CH683747A5 - Verfahren zur Herstellung von Endoprothesen. - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren gemäss dem Oberbegriff des unabhängigen Patentanspruchs 1 und nach dem Verfahren hergestellte Endoprothesen gemäss den Oberbegriffen der entsprechenden unabhängigen Patentansprüche. Es handelt sich dabei um Endoprothesen für eine wenigstens teilweise direkte Berührung mit dem Blut oder mit der Lymphe, wie beispielsweise Blut- oder Lymphgefässprothe-sen, Herzklappen, Kunstherzen und dergleichen, die aus einem vorgeformten, künstlichen oder biologischem Trägermaterial bestehen, an dessen Oberflächen oder mindestens bestimmten Oberflächenbereichen oder in oberflächennahen Schichten körpereigene Zellen angelagert oder eingelagert werden, die sich vor oder nach der Implantation derart vermehren, dass die betreffenden Oberflächenbereiche von einer Schicht körpereigener Zellen bedeckt werden.

Bei Endoprothesen kann es von Vorteil sein, zusammen mit der Prothese körpereigene (autologe) Zellen zu transplantieren, die gewisse wichtige Funktionen übernehmen und damit bessere Resultate der Heilung und der Langzeitfunktion der Prothese ergeben. Durch die Arbeiten von Herring et al. (A single staged technique for seeding vascular grafts with autogenous endothelium, Surgery 84:498-504, 1978) wird experimentell gezeigt, dass sich in Arterienprothesen, auf deren innere Oberfläche körpereigene Endothelzellen übertragen wurden, ein neues Endothel bildet, und dass diese Prothesen dann auch bei kleinem Innendurchmesser nicht durch Gerinsel verstopfen.

Die Herstellung und Implantation von Endoprothesen mit körpereigenen Zellen aus Geweben von Mensch und Säugern steht noch in den Anfängen. Am bekanntesten sind die Verfahren zur Endothelia-lisierung von Gefässprothesen. Ein beispielhaftes Verfahren besteht darin, dass die Endothelzellen zusammen mit dem Blut für die Abdichtung auf textile Prothesen aufgetragen werden (M. Herring et al., Seeding arterial protheses with vascular endothelium. The nature of the lining, Ann Surg 1979; 190:84-90). Nach einem anderen Verfahren werden die Zellen zuerst in vitro auf der Prothese, die mit einem Substrat vorbereitet ist, kultiviert, bevor die Prothese in den Körper eingesetzt wird (W. Müller-Glauser et al., Immediately functional monolayers of endo thelial cells lined in vitro on vascular grafts, in P. Zilla et al. eds. Applied Cardiovascular Biology 1990-91 and Int. Soc. Appi. Cardiovasc. Biol. Basel: S. Karger, 1992:124-130). Wieder andere Verfahren benützen eine Kurzzeitkultur von etwa einer Stunde, um den Zellen Zeit zu geben, sich auf der Prothese festzusetzen (B.E. Jarrell et al., Immediate vascular graft monolayers using microvessel endothelial celis, in Endothelial Seeding in Vascular Surgery, edited by M. Herring and J.L Glover, Grüne & Stratton Inc., 1987:37-55).

Ein Verfahren und eine Einrichtung zum Aufbringen von vitalen Zellen auf vorgeformte, künstliche Träger zur Herstellung von Endoprothesen ist auch beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 93 810 297.7 (Veröffentlichungsnr. 0570 331 A1) derselben Anmelderin.

Die körpereigenen Zellen auf derartigen Prothesen leben und müssen während den Vorbereitungen zur Implantationsoperation und während der Implantation lebend erhalten werden. Dabei herrschen im Operationsfeld extrem unphysiologische Bedingungen. Nur wenn die Zellen diese Bedingungen unge-schädigt überleben, können sie nach der Operation ihre volle Funktion wieder aufnehmen. Dies wird gemäss dem Stande der Technik erreicht, indem derartige Prothesen hauptsächlich zur Verhinderung von schädlichem Wasserverlust oder gar Austrocknung bis möglichst kurz vor der Implantation in einer entsprechenden Flüssigkeit aufbewahrt werden und dann während der Operation und deren unmittelbaren Vorbereitungen entweder mit feuchter Gaze bedeckt oder ständig mit physiologischer Lösung betropft werden. Beide Vorgehensweisen sind nicht befriedigend, denn das Betropfen ist aufwendig und schlecht kontrollierbar und das Bedecken mit Gaze ist vor allem für Prothesen wie beispielsweise Herzklappen, die lebende Zellen an den äusseren Oberflächen aufweisen, ungünstig, da die Zellen mechanisch nicht widerstandsfähig sind und von der Gaze beschädigt werden können und da die Gaze beim Einnähen der Prothese mindestens teilweise entfernt werden muss.

