DE19964113A1

DE19964113A1 - Vorrichtung und Verfahren zur Züchtung und zur Nutzung von Hautzellen

Info

Publication number: DE19964113A1
Application number: DE19964113A
Authority: DE
Inventors: Joerg C Gerlach
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-12-31
Filing date: 1999-12-31
Publication date: 2001-07-05

Abstract

Vorrichtung zur Kultur von Zellen unter Medium-Perfusion, wobei im Inneren Membransysteme einen mehrschichtigen Aufbau bilden. Kammern bzw. Membranbeutel können separat mit Medium perfundiert werden und/oder die Zellen der Haut aufnehmen. Die inneren Membranbeutel sind mit den Hautzellen flächig entnehmbar, damit die Zellen auf Anteilen der Membransystem zum Patienten transportiert und auf die Wundareale aufgelegt werden können. Die Zellen werden vom Inneren der Kammer mit Nährstoffen und Sauerstoff durch die Zellträgermembran hindurch versorgt, während sie in der Wunde des Patienten anwachsen.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Anzucht, zum Erhalt, zur Vermehrung und zur Nutzung von Zellen der Haut mit einem für die Haut typischen mehrschichtigen Aufbau, sowie Verfahren zum Betreiben der Vorrichtung und die Verwendung als Alternativmethode zu Tierversuchen sowie als klinische Wundabdeckung am Patienten.

Vorrichtungen für die Züchtung von Hautzellen, z. B. Zellkulturschalen, Zellkulturflaschen oder Zellkulturbeutel, (VueLife Teflon Bags, AFC, USA) insbesondere im Bereich der klinischen Therapie mit Hautzellen, als alternative Methode zu Tierversuchen oder zur Nutzung der Leistungen der Zellen sind bekannt.

Obwohl Methoden zur Isolierung, Kultur und Vermehrung von Hautzellen der drei Schichten der Haut (Keratinozyten, dermale Fibroblasten und dermale Fettzellen) etabliert sind (¹) ist die klinische Behandlung von Patienten mit großflächigen, höhergradigen Verbrennungen der Haut nach wie vor problematisch und mit einer hohen Sterblichkeit belastet (²). Klinische Standardtherapie ist nach Wundreinigung a) zunächst die Deckung der verbrannten Flächen mit Wundabdeckungen und Spalthaut, die vom Patienten an gesunder Stelle entnommen wurde. Diese autologe Spalthaut steht jedoch meist nicht in ausreichender Menge zur Verfügung. So kann oft nur auf die Selbstheilung der verbrannten Haut unter den Wundabdeckungen gehofft werden. Anforderungen an solche Wundabdeckungen sind u. a. die Fähigkeit der Verminderung von Flüssigkeits-, Eiweiß-, und Wärmeverlusten aus der Wunde sowie zum Keimschutz der Wunde.

Wundabdeckungen zu a) sind beispielsweise "Integra" der Firma Integra Life Science, USA (³) oder "AlloDerm" der Fa. LifeCell, USA (⁴), bestehend aus abgetöteten nicht-autologen Zellkulturen.

Letztgenanntes Produkt mit welchem heterologe Hautzellen in einer Zellbank kultiviert werden, auf flächige Trägerschichten aufgebracht werden um in abgetöteter Form für die klinische Wundabdeckung zu Verfügung stehen, ist ein erster Schritt, die Verwendung autologer Spalthaut (b) mit Hautzellersatz unter Verwendung lebender kultivierter Zellen zu ergänzen.

Die Kommerzialisierung des Hautersatzes mit lebenden und insbesondere lebenden autologen Zellen erfordert erhebliche Anforderungen an die Logistik. Daher sind erste Angebote lebender Zellschichten mit nicht- autologen Zellen bearbeitet worden. "Dermagraft-TC" von der Firma Advanced Tissue Sciences, USA, nutzt tierisches Collagen als Trägerstruktur, welches mit lebenden allogenen humanen Fibroblasten aus einer Zellbank überschichtet wird (⁵). Die Firma Organogenesis, USA, verwendet lebende humane allogene Fibroblasten und allogene Keratinozyten (^{6, 7}) in einer zweilagigen Struktur, welche als "Apligraf" von der Firma Novartis, CH, vertrieben wird.

Eine bisher nicht-kommerziell, klinisch verwendete Methode mit autologen lebenden Zellen ist die Kultur von Keratinozyten der Patienten und das Auftragen dieser Zellen auf die Wunden in Form von Suspensionen, beispielsweise mit Fibrin(^{8, 9}).

