₂ = f₁ + δf haben, eine gleichmäßige Änderung der Feldvektorrichtung erreicht. Die Einstellung eines konstanten und kleinen Unterschiedes zwischen den Feldern ruft eine Änderung der Richtung des Vektors des summarischen elektrischen Feldes hervor, die mit der bekannten trigonometrischen Kosinussummengleichung beschrieben wird.
Für Zellen, die eine Anisotropie der Polarisierbarkeit da haben, die höher ist als der Schwellenwert a_i, wird eine Synchrondrehung nach dem drehenden Feldvektor hervorgerufen. Zellen die kleinere (als o.g. Schwellenwert) Werte der Anisotropie der Polarisierbarkeit da haben werden der Synchrondrehung nicht folgen und sich in einer chaotischen Position befinden. Der Schwellenwert a_i wird aus dem Gleichgewicht der Kräfte der orientierenden Wirkung des elektrischen Feldes definiert, welches zur Anisotropie der Polarisierbarkeit dα, zum Quadrat der Feldstärke, den Dimensionen des Partikels und zur Reibungskraft proportional ist. Die Reibungskraft ist der kinematischen Viskosität des Mediums, der Drehungsgeschwindigkeit und dem geometrischen Schnitt der Zellen proportional.
Bei der Erhöhung des Inkrements der Frequenz δf und dementsprechend der Erhöhung der Drehfrequenz des Feldvektors wird für die Zellfraktion mit dem höheren Wert da eine Störung der Synchronisation hervorgerufen. Eine diskrete Erhöhung der Frequenzinkrements δf auf eine bestimmte Stufe, die durch den absoluten Wert da, die Feldstärke E und Zelldimensionen festgelegt ist, führt zum Abbruch der Drehungssynchronie und zur Beendigung der Messung der elektrophysikalischen Heterogenität einer konkreten Zellfraktion.
Das Prinzip der Bestimmung der elektrophysikalischen Heterogenität der Suspension besteht in der gleichmäßigen Änderung der δf, wobei der Schritt der Frequenzzunahme von der erforderlichen Genauigkeit der Heterogenitätsanalyse abhängt und der ganze Frequenzzunahmebereich δf vom Bereich der Veränderung der Anisotropie der Polarisierbarkeit dα der suspendierten Zellen.
Bevorzugte Ausführungsbeispiele
Die Einrichtung für die elektrooptische Analyse der Zellen in einer Suspension (1) enthält eine elektrooptische Messzelle 1 für die zu untersuchende Suspension, die mit dem Behälter für die Probenvorbereitung und zur Abfallsammlung (im Schema nicht dargestellt) verbunden ist, impulsartige Lichtquellen 2, 3 und Spiegel 4, 5, 6, 7, die zur Führung der Lichtstrahlen von den Lichtquellen 2 und 3 zum Photosensor 8 (d.h. für die Herstellung der optischen Verbindung der Quelle 2 und 3 mit dem Photosensor 8) dienen. Der Photosensor ist an ein elektrisches Netz mit dem Spannungs-Frequenz-Umwandler 9 angeschlossen, dessen Eingang mit den Ausgängen der strobierbaren Frequenzzähler 10 und 11 verbunden ist. Die Einrichtung enthält auch zwei Einheiten A und B, wobei eine von ihnen (A) den in Reihe geschalteten Generator der harmonischen Spannung 12, den Attenuator 13 mit der Steuerung der Spannungsabschwächung und den Paraphasenverstärker 14 enthält. Die andere Einheit (B) enthält einen in Reihe geschalteten Generator der harmonischen Spannung 15, einen Attenuator 16 mit der Steuerung der Spannungsabschwächung und den Paraphasenverstärker 17, sowie einen Elektrodenkommutator, dessen Eingänge mit den Ausgängen der Paraphasenverstärker 14 und 17 verbunden sind.
