DE19854808C2 - Detektionsverfahren - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Detektionsverfahren zur quantitativen Erfas
sung von physiologisch präsentem Stickstoffmonoxid (NO) im Vollblut von Säugern.
Physiologisch präsentes NO ist im Blut als Folge der endothelialen NO-Synthese oder in
Folge Freisetzung aus NO-Donatoren enthalten. Über Quantifizierung des NO ist das
Detektionsverfahren sowohl zur Diagnose als auch zur Therapiekontrolle der endothelia
len Dysfunktion geeignet. Ebenso ist ein Drug-Monitoring bei Therapie mit NO-Donatoren
möglich.
WO 98/20336 A1 offenbart ein Verfahren zur Detektion von NO in flüssigen Medien,
indem dieses in ein Diffusionsgefäß überführt wird, in dem das enthaltene freie NO über
eine semipermeable Membran zu einem NO-bindenden Chelatbildner diffundiert und die
an durch den Chelatbildner gebundene Menge an NO anschließend bestimmt wird.
Nachteilhaft wird nur freies NO und nicht hieraus gebildetes Nitrit erfaßt. NO hat im Blut
aber nur eine sehr kurze Halbwertszeit, so daß die tatsächlich enthaltene Menge an NO
nach Entnahme des Vollbluts, Überführung in das Diffusionsgefäß sowie Diffusion nicht
erfaßt werden kann.
DE 21 41 487 B2 beschreibt ein Reagenz, mit dem Nitrit über eine Farbreaktion
bestimmt werden kann. Ein Verfahren zur Detektion von NO im Vollblut wird nicht
offenbart.
WO 93/21525 A1 beschreibt ein Verfahren zur Detektion von S-Nitrosothiolen in
biologischen Flüssigkeiten durch Messung der Chemoluminiszenz nach Photolyse und
Umsetzung mit Ozon. Die Messung der Proben erfolgt direkt nach Entnahme sowie nach
Umsetzung mit Quecksilber und Oxidation mit Sauerstoff. Aus der Differenz beider
Werte ergibt sich die Menge an S-Nitrosothiolen. Dieses Verfahren ist jedoch apparativ
und im Betrieb sehr aufwendig und für die klinische Routineanalytik nicht geeignet. Soll
im Blut die Menge an freiem NO quantifiziert werden, muß die Messung unmittelbar nach
Blutentnahme erfolgen. Aufgrund der nur sehr kurzen Halbwertzeit von NO im Blut kann
aber auch dann dessen vollständige Erfassung nicht sichergestellt werden.
DE 196 04 361 A1 offenbart ein Detektionsverfahren, mit dem physiologisch präsentes
NO im Blut von Säugern quantitativ erfaßt werden kann. Auf die in dieser Druckschrift
enthaltenen Ausführungen wird vollinhaltlich Bezug genommen. Das Detektionsver
fahren beruht auf der quantitativen Erfassung von Nitrit, welches im Blut aus physiolo
gisch präsentem NO gebildet wird. Zur Vermeidung einer raschen Konversion des Nitrits
zu Nitrat werden definierte Volumina des Blutes nach Entnahme in definierte Volumina
NaOH-Lösung verbracht und unmittelbar anschließend mit einer definierten Mengen
Phosphorsäure neutralisiert. Mit Überführung der Probe in die NaOH-Lösung (Stopp
lösung) werden die enthaltenen Blutbestandteile sofort zerstört und der innerhalb der
Erythrozyten rasch erfolgende Metabolismus von Nitrit zu Nitrat unterbunden. Nach
Zentrifugation und Ultrafiltration wird der Nitrit-Gehalt unter Verwendung einer
Anionenaustauschersäule hochdruckflüssigkeitschromatographisch bestimmt.