Die Verwendung lebender patienteneigener, autologer, Zellen wird mittlerweile ebenfalls kommerzialisiert. Von der Firma Genzyme, USA, wird ein Verfahren angeboten, in welchem den Patienten Keratinozyten autolog an gesunder Stelle entnommen werden, innerhalb weniger Tage in Kulturschalen außerhalb des Körpers vermehrt werden und in lebender Form als großflächige Schicht unter Zuhilfenahme einer Trägerstruktur aus Fettgaze auf die Wunde aufgelegt werden (^{10, 11}).

Bei diesem Stand der Technik ist die Anzucht, Kultur und Vermehrung von Hautzellen bekannt. Diese Verfahren konnten bisher keine zufriedenstellenden klinischen Ergebnisse liefern. Insbesondere über Gelenken führt die durch mangelnde Bindegewebsschichten fehlende Verschieblichkeit zu Narben, Kontrakturen und zu leichter Verletzlichkeit der neugebildeten Hautanteile.

Problematisch bei den derzeitig angewandten Entwicklungen sind: die mangelhafte Einheilungsrate, die unbefriedigenden kosmetischen Ergebnisse; zusätzlich verschlechtern Wundinfektionen die Heilung. Klinisch ist für die Patienten während der Wartezeit auf die Anwendung der Wundabdeckungen oft der Eiweiß- und Flüssigkeitsverlust aus den Wunden limitierend. Dabei führt oft eine mangelhafte Wundabdeckung vor dem Auftragen der Zellen zu Komplikationen. Das beim Stand der Technik meist erforderliche Entfernen der Zellträgerschicht mit dem Abreißen der Hautzellen führt zu weiterer Verschlechterung der Ergebnisse.

Hier setzt die vorliegende Erfindung ein, deren Aufgabe es in einer ersten Anwendung ist, eine Vorrichtung anzugeben, die es ermöglicht, daß der Wärme-, Eiweiß- und Flüssigkeitsverlust in der ersten klinischen Phase aus den Wunden verringert werden kann und die einen Keimschutz ermöglicht. In einer zweiten Anwendung können Enzyme zur Wundreinigung aufgetragen werden. In einer weiteren bevorzugten Anwendung während der späteren klinischen Phase wird das Ergebnis der Behandlung von Hautdefekten mit Hautzellen verbessert. Die Aufgabe wird durch die Ansprüche 1-4 sowie 15-17 und 20-22 gelöst. Die Ansprüche 5-14 beschreiben die Art und Eigenschaften der bevorzugt eingesetzten Membranen. Die Unteransprüche 18 und 19 sowie 31-32 betreffen vorteilhafte Weiterbildungen. Verfahren zum Betrieb der Vorrichtung sind durch die Ansprüche 23-30 sowie 33-36 beschrieben. Die Ansprüche 37 bis 41 betreffen Weiterbildungen des Verfahrens und der Vorrichtung zu ihrer Verwendung als klinische Wundabdeckung am Patienten, Anspruch 42 zu ihrer Verwendung im Labor.

Erfindungsgemäß wird dabei unter der Vorrichtung ein Gerät zur Kulturmedium-Perfusion in Form eines Körpers verstanden, der aus einem Außengehäuse und einem inneren Bereich besteht, wobei im Inneren des Körpers Membransysteme einen mehrschichtigen Aufbau bilden. Diese einzelnen Schichten bilden übereinander angeordnete Kammern, welche separat mit Medium perfundiert werden und/oder die Zellen der Haut aufnehmen können. Weiter unten wird beschrieben, daß diese Kammern so gestaltet werden können, daß die Membransysteme Beutel ausbilden können, welche aus der Vorrichtung entnehmbar sind.

Erfindungswesentlich ist nun, daß die Art der Membranen, welche den mehrschichtigen Aufbau ermöglichen, die Verbindung der Membranen zum Gehäuse, die Art der Bildung von Kammern, die Anschlüsse zur Mediumperfusion sowie die Anordnung der Kammern im Vergleich zum Stand der Technik weiterentwickelt wurden.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Kammern in der Vorrichtung von Flachmembranen gebildet. Die Zellen werden auf den Flachmembranen kultiviert und dabei in den Kammern mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt (Abb. 1). Dies ist durch Lösung von Nährstoffen und Sauerstoff in den perfundierenden Medien möglich, aber auch durch einen Transport über eigene, darunter oder darüber liegende Kammersysteme aus weiteren Membrankammern (Abb. 2), wobei der Antransport dann per Diffusion oder Perfusion durch die permeablen Membran wände hindurch von bzw. zu den Zellen erfolgt (Abb. 3, 4).