Die elektrooptische Messzelle 1 (2) enthält vier paarweise gegenüberliegende lichtdurchlässige Fenster 19 und dreizehn Nadelelektroden 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, die in fünf Reihen zwischen den genannten Fenstern plaziert sind. Die mittlere Elektrode 26 der mittleren Reihe ist dabei zentral angeordnet. Der Elektrodenkommutator 18 (3) besitzt acht Ausgänge 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, die mit Elektroden 20–32 der elektrooptischen Messzelle 1 verbunden sind. Die äußere Elektroden 20, 22, 30, 32 der ersten und fünften Reihen sind mit dem Ausgang 33 des Elektrodenkommutators 18 verbunden (2). Ein Paar der gegenüberliegenden Elektroden 21 und 31 der ersten und fünften Reihe ist mit dem Ausgang 38 des Kommutators 18 verbunden. Das andere Paar der gegenüberliegenden Elektroden 25 und 27 der ersten und fünften Reihe ist mit dem Ausgang 34 des Kommutators 18 verbunden. Die Elektrode 23 ist mit dem Ausgang 35 verbunden, die Elektrode 24 ist mit dem Ausgang 40 verbunden, die Elektrode 26 ist mit dem Ausgang 37 verbunden, die Elektrode 28 ist mit dem Ausgang 36 verbunden, die Elektrode 29 ist mit dem Ausgang 39 des Elektrodenkommutators 18 verbunden. Dabei gehören die Elektroden 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 30, 31, 32 zum System C, das elektrisch mit einem der Paraphasenverstärker 14 verbunden ist. Die Elektroden 23, 24, 28, 29 gehören zum System D, das elektrisch mit dem anderen Paraphasenverstärker 17 verbunden ist (3).
Die Einrichtung (1) ist mit dem Computer 41 mit einer gesamten Schiene 42 ausgestattet, die mit den steuernden Eingängen der Generatoren 12, 15, Attenuatoren 13, 16, den Elektrodenkommutator 18, den impulsförmigen Lichtquellen 2 und 3 und den Ausgängen der strobierbaren Frequenzzähler 10 und 11 verbunden ist.
Die Einrichtung funktioniert folgendermaßen: die elektrooptische Messzelle 1 wird mit der zu untersuchenden Zellsuspension gefüllt. Auf die steuernden Eingänge der impulsartigen Lichtquellen 2 und 3 werden über die Gesamtschiene 42 des Computers 41 Codereihenfolgen gegeben, die die Intensität des Lichtstrahles jeder der impulsartigen Lichtquellen 2 und 3 vorgeben. Durch die steuernden Signale des Computers 41, die der Frequenz der Umschaltung der Lichtstrahlen folgen, bilden die impulsartige Lichtquellen 2 und 3 abwechselnd Lichtstrahlen, die in orthogonale Richtungen die elektrooptische Messzelle 1 durchdringen. In der Messzelle 1 werden gleichzeitig zwei elektrische Wechselfelder in Form des Radioimpulses mit wechselnden Parametern gebildet.
Nach den steuernden Signalen des Computers 41 erzeugen die Generatoren 12 und 15 eine harmonische Wechselspannung mit der Sollfrequenz im Bereich von 10 Hz (Anfangsfrequenzen der Volumenpolarisierbarkeit der Partikel) bis 40 MHz (Grenzfrequenzen der merklichen Erscheinungen der Volumenpolarisierbarkeit der Partikel) in Form von Radioimpulsen mit der festgelegten Füllungsfrequenz. Die harmonische Spannungen erreichen entsprechend die Eingänge der Attenuatoren 13, 16, in denen durch Steuerung des Computers 41 der Abschwächungsfaktor und damit die Feldstärke in der Zelle 1 verändern werden kann. Die Spannungen werden weiterhin an die Paraphasenverstärker 14 und 17 angelegt. Dabei ist ein Ausgang P des Verstärkers 14 durch den Kommutator mit der Elektrodengruppe 20, 22, 30, 32 verbunden und der andere (paraphase) Ausgang Q des Verstärkers 14 durch den Kommutator mit der Elektrode 26 verbunden. Abhängig von der Richtung des Vektors der Feldstärke des elektrischen Feldes, der durch die Steuerbefehle des Computers 41 vorgegeben wird, die an die steuernden Eingänge des Elektrodenkommutators 18 angelegt werden, wird ein Ausgang P des Verstärkers 14 durch den Kommutator zusätzlich an die Elektroden 25, 27 angeschlossen und der andere Ausgang Q wird zusätzlich an die Elektroden 21, 31 angeschlossen oder bei einer Richtungsänderung des Feldstärkevektors wird der Ausgang P des Verstärkers 14 durch den Kommutator zusätzlich mit den Elektroden 21, 31 verbunden, der andere Ausgang Q wird zusätzlich mit den Elektroden 25, 27 verbunden.
