DE19960106A1

DE19960106A1 - Enzyme und Gene für die Herstellung von Vanillin

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Publication number: DE19960106A1
Application number: DE19960106A
Authority: DE
Inventors: Juergen Rabenhorst; Alexander Steinbuechel; Horst Priefert; Sandra Achterholt
Original assignee: Haarmann and Reimer GmbH
Current assignee: Haarmann and Reimer GmbH
Priority date: 1999-12-14
Filing date: 1999-12-14
Publication date: 2001-06-21
Also published as: EP1240336A2; CA2394140A1; WO2001044480A3; JP2003520580A; US20030092143A1; WO2001044480A2; AU2839401A

Abstract

Enzyme aus Amycolatopsis sp. HR167 (DSMZ 9992) können für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure eingesetzt werden. Für diese Enzyme codierende DNA sowie mit dieser DNA transformierte Wirtszellen können für die Produktion von Vanillin eingesetzt werden.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Enzyme für die Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure, deren Verwendung bei der Herstellung von Vanillin, für diese Enzyme codierende DNA sowie mit dieser DNA transformierte Wirtszellen.

In der EP A 0 583 687 wird die Herstellung substituierter Methoxyphenole mit einer neuen Pseudomonas sp. beschrieben. Ausgangsmaterial ist hier Eugenol und die erhaltenen Endprodukte sind Ferulasäure, Vanillinsäure, Coniferylalkohol und Coniferylaldehyd.

Aus "Biocatalytic transformation of ferulic acid: an abundant aromatic natural product; J. Ind. Microbiol. 15: 457-471" sind die Biotransformationsmöglichkeiten mit Ferulasäure bekannt.

Die Gene und Enzyme zur Synthese von Coniferylalkohol, Coniferylaldehyd, Ferula säure, Vanillin und Vanillinsäure aus Pseudomonas sp. wurden in EP-A 0 845 532 beschrieben.

Die Enzyme zur Umsetzung von trans-Ferulasäure zu trans-Feruloyl-SCoA Ester und weiter zum Vanillin, sowie das Gen für die Spaltung des Esters aus Pseudomonas fluorescens werden in WO 97/35999, J. Biol. Chem. 273: 4163-4170 und Microbiology 144: 1397-1405 beschrieben.

In EP A 97 110 010 und in Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 456-461 wird ein Prozess für die Produktion von Vanillin mit Streptomyces setonii beschrieben.

In der DE A 198 50 242 wird die Konstruktion von Produktionsstämmen für die Herstellung von substituierten Phenolen durch gezielte Inaktivierung von Genen des Eugenol- und Ferulasäure-Katabolismus beschrieben.

Die DE-A 195 32 317 beschreibt die fermentative Gewinnung von Vanillin aus Ferulasäure mit Amycolatopsis sp. in hohen Ausbeuten.

Es wurden Enzyme aus Amycolatopsis sp. HR167 (DSMZ 9992) für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure gefunden.

Die Enzyme wurden isoliert und charakterisiert.

Enzyme gemäß der Erfindung sind solche, welche zumindest die Aktivität einer Feruloyl-CoA Synthetase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise 80%ige Identität, besonders bevorzugt 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30, fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen, sowie solche, welche die Aktivität einer Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase ausüben und eine Aminosäurese quenz umfassen, die eine zumindest 70%ige Identität, vorzugsweise 80%ige Identi tät, besonders bevorzugt 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Aminosäuren und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.

Der Grad der Identität der Aminosäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standard einstellungen (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).

Der Ausdruck "Enzyme", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Proteine, die durch die oben beschriebene Funktionalität charakterisiert sind. Er umfasst Amino säureketten, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozes sierung, oder durch an sich bekannte chemische Verfahren modifiziert sein können.

Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in einem Polypeptid vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an der Amino säure-Seitenkette, am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen bei spielsweise Acetylierungen, Äcylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid- Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten oder Phophatidylinositol, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbildungen, Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycosylierungen, Hydroxylierungen, Iodierungen, Methylierungen, Myristoylierungen, Oxidationen, proteolytische Prozessierungen, Phosphorylierungen, Selenoylierungen und tRNA-vermittelte Additionen von Aminosäuren.

Die erfindungsgemäßen Enzyme können in der Form "reifer" Proteine oder als Teile größerer Proteine, z. B. als Fusionsproteine, vorliegen. Weiterhin können sie Sezer nierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder zusätzliche stabilisieren de Aminosäuren aufweisen.