Diese Aufgaben können in den Kammern durch Flachmembranen, aber auch durch Hohlfasermembranen ermöglicht werden, wobei verschiedene Flachmembransysteme sich übereinander abwechseln können, bzw. verschiedene Kapillarmembransysteme übereinander angeordnet oder aber miteinander verwoben eingebracht, bzw. als Kombination von Flach- und Kapillarmembran angeordnet werden können.

Erfindungsgemäß sind nun im Inneren der Vorrichtung die Zellen so kultiviert, daß beispielsweise verschiedene Zellschichten zeitgleich in separaten Vorrichtungen, zeitgleich in einer Vorrichtung oder nacheinander in separaten Vorrichtungen versorgt werden können (Abb. 2).

So wird für jede Kammer in einer Vorrichtung ein unabhängiger Einlaß bzw. Auslaß für die Perfusion von Kulturmedium bzw. Gas durch die Kammern hindurch ermöglicht.

Erfindungsgemäß werden als Flachmembranen oder Hohlfasermembranen bevorzugt Membranen aus Cellulose/Cellulosesulfat verwendet. Die Auswahl der Membranen richtet sich dabei nach den gewünschten Eigenschaften zur Immobilisierung der Zellen und nach den Eigenschaften für den Stoffaustausch. Erfindungsgemäß lassen sich aber alle gängigen Flach- oder Hohlfasermembranen, die bereits aus dem Stand der Technik für Stoffaustauschverrichtungen und/oder für die Immobilisierung für Zellkulturen bekannt sind, anwenden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist in einer ihrer Ausgestaltungen die Möglichkeit auf, daß unter Wahrung der Sterilität die inneren Membranschichten mit den Hautzellen flächig entnehmbar sind, damit die Zellen auf Anteilen der Membransysteme zum Patienten transportiert und flächig mit der Zellseite zum Patienten auf die Wundareale aufgelegt werden können (Abb. 3).

Werden die Zellen zunächst auf den Membranen kultiviert, wird die gesamte Vorrichtung zur klinischen Anwendung um 180° gedreht, damit die Zellen zur Patientenwunde nach unten zeigen und die Membran einen Wundabschluß bildet (Abb. 3).

In einer bevorzugten Ausgestaltung bestehen erfindungsgemäß diese steril entnehmbaren Membransysteme aus der Zellschicht und weiteren flächigen Membranschichten, die auch während des Transportes zum Patienten und auch nach Auflegen auf die verbrannten Hautareale eine weiterhin perfundierbare Kammer bilden, welche mit Medium perfundiert werden kann. In dieser Ausführungsform werden die Zellen vom Inneren der Kammer mit Nährstoffen und Sauerstoff durch die Zellträgermembran hindurch versorgt, während sie in der Wunde des Patienten anwachsen (Abb. 3).

Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, Membranen einzusetzen, welche nach Auflage auf das Patientengewebe und Anwachsen der Zellen nicht mechanisch unter Auslösen neuer Wunden abgezogen werden müssen. Dies ist möglich durch Verwendung von resorbierbaren Membranen. Eine weitere erfindungsgemäße Ausgestaltung sieht vor, daß durch Lösungsmittel auflösbare Membranen verwendet werden. Eine bevorzugte Ausgestaltung sieht die Verwendung von enzymatisch verdaubaren Membranen vor.

Aus der Patentschrift DD 160 393 (1980) bzw. DE 33 06 259 (1990) und DE 40 21 049 A1 (1990) mit Auslandsanmeldungen CA 1 232 459, GB 2 135 954, CH 659 591 sind Cellulosesulfatmembranen bekannt. Diese sind durch Einsatz des Enzymes Cellulase verdaubar. Cellulase greift jedoch aufgrund seines Ursprunges aus der Pflanzenwelt menschliche Zellen des Patienten nicht an. Dabei gilt das Enzym Cellulase als patientenverträglich, hautzellunschädlich und für klinische äußerliche Behandlungen einsetzbar. Aus der klinischen Erfahrung ist die Verwendung weiterer enzymatisch verdaubarer Membransubstanzen wie Collagen, welches mit (körpereigener) Collagenase verdaubar ist bekannt. Auflösbare Membranen sind, z. B. aus Zuckermolekülen, bekannt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird vorgeschlagen, daß zusätzlich eine vergleichbare Membrankammer bereits in der ersten klinischen Phase einer Patientenbehandlung ohne Zellen als Wundabdeckung verwendet wird. Hier dienen die Membranen der Kammer als Keimschutz. Die Verwendung semipermeabler Membranen und die Perfusion der Kammer mit physiologischem Medium vermindert den Eiweiß- und Flüssigkeitsverlust aus der Wunde. Weiterhin kann durch diese perfundierbare Kammer eine Wundreinigung (Debridement), z. B. mit dem Enzym Crillase, erfolgen. Wird das Medium zusätzlich erwärmt, kann auch der Wärmeverlust des Patienten reduziert werden. Wird eine auflösbare oder verdaubare Membran verwendet, kann eine zweite, zellbesiedelte Membrankammer ohne mechanische Verletzung der Wunde in einer späteren Phase aufgetragen werden, nachdem sich die Hautzellen des Patienten vermehrt haben.