Das beschriebene Verfahren führt zwar zu einer deutlichen Verminderung des Abbaus
von Nitrit zu Nitrat im Blut, aber nicht zu dessen vollständiger Vermeidung. Weiterhin
kann es durch NaOH zu einer Hämolyse von Erythrozyten kommen, so daß Hämoglobin
freigesetzt wird. Hämoglobin enthält an seinen Seitenketten an Schwefelgruppen funk
tionelle Nitrosothiol-Gruppen (Jia L, Bonaventura C, Bonaventura J, Stamler JS: S-nitro
sohaemoglobin: a dynamic activity of blood involved in vascular control. Nature 1996,
380: 221-226; Stamler JS, Jia L, Eu JP, McMahon TJ, Demchenko IT, Bonaventura J,
Gernert K, Piantadosi CA: Blood flow regulation by S-nitrosohemoglobin in the physiolo
gical oxygen gradient. Science 1997, 276: 2034-2037). Diese können in Anwesenheit
von NaOH in Nitrit überführt werden, welches durch das Detektionsverfahren dann
ebenfalls erfaßt wird.
Das Vorgenannte hat eine Verfälschung der Meßergebnisse des Detektionsverfahrens
zur Folge, welches ja die quantitative Erfassung des im Blut enthaltenen physiologisch
präsenten Stickstoffmonoxids zum Ziel hat. In Folge vorgegebener Mengen an Phos
phorsäure kann auch nicht für alle Proben sichergestellt werden, daß diese tatsächlich
zu der angestrebten Neutralisation führt. Dies hat eine erhebliche Streuung der
Meßwerte zur Folge, da es in einem Teil der Proben zu einer Hämolyse der Erythrozyten
kommt und die im freigesetzten Hämoglobin enthaltenen Nitrosothiole unter Einwirkung
der Lauge zu Nitrit umgesetzt werden. In der Praxis ist es auch nicht immer sicherge
stellt, daß die erhaltenen Proben sofort weiterverarbeitet und der Nitrit-Gehalt bestimmt
wird, was die Qualität der Meßwerte weiter verschlechtert und der breiten Anwendung
des Detektionsverfahrens in der klinischen Routineanalytik entgegensteht.
Es war daher Aufgabe der Erfindung, ein neues, einfach durchzuführendes Detektions
verfahren zur Verfügung zu stellen, welches die oben genannten Nachteile des bekann
ten Detektionsverfahrens nicht aufweist und auch für die klinische Routineanalytik ge
eignet ist. Insbesondere sollten nach Zugabe der Stopplösung zum Blut ein Abbau von
NO in der Probe auf ein Minimum reduziert und die Freisetzung von Nitrit aus den
Erythrozyten in Folge Hämolyse und Abbau von freigesetztem Nitrosothiol vermieden
werden.
Diese Aufgabe wurde gelöst, indem ein Detektionsverfahren zur quantitativen Erfassung
der endothelialen Dysfunktion zur Verfügung gestellt wird, welches dadurch gekenn
zeichnet ist, daß ein abgemessenes Volumen an Vollblut 1 : 2 bis 1 : 10, vorzugsweise 1 : 5
mit einer 0,9% G/V NaCl und 3,5% G/V Citrat enthaltenden Lösung verdünnt wird, die
enthaltenen Zellen abgetrennt und der Nitrit-Gehalt in der verbleibenden Lösung
quantitativ bestimmt wird. Als Citrat kommen alle Salze in Betracht, die ausreichend
löslich sind, um die genannte Lösung herzustellen, insbesondere das Natrium- und das
Kaliumsalz. Bevorzugt ist Natriumcitrat enthalten. Die genannte Citratkonzentration ist
auf Tri-Natriumcitrat-Dihydrat bezogen. Werden andere Salze verwendet, sind hierzu
äquimolare Mengen einzusetzen.
Überraschenderweise kommt es nach Zugabe der NaCl und Citrat enthaltenden Lösung
in dem Detektionsverfahren zu einem fast vollständigen Erliegen des Abbaus von Nitrit
zu Nitrat, obwohl die Erythrozyten, die diesen Abbau katalysieren, nicht zerstört werden.
Vorteilhaft werden die Blutproben nicht mit Lauge versetzt, so daß auch hiermit einher
gehende Hämolyse der Erythrozyten mit anschließender Freisetzung von zusätzlichem
Nitrit grundsätzlich vermieden wird. Weiterhin ist die Anzahl der erforderlichen Verfah
rensschritte nach Entnahme der Blutprobe reduziert, da der nach Zugabe von Lauge
erforderliche Neutralisationsschritt entfällt. Gegenüber dem bekannten Detektions
verfahren ist das neue Detektionsverfahren einfacher durchzuführen, unempfindlicher
gegenüber Störungen in Folge von Schwankungen bei Probenaufbereitung und führt
insgesamt zu verbesserten Meßergebnissen mit geringer Streuung. Es ist somit auch für
die klinische Routineanalytik gut geeignet.
