DE19917956A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Überwachung aerober biotechnologischer Prozesse - Google Patents

Abstract

In der Umwelt- und Produktbiotechnologie werden Mikroorganismen mit speziellen Stoffwechselleistungen verwendet. Für einen störungsfreien Prozessablauf wäre eine laufende Überwachung erforderlich, die über den aktuellen physiologischen Zustand der Mikroorganismen ständig informiert. DOLLAR A Dazu bekannt ist die Anwendung der Fließinjektionsanalyse (FIA). Diese Methode ist jedoch bisher überwiegend auf typische produktbiologische Zwecke beschränkt. Bekannt ist weiterhin eine Vorrichtung zur Schadstoffdetektion mittels definierter Leuchtbakterien und weitere aufwendige Anordnungen mit Biosensoren. DOLLAR A Der Erfindung liegt deshalb das Problem zu Grunde, ein Verfahren zur laufenden Überwachung aerober biotechnologischer Prozesse und damit zur Havariefrüherkennung bei diesen Prozessen zu entwickeln. Außerdem soll eine wirkungsvolle Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens geschaffen werden. DOLLAR A Erfindungsgemäß werden in ein Fließsystem prozesseigene Mikroorganismen in eine Messkammer eingebracht, kalibriert und von potentiell toxisch wirkenden Substanzen überströmt. Gleichzeitig werden in einer zweiten Messkammer des Fließsystems prozesseigene Mikroorganismen von einer Trägerlösung überströmt und in beiden Messkammern werden die Gelöstsauerstoffkonzentrationen detektiert und nachfolgend ausgewertet. Während des Messvorganges liegen dabei die prozesseigenen Mikroorganismen immobilisiert oder frei suspendiert vor. DOLLAR A Die zur Durchführung des Verfahrens geschaffene Vorrichtung ...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Überwachung aerober bio­ technologischer Prozesse sowie eine zur Durchführung des Verfah­ rens vorgesehene Vorrichtung.

In der Umwelt- und Produktbiotechnologie werden Mikroorganismen mit speziellen Stoffwechselleistungen verwendet. Für einen stö­ rungsfreien Prozess wäre eine laufende Überwachung erforderlich, die über den aktuellen physiologischen Zustand der Mikroorganis­ men ständig informiert.

Es hat dazu bisher nicht an Versuchen und Methoden gefehlt, sol­ che Informationen zu ermöglichen.

Aus dem Stand der Technik ist die Anwendung der Fließinjektions­ analyse (Flow Injection Analysis, FIA) bekannt. Dabei wird in einem Fließsystem eine Probe injiziert und über eine Reaktions­ strecke einem Detektor zur Ermittlung von Konzentrationsverände­ rungen und anderen Messwertänderungen zugeführt. Bisher ist je­ doch die Anwendung der FIA auf typische produktbiologische Zwecke und wenige Zustandsgrößen wie z. B. Temperatur, pH-Wert beschränkt (Schügerl: "Analytische Methoden in der Biotechnologie", Vieweg 1991).

Zur on line - Erkennung von toxischen Schwermetallen und organi­ schen Kontaminanten und zur Kontrolle der Wasserqualität wird weiterhin ein Analysator (Microtox®-OS Test System) der Firma AZUR Environmental, Carlsbad, USA, beschrieben, mit welchem eine automatische Schadstoffdetektion und Gewässerkontrolle mit Hilfe von definierten Leuchtbakterien durchgeführt wird ("The Mikrotox®- OS Test System, Continuous Water Quality Monitoring", Firmenschrift AZUR Environmental, 1997).

Ferner ist aus der DE 29 51 5965 U1 eine Durchflussmesszelle für Biosensoren bekannt, die jedoch eine komplizierte Messeinrichtung aufweist.

Alle bekannten Methoden und Anordnungen ermöglichen jedoch keine frühzeitige bzw. laufende Erkennung schnell wechselnder biospezi­ fischer Prozesszustände.

