DE19811506A1 - Mikrosatellitenmarker für Secale cereale, Triticale und verwandte Spezies - Google Patents

Mikrosatellitenmarker für Secale cereale, Triticale und verwandte Spezies

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige genetische Marker - sogenannte Mikrosatelliten - für Roggen (Secale cereale L.) und nahe verwandte Spezies (Tribus: Triticeae und Poeae) sowie ihre Verwendung.

Description

Die Erfindung betrifft neuartige genetische Marker für Roggen (Secale cereale L.) und nahe verwandte Spezies (Tribus Triticeae, Poeae) sowie ihre Verwendung.
Die am weitesten verbreiteten bekannten genetischen Marker auf DNS-Basis sind die sogenannten Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen(RFLP)-Marker. Zur Anwendung dieser Marker wird genomische DNS mit Restriktionsenzymen verdaut, auf Agarosegelen aufgetrennt und auf Nylonmembranen transferiert (Southernblot). Durch Hybridisierung mit radioaktiv markierten DNS-Sonden werden spezifische Fragmente detektiert. Beim Auftreten von Mutationen im Bereich der verwendeten Restriktionsenzyme oder kleineren Deletionen/Insertionen werden Polymorphismen zwischen verschiedenen Individuen gefunden, welche stabil und in der Regel kodominant vererbt werden. Die RFLP-Methode ist technisch sehr aufwendig auf Radioaktivität angewiesen und hat sich deshalb nicht als praktikabel erwiesen. Außerdem detektiert sie in hochgezüchtetem Material bei Roggen nur wenig Polymorphismen.
Bei der anderen, in den letzten Jahren entwickelten molekularen Markerklasse, den RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) läßt die Reproduzierbarkeit der Er­ gebnisse bei Übertragung auf ein anderes Material beziehungsweise in einem ande­ ren Labor häufig zu wünschen übrig.
Mikrosatellitenmarker (auch als Simple sequence repeats (SSR)-Marker bezeichnet) zeigen einen höheren Grad an Polymorphismus als andere bisher entwickelte DNS-Marker. Simple sequence repeats (SSR) bestehen aus einer tandemartig angeordneten Wiederholung einer Di-, Tri- oder Tetranukleotidsequenz, zum Beispiel (GA)n. Sie können auch zusammengesetzt sein, zum Beispiel (GT)n1(GA)n2 oder eine sogenannte imperfekte Reihe darstellen, wie etwa (GT)n1CT(GT)n2. Ein SSR(=Mikrosatelliten)-Marker besteht aus einer solchen Sequenz mit zwei flankierenden einzelsträngigen DNS-Sequenzen, die in der Regel 16 bis 25 Basenpaare lang sind. Diese, als Primer bezeichneten DNS-Stränge dienen der Vermehrung über die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und damit im gegebenen Fall zur Detektion eines Längenunterschieds zwischen PCR-Produkten, der auf dem Polymorphismus in der SSR-Region beruht. Um auch Unterschiede von 2 Basenpaaren deutlich machen zu können, erfolgt die Auftrennung der PCR-Produkte über hochauflösende Agarosegele oder native beziehungsweise de­ naturierende Polyacrylamidgele. SSRs haben den Vorteil über die PCR detektiert zu werden, so daß sehr leicht große Probenmengen analysiert werden können.
In der DE-A-195 25 284, Mol. Gen. Genet. (1995) 246: 327-333 und Theor. Appl. Genet. (1995) 90: 247-252 sind Mikrosatellitenmarker aus Weizen (Triticum aestivum L.) beschrieben, die als genetische Marker für Weizen verwendet werden. In Mol. Gen. Genet. (1995) wurden diese Mikrosatellitenmarker aus Weizen auch zur PCR-Amplifikation mit Roggen (Secale cereale) und Gerste (Hordeum vulgare, H. spontaneum) verwendet.