Die Abtrennung der im Blut enthaltenen Zellen erfolgt mit den aus dem Stand der
Technik bekannten Verfahren. Besonders geeignet ist die Zentrifugation.
Wird das Detektionsverfahren in der Kälte durchgeführt, kommt der nur noch sehr lang
sam erfolgende Abbau von Nitrit zu Nitrat vollständig zum Stillstand. Nach einer bevor
zugten Ausführungsform der Erfindung wird das Detektionsverfahren daher in der Kälte
durchgeführt. Gut geeignet sind Temperaturen zwischen cirka 10°C und 0°C, besonders
geeignet ist cirka 4°C.
Je nach verwendeter Meßmethodik zur Bestimmung der Nitritmenge führen in den
Proben enthaltene makromolekulare Bestandteile zu Störungen. Erfolgt die Erfassung
der Nitritmenge durch optische Meßverfahren, interferieren alle makromolekularen
Bestandteile, die Verfärbungen der Probe im Meßbereich zur Folge haben. In solchen
Fällen ist es zweckmäßig, aus der erhaltenen Probe auch alle makromolekularen
Bestandteile abzutrennen, die zu Verfärbungen führen und das Meßverfahren stören.
Ein geeignetes Verfahren zur Abtrennung störender makromolekularer Bestandteile ist
Ultrafiltration mit Ultrafiltern geeigneter Trenngrenze. Eine geeignete Trenngrenze liegt
vor, wenn die makromolekularen Bestandteile zurückgehalten werden, die mit der
Wellenlänge des zur Messung verwendeten Lichtes interferieren. Da die Filtrationsdauer
mit Abnahme der Porengröße der Ultrafilter zunimmt, ist es zweckmäßig, Ultrafilter mit
möglichst großer Porengröße zu verwenden, welche die störenden makromolekularen
Bestandteile aber noch zuverlässig abtrennen.
Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird die mit der NaCl und Citrat
enthaltenden Lösung verdünnte Blutprobe zunächst zentrifugiert, um insbesondere die
enthaltenen zellhaltigen Blutbestandteile abzutrennen und die im Überstand verblei
benden makromolekularen Bestandteile anschließend mittels Ultrafiltration entfernt.
Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Abtrennung der
Zellen und makromolekularen Bestandteile, indem zunächst 10 min bei 10.000 g
zentrifugiert und der erhaltene Überstand in einem Ultrafiltrationsröhrchen mit einem cut-
off von 10.000 Dalton 1 Stunde bei 3.000 g zentrifugiert wird.
Die quantitative Erfassung des Nitrits in den erfindungsgemäß behandelten Proben kann
entsprechend den zu Nitritbestimmung bekannten Methoden vorgenommen werden.
Neben der HPLC-Methodik, wie sie in DE 196 04 361 A1 beschrieben ist, kommt hierfür
auch floureszenzspektroskopische Bestimmung nach säurekatalysierter Umsetzung mit
2,3-Diaminonaphthalen (DAN) in Betracht (Misko TP, Schilling RJ, Salvemini D, Moore
WM, Currie MG: A flourometric assay for the measurement of nitrite in biological
samples. Anal. Biochem. 1993, 214: 11-16).
Gegen die HPLC-Bestimmung spricht der relativ hohe apparative Aufwand sowie der
hohe Zeitbedarf. So ist es nach jedem Durchlauf erforderlich, daß die auf die Säule
aufgegebene Probe wieder vollständig von dieser entfernt wird. Weiterhin wäre die
Aufreinigung der Probe mit einer Vorsäule erforderlich, um eine Verschmutzung der
Säule mit in den Proben enthaltenem Eiweiß zu verhindern.
Das floureszenzspektroskopische Meßverfahren ist hochempfindlich für Nitrit und geeig
net, die geringen Konzentrationsänderungen von Nitrit im Blut zu erfassen, welches aus
dem physiologisch präsenten NO gebildet wird. Nachteilhaft ist ein Meßfehler als Folge
von Interferenzen mit im Blut enthaltenen Bestandteilen nicht immer zuverlässig ver
meidbar. Insgesamt ist dieses Verfahren weniger robust.