Ein Ausgang P des Verstärkers 17 ist durch den Kommutator 18 mit der Elektrode 23, der andere (paraphase) Ausgang Q des Verstärkers 17 ist durch den Kommutator 18 mit der Elektrode 29 verbunden. Abhängig von der Richtung des Vektors der Feldstärke des elektrischen Feldes, der von den Steuerbefehlen des Computers 41 vorgegeben wird, die an die Eingänge des Elektrodenkommutators 18 angelegt werden. Der erste Ausgang P des Verstärkers 17 wird durch den Kommutator zusätzlich an die Elektrode 24 angeschlossen, der andere Ausgang Q wird zusätzlich an die Elektrode 28 oder bei einer Richtungsänderung des Feldstärkevektors der erste Ausgang P des Verstärkers 17 durch den Kommutator 18 zusätzlich an die Elektrode 28, der zweite Ausgang Q wird zusätzlich an die Elektrode 24 angeschlossen.
Der gezeigte Betriebsalgorithmus des Elektrodenkommutators 18 erlaubt es eine Superposition von zwei elektrischen Wechselfeldern in der elektrooptischen Zelle 1 zu generieren.
Das elektrische Feld in der Zelle 1 ruft eine Partikelorientierung hervor, die zur Zunahme der optischen Dichte der Suspension in einer Richtung und zur Abnahme der optischen Dichte in orthogonaler Richtung führt, die eine Veränderung der Intensität, der abwechselnd von den Lichtquellen 2 und 3 generierten orthogonalen Lichtstrahlen entsprechen, die als elektrooptisches Signal (Antwort) definiert wird. Die Veränderung der Richtung des Vektors der Feldstärke des elektrischen Feldes führt zur Veränderung der Zellorientierung und zum gegensätzlichen Wechsel der Art der Veränderung der optischen Dichte in diesen Richtungen. Mittels des Spiegelsystems 4, 5, 6, 7 werden die Lichtstrahlen zum Photosensor 8 geleitet. Die Ausgangsspannung des Photosensors 8 wird an den Spannungsfrequenzumformer 9 angelegt. Die Impulse des Umformerausgangs 9 werden mittels der strobierbaren Frequenzzählern 10 und 11 erfasst. Die Anzahl der Impulse entspricht der Intensität der orthogonalen Lichtstrahlen, die durch die Zelle 1 durchgelassen wurden. Die Messwerte der Zähler 10 und 11 werden mittels des Computers 41 erfasst und nach der Bestimmung deren Differenz werden sie für die Erstellung der Kurven der Abhängigkeit des elektrooptischen Signals von der Zeit bei veränderlichen Parametern des elektrischen Feldes herangezogen.
Als resultierendes vom Computer 41 registriertes Signal gilt die zeitliche Veränderung der optischen Eigenschaften der Zellsuspension, die als Differenz der Intensität der orthogonalen Lichtstrahlen definiert wird, die während der Wirkung des Radioimpulses des elektrischen Feldes mit den eingestellten Parametern auf die Suspension entstanden sind.
Die Programmierung der variablen Parameter des elektrischen Feldes während jedes Radioimpulses gewährleistet die Möglichkeit, die Viskosität des Inhaltes der zu untersuchenden Zellen und die elektrophysikalische Selektivität der gleich dimensionierten Zellen in der Suspension zu bestimmen. Darüber hinaus gibt die Veränderung der Parameter des elektrischen Feldes während eines Radioimpulses die Möglichkeit, durch das Ausschließen der Wirkung der Nulllinienschwankung die Genauigkeit der Messung des elektrooptischen Signals zu erhöhen.