Untersuchungen haben jedoch ergeben, daß SSR-Marker sehr spezifisch für einen Locus sind und daß für andere Getreidearten wie Weizen, Gerste, Reis oder Mais bereits vorliegende SSR-Marker nicht oder nur sehr begrenzt für die Analyse von Roggen-DNS verwendbar sind. So wurde gefunden, daß maximal 10% von SSR-Markern des Kulturweizens (Triticum aestivum) zu spezifischen DNS-Amplikons beim Roggen führen. Als Grund hierfür kann die bereits weit fortgeschrittene Divergenz in der DNS-Sequenz zwischen den beiden Getreidearten angeführt werden. Für eine sinnvolle Anwendung in der Roggenzüchtung ist es deshalb zwingend notwendig, roggenspezifische SSR-Marker zu entwickeln.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Mikrosatellitenmarker zur genetischen Analyse und Züchtung von Pflanzen der Spezies Secale cereale und verwandte Ar­ ten bereitzustellen, die sich durch einen höheren Grad an DNS-Polymorphismus auszeichnen als andere bisher für das Roggengenom entwickelte molekulare Son­ den.
Es wurde gefunden, daß spezielle aus Roggen (Secale cereale L.) stammende spezifische Primersequenzen die gestellte Aufgabe erfüllen.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit
  • (1) Mikrosatellitenmarker auf Basis hypervariabler Genomabschnitte für Pflanzen der Spezies Secale cereale L. sowie der Tribus Triticeae und Poeae, die
    • - einen simple sequence repeat (SSR) Marker als sequence tagged site (STS) umfassen, die durch zwei spezifische aus Secale cereale L. abgeleitete Primer definiert ist, welche im Durchschnitt 22 ± 4 Basen lang sind und links und rechts eine Mikrosatellitensequenz flankieren, und
    • - durch Amplifikation hypervariabler Genomabschnitte mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) in Gegenwart der zwei spezifischen Primer zu polymorphen Fragmenten (PCR-Produkte verschiedener Länge) erhältlich sind;
  • (2) ein Verfahren zur Herstellung eines Mikrosatellitenmarkers, wie in (1) definiert, für Pflanzen der Spezies Secale cereale sowie der Tribπs Triticeae und Poeae, dadurch gekennzeichnet, daß hypervariable Genomabschnitte mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) in Gegenwart der zwei spezifischen Primer zu polymorphen Fragmenten amplifiziert und anschließend aufgetrennt werden;
  • (3) die Verwendung der Mikrosatellitenmarker, wie in (1) definiert, zur genetischen Analyse von Secale cereale und Triticale sowie weitere Arten der Tribπs Triticeae und Poeae; und
  • (4) die in (1) definierten aus Secale cereale abgeleiteten Primerpaare.
Die erfindungsgemäßen Marker basieren auf der Amplifikation bestimmter hyperva­ riabler Genomabschnitte, den sogenannten Mikrosatelliten, mit Hilfe der Polymera­ sekettenreaktion (PCR). Zur spezifischen Amplifikation werden für jeden Mikrosatelliten-Locus zwei aus Secale cereale L. abgeleitete Primer jeweils links und rechts der Mikrosatellitensequenz benötigt. Diese Primer sind im Durchschnitt 22 ± 4 Basen lang und durch ihre Sequenzen definiert. Ein Mikrosatellitenmarker ist im Prinzip eine sequence tagged site (STS), welche durch zwei spezifische Primer definiert ist. Diese Primer flankieren jeweils links und rechts eine sogenannte Mikrosatellitensequenz.
Eine Mikrosatellitensequenz ist definiert als tandemrepetitive Wiederholung einer Di-, Tri- oder Tetranukleotidsequenz, die ein Grundmotiv von 2-4 Nukleotiden, beispielsweise (GA)n, wobei n ≧ 8 umfaßt. Es treten auch zusammengesetzte Mi­ krosatellitensequenzen auf, beispielsweise (GT)n(AT)n, sowie imperfekte Sequen­ zen, bei welchen einzelne Basen mutiert sind, beispielsweise (GA)nCA(GA)n.
Zwischen verschiedenen Linien und Sorten kommt es zu Variationen der Anzahl der Repeats an einem bestimmten Locus. Dies führt nach Amplifikation des Mikro­ satelliten mittels der spezifischen Primer in den flankierenden Sequenzen zu PCR-Produkten verschiedener Länge und damit zu Polymorphismus. Diese Polymor­ phismen werden stabil vererbt und können daher als genetische Marker verwendet werden. In manchen Fällen treten auch Nullallele (kein sichtbares Fragment) auf, wenn Mutationen innerhalb der Bindungsstelle für die Primer vorhanden sind.
