DE19800746A1

DE19800746A1 - Bakterielle Plasmidvektoren basierend auf alpha-Amylase mit breitem Wirtsspektrum und multiplen Anwendungen, unter besonderer Berücksichtigung Gram-positiver Bakterien

Info

Publication number: DE19800746A1
Application number: DE1998100746
Authority: DE
Original assignee: MUSCHOLL SILBERHORN ALBRECHT D
Current assignee: MUSCHOLL SILBERHORN ALBRECHT D
Priority date: 1998-01-12
Filing date: 1998-01-12
Publication date: 1999-07-15

Description

Stand der Technik (Ansprüche 1-5)

Folgende genetische Elemente bzw. Genprodukte weisen einen breiten Wirtsbereich auf:

a) AmyL (= α-Amylase von Bacillus licheniformis) wird sowohl von Gram-positiven Bakterien als auch von E. coli in aktiver Form ins Medium ausgeschieden. (Gene (1992) 118: 21)
b) AphA3 (3'-Aminoglycosid-Phosphotransterase TypIII = Kanamycin-Resistenz) wird in Gram-positiven Bakterien und in E. coli ausgehend vom Originalpromotor exprimiert. (EMBO J (1985) 4: 3583)
c) ErmAM (Adenin-N⁶-Methylase (23SrRNA)= Erythromycin-Resistenz); wie b). (MGG (1987) 206: 259)
d) Cat (Chloramphenicol-Acetyltransferase = Chloramphenicol-Resistenz) führt in Verbindung mit jeweils artspezifischen Promotoren zu cm^r-Phänotyp. (Gene (1983) 86: 313; Gene (1986) 45: 45)
e) pIP501 repliziert in sehr vielen Gram-positiven Bakterien. (Antimicrob Agents Chemother (1984) 25: 289)
f) pVA838; wie e). (Gene (1982) 19: 345).

α-Amylase von Bacillus licheniformis ist äußerst hitzestabil (2 h 95°C ohne Aktivitätsverlust), weist ein hohes Temperaturoptimum auf (ca. 75°C) und adsorbiert bei 4°C reversibel an Stärke, läßt sich somit problemlos reinigen (J Bacteriol (1986) 166: 635). Das Signalpeptid ist ohne Aktivitätsverlust gegen heterologe Signalpeptide austauschbar. Ein einfacher Aktivitätstest ist im Handel erhältlich (Phadebas® der Fa. Pharmacia) (Gene (1992) 118: 21).

Der Mechanismus zur Verankerung von Proteinen auf der Zelloberfläche ist bei Gram-positiven Bakterien hochkonserviert (Science (1995) 268: 103). Die zugrunde liegenden Sequenzmerkmale am 3'-Ende der Strukturgene können ohne Funktionsverlust ausgetauscht werden (J Bacteriol (1997) 119: 3068). Die Stabilität von Fremd-DNA läßt sich in rekombinanten DNA-Molekülen durch starke Transkriptions- Terminatoren wesentlich erhöhen (Gene (1987) 55: 179).

Die Replikation von pIP501 hängt allein von der in-trans-Wirkung des RepA-Proteines auf den Replikationsursprung (ori) ab. Die Konzentration von RepA in der Zelle bestimmt die Kopienzahl des Plasmids (J Bacteriol (1992) 119: 5475). Stabile Derivate mit unterschiedlicher Kopienzahl (u. a. pAM401 und pWM401) sind seit längerem erfolgreich im Einsatz (Ferretti (Hrsg.) (1987) "Streptococcal Genetics", ASM, Washington D.C., S. 25). Die Stabilität des Plasmids wird durch in-trans-Wirkung einer spezifischen Resolvase (ResIP) erhöht (Plasmid (1994) 31: 100).

Das recA-Gen als wichtigster Faktor für homologe Rekombination in allen Organismen enthält hochkonservierte Bereiche, die zur Herstellung universeller Oligonukleotide und mit deren Hilfe zur Erzeugung artspezifischer PCR-Produkte herangezogen werden können (J Bacteriol (1992) 174: 5171).

Bakterielle Plasmidvektoren basierend auf α-Amylase mit breitem Wirtsspektrum Problem

Die Gram-positiven Bakterien werden trotz ihrer herausragenden Bedeutung (sie stellen z. B. die wichtigsten Krankheitserreger, sind an nahezu allen wirtschaftlich bedeutsamen Fermentationsprozessen beteiligt, bilden wichtige Antibiotika und Enzyme, usw.) von kommerziellen Anbietern molekularbiologischer Hilfsmittel (wie z. B. Klonierungsvektoren) praktisch völlig vernachlässigt. Ähnliches gilt für die meisten, mit E. coli nicht verwandten Gram-negativen Bakterien.