Die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von orthogonalen Lichtstrahlen, die durch dasselbe Elementarvolumen der Zellsuspension durchgedrungen sind, erlaubt den Einfluss der Partikelsedimentation und das Rauschen durch die Dichtefluktuationen in der Suspension auszuschließen.
Die Vorteile der beschriebenen Einrichtung und des Verfahrens werden mit folgenden Untersuchungsbeispielen von Zellsuspensionen veranschaulicht.
Beispiel 1
Bestimmung der Konzentration der elektrophysikalisch-homogenen Fraktionen der Suspension von E.coli Zellen
Zur Untersuchung wurden Zellen des Bakteriums E.coli verwendet. Das Wachstumsmedium mit den Zellen von E.coli, das nach der 4-ständigen Kultivierung im Schüttler bei 37°C auf dem Mineralmedium M9 (s. Methoden der Allgemeinen Bakteriologie// unter der Redaktion von Gerhard B. 1 M.MIR 1984) mit der Zugabe von 0,8% Glukose entnommen wurde, wurde durch die Zellulosemembran "Vladipor N 5" filtriert. Das Pellet auf dem Filter wurde mit destilliertem Wasser gewaschen und in TRIS-Puffer mit der spezifischen Leitfähigkeit von 10^–2 Om^–1×m^–1 resuspendiert. Die gewonnene Suspension mit der optischen Dichte von 0,22 wurde in drei Teile geteilt und somit drei Proben gewonnen. Die Probe 1 wurde unbehandelt verwendet. Die Probe 2 wurde in einem Wasserbad bei 60°C 10 Minuten behandelt. Zum Erhalt der Modellgemische wurden Probe 3 und Probe 2 im Verhältnis 1:1 und 1:3 gemischt und somit die Probe 4 und 5 erhalten. Dementsprechend lag der relative Gehalt von lebensfähigen Zellen in diesen Proben bei 50% und 25%.
Es wurden Vor- und Hauptmessungen durchgeführt. Die Vormessungen wurden mit den Proben 1 und 2 zur Bestimmung der Ausgangsdaten E, f₁ und δf durchgeführt. Dazu wurde jede Probe in die elektrooptische Zelle gefüllt, durch welche abwechselnd orthogonale Lichtstrahlen von den Lichtquellen 2 und 3 durchgelassen wurden. Gleichzeitig wurde von dem Computer 41 durch die Leitschiene ein Signal auf die steuernden Eingänge gegeben, z.B. des Generators 12. Vom Ausgang des Generators wurde eine Frequenzreihe f des elektrischen Feldes mit den Frequenzen 200 kHz, 400 kHz, 800 kHz, 1,600 MHz, 3,200 MHz und 4,800 MHz erhalten. Bei der Untersuchung von E.coli Zellen decken diese Frequenzen den Bereich der deutlichen Veränderungen des elektrooptischen Signals ab. Mit Hilfe des Attenuators 13 wurde die Feldstärke E in der elektrooptischen Zelle 1 auf 4000 V/m eingestellt, was der Grenze der linearen Abhängigkeit des elektrooptischen Signals von dem Quadrat der Stärke des elektrischen Feldes entspricht. Die Frequenz F, diskreter um 90° der Veränderung der Richtung des Feldstärkevektors, wurde auf Null eingestellt, und selbst der Feldstärkevektor wurde parallel, zum Beispiel zu dem Lichtstrahl von der Lichtquelle 2, eingestellt.
In Versuchen mit den Proben 1 und 2 wurde das elektrooptische Signal bei den o.g. Feldparametern gemessen. Dabei wirkte das elektrische Feld 4 Sekunden lang. Graphische Resultate dieser Messung sind in 4a und 4b entsprechend für die Probe 1 und 2 dargestellt.
Ausgehend von dem erhaltenen maximalen Unterschied der elektrooptischen Signale für die untersuchten Proben 1 und 2 wurde eine Frequenz des elektrischen Feldes f₁ von 3,200 MHz gewählt, und der Bereich der Frequenzvariation f₂ wurde zwischen 3,200 MHz und 3,200004 MHz begrenzt.