Die Auftrennung und Detektion der erhaltenen PCR-Produkte kann mit verschiede­ nen technischen Varianten durchgeführt werden. Für die Auftrennung der Fragmente können hochauflösende Agarosegele, native Polyacrylamidgele oder denaturierende Polyacrylamidgele (= Sequenziergele) verwendet werden. Die Detektion der Fragmente kann je nach Trennungssystem über Ethidiumbromidfärbung, Silberfär­ bung, bei radioaktiver Markierung der PCR-Fragmente über Autoradiographie erfol­ gen.
Eine weitere sehr effektive Variante der Auftrennung und Detektion besteht im Ein­ satz eines automatischen Sequenziergerätes mit farbstoff- bzw. fluoreszenzmarkier­ ten Primern. Hierzu ist erforderlich, einen Primer aus jedem Mikrosatelliten-Primer­ paar farbstoff- bzw. fluoreszenzmarkiert zu synthetisieren. Aus der PCR-Amplifika­ tion resultiert ein markiertes Produkt, welches von dem Sequenziergerät detektiert werden kann. Dabei werden für jede Probe farbstoff- bzw. fluoreszenzmarkierte Größenstandards in derselben Spur mit aufgetrennt. Eine spezielle Software erlaubt es danach, die absolute Größe jedes aufgetrennten Fragmentes zu berechnen und somit auch Fragmente zwischen verschiedenen Gelläufen zu vergleichen. Mit dieser Methode können pro Tag mehrere hundert Proben weitgehend automatisch analy­ siert werden.
Erfindungsgemäß werden Mikrosatellitenmarker bereitgestellt, die die in der folgen­ den Tabelle gezeigten aus Secale cereale L., d. h. der Roggensorte "Carokurz", abgeleitete Primerpaare mit zugeordneten Mikrosatellitensequenzen bzw. eine Anzahl davon enthalten und die Loci von allen Chromosomen des Roggengenoms amplifizieren und daher zur Genmarkierung Verwendung finden.
Weiterhin sind auch Primer verwendbar, die eine Homologie von mindestens 60%, insbesondere von mindestens 80%, zu den vorstehend aufgeführten Primern auf­ weisen.
Zur Herstellung der gezeigten Primer wird die im Zellkern vorliegende DNS des Kul­ turroggens (Secale cereale L.) mit MbOI und Sau3AI, welche die Basenabfolge GATC erkennen, vollständig verdaut. Bruchstücke im Bereich von 200 bis 1500 Basenpaaren werden daraufhin in einen Vektor kloniert, der die gleichen Restrik­ tionsenden besitzt wie die genomischen DNS-Fragmente des Roggens. Als Vektor dient der λ-Phage ZAP Express (Stratagene Inc.). Nachfolgend wird die so verpackte genomische Roggen-DNS mit Hilfe der Hybridisierungstechnik nach den SSR-Motiven (GT)n, (GA)n, (CT)n und (CA)n abgesucht. Dies erfolgt mit radioaktiv markierten einzelsträngigen Oligonukleotiden der Abfolge (GT)10 und (CT)10. Auf einem Autoradiogramm ergeben alle solche DNS-Fragmente sichtbare Signale, in denen eines oder mehrere der oben genannten Motive enthalten sind. Diese Phagenklone werden für die Sequenzierung, die nach dem Strangabbruchverfahren (=Didesoxy-Methode) durchgeführt wird, in Plasmid-vektoren überführt. Die Sequenz eines solchen Roggen-DNS-Bruchstücks offenbart neben dem SSR auch DNS-Sequenzen links und rechts dieser Zielregion. Diese Sequenzen dienen der Konstruktion eines Primerpaars, welches den SSR einschließt. Die Konstruktion wird durch ein Computerprogramm unterstützt. Mit dessen Hilfe ist es möglich, für die PCR optimale Primer zu erstellen, die zur Vermehrung nur eines oder weniger Produkte führen.
Diese erfindungsgemäßen Marker zeichnen sich durch einen hohen Grad an Poly­ morphismus innerhalb und zwischen verschiedenen Roggensorten bzw. -linien aus und detektieren in der Regel in Roggenpopulationen mehrere Allele pro Marker-Locus.