Enzyme, die im Vergleich zu der Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase, die aus den erfindungsgemäßen Enzymen mit einer Amino säuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 bestehen, eine um 50% höhere oder verminderte Aktivität ausüben, werden noch als erfindungsgemäß betrachtet.

Die erfindungsgemäßen Enzyme können im Vergleich zu der entsprechenden Region natürlich vorkommender Feruloyl-CoA Synthetasen und der Enoyl-CoA Hydrata sen/Aldolasen Deletionen oder Aminosäuresubstitutionen aufweisen, solange sie zumindest noch eine biologische Aktivität der vollständigen Enzyme ausüben. Konservative Substitutionen sind bevorzugt. Solche konservativen Substitutionen umfassen Variationen, wobei eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure aus der folgenden Gruppe ersetzt wird:

1. Kleine aliphatische, nicht-polare oder wenig polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly;
2. Polare, negativ geladene Reste und deren Amide: Asp, Asn, Glu und Gln;
3. Polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys;
4. Große aliphatische, nicht-polare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys; und
5. Aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.

Die folgende Liste zeigt bevorzugte konservative Substitutionen

Ursprünglicher Rest
Substitution
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gln, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gln
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gln, Glu
Met	Leu, Tyr, Ile
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Nukleinsäuren, die für die erfin dungsgemäßen Enzyme codieren.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich insbesondere um einzel strängige oder doppelsträngige Desoxyribonukleinsäuren (DNA) oder Ribonuklein säuren (RNA). Bevorzugte Ausführungsformen sind Fragmente genomischer DNA, die Introns enthalten können, und cDNAs.

Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren stellen cDNAs dar, welche eine Nukleotidsäuresequenz gemäß SEQ ID NO 1 besitzen.

Nukleinsäuren, welche unter stringenten Bedingungen an die Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 1 hybridisieren, sind ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.

Der Ausdruck "hybridisieren", wie er hierin verwendet wird, beschreibt den Vor gang, bei welchem ein einzelsträngiges Nukleinsäuremolekül mit einem komplemen tären Strang eine Basenpaarung eingeht. Auf diese Weise können ausgehend von der hierin offenbarten Sequenzinformation beispielsweise DNA-Fragmente aus anderen Organismen isoliert werden, welche für Enzyme mit der Aktivität von Feruloyl-CoA Synthetasen und/oder Enoyl-CoA Hydratasen/Aldolasen codieren.

Weiterhin sind von der vorliegenden Erfindung Nukleinsäuren umfasst, die eine zu mindest 70%ige Identität, vorzugsweise 80%ige Identität, besonders bevorzugt 90%ige Identität, ganz besonders bevorzugt 95%ige Identität, mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20, vorzugsweise wenigstens 25, besonders bevorzugt wenigstens 30 fortlaufenden Nukleotide und ganz besonders bevorzugt über deren Gesamtlängen aufweisen.

Der Grad der Identität der Nukleinsäuresequenzen wird vorzugsweise bestimmt mit Hilfe des Programms GAP aus dem Programmpaket GCG, Version 9.1 unter Standard einstellungen (Nucleic Acids Research 12, 387 (1984).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin DNA-Konstrukte, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure und einen heterologen Promotor umfassen.

Der Ausdruck "heterologer Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Promotor, der andere Eigenschaften als derjenige Promotor aufweist, der im Ursprungsorganismus die Expression des betreffenden Gens kontrolliert. Der Aus druck "Promotor", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich allgemein auf Expres sionskontrollsequenzen.

Die Auswahl von heterologen Promotoren ist davon abhängig, ob zur Expression pro- oder eukaryotische Zellen oder zellfreie Systeme verwendet werden. Beispiele für heterologe Promotoren sind das lac-System, das trp-System, die Haupt-Operator- und Promotorregionen des Phagen lambda, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, der Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase, der frühe oder späte Promotor des SV40, des Adenovirus oder des Cytomegalovirus, der Promotor der Sauren Phosphatase und der Promotor des α-Mating-Faktors der Hefe.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt enthalten. Als Vektoren können alle in molekularbiologischen Laboratorien verwendete Plasmide, Phasmide, Cosmide, YACs oder künstliche Chromosomen verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Wirtszellen, die eine erfindungs gemäße Nukleinsäure, ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt oder einen erfin dungsgemäßen Vektor enthalten.

Der Ausdruck "Wirtszelle", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Zellen, die natürlicherweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren nicht enthalten.