Abwechselnd wurden die Proben 4 und 5 in die elektrooptischen Zelle gefüllt und untersucht. Bei der kontinuierlichen Wirkung des orientierenden elektrischen Feldes, das mit der Frequenz f₁ = 3,2 MHz und Feldstärke E₁ = 4000 V/m auf die Elektroden des Systems C (20, 21, 22, 25, 26, 27, 30, 31, 32) angelegt wurde, wurde alle 4 Sekunden die Frequenz f₂ des auf die Elektroden des Systems D (23, 24, 28, 29) angelegten steuernden elektrischen Feldes diskret mit einem Schritt von δf = 0,2 Hz in dem Bereich von 3,200 MHz bis 3,200004 MHz (4a) verändert. Dabei wurde die Stärke des von dem Generator 15 erzeugten Feldes – auf E₂ = 4000 V/m eingestellt. Für beide Felder wurde die Frequenz F, diskreter um 90° der Veränderungen der Richtung des Feldstärkevektors, auf Null eingestellt und die Feldstärkevektoren wurden parallel, z. B. zu dem Lichtstrahl von der Lichtquelle 2 eingestellt; die Phasendifferenz im Anfangszeitmoment wurde auf Null eingestellt. Die Messergebnisse des elektrooptischen Signals für die Proben 4 und 5 sind entsprechend in den 4d und 4e dargestellt.
Die Analyse der Messergebnisse zeigt, dass auf den in den 4d und 4e dargestellten Kurven zwei charakteristische stufenförmige Bereiche M und N zu erkennen sind, die den zwei nach den elektrophysikalischen Eigenschaften unterschiedlichen Zellfraktionen zuzuordnen sind. Die erste Stufe M der Abnahme des elektrooptischen Signals charakterisiert eine Fraktion von inaktivierten (lebensunfähigen) Zellen. Die zweite Stufe N der Abnahme des Signals bis Null charakterisiert die Fraktion der intakten (lebensfähigen) Zellen. Die Normierung des Absolutwertes jeder Stufe zum Summensignal, welches dem Anfang der elektrooptischen Untersuchung entspricht, charakterisiert den prozentuellen Anteil der Fraktionen, der für die Probe 4 und 5 entsprechend 50% und 25% beträgt. Berechnungen der durchschnittlichen Werte des Summensignals und die Bestimmung des Verhältnisses der Signale haben gezeigt, das der relative Messfehler nicht höher als 3% ist.
Der Undeutlichkeit des Überganges von einer Fraktion zu der anderen liegt die Zellgrößeheterogenität jeder Fraktion zugrunde.
Beispiel 2
Bestimmung der relativen Viskositätsveränderung des intrazellulären Inhaltes von Kaninchenerythrozyten in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer.
Für die Untersuchung wurde die Probe des Kaninchenvollblutes geteilt. Der erste Probenteil wurde unmittelbar nach der Blutgewinnung gemessen, der zweite Teil wurde 5 Tage mit der Zugabe des "Igle"-Mediums bei einer Temperatur von +2°C aufbewahrt. In jede Probe wurde Heparin gegeben und mit der isotonischen Saccharoselösung (11 Gew.%) verdünnt.
Die zu untersuchende Probe wurde in die elektrooptische Zelle 1 gefüllt, durch die abwechselnd Lichtstrahlen von den Lichtquellen 2 und 3 durchgelassen wurden. Die elektrooptischen Messungen wurden bei dem Anlegen von zwei elektrischen Wechselfeldern durchgeführt, die in der Zelle 1 von den Generatoren der harmonischen Spannung 12 und 15 erzeugt wurden. Für das orientierende elektrische Feld wurde die Feldstärke auf E₁ = 5000 V/m eingestellt, was der Grenze der linearen Abhängigkeit des elektrooptischen Signals von dem Quadrat der Stärke des elektrischen Feldes entspricht. Der Wert der Frequenz f₁ = 400 kHz wurde gewählt, da mit ihr ein ausreichendes elektrooptisches Signal erzeugt werden konnte. Die Frequenz F₁ der diskreten um 90° der Veränderungen der Richtung des Feldstärkevektors wurde auf Null eingestellt, und der Feldstärkevektor wurde parallel, z.B. zu dem Lichtstrahl von der Lichtquelle 2, eingestellt.