Der Erfindung liegt deshalb das Problem zugrunde, ein Verfahren zur laufenden Überwachung aerober biotechnologischer Prozesse und damit zur Havariefrüherkennung bei diesen Prozessen zu entwickeln. Außerdem soll eine wirkungsvolle Vorrichtung zur Durchführung die­ ses Verfahrens geschaffen werden.

Das Verfahren gem. der Erfindung löst dieses Problem mit den kenn­ zeichnenden Merkmalen des Patentanspruches 1. Vorteilhafte Ausge­ staltungen hiervon sind in den Patentansprüchen 2 bis 4 angegeben.

Danach werden in einem Fließsystem prozesseigene Mikroorganismen in eine Messkammer eingebracht, kalibriert und von potentiell to­ xisch wirkenden Substanzen überströmt. Gleichzeitig werden in einer zweiten Messkammer des Fließsystems prozesseigene Mikroorganismen von einer Trägerlösung überströmt und in beiden Messkammern werden die Gelöstsauerstoffkonzentrationen detektiert und nachfolgend aus­ gewertet.

Während des Messvorganges liegen dabei die prozesseigenen Mikro­ organismen in den Messkammern gem. Patentanspruch 2 immobilisiert oder frei suspendiert gem. Patentanspruch 3 vor.

Vorteilhafterweise erfolgt nach Beendigung des Messvorganges gem. Patentanspruch 4 eine automatische Reinigung der Messkammern.

Die zur Durchführung des Verfahrens geschaffene Vorrichtung ist durch die Merkmale des Patentanspruches 5 gekennzeichnet.

Zweckmäßige Ausgestaltungen hierzu sind in den Patentansprüchen 6 bis 8 angegeben.

Danach besteht die Vorrichtung aus einem Fließsystem mit parallel angeordneten Messkammern 1,1 und 1,2; einer Steuerungs- und Auswer­ teeinheit 2 verbunden mit einer Anzeigeeinheit 3 sowie Pumpen und Absperreinrichtungen.

Gem. Patentanspruch 6 sind in den Messkammern Signalgeber 4 in räumlich enger Kopplung zu den prozesseigenen Mikroorganismen an­ geordnet.

Als Signalgeber werden vorzugsweise gem. Patentanspruch 7 Sauer­ stoff-Elektroden verwendet.

Weiterhin enthalten die Messkammern gem. Patentanspruch 8 vorzugs­ weise eine semipermeable Membran mit einem Porendurchmesser unter 10 µm.

Das erfindungsgemäße Verfahren, unter Verwendung der erfindungs­ gemäßen Vorrichtung weist den entscheidenden Vorteil auf, die pro­ zesseigenen Mikroorganismen als sensitive Komponente zu nutzen und damit auf die Verwendung zusätzlicher Mikroorganismen zu verzich­ ten. Damit erzielte Kontrolluntersuchungen bestätigen den überra­ schenden Vorteil dieser Methode. Die Erfindung ermöglicht ein lau­ fendes Überwachen aerober biotechnologischer Prozesse und damit eine Havariefrüherkennung. Die detektierten Signale ermöglichen aktuelle Informationen über Zellzustände, Inhibierungen und Akti­ vierungen sowie über mögliche Hemmzustände.

Das Verfahren und die Vorrichtung sind vielfältig einsetzbar, z. B. zur Überwachung fermentatorischer Prozesse, zur Überwachung der Abwasserreinigung in Belebungsbecken sowie im Labor für Screening- Tests.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen und Anwendungsbeispiele näher erläutert.