Erfindungsgemäß werden in weiteren bevorzugten Ausführungsformen noch Abwandlungen vorgeschlagen. Diese sind in Abb. 5 und 6 erläutert.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform sieht vor, daß die kultivierten Hautzellen humanen Ursprungs und hier insbesondere autologe Hautzellen von Patienten mit Schädigungen der Haut sind. Besonders in der Behandlung von Patienten nach Verbrennungen ist der erfindungsgemäße Bioreaktor und das Verfahren für den Aufbau von humaner Haut geeignet. Durch den Einsatz einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit Hautzellen konnte bereits organtypischer Hautaufbau ermöglicht werden, der sich am physiologischen Hautaufbau orientiert.

Weitere Merkmale, Einzelheiten und Vorzüge der Erfindung ergeben sich aus den Figurenbeschreibungen Abb. 1 bis Abb. 6.

Abbildungsbeschreibungen

Abb. 1 zeigt eine Ausführung des Außengehäuses der Vorrichtung mit einem perfundierbaren Membranbeutelsystem im Innenraum. Dargestellt ist hier nur eine Hälfte des Gehäuses im Anschnitt. An den mit * markierten Stellen setzt sich das Gehäuse spiegelbildlich fort (siehe hierzu Abb. 2). Der Anschnitt wurde zeichnerisch so dargestellt, daß im Außengehäuse (1) die verschiedenen Durchtritte (2) dargestellt werden konnten, die in verschiedene Kompartments des Innenraums (3) der Vorrichtung führen. Die Vorrichtung ist vorzugsweise aus transparentem Material hergestellt.

Um die obere und untere Aussenfläche der Vorrichtung auch während des Gebrauches steril zu halten, sind je zwei Schutzfolien (4) im oberen und unteren Bereich der Vorrichtung mittels lösbarer Verbindungen (5) angebracht. Nach Entfernen einer der äußersten Schutzfolien verbleibt eine Fläche der darunter liegenden Schutzfolie zur sterilen Vorbereitung z. B. eines Skalpellschnitts. Nach Entfernen der zweiten Schutzfolie ist der entsprechende Teil des darunter liegenden Gehäuses steril z. B. mit einem Skalpellmesser zu öffnen. Linie (6) zeigt eine mögliche Schnittlinie, mit welcher das Außengehäuse der Vorrichtung so geöffnet werden kann, daß der Innenraum steril bleibt. Unter sterilen Bedingungen kann im Innenraum durch Fortsetzung des Schnittes entlang der Schnittlinie (6) anschließend der Membransystembeutel (siehe Abb. 3, Nr. 20) im Innenraum der Vorrichtung herausgelöst werden.

Der Innenraum der Vorrichtung besteht aus einem Beutel mit Membran (7) sowie mit Membran (8). Der Beutel kann aus einem Guss aus dem Membranmaterial für (7) und (8) hergestellt sein, er kann aber auch aus einzelnen (z. B. durch Silikonkautschuk) miteinander verbundenen Membrananteilen (7 bzw. 8) geformt sein, wobei die Verbindung der Membranteile die Flexibilität des Beutels nicht reduzieren soll.

Auf der Außenseite von Membran (8) werden beispielsweise Zellen (9) kultiviert.

Membran (7) und Membran (8) sind mittels genannter Verbindung untereinander zu einem perfundierbaren Beutel verbunden (siehe Abb. 3, Nr. 20). Diese Verbindung führt zum Außengehäuse der Vorrichtung und ist dort verankert. Durch diese Konstruktion ist gewährleistet, daß die verschiedenen Kompartments der Vorrichtung unabhängig perfundierbar bleiben, ebenso ist gewährleistet, daß der innere Membranbeutel auch nach dem Herauslösen an Schnittlinie (6) weiterhin perfundierbar bleibt. Durch die Durchtrittsöffnung (11) kann Gas, bzw. Medium in die oberste Kammer ein- bzw. ausgeführt werden. Über die Durchtrittsöffnung (12) werden. Durch die Durchtrittsöffnung (13) kann ein drittes Kompartment der Vorrichtung perfundiert werden. Dies ist interessant, um die Zellen in die Vorrichtung einzubringen, um die Zellen mit Medium zu perfundieren, aber auch um die Zellen nach Ausbildung einer mehrlagigen Keratinozytenschicht mit Luft zu behandeln.