Ein weiteres Verfahren zur Bestimmung von Nitrit ist dessen photometrische Bestim
mung nach Umsetzung mit Sulfanilamid und N-(1-naphthyl)-ethylendiamin im sauren
Milieu (Griess-Reaktion). Diese Methode ist zwar einfach und mit geringem apparativen
Aufwand durchzuführen, ist aber mit einer Nachweisgrenze von cirka 1 µmol/l zu
unempfindlich, um für das Detektionsverfahren geeignet zu sein. In einer Weiterent
wicklung dieser Methode wird die photometrische Messung des Nitrits nach dessen
Umsetzung mit dem Griess-Reagenz in einem Fluß-Injektions-Assay durchgeführt (Pratt
PF, Nitipatikom K, Champbell WB: Simultaneous determination of nitrite and nitrate in
biological samples by multichannel flow injection analysis. Anal. Biochem. 1995, 231:
383-386). Hierdurch gelang es, die Nachweisgrenze für Nitrit auf 25 nM abzusenken.
Dieses ist jedoch ebenfalls nicht empfindlich genug, um die geringen Schwankungen des
Nitritgehaltes im Blut als Folge des Abbaus von physiologisch präsentem NO zu
erfassen. Auch ergeben sich hohe Streuungen der photometrisch ermittelten Meßwerte
infolge interindividuell unterschiedlicher Absorption der einzelnen Blutproben im
Meßbereich.
Nach Durchführung umfangreicher Versuche wurde eine Methode zur Bestimmung des
Nitrites in den Proben gefunden, welches die o. g. Nachteile nicht aufweist.
Im erfindungsgemäßen Detektionsverfahren erfolgt die Bestimmung des Nitritgehaltes
bevorzugt nach dieser Methode. Nach dieser bevorzugten Ausführungsform des Detekti
onsverfahrens erfolgt die quantitative Erfassung des Nitritgehaltes photometrisch nach
Durchführung der Griessreaktion, wobei die Auswertung entsprechend dem Standard
additionsverfahren vorgenommen wird. Bei verhältnismäßig geringem apparativen
Aufwand ist es hierdurch möglich, Nitrit mit einer Nachweisgrenze von wenigen nM
hochsensitiv zu bestimmen und gleichzeitig einen hohen Probendurchsatz zu erzielen.
Die Bestimmung ist robust und preiswert und daher für die klinische Routineanalytik
besonders gut geeignet.
Bei der Durchführung des Detektionsverfahrens ist jedwede Kontamination mit Nitrit zu
vermeiden, die zu einer Verfälschung des Meßergebnisses führt. Neben der Verwen
dung hochreiner Chemikalien ist auch darauf zu achten, daß die Behältnisse zur Ent
nahme und Aufbereitung der Blutprobe bis hin zur Messung sowie alle Gerätschaften,
mit welcher diese in Kontakt kommt, weitgehend frei von Nitrit sind. Die erforderlichen
Lösungen sollten je nach Bedarf aus den nichtkontaminierten Bestandteilen frisch zube
reitet werden, da die Lösungen aus der Luft Stickoxide aufnehmen, die sich hier zu Nitrit
umsetzen können.
Für das Untersuchungslabor ist es aber recht aufwendig, die für die Durchführung des
Detektionsverfahrens erforderlichen Chemikalien und Behältnisse jeweils vorab im Hin
blick auf Nitritkontamination zu untersuchen. Vorteilhaft ist, wenn diesem eine Zu
sammenstellung der erforderlichen Materialien zur Verfügung steht, welche jeweils
nicht oder nur gering mit Nitrit kontaminiert sind und zur Durchführung des Detektions
verfahrens geeignet ist. Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Kit für die Durch
führung des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens, welches a) ein Behältnis mit
NaCl, b) ein Behältnis eines Citratsalzes, c) ein Behältnis mit Wasser, d) Venenpunk
tionsbesteck und e) eine Spritze enthält. Zur Durchführung des Detektionsverfahrens
wird aus dem enthaltenen NaCl, dem Citrat und dem Wasser die Stopplösung herge
stellt. Die Blutprobe wird mittels dem Venenpunktionsbesteck und der Spritze entnom
men und wie beschrieben mit der NaCl und Citrat enthaltenden Lösung verdünnt. Der
Abbau von in der Blutprobe enthaltenem Nitrit wird hierdurch auf ein Minimum reduziert.