Eine weitere, bekannte Methode zur Feuchthaltung der lebenden Zellen in Gefässprothesen besteht darin, einen Katheter in das Gefäss einzuführen und bis kurz vor Abschluss der Implantationsoperation eine geringe Menge physiologischer Salzlösung durch die Prothese fliessen zu lassen. Mit dieser Methode können die Zellen zwar kontrolliert feucht gehalten werden, aber sie bedeutet einen operativen Mehraufwand. Die Methode ist nur für Gefässprothesen anwendbar.

Es ist nun die Aufgabe der Erfindung, Endoprothesen mit körpereigenen Zellen und Verfahren zu deren Herstellung derart zu verbessern, dass die Prothesen zwar wenigstens auf vorgegebenen Bereichen ihrer Oberflächen lebende Zellen aufweisen, deren Vitalität möglichst erhalten bleiben soll, trotzdem aber ohne besondere Vorkehrungen und hinderliche Manipulationen, also in möglichst gleicher Art und Weise wie Prothesen ohne lebende Zellen, implantiert werden können. Das Verfahren soll auch in Operationssälen einsetzbar sein.

Es handelt sich dabei um das technische Problem, die Zellen auf der Prothese derart zu schützen, dass möglichst alle auf der Prothese aufgetragenen Zellen nach der Implantation lebensfähig sind und dass durch den Schutz der Zellen trotzdem weder die chirurgischen Manipulationen behindert werden, noch die Wirkung der Prothesenoberfläche auf Blut oder Lymphe negativ beeinflusst wird.

Diese Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren gemäss dem unabhängigen Verfahrensanspruch und den Prothesen gemäss dem entsprechenden unabhängigen Anspruch.

Das erfindungsgemässe Verfahren beruht im wesentlichen darauf, dass die lebenden Zellen nach an

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sich bekannten Verfahren auf vorgeformte, künstliche Träger aufgebracht werden, wobei zusätzlich ein zellschützendes Mittel aufgebracht wird. Dieses zellschützende Mittel, das wenigstens im Bereiche der lebenden Zellen auf dem Träger aufgebracht wird, hat Eigenschaften derart, dass es in erster Linie ein Austrocknen der Zellen verhindert, indem es die Zellen entweder hermetisch gegen eine austrocknend wirkende Umgebung abschliesst und/oder ihnen einen genügenden Flüssigkeitsvorrat zur Verfügung stellt. Zudem kann das zellschützende Mittel einen normalen Stoffwechsel der Zellen ermöglichen und die Zellen wenigstens in beschränktem Masse vor mechanischer Beschädigung schützen. Das zellschützende Mittel hat ferner Eigenschaften derart, dass es die Implantation der Prothese nicht behindert und dass es nach der Operation entweder auf sehr einfache Weise entfernt werden kann oder aber derart beschaffen ist, dass es im Körper belassen werden kann.

Das zellschützende Mittel wird je nach Art der Prothese vor, gleichzeitig mit oder nach der Auftragung der körpereigenen Zellen aufgetragen. Es kann auch aufgetragen werden nach einem Schritt von in-vitro-Kultur, währenddem die Zellen auf der Prothese bereits zu einem Verband vermehrt werden. Das zellschützende Mittel schützt die Zellen bis nach der Operation, insbesondere während der Operation und der dabei notwendigen Manipulationen der Prothese, so dass die Zellen in wirklich unbeschädigtem Zustand im Körper ihre volle Funktion wieder aufnehmen körmen.

Als zellschützendes Mittel kann ein Gel verwendet werden, das als Flüssigkeitsreservoir die lebenden Zellen umgibt und/oder gegen aussen abdeckt und genügend Flüssigkeit enthält, derart, dass die Verdunstung vor und während der Operation die Bereiche mit den Zellen nicht in Mitleidenschaft zieht. Eine derartige Gelschicht stellt auch einen beschränkten Schutz gegen mechanische Beschädigung der lebenden Zellen dar. Das Gel wird derart gewählt, dass es nach Beendigung der Implantation leicht weggespült werden kann oder aber dass es ohne Nebenwirkungen im Körper belassen werden kann.

Andererseits kann als zellschützendes Mittel auch eine im wesentlichen für Wasserdampf undurchlässige Membran, beispielsweise eine Kunststoffmembran, zur Anwendung kommen, die eine Abgabe von Feuchtigkeit von der Prothesenoberfläche an die sie umgebende Atmosphäre weitgehend verhindert. Eine derartige Membran wird nach der Implantation mechanisch entfernt oder, wenn sie aus einem entsprechenden Material besteht, im Körper belassen und resorbiert.