Sie sind daher für "DNA fingerprinting", Sortenidentifikation, zur Bestimmung von Selbst- und Fremdbefruchtungsraten im Zuchtmaterial, Verwandschafts- bzw. Ähn­ lichkeitsstudien, Charakterisierung von cytologischen Linien wie z. B. Deletionslini­ en, Substitutionslinien, Additionslinien etc. und allen Formen von genetischen Kartierungen, einschließlich der Kartierung von Einzelgenen und quantitativen Merkmalen (QTLs) verwendbar. Insbesondere sind sie zur genetischen Kartierung und Markierung von monogenen und polygenen Eigenschaften und somit für eine effektivere Selektion sowie zur Evaluierung von Sortenreinheit, Überprüfung von Zuchtschritten, besonders in der Hybridzuchtmethodik, auf Reinheit des Zuchtmaterials, gelungene Selbstung, erwünschtes Verhältnis von Komponenten in Populationen und Hybriden, und ähnliche für den Zuchterfolg zur Erstellung einer Sorte notwendigen Erfordernisse verwendbar. Außerdem ist ihr Einsatz sehr gut für eine Automatisierung geeignet und es ist möglich, die Detektion der Produkte mit nichtradioaktiven Methoden durchzuführen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Beispiele 1. Amplifikation der Mikrosatellitenmarker in der PCR
Die Reaktion fand in einem Volumen von 10 oder 20 µl statt und enthielt folgende Komponenten:
10 mM Tris (HCl) pH 8.0
50 mM KCl
1,5 mM MgCl2
0,01% w/v Gelatine
200 µM von jedem Desoxynukleotidtriphosphat
250 nM von jedem Primer
0,5-1 U Taq-Polymerase
50-100 ng Matrizen-DNS.
Die Reaktion lief nach folgendem PCR-Profil ab:
1 Zyklus 95°C 3 min bzw. 8 min (1 Zyklus)
40 Zyklen 95°C 1 min (Denaturierungsphase)
60°C* 1 min (Primeranlagerungsphase)
72°C 30 sek. (Elongationsphase)
1 Zyklus 72°C 10 min (Extensionsphase).
*Die Primeranlagerungstemperatur betrug je nach SSR-Marker 55°C, 60°C oder 65°C.
Bevorzugt wurde eine sogenannte "touchdown"-PCR bzw. "Hot Start"-PCR durchge­ führt. Im ersten Fall wurden dem o.a. Profil 5 Zyklen vorgeschaltet, für die lediglich die Annealing-Temperatur mit jedem Zyklus um 1°C abgesenkt wurde. Die Tempera­ tur der Annealing-Phase für den allerersten Zyklus betrug 5°C mehr als im Profil an­ gegeben. Bei der "Hot Start"-PCR wurde die Taq-Polymerase erst nach vollständiger Denaturierung der Matrizen-DNS aktiviert. Durch diese beiden Methoden wurde die Spezifität der Reaktion erhöht.
Jedes Reaktionsgemisch wurde vor Ausführung der PCR mit einem Tropfen Mine­ ralöl überschichtet. Die Amplifikation erfolgte in einem Perkin Elmer TC1 Thermo­ cycler.
2. Auftrennung des SSR-Markers in einem Metaphor®-Agarosegel
Die PCR-Reaktion wurde mit 1/10 Volumen (1 bzw. 2 µl) Ladungspuffer (50% Glycerin, 1 mM EDTA, 0,4% Bromphenolblau) gestoppt und der gesamte Ansatz in einem 3,5%igen Meta­ phor®-Agarosegel (5 mm dick, 25 cm lang) aufgetrennt.
Ansatz für 1 Gel (250 ml):
8,75 g Metaphor®-Agarose wurden langsam in 250 ml 1X TBE (0,09 M Tris (Borsäure) pH 8.3, 2 mM EDTA) eingerührt und zu einer klaren Lösung aufgekocht. Nach Abkühlung auf 60 bis 70°C wurde Ethidiumbromid für eine Endkonzentration von 1 µg/ml zugegeben und die Gelflüssigkeit in eine abgedichtete Gelform gegos­ sen, in welche ein Kamm zur Taschenbildung eingesetzt wurde. Nach Aushärtung wurde das Gel für 30 min auf 4°C abgekühlt. Nach dem Auftragen der Proben wurde eine Spannung von 140 V angelegt. Die Auftrennung war nach 34 h beendet. Da­ nach wurden die Fragmente mittels UV-Licht sichtbar gemacht und dokumentiert.
3. Auftrennung eines SSR-Markers in einem denaturierenden Polyacrylamidgel und autoradiografische Detektion
Für eine radioaktive Analyse wurde die PCR in einem Volumen von 10 µl durchgeführt. Anschließend wurde das gleiche Volumen Stop-Puffer (98% Formamid, 10 mM EDTA pH 8.0, 0,025% Bromphenolblau, 0,025% Xy­ lencyanol) zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem 6%igen denaturierenden Poly­ acrylamidgel aufgetrennt.