Die Durchtrittsöffnung (12) führt nicht unmittelbar in den Innenraum des Gehäuses, sondern über eine flexible Schlauchverbindung (14) in den Innenraum des Membranbeutels. Um ein vollständiges Entnehmen des Membranbeutels aus dem Außengehäuse zu gewährleisten, wird vor Entnahme des Beutels auch letztgenannte Schlauchverbindung (14), z. B. mit einem Skalpell, durchtrennt. Damit in der Phase des Durchtrennens des zu-/abführenden Schlauches kein Medium/Gas austreten kann, ist eine Schlauchklemme (15) kurz hinter der Ausführungsstelle des Schlauches aus dem Membranbeutel angebracht. Damit nach dem Herauslösen des Membranbeutels aus dem Reaktoraußengehäuse ein neuer Schlauch zur Fortsetzung der Perfusion steril konnektiert werden kann, ist ein entsprechender, z. B. Luer-Lock, Ansatz (16) ebenfalls in den Schlauch integriert.

Das Herauslösen des Beutels (bestehend aus Membran (7) und (8)) unter Wahrung der Perfusionsfähigkeit des Beutels erlaubt es, die auf einer Außenfläche des Beutels kultivierten Zellen (9) mit dem Beutel auf die Hautwunde eines Patienten aufzulegen und nach Auflegen des Zellbeutels auf die Wunde durch die Membranbeutelwand hindurch mit Sauerstoff/Medium zu versorgen (siehe Abb. 3).

Nachdem die Zellen auf der Wunde des Patienten angewachsen sind, läßt sich im Bereich der in der Abb. 1 dargestellten Schnittlinie (10) der dann überflüssige Teil des Membranbeutels abtrennen. Dies ist dann sinnvoll, wenn es sich bei der Zellträgermembran um ein resorbierbares Material handelt. Handelt es sich um ein, z. B. enzymatisch, auflösbares Membranmaterial, wird vor dem Abtrennen der Membrananteile das Lösungsmittel/Enzym durch die Perfusionskammer hindurch zur betreffenden Membran transportiert. Mit dem Auflösen des Membranmaterials erübrigt sich das Abtrennen oberen Membranbeutelanteils.

Der Anteil des Außengehäuses der Vorrichtung, welcher das Membranbeutelsystem aufnimmt (1), kann verschieden gestaltet werden, um mehrere Membranbeutelsysteme oder auch einfache Membranschichten aufzunehmen. Letztere Variante ist sinnvoll, wenn in einer Vorrichtung eine kombinierte, mehrschichtige Kultur verschiedener Zellarten für ein einzeitiges Auftragen auf die Wunde vorgesehen ist. Der mit (1) bezeichnete Anteil des Außengehäuses kann, z. B. durch Klebeverbindung (17), separat zu den weiteren Bestandteilen des Außengehäuses des Reaktor hergestellt und mit den restlichen Bestandteilen zu einem Gesamtaußengehäuse montiert worden sein.

Die Trennung des Aussengehäuses mittels Klebeverbindung (17) in zwei Anteile (1) und einen Anteil (1a) erlaubt die Anwendung mehrerer Anteile (1a) mit jeweils (7, 8 und 12-16) und somit die Herstellung von Aussengehäusen mit mehreren Membranbeuteln im Inneren. Der mit (1) bezeichnete Anteil des Außengehäuses des Reaktors ist aus Gründen der Übersichtlichkeit zeichnerisch relativ groß dargestellt, er kann in bevorzugten Ausführungsformen wesentlich kleiner dimensioniert sein.

Abb. 2 zeigt drei unabhängige Vorrichtungen gemäß Abb. 1 im Anschnitt. Die Abbildung zeigt einen Mediumskreislauf (18) und einen Gaskreislauf (19), welche mittels Schlauchsystemen drei unabhängige Vorrichtungen miteinander verbinden. In Abb. 1 wurde erläutert, wie in einer einzelnen Vorrichtung eine oder mehrere Zellarten in einem oder mehreren Membrankompartments für eine einschichtige Kultur und ein einzeitiges Auftragen auf die Patientenwunde realisiert werden kann. Aus Abb. 2 geht hervor, wie in einem gemeinsamen Kreislaufsystem drei verschiedenen Anordnungen können drei verschiedene Zellarten separat kultiviert werden und zeitlich unabhängig, mit jeweils einem eigenen Perfusionsbeutel, auf die Patientenwunde aufgetragen werden.