Es kann auch eine Gelschicht und eine Membran kombiniert als zellschützendes Mittel angewendet werden.

Bei Gefässprothesen kann das zellschützende Mittel zusätzlich die Funktion übernehmen, Blutungen beim ersten Durchfliessen der Prothese zu verhindern oder zu reduzieren.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Endoprothesen mit vitalen Zellen ist für Zell-Auto-Transplantate im Gebiet der Humanmedizin wie auch der Veterinärmedizin gleichermassen anwendbar.

Ein erstes Ausführungsbeispiel des erfindungsgemässen Verfahrens wird nun am Beispiel einer endothelialisierten Gefässprothese eingehend diskutiert. Der vorgeformte, künstliche Träger ist rohrför-mig und porös. Die vitalen Zellen werden durch Filtration durch die Trägerwand an dessen innerer Oberfläche angelagert. Dazu wird eine Suspension, die die Zellen einzeln oder als kleine Zellverbände enthält, von innen nach aussen durch die poröse Wandung des Trägers filtriert, wobei die Zellen und Zellverbände im Bereiche der inneren Oberfläche zurückgehalten werden. Nach dieser Filtrierung wird die Prothese mit einer zu einem Gel erstarrenden Flüssigkeit behandelt.

Zur Erstellung einer äusseren Gelschicht wird die Viskosität der zum Gel erstarrenden Flüssigkeit durch entsprechende Einstellung von Temperatur und/oder Konzentration des Geliermittels derart eingestellt, dass die Prothese für die Flüssigkeit nur teilweise oder nicht permeabel ist. Für die Behandlung wird die Prothese in ein Rohr eingezogen und der Raum zwischen Rohr und Prothese mit gelierender Flüssigkeit gefüllt. Dabei kann durch Rotation des Rohres in horizontaler Lage oder durch Platzhalter dafür gesorgt werden, dass die Gelschicht rund um die Prothese etwa gleich dick ist. Die Behandlung kann auch in einem U-Rohr mit entsprechenden Platzhaltern vorgenommen werden.

Für Prothesen mit in-vitro kultivierter Zellschicht empfiehlt sich eine äussere Gelschicht. Diese kann gleich aufgebracht werden, wie oben für eine poröse Prothese beschrieben.

Soll eine innere Gelschicht in einer Prothese mit in-vitro kultivierter Zellschicht oder mit einzelnen an der inneren Oberfläche eingelagerten Zellen oder Zellverbänden erstellt werden, wird die Prothese mit einer berechneten Menge gelierender Flüssigkeit gefüllt und diese bei rotierender Prothese erstarren gelassen. Dadurch bildet sich eine regelmässige Gelschicht auf der Innenwand. Die Prothese kann auch ganz mit gelierender Flüssigkeit gefüllt und das überschüssige Gel nach dem Gelieren ausgeblasen oder mit einem Glasstab ausgestossen werden. Auf der Innenwand verbleibt eine genügende Gelschicht.

Für eine Kombination von innerer und äusserer Gelschicht werden die beiden angegebenen Verfahren entsprechend kombiniert.

Das Verfahren kann entsprechend adaptiert auch für nicht-rohrförmige Prothesen, beispielsweise Herzklappen, zur Anwendung kommen.

Das Gel behindert die Implantationsoperation in keiner Weise. Es wird nach Beendigung der Operation von der Prothese gespült oder auf ihr belassen.

Das verwendete Gel muss immunologisch inaktiv und zellverträglich sein. Es wird beispielsweise aus Gelatine für Plasma-Ersatz hergestellt. Wenn es lediglich als feuchtes Umgebungsmedium dienen soll,

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wird die zu einem Gel erstarrende Flüssigkeit aus Gelatine und physiologischer Lösung hergestellt. Wenn zusätzlich der Stoffwechsel der Zellen vollauf funktionieren soll, wird die Flüssigkeit aus Gelatine und einer entsprechenden Nährlösung hergestellt. Das Gel muss isotonisch sein.

An der Stelle eines auf Gelatine basierenden Gels kann auch ein auf Fibrinogen basierendes Gel (z.B. Tissucol der Firma Immuno, Wien), Plasma oder geeignete Bestandteile der extracellulären Matrix (z.B. Proteoglykane) zur Anwendung kommen. Auch die Anwendung von synthetischen Gele oder von Mischungen verschiedener Gele ist denkbar.