Als Wirtszellen eignen sich sowohl prokaryotische Zellen, wie Bakterien der Gattungen Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, vorzugsweise E. coli, als auch eukaryotische Zellen, wie Hefen der Gattungen Saccharomyces, Candida, Pichia, filamentöse Pilze der Gattungen Aspergülus, Penicillium, oder Pflanzenzellen oder ganze Pflanzen verschiedener Gattungen, wie Nicotiana, Solanum, Brassica, Beta, Capsicum und Vanilla.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Enzyme. Zur Herstellung der Enzyme, die von den erfindungs gemäßen Nukleinsäuren codiert werden, können Wirtszellen, die eine der erfin dungsgemäßen Nukleinsäuren enthalten, unter geeigneten Bedingungen kultiviert werden. Dabei kann die zu exprimierende Nukleinsäure an die "Codon Usage" der Wirtszellen angepaßt werden. Die gewünschten Enzyme können danach auf übliche Weise aus den Zellen oder dem Kulturmedium isoliert werden. Die Enzyme können auch in in vitro-Systemen hergestellt werden.

Ein schnelles Verfahren zum Isolieren der erfindungsgemäßen Enzyme, die von Wirtszellen unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure synthetisiert werden, beginnt mit der Expression eines Fusionsproteins, wobei der Fusionspartner auf einfache Weise affnitätsgereinigt werden kann. Der Fusionspartner kann beispielsweise Glutathion S-Transferase sein. Das Fusionsprotein kann dann an einer Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der Fusionspartner kann durch partielle proteolytische Spaltung beispielsweise an Linkem zwischen dem Fusionspartner und dem zu reinigenden erfindungsgemäßen Polypeptid abgetrennt werden. Der Linker kann so gestaltet werden, dass er Ziel-Aminosäuren, wie Arginin- und Lysin-Reste einschließt, die Stellen für eine Spaltung durch Trypsin definieren. Um solche Linker zu erzeugen, können Standard-Klonierungsverfahren unter Verwendung von Oligo nukleotiden angewendet werden.

Weitere mögliche Reinigungsverfahren basieren auf präparativer Elektrophorese, FPLC, HPLC (z. B. unter Anwendung von Gelitrations-, Reversphasen- oder leicht hydrophoben Säulen), Gelitration, differentieller Präzipitation, Ionenaustausch- Chromatographie und Affinitätschromatographie.

Die Ausdrücke "Isolierung oder Reinigung", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, dass die erfindungsgemäßen Enzyme von anderen Proteinen oder anderen Makromolekülen der Zellen abgetrennt werden. Vorzugsweise ist eine die erfin dungsgemäßen Enzyme enthaltende Zusammensetzung hinsichtlich des Proteingehalts gegenüber einer Präparation aus den Wirtszellen mindestens 10-fach und besonders bevorzugt mindestens 100-fach angereichert.

Die erfindungsgemäßen Enzyme können auch ohne Fusionspartner mit Hilfe von Antikörpern, die an die Enzyme binden, affinitätsgereinigt werden.

Ferner sind auch Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auf die übliche Weise hergestellt werden. Beispielsweise können die Nuklein säuremoleküle vollständig chemisch synthetisiert werden. Man kann auch nur kurze Stücke der erfindungsgemäßen Sequenzen chemisch synthetisieren und solche Oligo nukleotide radioaktiv oder mit einem Fluoreszenzfarbstoff markieren. Die markierten Oligonukleotide können verwendet werden, um ausgehend von Bakterien oder Pflanzen-mRNA hergestellte cDNA-Banken oder ausgehend von genomischer Bakte rien oder Pflanzen-DNA hergestellte genomische Banken zu durchsuchen. Klone, an die die markierten Oligonukleotide hybridisieren, werden zur Isolierung der betreffen den DNA ausgewählt. Nach der Charakterisierung der isolierten DNA erhält man auf einfache Weise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können auch mittels PCR-Verfahren unter Ver wendung chemisch synthetisierter Oligonukleotide hergestellt werden.

Der Ausdruck "Oligonukleotid(e)", wie er hierin verwendet wird, bedeutet DNA- Moleküle, die aus 10 bis 50 Nukleotiden, vorzugsweise 15 bis 30 Nukleotiden, be stehen. Sie werden chemisch synthetisiert und können als Sonden verwendet werden.

Ebenso betrifft die Erfindung die einzelnen Herstellungsschritte der Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure:

a) das Verfahren zur Herstellung von Feruloyl-CoenzymA aus Ferulasäure, das in Anwesenheit von Feruloyl-CoA Synthetase stattfindet;
b) das Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-β-hydroxy propionyl CoenzymA aus Feruloyl-CoenzymA, das in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet;
c) das Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl- β-hydroxypropionyl-CoenzymA, das in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.