Abb. 3 zeigt die Verwendung des Membransystembeutels (20), der aus Membran (7) und (8) in Abb. 1 besteht, mit den Zellen (9), nach Kultur und Entnahme aus dem Bioreaktoraußengehäuse und nach Auflage der Zellseite des Membranbeutels (20) auf einem Patienten. Die Abbildung stellt dar, wie ein Membranbeutel (20) aus den Vorrichtungen (siehe Abb. 1, Abb. 2) entnommen und auf eine Patientenwunde, z. B. nach Verbrennungen, aufgelegt werden kann. Eine Zellschicht (9) ist auf einer Außenseite des Membranbeutels (20) kultiviert. Der Membranbeutel mit dieser Zellschicht wird so auf die Patientenwunde aufgelegt, daß die Zellen vom Membranbeutel in die Wunde hinein anwachsen können. In dieser Phase kann der Membranbeutel über ein Mediumzulauf-Reservoir (21), einen Zulaufschlauchanschluß (22), einen Auslaufschlauchanschluß (23) und ein Mediumablauf-Reservoir (24) perfundiert werden. Durch Einstellung der Lage von Mediumzulauf- und Mediumablauf-Reservoir kann der hydrostatische Druck im Inneren des Mediumbeutels sowie das Gewicht des gesamten Mediumsbeutels auf der Patientenwunde eingestellt werden. Fin außen um den Membranbeutel herum angelegter Verband (25) kann den Membranperfusionsbeutel zusätzlich fixieren, bzw. auf die Wunde komprimieren.

Analog zur beschriebenen Verfahrensweise können auch mehrere Membranperfusionsbeutel (siehe Abb. 2) zeitgleich übereinander auf eine Wunde verbracht werden.

In einer bevorzugten Anwendung wird das Medium auf Körpertemperatur erwärmt.

Aus den Hautwunden von Verbrennungspatienten tritt häufig eine größere Menge Gewebswasser auf. Ist die Permeabilität der Membran Wand des Membranperfusionsbeutels geeignet gewählt, kann dieses Sekret durch die Membran Wand hindurch in den Mediumablauf geleitet werden. Auf diese Weise wird eine Ausbildung von Sekretblasen zwischen Wunde und der aufgetragenen Zellschicht des Membranbeutels vermieden.

Abb. 4 zeigt eine Option des Betriebs der Vorrichtung unter einstellbaren Perfusions-, bzw. Diffusionsbedingungen. Sie erläutert, wie die Zellen (9), solange sie sich in der kompletten Vorrichtung befinden, mit Medium perfundiert werden können. Dies ist mittels Perfusion von Medium an den Zellen entlang der Linie (26) zu (26a) denkbar, bei geeigneter Membranpermeabilität aber auch mittels Diffusion des Mediums durch die Membranwand ausgehend von Linie (26b) darstellbar.

Abb. 1-4 stellen Systeme dar, in welchen die Zellen über das perfundierte Medium mit darin gelöstem Sauerstoff versorgt werden.

Abb. 5 zeigt eine alternative Option der Oxygenierung von Zellen in der Vorrichtung. Eine Variation der Anordnung der Membransysteme im Inneren des Reaktorgehäuses ist dargestellt, um einen zusätzlichen Sauerstofftransport über in Gasform integrierte hydrophobe Membransysteme (27 + 28) zu erreichen.

Abb. 6 zeigt Abwandlungen der vorgestellten Vorrichtung in weiteren bevorzugten Ausführungsformen. Optionen zur Verwendung von Flachmembranen und/oder Kapillarmembranen werden erläutert. In Abb. 6a werden die in Abb. 5 verwendeten Flachmembranen (27 und 228) zur zusätzlichen Sauerstoffversorgung durch Kapillarmembranen (29) ersetzt. Abb. 6b zeigt, wie mit dem in Abb. 5 dargestellten Aufbau auch zwei oder mehrere Zellschichten zeitgleich in einer Vorrichtung unter Vermeidung von Flachmembranen kultiviert werden können. Die resorbier-/verdau baren Flachmembranen aus Abb. 1-5 sind durch entsprechende Kapillarmembranen für die Mediumversorgung (30) und die Sauerstoffversorgung (29) ersetzt.

Abb. 6c zeigt einen Aufbau mit drei Zellschichten, welche durch resorbier-/verdau bare Sauerstoffkapillaren (29) versorgt sind und die durch resorbier-/verdaubare Flachmembranen (30) voneinander getrennt sind. Die Zellernährung erfolgt hier mittels Perfusion des Ernährungsmediums analog zu Abb. 4.

Durch die erfindungsgemäße Ausgestaltung der Vorrichtung konnte die Ausbildung mehrlagiger Hautschichten mit organtypischem Hautaufbau ermöglicht werden.