Eine weitere Voraussetzung für das Gel besteht darin, dass es, wenn es nicht auf der Prothese belassen werden kann, bei Bedingungen, die die Zellen unbeschadet überleben können, wieder entfernt werden kann. Auch diese Bedingung wird von Plasma-Ersatz-Gelatine erfüllt, die aus dem Innern von Gefässprothesen durch das Blut ausgespült und auf äusseren Oberflächen unbeschadet belassen werden kann.

Erstreckt sich das Gel auf die innere Oberfläche der Gefässprothese, muss es athrombogen sein. Gelatinehaitige Präparate, die als Plasma-Ersatz verwendet werden und bei höherer Konzentration Gele bilden können, weisen Athrombogeneität als wesentliche Eigenschaft auf und sind deshalb für die Anwendung geeignet.

Erstreckt sich das Gel nur auf der Aussenseite der Gefässprothese kann es thrombogen sein. Der Vorteil einer thrombogenen Aussenschicht liegt darin, dass dadurch Nachblutungen reduziert werden.

Athrombogeneität des Gels kann erreicht werden durch Zusatz (Beimischung oder Bindung) von Antikoagulantien oder Thrombocytenhemmern, von Cumarin oder Aspirin. Die athrombogene Wirkung des Gels muss keine Langzeitwirkung sein, da das Gel in den meisten Fällen nach der Operation entfernt wird. Ähnliche Verfahren zur Thromboseprophylaxe sind auch bekannt für Kunststoffprothesen, an die zu diesem Zwecke beispielsweise Heparin kovalent gebunden wird.

Zur Herstellung eines thrombogenen Gels wird diesem ein blutstillendes Mittel zugesetzt. Thromboge-ne Gels sind nur auf der Aussenseite von rohrförmigen Prothesen anwendbar. Als blutstillende Mittel kommen beispielsweise Vitamin K, Thrombin oder hochmolekulare Kolloide in Frage.

Bei der Herstellung des Gels, beispielsweise aus Gelatine für Blutplasma-Ersatz, muss darauf geachtet werden, dass die Osmolarität der wässrigen Gelatinelösung isotonisch bleibt. Es ist auch von Vorteil, aber nicht notwendig, dass bei Anwendung für Gefässprothesen das wässrige Lösungsmittel auch isoionisch mit dem Blut ist. Ferner können in der Lösung auch Nährstoffe für die Zellen, wie Glukose und Aminosäuren, enthalten sein. Die Konzentration der gelierenden Substanz wird zwischen 10 und 20%, je nach Gelier-Eigenschaften der Moleküle, bspw. bei Gelatine für Plasma-Ersatz-Präparate typischerweise 15%, gewählt. Vor Gebrauch wird das steril hergestellte Gel bei 30 bis 37°C verflüssigt und dann noch flüssig, etwa mit einer Temperatur von 30°C, als etwa 2 mm dicke Schicht, beispielsweise nach dem bereits für rohrförmige Prothesen beschriebenen Verfahren, aufgetragen. Bei Raumtemperatur von 20 bis 25°C erstarrt diese Schicht innert etwa 5 min zu einem Gel.

Für nicht-rohrförmige Prothesen ist es sinnvoll, eine genau berechnete Menge der gelierenden Flüssigkeit auf die Oberfläche aufzubringen und durch entsprechende Bewegung dafür zu sorgen, dass diese sich gleichmässig verteilt. Die gelierende Flüssigkeit kann auch bei schon sehr fortgeschrittener Gelierung beispielsweise durch eine breite Schlauchöffnung aufgebracht werden. Die Dicke von 2 mm stellt einen Richtwert dar und muss nicht allzu genau eingehalten werden (siehe Versuchsprotokolle am Ende der Beschreibung).

Die Schutzwirkung einer derartigen Gelatine-Gel-Schicht tritt genügend rasch ein und bietet den Zellen, wie in-vitro-Untersuchungen an Zellkulturen in einer laufenden Laminarflow-Bench (siehe Versuchsprotokolle am Ende der Beschreibung) gezeigt haben, während wenigstens zwei Stunden den erforderlichen Schutz, unter dem sie vital erhalten werden können. Beispielsweise bei einer Herzklappen-Operation sind die Bedingungen für die Zellen bezüglich der trocknenden Luftströmung über dem Operationsfeld und der Dauer der Exposition weniger extrem womit gezeigt ist, dass der durch die Gelschicht erreichte Schutz der Zellen im Fall einer Herzklappenoperation ausreichend ist.