Die oben genannten Herstellungsverfahren basieren auf den genannten isolierten Enzymen oder Zellextrakten, die die genannten Enzyme enthalten.

Ebenso betrifft die Erfindung Herstellungsverfahren basierend auf Wirtszellen enthaltend die oben genannten Gene und Wirtszellen transformiert mit der genannten DNA bzw. den genannten Vektoren.

Bevorzugtes Substrat für die Herstellung von Vanillin mit den oben genannten Wirtszellen ist Ferulasäure. Jedoch kann der Zusatz weiterer Substrate oder sogar der Austausch der Ferulasäure gegen ein anderes Substrat möglich sein.

Als Nährmedium für die erfindungsgemäß eingesetzten Wirtszellen kommen syn thetische, halbsynthetische oder komplexe Kulturmedien in Betracht. Diese können kohlenstofthaltige und stickstoffhaltige Verbindungen, anorganische Salze, gegeben enfalls Spurenelemente sowie Vitamine enthalten.

Als kohlenstoffhaltige Verbindungen können Kohlenhydrate, Kohlenwasserstoffe oder organische Grundchemikalien in Betracht kommen. Beispiele für vorzugsweise verwendbare Verbindungen sind Zucker, Alkohole bzw. Zuckeralkohole, organische Säuren oder komplexe Gemische.

Als Zucker kommt vorzugsweise Glucose in Betracht. Als organische Säuren können vorzugsweise Zitronensäure oder Essigsäure zum Einsatz kommen. Zu den kom plexen Gemischen zählen z. B. Malzextrakt, Hefeextrakt, Casein oder Caseinhydro lysat.

Als stickstoffhaltige Substrate kommen anorganische Verbindungen in Betracht. Bei spiele hierfür sind Nitrate und Ammoniumsalze. Ebenso können organische Stick stoffquellen zum Einsatz kommen. Hierzu zählen Hefeextrakt, Sojamehl, Casein, Caseinhydrolysat und Maisquellwasser.

Zu den einsetzbaren anorganischen Salzen zählen beispielsweise Sulfate, Nitrate, Chloride, Carbonate und Phosphate. Als Metalle enthalten die genannte Salze vor zugsweise Natrium, Kalium, Magnesium, Mangan, Calcium, Zink und Eisen.

Die Temperatur für die Kultivierung liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 100°C. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 15 bis 60°C, höchst bevorzugt sind 22 bis 45°C.

Der pH-Wert des Mediums beträgt bevorzugt 2 bis 12. Besonders bevorzugt ist der Bereich von 4 bis 8.

Grundsätzlich können für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens alle dem Fachmann bekannten Bioreaktoren eingesetzt werden. Vorzugsweise kommen alle für Submersverfahren geeigneten Vorrichtungen in Betracht. Das heißt, es kön nen erfindungsgemäß Gefäße ohne oder mit mechanischer Mischeinrichtung einge setzt werden. Zu ersteren zählen z. B. Schüttelapparaturen, Blasensäulen- oder Schlaufenreaktoren. Zu letzteren gehören vorzugsweise alle bekannten Vorrichtun gen mit Rührern in beliebiger Gestaltung.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann kontinuierlich oder diskontinuierlich durch geführt werden. Die Dauer der Fermentation bis zum Erreichen einer maximalen Produktmenge hängt von der speziellen Art der eingesetzten Wirtszellen ab. Grund sätzlich liegen die Zeiten der Fermentation jedoch zwischen 2 und 200 Stunden.

Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von Vanillin aus Ferulasäure mit beliebi gen Wirtszellen.

Beispiele Vorgehensweise

Von dem Ferulasäure verwertenden Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurden nach NMG-Mutagenese Mutanten erhalten, die Defekte in einzelnen Schritten des Ferula säure-Katabolismusses aufwiesen. Ausgehend von partiell EcoRI-verdauter Gesamt- DNA des Amycolatopsis sp. HR167 Wildtyps wurde eine Genbank in dem Cosmid pVK100 angelegt, welches über ein breites Wirtsspektrum verfügt und auch in Pseudomonaden stabil repliziert wird. Die Hybridcosmide wurden nach Verpackung in λ-Phagenpartikel nach Escherichia coli S17-1 transduziert. Die Genbank umfaßte 5000 rekombinante E coli S17-1 Klone. Das Hybridcosmid eines jeden Klons wurde konjugativ in zwei Ferulasäure-negative Mutanten (Mutanten 5K6167 und SK6202) des Stammes Pseudomonas sp. HR199 übertragen und auf eine mögliche Fähigkeit zur Komplementation überprüft. Dabei wurden die Hybridcosmide pVKI-1, pVK12-1, pVK15-1 identifiziert, deren Erhalt die Mutanten SK6167 und SK6202 wieder in die Lage versetzten Ferulasäure zu verwerten.