Für das steuernde Feld wurde die Frequenz auf f₂ = 400 kHz und die Feldstärke auf E₂ = 2000 V/m eingestellt. Dabei wurde im Anfangszeitmoment der Phasenunterschied der orientierenden und steuernden Felder auf Null eingestellt. Die Größe der Feldstärke E₂ wurde ausgehend von der quasilinearen Abhängigkeit der elektrooptischen Antwort von der Viskosität des intrazellularen Inhaltes der Erythrozyten gewählt. Die Quasilinearität wird dann beobachtet, wenn das Quotientenverhältnis der Quadrate der Feldstärken der orientierenden und steuernden Felder nicht größer als 10–20% ist. Ausgehend von der Optimierung der Größe der elektrooptischen Antwort, die von dem Volumen der zu untersuchenden Zellen abhängig ist, wurde die Frequenz F₂ der diskreten um 90° der Veränderungen der Richtung des Feldstärkevektors auf 0,5 Hz eingestellt. In Abhängigkeit von dem Zellvolumen ist die Frequenz F entweder unzureichend für das Erhalten der elektrooptischen Antwort oder es führt zu einer irreversiblen Zelldeformierung.
Die 5a und 5b zeigen die Ergebnisse der Messung der elektrooptischen Antwort (des Signals) entsprechend für zwei untersuchte Proben der Kaninchenerythrozyten 1 und 2. Es ist zu sehen, dass es in jeder Kurve sich wiederholende Bereiche des elektrooptischen Signals mit den verschiedenen Amplituden gibt. Der Vergleich des Verhältnisses dieser Amplituden von beiden Kurven ergibt die Möglichkeit eine Aussage über die Abnahme der Plastizität der Formdeformierung der Erythrozyten zu treffen, was der Viskositätszunahme des intrazellularen Inhaltes um ungefähr 28% entspricht.
Das bestätigt die Anwendungsmöglichkeit des beschriebenen Verfahrens zur Einschätzung der Viskositätsänderung des intrazellularen Inhaltes und ermöglicht demzufolge die Erstellung von Kalibrierungskurven zur Bestimmung der Viskosität des Zellinhaltes.
Die beschriebene Einrichtung erlaubt auch das bekannte Verfahren (RU, 2070919) der elektrooptischen Analyse der Zellen für die Bestimmung der Anisotropie der Polarisierbarkeit der Zellen zu realisieren.
Wirtschaftliche Anwendung
Die beschriebene Einrichtung zur elektrooptischen Analyse der Zellen in Suspension und das Verfahren der elektrooptischen Analyse können zur Bestimmung verschiedener Kriterien des Zellzustandes, die die Qualität und die Effektivität des biotechnologischen Prozesses widerspiegeln, herangezogen werden; sie können in Mikrobiologie, Lebensmittelindustrie, Medizin und anderen Industriebereichen, die biotechnologische Prozesse nutzen, angewendet werden.
REFERAT
Eine Einrichtung für die elektrooptische Analyse der Zellen in Suspension enthält eine elektrooptische Messzelle (1), ausgestattet mit lichtdurchlässigen Fenstern (19) und dreizehn Elektroden (20–32), die in fünf Reihen zwischen den Fenstern (19) plaziert sind; die mittlere Elektrode (26) der mittleren Reihe ist zentral; impulsartige Lichtquellen (2, 3) welche optisch mit dem Photosensor (8) verbunden sind, der Photosensor ist an die Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von Lichtstrahlen angeschlossen; zwei Gruppen des in Reihe geschalteten Spannungsgenerators (12, 15), Attenuators (13, 16) und Paraphasenverstärkers (14 oder 17) und einen Elektrodenkommutator (18), dessen Eingänge an die Ausgänge der Paraphasenverstärker (14, 17) angeschlossen sind.