Nach dem Einnähen der Prothese kann eine derartige Gel-Schicht durch kurzes Abspülen mit physiologischer Kochsalzlösung von 37°C entfernt werden. Dabei löst sich das Gel auf, während die Zellen erhalten bleiben. Das Gel kann aber auch auf der Prothese belassen werden, wenn es im Körper keine schädliche Wirkung entwickelt. Dies ist insbesondere der Fall, wenn im Innern von rohrförmigen Prothesen Gele aus Plasma-Ersatz-Mitteln oder Plasma verwendet werden, die ganz einfach vom Blut mitgespült werden. Ein Wegspülen des Gels im Innern einer rohrförmigen Prothese muss unmittelbar vor deren Anschluss an die Blutbahnen geschehen, auf der Aussenseite von Gefäss- oder anderen Prothesen nach dem Einnähen der Prothese und vor dem Wundverschluss, oder sinngemäss entsprechend der Operationstechnik.

Zur Herstellung der gelierenden Lösung kann beispielsweise die folgende Rezeptur benützt werden: 15 g Gelatine (Plasma-Ersatz-Qualität) wird unter Vermeidung von mikrobieller Verunreinigung in ein 100 ml-Vial eingewogen und 85 ml Wasser (Aqua ad iniectabilia) zugegeben. Das Vial wird geschlossen und geschüttelt, um die Gelatine vollständig zu lösen, und zur Quellung eine Stunde stehen gelassen. Dann wird die gequollene Gelatine im Wasserbad bei 60° während 25 min gelöst und 25 min bei 121° autoklaviert. Gleichzeitig wird 1 N-Natronlauge bei gleichen Bedingungen autoklaviert. Beim Abkühlen entsteht ein Gel, das sich bei ca 30° verflüssigt.

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Vor Gebrauch wird dieses Gel durch Erwärmen auf ca 30° verflüssigt und so viel sterile Natronlauge zugegeben, bis der pH 7,4 beträgt, was ca. 1,1 ml benötigt. Wird diese Lösung mit einer Temperatur von 30° und bei einer Umgebungstemperatur von ca. 20°C ausgegossen, erstarrt das Gel bei einer Schichtdicke von 2 mm in ca. 5 min.

Im Handel sind auch Prothesen, insbesondere Gefässprothesen erhältlich, die aus einem Träger mit einer Gelschicht bestehen. Diese Gelschicht dient insbesondere dafür, die Prothese blutdicht zu machen oder ihr eine für eine Auffiltrierung von Zellen geeignete Porosität zu verleihen. Derartige Gelschichten werden in der Regel als zellschützende Schichten nicht ausreichen (siehe auch Versuchsresultate am Ende der Beschreibung), es sei denn, sie werden vor dem Auftragen der Zellen entsprechend konditioniert. Für jedes Fabrikat ist mit entsprechenden Versuchen zu prüfen, ob die Gelschicht die Funktion eines zellschützenden Mittels übernehmen kann. Es ist zu prüfen, ob die Prothese schon unkonditioniert oder erst konditioniert oder nur mit zusätzlicher Gelschicht ein genügendes Überlebensmilieu für die Zellen bietet.

Als weitere Verfahrensvariante kann Gelmaterial zusammen mit der Zellauftragung auf die Prothesenoberfläche aufgebracht werden. Das kann durch Vermischen von Zellen und Gel-Lösung und gemeinsames Auftragen erfolgen.

In einer weiteren Weise kann Gelmaterial unmittelbar vor der Zellauftragung auf eine poröse Prothese, beispielsweise auf eine Gefässprothese aufgebracht werden, indem das Gel bspw. von innen nach aussen durch die Prothese gepresst wird, gefolgt von einem Auftragen der Zellen im Inneren der Prothese, bspw. indem die Zellen unter Ausnützung der Zentrifugalkraft in einem Rotations-Verfahren auf die Prothesenoberfläche aufgebracht werden.

Wie bereits eingangs erwähnt, kann anstelle der Gelschicht oder zusätzlich zu dieser als zellschützendes Mittel eine im wesentlichen für Wasserdampf undurchlässige Membran, beispielsweise eine Kunststoffmembran verwendet werden. Diese umgibt eine Gefässprothese schlauchartig und wird vor oder nach der Aufbringung der Zellen auf die Prothese so angebracht, dass die Prothese ganz davon umgeben ist und nur die Enden für die Anschlüsse frei liegen, wodurch die Zellen weitgehend vor Austrocknung geschützt sind.

Die zellschützende, schlauchförmige Membran kann, wenn sie vor der Aufbringung der Zellen über den rohrförmigen Träger gezogen wird, auch für eine BeSchichtung einer porösen Prothese mit vitalen Zellen durch Filtration von innen nach aussen oder von aussen nach innen benützt werden, indem die Trägerwand als Filter dient und Träger und Membran als zwei konzentrisch liegende Rohre für Zu- und Abfluss angeschlossen werden.