Literatur ¹

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Claims

1. Vorrichtung zur Anzucht, zum Erhalt, zur Vermehrung und zur Nutzung von Zellen der Haut, welche Membranbeutel enthält, die sowohl als sterile Wundabdeckung zur Verminderung des Flüssigkeits-, Eiweiß- und Wärmeverlustes aus Hautverletzungen als auch zum Auftragen von Hautzellen dienen, wobei die Vorrichtung vorbereitende Maßnahmen, z. B. zur Wundvorbereitung am Patienten, oder zur Kultur von Hautzellen in Laborumgebung und nachfolgend am Patienten ermöglicht und im Innenraum aus einem oder mehreren Membranbeuteln besteht, welche steril entnehmbar und auf die Haut aufzulegen sind, ohne die Eigenschaft einer perfundierbaren Kammer in einem geschlossenen Kreislauf zu verlieren.

2. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, in welcher für jede Membransystemkammer in einer Vorrichtung ein unabhängiger Einlaß bzw. Auslaß für die Perfusion von Kulturmedien oder Gasen durch die Kammern hindurch ermöglicht wird.

3. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 und 2, in welcher die Membrankammersysteme aus Flachmembranen auch durch Hohlfasermembransysteme ergänzt werden.

4. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei sich verschiedene Flachmembransysteme übereinander abwechseln können, bzw. verschiedene Kapillarmembransysteme übereinander angeordnet oder aber miteinander verwoben eingebracht, bzw. als Kombination von Kapillar- und Flachmembranen angeordnet werden können.

5. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Flachmembranen, Membranen aus resorbierbaren Materialien verwendet werden.

6. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Hohlfasermembranen, Membranen aus resorbierbaren Materialien verwendet werden.

7. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Flachmembranen, Membranen aus Collagen verwendet werden.

8. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Hohlfasermembranen, Membranen aus Collagen verwendet werden.

9. Vorrichtung gemäß Anspruch 1, in welcher als Flachmembranen, Membranen aus Lösungsmittel auflösbare Materialien verwendet werden.

10. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Hohlfasermembranen, Membranen aus Lösungsmittel auflösbare Materialien verwendet werden.

11. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Flachmembranen, Membranen aus enzymatisch auflösbaren Materialien verwendet werden.

12. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Hohlfasermembranen, Membranen aus enzymatisch auflösbaren Materialien verwendet werden.

13. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 4, in welcher als Flachmembranen, Membranen aus Cellulose/Cellulosesulphat verwendet werden.

14. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 14, in welcher als Hohlfasermembranen, Membranen aus Cellulose/Cellulosesulphat verwendet werden.

15. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 14, in der die inneren Membranbeutelsysteme steril entnommen werden können, indem auf der oberen und unteren Fläche der Vorrichtung je zwei Schutzfolien mittels lösbarer Verbindungen angebracht sind, welche nach Entfernen einer der äußeren Schutzfolien eine darunter liegende sterile Folie aufweist, die eine sterile Vorbereitung z. B. eines Skalpellschnittes ermöglicht. Nach Entfernung einer der zweiten Schutzfolien ist der entsprechende darunterliegende Teil der Vorrichtung steril, z. B. mit einem Skalpellmesser oder an Sollbruchstellen zu öffnen und innen liegende Membranbeutelsysteme steril zu entnehmen.

16. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 15, mit Durchtrittsöffnungen im Außengehäuse, durch welche Medien zu bzw. von den Membranbeutelsystemen transportiert werden können.

17. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 16, mit verschließbaren Schlauchverbindungen im Innenraum zwischen Außengehäuse und Membranbeutelsystemen, welche steril dekonnektierbar und anschließend wieder rekonnektierbar sind, ohne daß es zum Flüssigkeitsaustritt aus den Schläuchen kommt.

18. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 17, mit einem modular aufgebauten Außengehäuse, in welcher Module aus verschiedenen Schichten übereinander verbunden werden können, wobei jedes Modul ein perfundierbares Membranbeutelsystem mit Ver- und Entsorgungsanschlüssen enthält.

19. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 18, welche Membranbeutelsysteme enthält, die so vorgefertigt sind, daß sie von der Auflagefläche her für einen Oberarm, einen Unterarm, einen ganzen Arm und für die unteren Extremitäten sowie alle weiteren Körperregionen vorgeformt sind.

20. Ausführungs gemäß Anspruch 1 bis 19, in welcher Membranbeutel die Kammersysteme in der Vorrichtung bilden, wobei die Zellen auf der Außenseite von Flachmembranbeuteln kultiviert und durch die Membran wände aus dem Inneren des perfundierbaren Beutels mit Nährstoffen und Sauerstoff versorgt werden.