Die komplementierende Eigenschaft der Plasmide pVK1-1, pVK12-1, pVK15-1 konnte auf ein 20 kbp EcoRI-Fragment (E200) zurückgeführt werden. Auf einem 4 kbp PstI-Subfragment (P40) wurden die Gene fcs und ech lokalisiert, die für die Feruloyl-CoA Synthetase und Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase codieren.

Durch Expression dieser Gene waren rekombinante Stämme von E coli XL1-Blue in der Lage Ferulasäure in Vanillin zu überführen.

Material und Methoden

Wachstumsbedingungen der Bakterien. Stämme von Escherichia coli wurden bei 37°C in Luria-Bertani (LB) oder M9-Mineralmedium (Sambrook, J. E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.) angezogen. Stämme von Pseudomonas sp. wurden bei 30°C in Nutrient Broth (NB, 0,8%, wt/vol) oder in Mineralmedium (MM) (Schlegel, H. G. et al. 1961. Arch. Mikrobiol. 38: 209-222) angezogen. Stämme von Amycolatopsis sp. wurden bei 42°C in Hefeextrakt-Malz extrakt-Glucose-Medium (YMG, Hefeextrakt 0,4%, wt/vol, Malzextrakt 1%, wt/vol, Glucose 0,4%, wdvol, pH 7,2) angezogen. Ferulasäure, Vanillin, Vanillin säure und Protocatechusäure wurden in Dimethylsulfoxid gelöst, und dem jeweiligen Medium in einer Endkonzentratien von 0,1% (wt/vol) zugesetzt. Bei der Anzucht von Transkonjuganten von Pseudomonas sp. wurden Tetracyclin und Kanamycin in Endkonzentrationen von 25 µg/ml bzw. 300 µg/ml eingesetzt.

Nitrosoguanidin-Mutagenese. Die Nitrosoguanidin-Mutagenese von Pseudomonas sp. HR199 wurde mit Modifikationen nach Miller (Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.) durchgeführt. An Stelle des Citrat-Puffers kam Kalium-Phosphat (KP)-Puffer (100 mM, pH 7,0) zum Einsatz. Die Endkonzentration von N-Methyl-N'-Nitro-N- Nitrosoguanidin betrug 200 µg/ml. Die erhaltenen Mutanten wurden hinsichtlich des Verlustes der Fähigkeit Ferulasäure als Wachstumssubstrate nutzen zu können ge screent.

Qualitativer und quantitativer Nachweis von Stoffwechselintermediaten in Kultur überständen. Kulturüberstände wurden direkt, bzw. nach Verdünnung mit H₂O- bidest. mittels Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie (Knauer-HPLC) analysiert. Die Chromatographie erfolgte an Nucleosil-100 C18 (7 µm; 250 × 4 mm). Als Lösungsmittel diente 0,1% (vol/vol) Ameisensäure und Acetonitril. Der verwendete Gradient zur Elution der Substanzen verlief wie folgt.
00:00-06:30 → 26% Acetonitril
06:30-08:00 → 100% Acetonitril
08:00-12:00 → 100% Acetonitril
12:00-13:00 → 26% Acetonitril
13:00-18:00 → 26% Acetonitril

Bestimmung der Feruloyl-CoA-Synthetase (Ferulasäure-Thiokinase)-Aktivität. Die Bestimmung der FCS-Aktivität erfolgte bei 30°C durch einen optisch enzymatischen Test, modifiziert nach Zenk et al. (Zenk et al. 1980. Anal. Biochem. 101: 182-187). Der Reaktionsansatz mit einem Volumen von 1 ml enthielt 0,09 mmol Kalium-Phos phat (pH 7,0), 2,1 mmol MgCl₂, 0,7 mmol Ferulasäure, 2 mmol ATP, 0,4 mmol Coenzym A und Enzymlösung. Die Entstehung des CoA-Esters aus Ferulasäure wurde bei λ = 345 nm verfolgt (ε = 10 cm²/mmol). Die Enzymaktivität wurde in Einheiten (U) angegeben, wobei 1 U der Enzymmenge entspricht, die 1 mmol Substrat pro Minute umsetzt. Die Proteinkonzentrationen in den Proben wurden nach Lowry et al. (Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall. 1951. J. Biol. Chem. 193: 265-275) bestimmt.