Ansatz für 1 Gel (60 ml):
25,2 g Harnstoff
6 ml 10X TBE
7,2 ml 50% Long Ranger (AT Biochem)
mit destilliertem Wasser auf 60 ml auffüllen
30 µl TEMED
300 µl Ammoniumpersulfat.
Das Gel wurde zwischen zwei abgedichtete Glasplatten (33 cm breit, 40 cm lang) gegossen, zwischen denen mit Hilfe von Spacern ein Abstand von 0,4 mm herge­ stellt wurde. An der oben offenen Seite wurde eine Tasche für 2 aneinanderliegende Haifisch-Kämme gebildet. Nach Polymerisation wurde das Gel in eine heizbare, ver­ tikale Sequenzierapparatur eingespannt und beide Elektrodenbehälter mit 1X TBE befüllt. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte unter 55 W und 1500 V für ca. 2 h. Nach Trocknung des Gels bei 65°C für 1,5 h wurde ein Röntgenfilm über Nacht exponiert und am darauffolgenden Tag entwickelt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (10)

1. Mikrosatellitenmarker auf Basis hypervariabler Genomabschnitte für Pflanzen der Spezies Secale cereale L. sowie der Tribus Triticeae und Poeae, die
  • - einen simple sequence repeat (SSR) Marker als sequence tagged site (STS) umfassen, die durch zwei spezifische aus Secale cereale L. abgeleitete Primer definiert ist, welche im Durchschnitt 22 ± 4 Basen lang sind und links und rechts eine Mikrosatellitensequenz flankieren, und
  • - durch Amplifikation hypervariabler Genomabschnitte mit Hilfe der Polymera­ sekettenreaktion (PCR) in Gegenwart der zwei spezifischen Primer zu polymorphen Fragmenten erhältlich sind.
2. Mikrosatellitenmarker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mi­ krosatellitensequenz eine tandemrepetitive n-fache Wiederholung einer Di, Tri- oder Tetranukleotidsequenz ist, wobei n ≧ 8 ist.
3. Mikrosatellitenmarker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mi­ krosatellitensequenzen eine zusammengesetzte Mikrosatellitensequenz ist.
4. Mikrosatellitenmarker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mi­ krosatellitensequenz eine imperfekte Sequenz ist, bei welcher einzelne Basen mutiert sind.
5. Mikrosatellitenmarker nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pri­ mer aus der Roggensorte "Carokurz" abgeleitet sind.
6. Mikrosatellitenmarker nach Anspruch 1 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die zwei Primer aus den Primerpaaren der nachfolgenden Tabelle ausgewählt sind:
7. Verfahren zur Herstellung eines Mikrosatellitenmarkers gemäß Anspruch 1-6, für Pflanzen der Spezies Secale cereale sowie der Tribus Triticeae und Poeae, dadurch gekennzeichnet, daß hypervariable Genomabschnitte mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) in Gegenwart der zwei spezifischen Primer zu polymorphen Fragmenten amplifiziert und anschließend aufgetrennt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Auftrennung der Marker hochauflösende Agarosegele, native Polyacrylamidgele oder denaturie­ rende Polyacrylamidgele verwendet werden.
9. Verwendung der Mikrosatellitenmarker nach Anspruch 1-6, zur genetischen Analyse von Secale cereale und Triticale sowie weitere Arten oder Tribus Triticeae und Poeae.
10. Primerpaare, die aus Secale cereale abgeleitet sind und wie in Ansprüchen 1, 5 oder 6 definiert sind.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10222632A1 (de) * 2002-05-17 2003-12-11 Con Cipio Gmbh Mikrosatellitenmarker für genetische Analysen und zur Unterscheidung von Rosen
CN102181548A (zh) * 2011-04-14 2011-09-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基于黑麦est序列的黑麦1r～7r染色体特异的分子标记及其应用

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DE10222632B4 (de) * 2002-05-17 2006-03-09 Con Cipio Gmbh Mikrosatellitenmarker für genetische Analysen und zur Unterscheidung von Rosen
CN102181548A (zh) * 2011-04-14 2011-09-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 基于黑麦est序列的黑麦1r～7r染色体特异的分子标记及其应用

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