Es zeigen,

Fig. 1 eine Ausführungsform der Fließstrecke

Fig. 2 resultierende Mess-Signale in allgemeiner Form

Fig. 3,1 und 3,2 Mess-Signale gem. Anwendungsbeispiel 1

Fig. 4 Dosis-Wirkungs-Beziehung von Cadmium auf die Mikroorga­ nismen

Fig. 5 die Hemmung von Wachstumsrate und Styrolabbaurate durch Cadmium

Fig. 6 Dosis-Wirkungs-Beziehung von handelsüblichem Tensid auf eine Belebtschlammpopulation gem. Anwendungsbeispiel 2

Fig. 7 Wachstumshemmung von Belebtschlammorganismen gem. Anwen­ dungsbeispiel 2.

Das Fließsystem weist zwei parallel angeordnete Messkammern 1,1 und 1,2 auf, welche Signalgeber 4 enthalten, eine Steuerungs- und Auswerteeinheit 2 verbunden mit einer Anzeigeeinrichtung 3 sowie übliche Pumpen und Absperreinrichtungen. Als Pumpen dienen vorzugs­ weise Peristaltikpumpen und für die Absperreinrichtungen bevorzugt Schlauchquetschventile.

In der Messkammer 1,1 läuft der eigentlichen Messvorgang bzw. Mess­ zyklus ab, während die Messkammer 1,2 zu Referenzmessungen dient. Als Signalgeber 4 werden in einer bevorzugten Ausführung Sauerstoff- Elektroden eingesetzt, die sich in den Messkammern in unmittelbarer Nähe der Mikroorganismen befinden.

Zu Beginn der Messung wird suspendierte Biomasse mit den zu cha­ rakterisierenden Mikroorganismen zu den Messkammern 1,1 und 1,2 gefördert.

Die Biomasse kann während der Messung als Suspension in den Mess­ kammern vorliegen oder sie wird an einer semipermeablen Membran, vorzugsweise einer Kernspurmembran mit Porendurchmessern unter 10 µm immobilisiert.

Anschließend wird eine sauerstoffhaltige Trägerflüssigkeit (Car­ rier), vorzugsweise eine sauerstoffhaltige Pufferlösung, zu den Messkammern gefördert. Mittels der Signalgeber 4 werden nun Sig­ nale über die Steuerungs- und Auswerteeinheit erfasst - eine Grundlinie wird eingestellt.

Zu diskreten Zeitpunkten werden weiterhin die in beiden Messkam­ mern befindlichen Mikroorganismen mit einem verwertbaren Substrat zur Kalibrierung kurzzeitig beprobt, welches messbare Stoffwech­ selreaktionen bewirkt. Die Beprobung erfolgt vorzugsweise auf bei­ den Messkammern gleichzeitig. Die aus den Stoffwechselreaktionen resultierenden Signale werden aufgezeichnet und ausgewertet.

In Fig. 2 ist ein Messablauf unter Verwendung von Sauerstoffelek­ troden als Signalgeber dargestellt. Das Signal aus der Messkammer 1,1 ist dabei als Kurve a dargestellt, das Signal aus der Mess­ kammer 1,2 in Kurve b. Die Abschnitte Ia und Ib zeigen die resul­ tierenden Signale auf 3 aufeinanderfolgende Substratbeprobungen während der Kalibrierungsphase.

Anschließend werden die in der Messkammer 1,1 befindlichen Mikro­ organismen für eine defininierte Dauer mit einer potentiell to­ xisch wirkenden Substanz (Noxe) z. B.. Industrieabwasser überströmt. Während dieser Noxenkontaktphase werden die Mikroorganismen in der Messkammer 1,2 mit Carrier überströmt (Abschnitte IIa und IIb).

Nach Beendigung des Noxenkontaktes erfolgt analog Abschnitt I eine Substratbeprobung. Dies stellt die Messphase dar. Eine schädigende Wirkung der Noxe auf die eingesetzten Mikroorganismen wird erkannt, wenn die Signale auf die Substratbeprobungen in Messkammer 1,1 nach Noxenkontakt kleiner als vor Noxenkontakt sind. Die Kontrolle er­ folgt anhand der Signale der Mikroorganismen aus der Messkammer 1,2. Hier sollen die Signale in Abschnitt IIIb analog zu denen aus Ab­ schnitt Ib sein. Gegebenenfalls dienen diese Signale zur Fehlerkor­ rektur der Signale aus der Messkammer 1,1. Alle Mess-Signale werden in der Steuerungs- und Auswerteeinheit erfasst, mathematisch aufge­ arbeitet und ein Toxizitätsgrad als Messergebnis errechnet, welcher die Hemmwirkung der toxischen Probe auf die eingesetzten Mikroorga­ nismen angibt.