Wird die Probe anschließend in der Kälte gelagert, kommt er vollständig zum Stillstand.
Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform des Kits sind in diesem zusätzlich zu den
genannten Bestandteilen Zentrifugenröhrchen zur Plasmazentrifugation sowie
Zentrifugenröhrchen mit passenden Ultrafiltrationsröhrchen zur Durchführung der
Ultrafiltration enthalten. Vorzugsweise sind Ultrafiltrationsröhrchen mit einem cut-off von
10.000 Dalton enthalten.
Erfolgt die quantitative Bestimmung des Nitritgehaltes photometrisch nach Durchführung
der Griess-Reaktion, ist es zweckmäßig, daß die für die Griess-Reaktion erforderlichen
Chemikalien ebenfalls im Kit enthalten sind. Nach einer zweckmäßigen Ausführungsform
des Kits zur Durchführung des Detektionsverfahrens sind daher weiterhin a) ein Behält
nis mit Sulfanilamid, b) ein Behältnis mit N-(1-naphthyl)-ethylendiamin gelöst in Salz
säure, c) ein Behältnis mit einem Nitritsalz, vorzugsweise Natriumnitrit und d) ein Behält
nis mit Wasser enthalten.
Nach einer weiteren zweckmäßigen Ausführungsform sind zusätzlich Einwegreaktions
gefäße zur Vorbereitung der Einzelproben für die photometrische Messung enthalten.
Die Ausführungsbeispiele, ohne darauf beschränkt zu sein, erläutern die Erfindung.
Die Proben sowie alle vorbereiteten Lösungen und verwendeten Zentrifugen wurden,
soweit nicht anders erwähnt, auf Eis gelagert, bzw. auf 4°C vorgekühlt. Die Entnahme
der Blutproben erfolgte mittels Venenpunktionsbesteck in Einweg-Plastikspritzen.
Zur Aufarbeitung des Blutes wurden zwei unterschiedliche Varianten einer Stopplösung
eingesetzt: A) das abgenommene Blut wurde sofort zu gleichen Volumenteilen mit einer
0,1 N NaOH-Lösung, welche in Einweg-Plastikspritzen vorgelegt wird, vermischt. Im
Anschluß wurde das Gemisch aus Stopplösung und Blut mit einem Standardvolumen 1
molarer H3PO4 auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Alternativ zu dieser Methode wurde
das Blut B) sofort unter einer Verdünnung von 1 : 5 in eine 0,9%ige (G/V) Kochsalz
lösung (NaCl, 308 mOsm/l, 154 mM) mit 3,5% (G/V) Citrat (tri-Natriumcitrat-Dihydrat)
ebenfalls in vorbereiteten Einwegspritzen aufgenommen.
Bei beiden Varianten erfolgte eine 10-minütige Zentrifugation bei 10.000 g. Der klare
Überstand wurde anschließend in gekühlte Ultrafiltrationsröhrchen (cut-off 10.000
Dalton) überführt. Diese Zentrifugation erfolgte bei 3.000 g über einen Zeitraum von
einer Stunde. Parallel zu jeder Aufarbeitung wurden Leerwerte mitgeführt, wobei die
vorbereitete Stopplösung entsprechend den Blutproben aufgearbeitet und behandelt
wurde.
Die quantitative Bestimmung des Nitritgehaltes der aufbereiteten Blutproben erfolgte in
einem Flußinjektionsverfahren durch photometrische Bestimmung unter Durchführung
der Griess-Reaktion. Messung und Auswertung wurden entsprechend dem Standard
additionsverfahren vorgenommen. Die Flow-Injection Anlage zur quantitativen Bestim
mung von Nitrit besteht aus einer HPLC-Pumpe (Shimadzu LC-6A, Japan), einem
automatischen Probenaufgeber (Spark Holland Triathlon, NL), einem UV-Detektor
(Shimadzu SPD-6AV, Japan) und einem Integrator zur Datenaufnahme (Shimadzu C-
R4AXC Chromatopac, Japan), die Kapillaren bestehen aus Polyetheretherketon. Als
Laufmittel dient das Griess-Reagenz, bestehend aus äquimolaren Mengen Sulfanilamid
und in 1%iger Salzsäure gelöstes N-(1-naphthyl)-ethylendiamin). Die Flußgeschwindig
keit des Laufmittels betrug 1 ml pro Minute.