Elektrophoretische Methoden. Die Auftrennung von proteinhaltigen Extrakten erfolgte unter denaturierenden Bedingungen in 11,5% (wt/vol) Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli (Laemmli, U. K. 1970. Nature (London) 227: 680- 685). Zur unspezifischen Proteinfärbung wurde Serva Blue R verwendet.

Transfer von Proteinen aus Polyacrylamidgelen auf PVDF-Membranen. Proteine wurden aus SDS-Polyacrylamidgelen mit Hilfe eines Semidry-Fastblot Gerätes (B32/33, Biometra, Göttingen, Deutschland) nach Herstellerangaben auf PVDF- Membranen (Waters-Millipore, Bedford, Mass., USA) übertragen.

Bestimmung von Nterminalen Aminosäuresequenzen. Die Bestimmung von N- terminalen Aminosäuresequenzen erfolgte mit Hilfe eines Protein Peptide Sequenzers (Typ 477 A, Applied Biosystems, Foster City, USA) und eines PTH- Analysers nach Herstellerangaben.

Isolierung und Manipulation von DNA. Die Isolierung von genomischer DNA er folgte nach der Methode von Marmur (Marmur, J. 1961. J. Mol. Biol. 3: 208-218). Die Isolierung und Analyse von Plasmid-DNA bzw. von DNA-Restriktionsfrag menten, die Verpackung von Hybridcosmiden in λ-Phagenpartikel und die Trans duktion von E. coli erfolgten nach Standardmethoden (Sambrook, J., E. F. Fritsch und T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York.).

Transfer von DNA. Präparation und Transformation von kompetenten Escherichia coli-Zellen erfolgten nach der Methode von Hanahan (Hanahan, D. 1983. J. Mol. Biol. 166: 557-580). Konjugativer Plasmidtransfer zwischen Plasmid-tragenden Escherichia coli S17-1-Stämmen (Donor) und Pseudomonas sp.-Stämmen (Rezipient) erfolgte auf NB-Agarplatten nach der Methode von Friedrich et al. (Friedrich, B. et al. 1981. J. Bacteriol. 147: 198-205), oder durch eine "Mini komplementations-Methode" auf MM-Agarplatten mit 0,5% (wt/vol) Gluconat als C-Quelle und 25 µg/ml Tetracyclin oder 300 µg/ml Kanamycin. Dabei wurden Zellen des Rezipienten in einer Richtung als Impfstrich aufgetragen. Nach 5 min wurden dann Zellen der Donor-Stämme als Impfstriche aufgetragen, wobei der Rezipienten-Impfstrich gekreuzt wurde. Nach einer Inkubation für 48 h bei 30°C wuchsen die Transkonjuganten direkt hinter der Kreuzungsstelle, wohingegen weder Donor- noch Rezipienten-Stamm zum Wachstum in der Lage war.

DNA-Sequenzierung. Die Bestimmung von Nukleotidsequenzen erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruch-Methode von Sanger et al. (Sanger et al. 1977. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) mit einem "LI-COR DNA-Sequencer Modell 4000L" (LI-COR Inc., Biotechnology Division, Lincoln, NE, USA) unter Verwendung eines "Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza- dGTP" (Amersham Life Science, Amersham International pls, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) jeweils nach Vorschrift des Herstellers bestimmt.

Mit Hilfe von synthetischen Oligonukleotiden wurden nach der "Primer-hopping Strategie" von Strauss et al. (Strauss, E. C. et al. 1986. Anal. Biochem. 154: 353-360) beide DNA-Stränge sequenziert.

Chemikalien, Biochemikalien und Enzyme. Restriktionsenzyme, T4 DNA-Ligase, Lambda-DNA und Enzyme bzw. Substrate für die optisch enzymatischen Tests wurden von C. F. Boehringer & Söhne (Mannheim, Deutschland) oder von GIBCO/BRL (Eggenstein, Deutschland) bezogen. Agarose vom Typ NA wurde von Pharmacia-LKB (Uppsala, Schweden). Alle anderen Chemikalien waren von Haarmann & Reimer (Holzminden, Deutschland), E. Merck AG (Darmstadt, Deutschland), Fluka Chemie (Buchs, Schweiz), Serva Feinbiochemica (Heidelberg, Deutschland) oder Sigma Chemie (Deisenhofen, Deutschland).