Am Ende des Messvorganges bzw. der Messzyklen erfolgt die Reini­ gung der Messkammern, indem eine Spüllösung die Messkammern durch­ strömt.

Anwendungsbeispiel 1

Die aromatische Verbindung Styrol wird in der chemischen Industrie vielseitig als Lösungsmittel oder als Reaktionspartner z. B. für die Herstellung von Kunststoffen verwendet. Styrol tritt dadurch in vielen Prozessen als Schadstoff in der Abluft auf, die Dämpfe sind gesundheitsschädigend.

Die Beseitigung von Styrol aus Abgasen kann u. a. durch Gaswäsche und anschließend einem mikrobiologischen Abbau der entstandenen Flüssigphase (styrolhaltiges Abwasser) erfolgen. Der Bakterien­ stamm Pseudomonas spec. ist in der Lage, Styrol als einzige Koh­ lenstoff- und Energiequelle, aerob bis zu Kohlendioxid und Wasser umzusetzen und wird zum biotechnologischen Styrolabbau aus der Flüssigphase eingesetzt.

Dabei kommt es produktionsbedingt in bestimmten Intervallen zum Eintragen von Nebenschadstoffen, wie Schwermetallen, in die Wasch­ flüssigkeiten. Vorherrschend sind dabei u. a. Cadmiumionen. Diese wirken stark schädigend auf die Atmungsaktivität der Mikroorganis­ men und gefährden somit den Prozess.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird zu diskreten Zeitpunkten anfallende Mikroorganismensuspensionen aus dem Abbau­ prozess entnommen und zeitgleich in den Messkammern 1,1 und 1,2 immobilisiert. Als Carrier dient ein Kalium-Phosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,0; einer Puffermolarität von 10 mM, einer konstanten Temperatur von 24°C und einem korrespondierenden Sauer­ stoffgehalt bei Normaldruck von 8,41 mg/l. Mit dem Carrier werden beide Messkammern überströmt. Es erfolgt eine dreimalige sequen­ tielle Beprobung beider Messkammern mit Styrol in einer Konzent­ ration von 1 mM (Phase I). Nachfolgend wird die Messkammer 1,1 mit cadmiumhaltigem Abwasser überströmt (Phase IIa). Gleichzeitig überströmt der Carrier die Messkammer 1,2 (Phase IIb). Daraufhin erfolgt eine nochmalige dreifache Beprobung der beiden Messkam­ mern zeitgleich mit Styrol analog Phase I (Phase III).

Während des gesamten Messablaufes wird die Atmungsaktivität der Mikroorganismen in beiden Messkammern erfasst und ausgewertet. Nach vollendeter Messung werden die Messkammern gespült und mit aktuellen Mikroorganismen aus dem Prozess neu bestückt. Die für weitere Messungen eingesetzten Abwässer enthielten verschiedene Konzentrationen an Cadmiumnitrat, welches die Atmungsaktivität der Mikroorganismen deutlich hemmt.

Die Meßsignale einer Messung sind aus den Fig. 3,1 und 3,2 zu entnehmen.

Parallel zu dieser Messung wurden mittels Atomabsorptionsspek­ troskopie (AAS) ein Cadmiumgehalt von 15 mg/l ermittelt. Die ermittelte Hemmwirkung der Atmungsaktivität der im eingesetzten Abwasser aktuellen Prozesspopulation von Pseudomonas spec. betrug 30%.