Zur Messung des Nitritgehaltes der Blutproben wurden diese jeweils zu je 5 Einzel
proben von 190 µl in Einwegreaktionsgefäße aliquotiert und mit jeweils 10 µl wässriger
Lösungen aufsteigenden Nitritkonzentration (Natriumnitrit; Endkonzentration = 0, 50,
100, 200, 400 nM) versetzt. Die erhaltenen Proben wurden durch den Probenaufgeber in
das Laufmittel injiziert und der sich ergebende Farbumschlag im UV-Detektor mit einem
Volumen von 8 µl bei einer Wellenlänge von 545 nM bestimmt. Zur Auswertung wurden
die aus jeweils einer Blutprobe hervorgegangenen 5 Meßwerte aufsteigender Nitritkon
zentration (Peakhöhen, Y-Werte) graphisch gegen die jeweilige Nitritkonzentration (X-
Werte) aufgetragen, eine lineare Regression durchgeführt und der Schnittpunkt der
erhaltenen Geraden mit der X-Achse (Y = O) ermittelt. Dieser entspricht der in der aufge
gebenen Probe enthaltenen Nitritkonzentration. Nach mathematischer Korrektur des
Verdünnungsfehlers und Substraktion der Leerwerte ergaben sich die Ausgangskonzen
trationen der entnommenen Blutproben.
Abb. 1 zeigt die Konzentrationsänderung von Nitrit im Blut direkt nach Zugabe einer
ungekühlten Citratlösung sowie nach anschließender Lagerung bei Raumtemperatur
über 10, 20, 30 und 60 Minuten. Dargestellt ist die Änderung des Nitritgehaltes einer
Probe mit (Kreise) und ohne (Dreiecke) Zusatz von 4.000 nM NaNO2. Es ergibt sich, daß
der Nitritgehalt nach Zugabe der Stopplösung unabhängig vom Ausgangswert nur noch
langsam abnimmt.
Abb. 2 zeigt die Serumkonzentrationen von Nitrit in Blutproben unterschiedlicher
Probanden, die mit unterschiedlichen Nitritmengen versetzt und ab Aufnahme in der eis
gekühlten Citratlösung bis zur weiteren Aufarbeitung unterschiedlich lange Zeiträume
gekühlt gelagert wurden. Es ergibt sich, daß bei Verwendung von vorgekühlter Citrat
lösung und Kühlung der hiermit versetzten Blutprobe die noch vorhandene Abnahme des
Nitritgehaltes vollständig zum Stillstand kommt.
Abb. 3 zeigt die Wiederfindungsrate der im Blut enthaltenen Nitritkonzentration
nach Behandlung der Blutproben gemäß a) Variante A, jedoch ohne Neutralisation der
Probe mit H3PO4 (offene Quadrate), b) gemäß Variante A ohne Änderung, d. h. mit
Neutralisation mit H3PO4 (gefüllte Quadrate) und c) gemäß Variante B (offene Kreise).
Dargestellt sind die Mittelwerte von jeweils 5 Blutproben mit Standardabweichung. Wie
sich hieraus ergibt, kommt es nach Behandlung mit 0,1 N NaOH zu einer massiven
Abnahme der in den Blutproben enthaltenen Nitritmenge. Nach 3 Stunden sind nur noch
33% der initial enthaltenen Nitritmenge nachweisbar. Bei Neutralisation der Blutproben
mit H3PO4 ist die Wiederfindungsrate zwar erhöht, doch kommt es auch unter diesen
Bedingungen zu einer deutlichen Abnahme der anfänglich enthaltenen Nitritmenge.
Demgegenüber ist der initiale enthaltene Nitritgehalt der Blutproben auch nach 3
Stunden vollständig wiederzufinden.