Beispiel 1 Isolierung von Mutanten des Stammes Pseudomonas sp. HR199 mit Defekten im Ferulasäure-Katabolismus

Der Stamm Pseudomonas sp. HR199 wurde einer Nitrosoguanidin-Mutagenese unterzogen mit dem Ziel Mutanten mit Defekten im Ferulasäure-Katabolismus zu isolieren. Die erhaltenen Mutanten wurden bezüglich ihres Vermögens Ferulasäure und Vanillin als C- und Energiequelle nutzen zu können klassifiziert. Die Mutanten SK6167 und SK6202 waren nicht mehr in der Lage Ferulasäure als C- und Energie quelle zu nutzen, vermochten jedoch wie der Wildtyp Vanillin zu verwerten. Die o. g. Mutanten kamen bei Konjugationsexperimenten als Rezipienten der Genbank von Amycolatopsis sp. HR167 zum Einsatz.

Beispiel 2 Anlegen einer Amycolatopsis sp. HR167 Genbank im Cosmidvektor pVK100

Die genomische DNA des Stammes Amycolatopsis sp. HR167 wurde isoliert und einer partiellen Restriktionsverdauung mit EcoRI unterzogen. Die so erhaltene DNA- Präparation wurde mit EcoRI-geschnittenem Vektor pVK100 ligiert. Die DNA- Konzentrationen lagen dabei relativ hoch, um die Entstehung konkatemerer Liga tionsprodukte zu forcieren. Die Ligationsansätze wurden in λ-Phagenpartikel ver packt, mit denen anschließend E. coli S17-1 transduziert wurde. Die Selektion der Transduktanten erfolgte auf Tetracyclin-haltigen LB-Agarplatten. Auf diese Weise wurden 5000 Transduktanten erhalten, die über unterschiedliche Hybridcosmide verfügten.

Beispiel 3 Identifizierung von Hybridcosmiden, die essentielle Gene des Ferulasäure-Katabo lismus beherbergen

Die Hybridcosmide der 5000 Transduktanten wurden durch ein Minikomplemen tations-Verfahren konjugativ in die Mutanten SK6167 und SK6202 übertragen. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden auf MM-Platten mit Ferulasäure bezüglich ihres Vermögens wieder auf Ferulasäure wachsen zu können (Komplementation der Mutanten) untersucht. Die Mutanten SK6167 und SK6202 wurde durch den Erhalt der Hybridcosmide pVK1-1, pVK12-1, pVK15-1 komplementiert. Die komplemen tierende Eigenschaft war auf ein 20 kbp EcoRI-Fragment zurückzuführen.

Beispiel 4 Analyse des 20 kbp EcoRI-Fragments (E200) des Hybridcosmids pVK1-1

Das Fragment E200 wurde präparativ aus dem mit EcoRI-verdautem Hybridcosmid pVK1-1 isoliert und mit EcoRI-verdauter pBluescript SK^- DNA ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli XL1-Blue transformiert. Nach "Blau-Weiß"-Selektion auf X-Gal und IPTG enthaltenden LB-Tc-Amp-Agarplatten wurden "weiße" Trans formanden erhalten, deren Hybridplasmid pSKE200 das Fragment E200 kloniert ent hielten. Mit Hilfe dieses Plasmids und durch Einsatz unterschiedlicher Restriktions enzyme wurde eine physikalische Karte des Fragments E200 angefertigt.

Der die Mutanten SK6167 und SK6202 komplementierende Bereich wurde durch Klonierung von Subfragmenten von E200 in den Vektoren pVK101 und pMP92, die beide über ein weites Wirtsspektrum verfügen und auch in Pseudomonaden stabil sind, mit anschließender konjugativer Übertragung in die Mutanten SK6167 und SK6202 auf ein 4 kbp PstI-Subfragment (P40) eingegrenzt. Nach Klonierung dieses Fragments in pBluescript SK^- wurde die Nukleotidsequenz bestimmt, wobei die Gene fcs und ech identifiziert wurden, die für die Feruloyl-CoA Synthetase und Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase codieren. Das fcs Genprodukt von 491 Aminosäuren wies eine 35%ige Identität (über einen Bereich von 491 Aminosäuren) mit dem fadD13 Genprodukt aus Mycobacterium tuberculosis (Cole et al. 1998. Nature 393: 537-544) auf. Das ech Genprodukt von 287 Aminosäuren wies eine 62%ige Identität (über einen Bereich von 267 Aminosäuren) mit der p-hydroxycinnamoyl CoA hydratase/lyase aus Pseudomonas fluorescens (Gasson et al. 1998. Metabolism of ferulic acid to vanillin. J. Biol. Chem. 273: 4163-4170) auf.