Aus den weiteren Messungen resultiert die Dosis-Wirkungs-Beziehung von Cadmium auf den eingesetzten Prozess-Stamm. Die Ergebnisse sind aus Fig. 4 zu entnehmen.

Weiterhin ist aus Fig. 5 eine Hemmwirkung beim realen Abbau von Styrol im Prozess in Anwesenheit unterschiedlicher Cadmiumkonzentra­ tionen vergleichend dargestellt.

Anwendungsbeispiel 2

In biologischen Stufen von Abwasserreinigungsanlagen sind Tenside eine häufige Schadstoffgruppe. Bei den aeroben Belebungsstufen eingesetzten Mikroorganismen handelt es sich um Mischpopulationen verschiedenartigster Species, die in der Lage sind vielfältige organische Schadstoffe in kommunalen und industriellen Abwässern umzusetzten. Dabei können Tenside in hohen Konzentrationen den vorgesehenen mikrobiellen Abbau empfindlich stören und die Stoff­ übergangsvorgänge in die Zellen und in den Zellen hemmen.

Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurde die Hemmwirkung ver­ schiedener Konzentrationen handelsüblicher Tenside auf den kommu­ nalen Belebtschlamm aus einer Abwasserreinigungsanlage überprüft. Dazu wurde der Abbauprozess mit originalem Belebtschlamm in einer Laborkläranlage simuliert. Als Substrat wurde ein künstliches Abwasser, bestehend aus Glutaminsäure, Glukose und Harnstoff ein­ gesetzt. Die Messbedingungen wurden analog Anwendungsbeispiel 1 eingestellt. Als Proben dienten Abwasser mit verschiedenen Tensid­ konzentrationen.

Aus Fig. 6 sind die Dosis-Wirkungs-Beziehungen von handelsübli­ chem Tensid, mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ermittelt, auf eine Belebtschlammpopulation zu entnehmen. Weiterhin zeigt die Fig. 7 die Wachstumshemmung von Belebtschlammorganismen in Abhän­ gigkeit verschiedener Tensidkonzentrationen im Prozess.

Mit der erfindungsgemäßen Fließstrecke konnten Hemmwirkungen über 100 mg/l Tensid sicher nachgewiesen werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Überwachung aerober biotechnologischer Prozesse, dadurch gekennzeichnet, dass in einem Fließsystem prozesseigene Mikroorganismen in eine Messkammer eingebracht, kalibriert und von potentiell toxisch wirkenden Substanzen überströmt werden; gleichzeitig werden in einer zweiten Messkammer prozesseigene Mikroorganismen von einer Trägerlösung überströmt und in beiden Messkammern die Änderung von Zustandsgrößen detektiert und nach­ folgend ausgewertet.

2. Verfahren gem. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während des Messvorganges die prozesseigenen Mikroorganismen in den Messkammern immobilisiert vorliegen.

3. Verfahren gem. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während des Messvorganges die prozesseigenen Mikroorganismen in den Messkammern frei suspendiert vorliegen.

4. Verfahren gem. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Be­ endigung des Messvorganges eine automatische Reinigung der Mess­ kammern erfolgt.

5. Vorrichtung zur Überwachung aerober biotechnologischer Prozes­ se gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrich­ tung aus einem Fließsystem mit zwei parallel angeordneten Mess­ kammern 1,1 und 1,2; einer Steuerungs-Auswerteeinheit 2 - ver­ bunden mit einer Anzeigeeinheit 3 sowie Pumpen und Absperrein­ richtungen - besteht.

6. Vorrichtung gem. Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammern Signalgeber 4; in räumlich enger Kopplung zu den prozesseigenen Mikroorganismen enthalten.

7. Vorrichtung gem. den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeich­ net, dass die Signalgeber 4 vorzugsweise Sauerstoff-Elektroden sind.

8. Vorrichtung gem. Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammern vorzugsweise eine semipermeable Membran mit einem Porendurchmesser unter 10 µm enthalten.