Bei porösen Gefässprothesen hat die Membran den weiteren Vorteil, dass sie die anfängliche Blutung einschränken kann, da zwischen Membran und Prothese sich nur wenig Blut ansammeln kann, bis es zu einer Stase in der Prothesenwand kommt. Diese Wirkung kann noch verstärkt werden, wenn die Membran durch An- oder Einlagerung von thrombogenen Mitteln eine Koagulation fördert. Besteht die Membran aus einem abbaubaren Material, kann sie im Körper belassen werden. Eine Membran aus nicht abbaubarem Material soll wenige Minuten nach der ersten Durchblutung des Gefässes, beispielsweise durch Aufschneiden, entfernt werden. Zur Verhinderung von Nachblutungen kann die Membran im Körper bleiben, wenn sie nach 2 bis 3 Tagen porös wird und dann ganz abgebaut wird. Entsprechende abbaubare Materialien sind in der Chirurgie bekannt.

Statt der Kombination von Gel und Membran kann auch eine mit einem beispielsweise filzartigen Gewebe beschichtete Membran zur Anwendung kommen, wobei das filzartige Gewebe beispielsweise mit physiologischer Salzlösung getränkt wird und den vitalen Zellen als Feuchtigkeitsreservoir dienen kann. Auch ein derartiges Material muss abbaubar sein oder nach der Operation entfernt werden.

Zur Illustration der Wirkung von Gelschichten auf Prothesen folgen Beschreibung und Resultate von zwei Versuchsreihen:

Mit Versuchsresultaten des Versuches 1 soll gezeigt werden, dass verschiedene im Handel erhältliche Prothesen während einer Zeit und unter Verhältnissen, die denen einer Operation vergleichbar sind, einen grossen Teil der Feuchtigkeit verlieren, den sie durch Konditionieren anfänglich aufgenommen haben. Dadurch wird gezeigt, dass die Feuchtigkeit auf den Prothesen gegen Ende einer Operation ohne entsprechende Massnahmen für ein Überleben der Zellen nicht genügend ist. Ferner wird gezeigt, dass dieselben Prothesen erfindungsgemäss mit einer Gelschicht versehen ihre Feuchtigkeit über einen einer Operation etwa entsprechenden Zeitraum in genügendem Masse erhalten.

Mit den Versuchsresultaten der Versuchesreihe 2 wird gezeigt, dass die auf einer Prothese aufgebrachten Zellen unter einer 2 mm dicken Gelschicht eine Operation normaler Länge überleben können.

VERSUCH 1

Die folgenden Gefässprothesen wurden untersucht:

- Triaxial (Marke der Firma Vascutek, Prothese aus Dacron ohne Gel),

- Gelsoft (Marke der Firma Vascutek, Prothese aus Dacron mit abdichten dem Gel),

- Vascutek C40 und C1 (experimentelle Dacronprothesen mit poröser Gelschicht, speziell für das Auftragen der Zellen durch Filtrierung),

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- Triaxial mit Gel innen (Triaxial mit zellschützender Gelschicht auf der Innenseite),

- Triaxial mit Gel aussen (Triaxial mit zellschützender Gelschicht auf der Aussenseite).

Alle diese Prothesen haben einen textilen Aufbau und eine Wandstärke von > 0,1 mm.

Zur Durchführung des Versuches wurden je zwei Prothesenstücke (A und B) von 5 cm Länge trok-ken gewogen (Trockengewicht T), während einem Tag unter sterilen Bedingungen in physiologische Kochsalzlösung gelegt, abgetupft und wieder gewogen (Nassgewicht N). Dann wurden die Prothesenstücke in den Luftstrom einer Cleanbench (Luftstrom 0,4 m/sec) gelegt und je nach 5 Min, 15 Min, 30 Min, 1 Std, 2 Std, 4 Std und 24 Std wieder gewogen.

Die Gewichte der Prothesenstücke sind in der Tabelle 1 und in den graphischen Darstellungen der Fig. 1 und 2 dargestellt. Die Gewichte sind in Gramm aufgetragen.

Aus den Versuchsresultaten ist ersichtlich, dass alle Prothesen ohne zellschützende Schicht während 1 bis 2 Std. alles aufgenommene Wasser verlieren, während die mit einem zellschützenden Gel behandelten Prothesen eine Restfeuchtigkeit behalten. Das für die Gelsoft-Prothesen erreichte Gewicht unter dem ursprünglichen Trockengewicht hängt damit zusammen, dass bei der Konditionierung der Weichmacher ausgewaschen wurde.

Ein Wasserverlust an der Oberfläche der Prothesenstücke wirkt sich nicht sofort auf das Gewicht aus. Die Resultate zeigen aber, dass bereits nach 30 Min auch im Innern der Prothesenwand der Wassergehalt deutlich sinkt, was eine Notwendigkeit des Zellschutzes zeigt.