Beispiel 5 Heterologe Expression von Genen des Ferulasäure-Katabolismus aus Amycolatopsis sp. HR167 in Escherichia coli

Das 4 kbp PstI-Subfragment (P40) wurde präparativ aus dem mit PstI-verdautem Hybridplasmid pSKE200 isoliert und mit PstI-verdauter pBluescript SK^- DNA ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde E. coli XL1-Blue transformiert. Nach "Blau- Weiß"-Selektion auf X-Gal und Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) enthal tenden LB-Tc-Amp-Agarplatten wurden "weiße" Transformanden erhalten, deren Hybridplasmid pSKP40 das Fragment P40 kloniert enthielten. Die rekombinanten Stämme von E. coli XL1-Blue wiesen eine Feruloyl-CoA Synthetase Aktivität von 0,54 U/mg Protein auf.

Beispiel 6 Biotransformation von Ferulasäure zu Vanillin mit ruhenden Zellen des rekombinanten Stammes von Escherichia coli XL1-Blue (pSKP40), der das fcs und ech Gen aus Amycolatopsis sp. HR167 exprimiert

E. coli XL1-Blue (pSKP40) wurde in 50 ml LB-Medium mit 12,5 µg/ml Tetracyclin und 100 µg/ml Ampicillin bei 37°C für 24 h kultiviert. Die Zellen wurden steril geerntet, mit 100 mM Kalium-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und in 50 ml HR- mm mit 5,15 mM Ferulasäure resuspendiert. Nach 6 h waren 2, 3 mM Vanillin, nach 8 h 2,8 mM und nach 23 h 3,1 mM Vanillin im Kulturüberstand nachweisbar.

Erläuterungen zum Sequenzprotokoll

SEQ ID NO: 1 zeigt die Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase-cDNAs. SEQ ID NO: 2, und
SEQ ID NO: 3 zeigen ferner die Aminosäuresequenzen der von den Feruloyl-CoA Synthetase und der Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase-cDNA-Sequenzen abgeleiteten Proteine.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Enzyme aus Amycolatopsis sp. für die Synthese von Vanillin aus Ferulasäure.

2. Enzyme nach Anspruch 1 ausgewählt aus der Gruppe der Feruloyl-CoA Synthetasen oder Enoyl-CoA Hydratase/Aldolasen.

3. Enzyme nach den Ansprüchen 1 und 2, welche die Aktivität einer Feruloyl- CoA Synthetase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70%ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 über eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Aminosäuren aufweisen.

4. Enzyme nach den Ansprüchen 1 und 2, welche die Aktivität einer Enoyl- CoA Hydratase/Aldolase ausüben und eine Aminosäuresequenz umfassen, die eine zumindest 70%ige Identität mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 über eine Länge von wenigstens 20 fortlaufenden Aminosäuren aufweisen.

5. Nucleinsäure umfassend eine Nucleotidsequenz, die für ein Enzym gemäß der Ansprüche 1 bis 4 codiert und funktionelle Äquivalente davon.

6. Nucleinsäure gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA handelt.

7. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Fragmente genomischer DNA oder cDNA handelt.

8. Nucleinsäure nach den Ansprüchen 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nucleotidsequenz einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 über eine Länge von wenigstens 20 Nucleotide mit einer zumindest 70%igen Identität entspricht.

9. DNA-Konstrukt umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 und einen heterologen Promotor.

10. Vektor umfassend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9.

11. Cosmidklone, enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9.

12. Wirtszelle, enthaltend eine Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8 oder ein DNA-Konstrukt gemäß Anspruch 9 oder 10.

13. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine prokaryotische Zelle handelt.

14. Wirtszelle nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Escherichia coli handelt.

15. Wirtszelle nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine eukaryotische Zelle handelt.

16. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen einzellig oder filamentös wachsenden Pilz handelt.

17. Wirtszelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Pflanzenzellen handelt.

18. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms gemäß der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, umfassend

a) das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17 unter Bedingungen, die die Expression der Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7 gewährleistet, oder
b) das Exprimieren einer Nucleinsäure gemäß einem der Ansprüche 5 bis 11 in einem in-vitro System, und
c) die Gewinnung des Enzyms aus der Zelle, dem Kulturmedium oder dem in-vitro-System.

19. Verfahren zur Herstellung von Feruloyl-CoenzymA aus Ferulasäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwesenheit von Feruloyl-CoA Synthetase stattfindet.

20. Verfahren zur Herstellung von 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-β-hydroxy propionyl-CoenzymA, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwe senheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.

21. Verfahren zur Herstellung von Vanillin aus 4-Hydroxy-3-methoxyphenyl-β- hydroxypropionyl-CoenzymA, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion in Anwesenheit von Enoyl-CoA Hydratase/Aldolase stattfindet.