Mit der beschriebenen Methodik wurden unter Verwendung der Citratlösung Untersu
chungen an über 40 Probanden durchgeführt und die Zuverlässigkeit der Ergebnisse
geprüft. Da Nitrit als Marker der endothelialen NO-Synthese Verwendung finden soll,
wurden die Nitritkonzentrationen auch nach Infusion aufsteigender Dosierungen am Ace
tylcholin bestimmt. Acetylcholin wurde in die Arteria brachialis infundiert, wobei gleichzei
tig die hierdurch bewirkte Endothel-abhängige Änderung des Blutflusses am Unterarm
plethysmographisch bestimmt wurde.
In Abb. 4 ist in Summenstatistik die Steigerung des Blutflusses im Unterarm (A)
sowie die Serumnitritkonzentration (B) von 12 Probanden gegenüber der Acetylcholin
konzentration aufgetragen. Ein Vergleich dieser Ergebnisse mit den entsprechenden
Ergebnissen des Detektionsverfahrens des Standes der Technik (Abb. 1 von DE
196 04 361 A1) zeigt eine deutlich geringere Streuung der Meßwerte für das neue
Detektionsverfahren. Bei Auftragung der Nitritwerte gegen den gemessenen Blutfluß
ergibt sich eine hochsignifikante Korrelation, die lineare Regressionsanalyse ergab ein
r = 0,988 und ein p = 0,012.
Claims (10)
1. Detektionsverfahren zur quantitativen Erfassung der endothelialen Dysfunktion an
sowie zum Drug-monitoring von NO-freisetzenden Wirkstoffen in Säugern dadurch
gekennzeichnet, daß ein abgemessenes Volumen an Vollblut 1 : 2 bis 1 : 10,
vorzugsweise 1 : 5 mit einer 0,9% (G/V) NaCl und 3,5% (G/V) Citrat enthaltenden
Lösung verdünnt wird, die enthaltenen Zellen abgetrennt und der Nitritgehalt in der
verbleibenden Lösung quantitativ bestimmt wird.
2. Detektionsverfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
gesamte Verfahren in der Kälte, vorzugsweise bei cirka 4°C durchgeführt wird.
3. Detektionsverfahren gemäß Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß
auch die makromolekularen Bestandteile abgetrennt werden, die zu Verfärbungen
führen und das Meßverfahren stören.
4. Detektionsverfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtren
nung der Zellen durch Zentrifugation und die Abtrennung der zu Verfärbungen
führenden makromolekularen Bestandteile mittels Ultrafiltration erfolgt.
5. Detektionsverfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die
Abtrennung der Zellen und makromolekularen Bestandteile erfolgt, indem 10
Minuten bei 10.000 g zentrifugiert und der erhaltene Überstand in einem
Ultrafiltrationsröhrchen mit einem cut-off von 10.000 Dalton 1 Stunde bis 3.000 g
zentrifugiert wird.
6. Detektionsverfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die
quantitative Bestimmung des Nitritgehaltes in einem Fluß-Injektionsverfahren
photometrisch nach Durchführung der Griess-Reaktion erfolgt, wobei die Aus
wertung entsprechend dem Standardadditionsverfahren vorgenommen wird.
7. Kit für die Durchführung des Detektionsverfahrens gemäß Ansprüchen 1 bis 6
enthaltend:
- a) ein Behältnis mit NaCl
- b) ein Behältnis mit Citrat
- c) ein Behältnis mit Wasser
- d) Venenpunktions-Besteck und
- e) eine Spritze.
8. Kit gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) Zentrifugenröhrchen zur Plasmazentrifugation und
- b) Zentrifugenröhrchen mit passendem Ultrafiltrationsröhrchen zur Durchführung der Ultrafiltration
9. Kit gemäß Ansprüchen 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß
- a) ein Behältnis mit Sulfanilamid,
- b) ein Behältnis mit N-(1-naphthyl)-ethylendiamin gelöst in Salzsäure,
- c) ein Behältnis mit einem Nitritsalz, vorzugsweise Natriumnitrit und
- d) ein Behältnis mit Wasser
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich Einwegreaktions
gefäße enthalten sind.
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| WO2000033073A2 (de) | 2000-06-08 |
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| AU1859800A (en) | 2000-06-19 |
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