Das Verfahren der elektrooptischen Zellanalyse besteht in der elektrischen Einwirkung auf die zu untersuchende Zellsuspension von der Superposition von wenigstens zwei elektrischen Wechselfeldern mit dem gleichzeitigen Durchlassen der zueinander orthogonalen Lichtstrahlen durch die Suspension. Es wird die Intensität der durch die Suspension durchgelassenen Lichtstrahlen gemessen, die Intensitätsdifferenz wird als Größe des elektrooptischen Signals in Abhängigkeit von der Veränderung wenigstens eines Parameters der elektrischen Einwirkung definiert; auf Basis dieser Abhängigkeit werden definierte Zelleigenschaften bestimmt.

Claims

Einrichtung für elektrooptische Analyse der Zellen in Suspension, die enthält: – eine elektrooptische Zelle (1), ausgestattet mit durchsichtigen gegenüberliegenden Fenstern (19) und neun Nadelelektroden (20, 21, 22, 25, 26, 27, 30, 31, 32), die in drei Reihen – je drei Elektroden in jeder Reihe – zwischen den genannten Fenstern (19) plaziert sind; die mittlere Elektrode (26) der mittleren Reihe ist dabei zentral; – die optisch mit dem Photosensor (8) verbundenen und an die Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von Lichtstrahlen angeschlossenen Lichtquellen (2, 3); – sowie dem in Reihe geschalteten Spannungsgenerator (12), Attenuator der elektrischen Spannung (13) mit der Steuerung der Spannungsabschwächung, Paraphasenverstärker (14) und Elektrodenkommutator (18), dessen zwei Ausgänge an die erwähnten Elektroden angeschlossen sind; dadurch gekennzeichnet, dass – sie mit zusätzlichen, in Reihe geschalteten Spannungsgenerator (15), Attenuator der elektrischen Spannung (16) mit der Funktion der Steuerung der Spannungsabschwächung, Paraphasenverstärker (17), dessen Ausgänge mit den Eingängen des erwähnten Elektrodenkommutators (18) verbunden sind, ausgestattet ist; – die elektrooptische Zelle (1) ist mit wenigstens vier zusätzlichen Elektroden (23, 24, 28, 29) versorgt, die in Form der Nadel ausgeführt sind und in zwei Reihen zwischen den erwähnten Elektrodenreihen plaziert sind und zusammen fünf Elektrodenreihen bilden, – der Elektrodenkommutator (18) ist mit sechs zusätzlichen Ausgängen versorgt, dabei sind die äußeren Elektroden der ersten und fünften Reihe (20, 22, 30, 32) mit einem Ausgang (33) des erwähnten Kommutators verbunden, die mittleren paarweise gegenüberliegenden Elektroden der ersten und fünften Reihe (21, 31 und 25, 27) sind mit zwei anderen Ausgängen (38 und 34) des erwähnten Kommutators verbunden, und die zentrale Elektrode (26) ist mit dem für sie vorgesehenen separaten Ausgang (37) des erwähnten Kommutators verbunden. Damit wird ein Elektrodensystem gebildet, das elektrisch mit einen der erwähnten Paraphasenverstärker (14) verbunden ist. Andere Elektroden (23, 24, 28, 29) sind einzeln mit dem für jede Elektrode vorgesehenen separaten Ausgang (35, 40, 36, 39) des erwähnten Elektrodenkommutators (18) verbunden, was ein anderes Elektrodensystem bildet, das elektrisch mit dem anderen erwähnten Paraphasenverstärker (17) verbunden ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit zwei strobierbaren Frequenzzählern (10, 11) ausgestattet ist, die Einheit für die Bestimmung der Intensitätsdifferenz von Lichtstrahlen in der Form des Spannungs-Frequenz-Umwandlers ausgeführt ist, dessen Ausgang mit Eingängen von zwei strobierbaren Frequenzzählern (10, 11) verbunden ist.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Computer (41) ausgestattet ist, mit dessen gesamter Schiene (42) die Steuereingänge der Generatoren der elektrischen Spannung (12, 15), der Attenuatoren der elektrischen Spannung (13, 16), des Elektrodenkommutators (18), der Lichtquellen (2, 3) und die Ausgänge der strobierbaren Frequenzzähler (10, 11) gekoppelt sind.
Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquellen impulsartig arbeiten.
Verfahren der elektrooptischen Analyse der Zellen in Suspension, das die Einwirkung auf die genannte Suspension mit dem elektrischen Wechselfeld mit den vorgegebenen Werten der Feldstärke E und der Frequenz f und der Frequenz der Veränderung der Richtung des Feldstärkevektors F, das abwechselnde Durchlassen von orthogonalen Lichtstrahlen durch die Suspension, die Messung der Intensität der durch die Suspension durchgelassenen Lichtstrahlen, die Bestimmung der Intensitätsdifferenz als Größe des elektrooptischen Signals in Abhängigkeit von der Veränderung wenigstens eines Parameters des genannten elektrischen Feldes und weitere Bestimmung der Parameter der zu untersuchenden Zellen auf Basis dieser Abhängigkeit einschließt, dadurch gekennzeichnet, dass für die genannte Einwirkung ein elektrisches Wechselfeld gebildet wird, das die Superposition von wenigstens zwei elektrischen Wechselfeldern – orientierenden und steuernden – ist.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der Viskosität des Zellinhaltes – ein orientierendes elektrisches Wechselfeld erzeugt wird, für welches die Frequenz F₁ der Veränderungen der Richtung des Feldstärkevektors auf Null eingestellt wird, – die Richtung des erwähnten Feldstärkevektors parallel oder orthogonal zu den beliebigen erwähnten Lichtstrahlen eingestellt wird; dabei werden die Feldstärke E₁ und die Frequenzen f₁ in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen eingestellt; und ein steuerndes elektrisches Wechselfeld erzeugt wird, das die Veränderung der Zellgröße der zu untersuchenden Zellen steuert, für welches die Frequenz f₂ gleich der Frequenz f₁ eingestellt wird; – das steuernde elektrische Wechselfeld diskret um 90° der Veränderung der Richtung des Feldstärkevektors ist, – die Feldfrequenz F₂ in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen eingestellt wird, und die Feldstärke E₂ wird so unter dem Wert E₁ eingestellt, dass bei der genannten Einwirkung des elektrischen Feldes die zu untersuchenden Zellen ihre Dimensionen verändern, jedoch die räumliche Zellorientierung unverändert bleibt, dabei wird die Phasendifferenz von den genannten elektrischen Felder im Anfangszeitmoment auf Null eingestellt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass zur Bestimmung der elektrophysikalischen Selektivität der nach ihren Dimensionen ähnlichen Zellen – ein orientierendes elektrisches Wechselfeld erzeugt wird, für welches die Frequenz F₁ der Veränderung der Richtung des Feldstärkevektors auf Null eingestellt wird; – die Richtung des erwähnten Feldstärkevektors zu dem jeweiligen Lichtstrahl parallel oder orthogonal ist; dabei werden die Feldstärke E₁ und die Frequenzen f₁ in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu untersuchenden Zellen eingestellt; und – ein steuerndes elektrisches Wechselfeld erzeugt wird, für welches die Feldstärke E₁ gleich der Feldstärke E₂ ist, die Frequenz F₂ der Veränderung der Richtung des Feldstärkevektors Null gesetzt wird, – die Richtung des genannten Feldstärkevektors parallel der Richtung des Feldstärkevektors des orientierenden elektrischen Feldes eingestellt wird; – die Frequenz f₂ wird höher als f₁ auf den Wert δf eingestellt, δf wird in Abhängigkeit von den Dimensionen und dem Grad der Polarisierbarkeit der zu untersuchenden Zellen festgelegt; dabei wird die Phasendifferenz von den genannten elektrischen Feldern im Anfangszeitmoment auf Null eingestellt.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein elektrisches Wechselfeld in der Form eines Impulses erzeugt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Impuls des elektrischen Wechselfeldes in der Form eines Radioimpulses erzeugt wird.