21. Ausführung gemäß Anspruch 1 bis 20, in welcher die Zellen in verschiedenen Schichten zeitgleich oder zeitlich nacheinander auf der Außenseite der Membranbeutel kultiviert werden.

22. Ausführung gemäß Anspruch 1 bis 22, in welcher einzelne Zellschichten in einer Vorrichtung aber auf unabhängigen Membranbeuteln kultiviert werden.

23. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 22, in welchem die Zellen in einer Vorrichtung mit mehreren Membrankammersystemen aus weiteren Membrankammern per Diffusion oder Perfusion durch die permeablen Membran wände hindurch versorgt werden.

24. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 23, in welchem Hohlfasermembranen die Stoffver- und -entsorgung in den Kammersystemen übernehmen.

25. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 24, zum Auflegen der Kammern aus der Vorrichtung auf die Patientenwunde und Perfusion der Kammer mit Flüssigmedium, welches durch geeignete Permeabilität der Membranbeutel ein Austrocknen der Wunde verhindert, welches durch Wundkompression mit feuchtem Milieu Eiweiß- und Flüssigkeitsverluste aus der Wunde reduziert sowie überschüssiges Sekret aus der Wunde entfernt, welches durch geeignete Temperatur des Mediums Wärmeverluste reduziert und welches auch eine Wundreinigung durch Beigabe von wundreinigenden Enzymen ermöglicht.

26. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 25, zur Kultur von verschiedenen Arten von Hautzellen simultan in einer Vorrichtung mit verschiedenen Membrankammern oder parallel mit verschiedenen Vorrichtungen oder zeitlich versetzt nacheinander mit verschiedenen Vorrichtungen.

27. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 26, zum Auftragen von Zellkulturen auf Wunden, wobei die Zellen auf der Außenseite von perfundierbaren Kammersystemen kultiviert sind und durch die Kammer selbst auf die Wunde komprimiert werden.

28. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 27, in welchem die Membransystembeutel aus der Vorrichtung sowohl zum Wundabschluß als auch zum Zellauftragen eingesetzt werden, anschließend aber nicht mechanisch von den Wunden abgezogen werden müssen, sondern entfernt werden, indem resorbierbare, auflösbare oder enzymatisch verdaubare Materialien verwendet werden.

29. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 28, in welchem Membranmaterialien verwendet, welche semipermeabel für Sauerstoff und CO₂ sind, um eine Zellversorgung durch die Membranwände hindurch zu ermöglichen.

30. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 29, in welchem Membranmaterialien verwendet, welche semipermeabel für Kulturmedium, Nährstoffver-/-ent sorgung sind, um eine Zellversorgung durch die Membranwände hindurch zu ermöglichen.

31. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 30, in welcher die semipermeablen Membransysteme Porengrößen aufweisen, welche zwar einen Gas- oder Flüssigkeitsaustausch sowie den Austausch kleinerer Moleküle ermöglichen, aber eine Passage von Viren, Bakterien oder anderen Mikroorganismen aufgrund ihrer Porenausschlußgröße verhindern und so auch als Keimschutz dienen.

32. Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 31, welche einen Eiweißverlust reduziert.

33. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 32, in welchem verschiedene Zellarten mit verschiedenen Membranbeutelsystemen separat kultiviert werden können, die aber durch Zusammenschluß der Flüssigkeitskreisläufe untereinander mittels Mediatoren kommunizieren können.

34. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 33, mit welchem die Membrankammerbeutelsysteme nach dem Auflegen auf die Patientenwunde mit physiologischen Druckverhältnissen komprimiert werden können.

35. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 34, in welchem Wärmeverluste des Patienten durch Vorwärmung des Mediums reduziert werden.

36. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 35, in welcher Adhäsion der Zellen in der Wunde durch vorangehendes, flächiges Aufsprühen von Fibrinkleber auf die Zellschicht verbessert wird.

37. Verwendung der Membranbeutelsysteme gemäß Anspruch 1 bis 36, aus der Vorrichtung als klinische Wundabdeckung am Patienten.

38. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 37 zum Auftragen von Zellkulturen auf Hautwunden.

39. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 38 für kultivierte Hautzellen humanen Ursprungs.

40. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 39 für kultivierte autologe Hautzellen von Patienten.

41. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1 bis 40 für die Rekonstitution eines mehrschichtigen, organtypischen Hautaufbaus, der sich am physiologischen Hautaufbau orientiert.

42. Verwendung der Vorrichtung gemäß Anspruch 1-40 als Alternativmethode zu Tierversuchen in der pharmazeutisch/kosme tischen Industrie.