VERSUCH 2

Das Überleben von caninen Endothelzellen in der 4. bis 5. Passage (Endothelzellen) und von Zellen einer humanen permanenten Zellinie aus Gebärmutterhalskarzinom (HeLa-Zellen) wurden mit und ohne zellschützende Gelschicht nach dem folgenden Verfahren auf ihre Überlebensfähigkeit in einem Luftstrom von 0,4 m/sec getestet;

1. Konfluente Aussaat der Zellen in 6-Well Platten.

2. Bedecken der Zellen mit Gelschichten verschiedener Dicke nach folgendem Schema:

kein Gel trocken Gel 500 nl = 0.5 mm Gel 1000 nl =1 -0 mm Gel 2000 jxl =2.0 mm Gel 4000 fil =4.0 mm Medium für Kontrolle

3. Je eine 6-Well Platte für 15, 30, 60 und 120 Min im Cleanbench (Luftstrom 0,4 m/sec) inkubieren.

4. Nach der Inkubation das Gel durch Zugabe von warmem PBS ohne EDTA leicht auflösen und absaugen.

5. Zellen mit Trypsin ablösen und in 15ml-Röhrchen überführen. Mit PBS ohne EDTA nachspülen, zentrifugieren und Überstand abheben.

6. Blanc-Probe mit 0,5 ml PBS-EDTA versetzen und Zellzahlbestimmung mit Kristallviolett in Neubauer-Zählkammer durchführen: 20 jxl Zellsuspension mit 80 ni CV mischen, 10 Felder auszählen (entspricht 1 jxl Zellsuspension). Die Zellzahl sollte zwischen 200 000 und 500 000 Zellen pro ml liegen.

7. Alle Proben entsprechend verdünnen (mindestens 0,5 ml je Probe).

8. Proben nach folgendem Schema in eine 96-WelI Platte pipettieren (pro Well 100 nl):

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C

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G

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9. Pro Well 50 (il Fluoreszenzfarbstoff-Lösung beigeben und mischen (Fluoreszenzfarbstoff: Calzein-AM (Molecular Probes Inc. No. C-1430) in PBS ohne EDTA auf 7,5 jiM verdünnen, Endkonzentration von Calzein-AM in den Wells 2,5 |iM)

10. Inkubation bei Raumtemperatur für 45 Min.

11. Messung in Cytofluor 2350 (Millipore) bei: Filter (EX/EM) 485/530, Position B/B, Sensitivität 4 (ev,

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Die Tabellen und Graphiken der Fig. 3 und 4 zeigen die Versuchsresultate, Fig. 3 für Endothelzellen, Fig. 4 für HeLa-Zellen. Auf der Ordinate sind die überlebenden Zellen als Prozente der eingesetzten Zellen, auf der Abszisse die Dicke der Gelschicht, bzw. Dauer der Exposition im Luftstrom aufgetragen. Der Versuch ist repräsentativ.

Die Durchführung einer Anastomose dauert etwa 10 bis 15 Min. Die Daten zeigen, dass in dieser Zeit weniger als ein Drittel der Zellen ohne Schutzmassnahmen überleben. Eine Schicht von 2 mm Gelatinegel ermöglicht dagegen ein Überleben der Zellen bei einem Luftstrom von 0,4m/sec während 2 Stunden. Dies sind vermutlich Bedingungen wie sie bei einer Operation nicht auftreten. Die 2 mm Gelschicht bietet also einen weitgehenden Schutz für die Zellen bei der Implantation der Prothesen.

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von Endoprothesen, wobei auf einen vorgeformten künstlichen oder biologischen Träger körpereigene, vitale Zellen aufgebracht werden, dadurch gekennzeichnet, dass zum Schutze der lebenden Zellen gegen Feuchtigkeitsverlust wenigstens diejenigen Bereiche des vorgeformten Trägers, auf denen lebende Zellen aufgebracht werden, zusätzlich mit einem zellschützenden Mittel versehen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgeformte Träger gleichzeitig mit oder nach dem Auftragen der vitalen Zellen mit einem zellschützenden Mittel versehen wird, dadurch dass er mit einer zu einem Gel erstarrenden Flüssigkeit behandelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung der zu einem Gel erstarrenden Flüssigkeit Gelatine für Plasma-Ersatz und eine biologische Salzlösung verwendet werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die zu einem Gel erstarrende Flüssigkeit Fibrinogen, Plasma oder Bestandteile der extracellulären Matrix enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zu einem Gel erstarrende Flüssigkeit zwischen 10 und 20% Gelatine enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der zu einem Gel erstarrenden Flüssigkeit Nährstoffe für die Zellen zugesetzt werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Prothese nach Aufbringen der vitalen Zellen in eine zu einem Gel erstarrende Flüssigkeit getaucht und solange darin belassen wird, bis das Gel erstarrt ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine berechnete Menge der zu einem Gel erstarrenden Flüssigkeit auf die Oberfläche der Prothese gebracht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Prothese rohrför-mig ist und die zu einem Gel erstarrende Flüssigkeit in das Rohrinnere gegeben wird und die Prothese während dem Gelieren rotiert wird.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Prothese rohrförmig ist und dass sie für das Aufbringen der Gelschicht in ein Rohr gezogen wird, in dem durch Rotation oder durch Platzhalter dafür gesorgt ist, dass der Abstand zwischen Prothese und Rohr überall derselbe ist.

11. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der vorgeformte künstliche oder biologische Träger porös ist und gleichzeitig mit einer Suspension, die die vitalen Zellen enthält, und mit einer zu einem Gel erstarrenden Flüssigkeit behandelt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der gelierenden Flüssigkeit Antikoagulanzien beigegeben werden.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der gelierenden Flüssigkeit blutstillend wirkende Substanzen beigegeben werden.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Prothese wenigstens bereichsweise mit einer für Wasserdampf im wesentlichen undurchlässigen Membran als zellschützendem Mittel bedeckt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass als wasserdampfundurchlässige Membran eine Kunststoffmembran verwendet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserdampfundurchlässige Membran vor oder nach dem Auftragen der Zellen auf der Prothese angebracht wird.

17. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung einer Gefässprothese ein rohrförmiger, poröser Träger in einen Schlauch aus einer wasserdampfundurchlässigen Membran positioniert wird und dass anschliessend zwischen Membran und Träger eine Suspension mit vitalen Zellen gefördert und durch das Lumen des Trägers abgesaugt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 2 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass der direkt mit dem Blut oder mit Lymphe in permanentem Kontakt stehende Protheseteil mit einem zellschützenden Mittel versehen wird.

19. Endoprothese, bestehend aus einem vorgeformten, künstlichen oder biologischen Träger und darauf aufgetragenen, lebenden Zellen, hergestellt nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein den lebenden Zellen zugeordnetes, zellschützendes Mittel aufweist.

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

CH 683 747 A5

20. Endoprothese gemäss Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das zellschützende Mittel eine die Zellen gegen eine äussere Umgebung abdeckende Gelschicht ist.

21. Endoprothese nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das zellschützende Mittel eine die Zellen gegen eine äussere Umgebung abdeckende im wesentlichen für Wasserdampf undurchlässige Membran ist.

22. Endoprothese nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Prothese eine rohrförmige, poröse Gefässprothese ist und dass sie von der Membran schlauchförmig umgeben ist.

23. Endoprothese nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das zellschützende Mittel eine Kombination einer Gel-Schicht und einer im wesentlichen für Wasserdampf undurchlässigen Membran ist.

24. Endoprothese nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das zellschützende Mittel aus einem im Körper schadlos abbaubaren Material besteht.

8

Triaxiat

Gelsoft

C40

C1

Triaxial Gei innen

Triaxial Gel aussen

min.

A |

B

A

B

A

B

A |

B

A

B

A

B

Trockengewicht

T

0.528

0.510

0.938

1.075

0.414

0.416

0.381

0.380

0.748

0.729

0.736

0.722

Nassgewicht

N

0.896

0.866

1.586

1.715

0.782

0.805

0.739

0.705

1.750

1.700

1.820

1.856

nach 5 Min.

5

0.865

0.839

1.547

1.672

0.755

0.786

0.724

0.693

1.608

1.629

1.676

1.800

nach 15 Min.

15

0.826

0.800

1.448

1.617

0.711

Ö.723

0.690

0.644

1.552

1.580

1.635

1.785

nach 30 Min.

30

0.770

0.724

1.367

1.490

0.624

0.662

0.627

0.577

1.329

1.395

1.456

1.614

nach 60 Min.

60

0.640

0.543

1.173

1.304

0.505

0.512

0.479

0.384

1.164

1.225

1.246

1.418

nach 120 Min.

120

0.531

0.513

0.782

0.976

0.415

0.420

0.386

0.383

0.897

0.907

0.921

1.013

nach 4 Std.

240

0.532

6.514

0.589

0.699

0.418

0.423

0.385

0.384

0.893

0.880

0.859

0.891

nach 24 Std.

1440

0.532

0.513

0.593

0.696

0.416

0.420

0.384

0.380

0.895

0.880

0.858

! 0.876

o

X

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01

Tabelle 1