Die Ursachen hierfür beruhen u. a. auf folgenden Problemen:

- Der mögliche Kundenkreis, der sich mit einer bestimmten Spezies beschäftigt, ist zu gering für ein lohnendes Geschäft mit artspezifischen Produkten. Die Ausnahme stellt bekanntermaßen E. coli dar.
- Die Genregulation (wie z. B. Promotoraktivitäten, Plasmidreplikation) weist bei den verschiedenen Arten immense Unterschiede auf, welche Entwicklung und Einsatz artübergreifender Produkte sehr erschweren. Beispiele hierfür sind die eingeschränkte Verwendbarkeit der meisten Markergene und Plasmidreplikons.
- Stark promiskuitive Vektoren stellen ein gewisses - sei es reales oder postuliertes - Sicherheitsrisiko dar.

Lösung

Um wirtschaftlich interessant zu sein, müssen speziesübergreifende bakterielle Vektoren folgende Eigenschaften aufweisen:

I. Eine vielseitige Anwendbarkeit ohne Speziesbeschränkung, die möglichst viele wissenschaftliche Fragestellungen abdeckt. Da dies durch einen einzelnen Vektor nicht zu erreichen ist, muß die erforderliche Vektorfamilie durch ein einheitliches, vom Kunden leicht nachvollziehbares Prinzip verbunden sein.
II. Konkurrenzfähigkeit auch bei ausschließlichem Einsatz im Standardorganismus E. coli.
III. Kein Sicherheitsrisiko durch unkontrollierte Übertragbarkeit zwischen verschiedenen Spezies.

zu Forderung I

Einheitliches Prinzip aller Vektor ist das Gen für α-Amylase. Dies kommt auch durch die gemeinsame Grundbezeichnung "pAMY-" zum Ausdruck. (Die spezifizierende Nomenklatur wird aus Gründen der Zweckmäßigkeit im Abschnitt "Ausführung" erklärt).

Das Gen ist durch Polylinker ("multiple cloning sites" = MCS) bzw. Einzelschnittstellen in funktionelle Abschnitte gegliedert, die wesentlich die vielseitigen Anwendungen bedingen (s. Fig. 1):

a) Der stromauf von der Ribosomenbindestelle gelegene Polylinker (MCS u für "upstream") erlaubt die Insertion von Promotoren, Operatoren, Terminatoren usw., deren Aktivität durch einfache Amylasetests quantifizierbar ist. Außerdem erfolgt hier die Klonierung beliebiger, unabhängig von amyL zu exprimierender Gene.
b) Die das Startcodon abdeckende RcaI-(BspHI-)Schnittstelle (nur in den ermAB-haltigen Vektoren einzigartig) ermöglicht zusammen mit MCS u einen Austausch der Ribosomenbindestelle ("Shine- Dalgarno"-Sequenz).
c) Die knapp hinter dem ATG-Startcodon schneidende BseRI-Schnittstelle erlaubt zusammen mit MCS u auch den Austausch des Startcodons (mittels maßgeschneiderter Oligonukleotide).
d) Die das Signalpeptid vom Strukturgen trennende MCS s(+/-) (für "Signalpeptid; +/-, da in zwei Orientierungen vorliegend) ermöglicht
- - den Austausch gegen andere Signalpeptide (gemeinsam mit dem gleichzeitig vorhandenen MCS u'),
- - die effektive Klonierung von Fremd-DNA, deren Erfolg durch Zerstörung der Amylase-Aktivität auf stärkehaltigen Agarplatten erkennbar ist (ähnlich der klassischen "lacZ'"-Selektion). Weitere, innerhalb des Amylasegens gelegene Schnittstellen ergänzen die Klonierungsmöglichkeiten von MCS s.
- - die in-frame-Fusion des Signalpeptids mit beliebigen Strukturgenen, deren Produkte folglich aus der Zelle ausgeschleust werden. Auch N-terminale Fusionen mit Amylase sind möglich, jedoch unter weitgehendem Verlust der Enzymaktivität.
e) Die am 3'-Ende gelegene MCS d (für "downstream") ermöglicht die Konstruktion C-terminaler Fusionsproteine. Die Amylase-Aktivität wird dadurch i.d.R. nicht oder nur unwesentlich beeinträchtigt. Die Fusionsproteine können über Stärkeadsorption einfach gereinigt werden. Ihr Verbleib läßt sich durch rasch durchführbare Aktivitätsfärbung in nativem oder denaturierendem Polyacralamid-Gel nachweisen; zeitaufwendige Immunoblots erübrigen sich.
f) ein sich wahlweise anschließender Zellwandanker (von amyL getrennt durch MCS w1 bzw. w2, für "cell-wall-anchor") ermöglicht in Gram-positiven Bakterien die Expression von Fusionsproteinen auf der Zelloberfläche. Dies kommt den Erfordernissen der auf diesem Gebiet spezialisierten Forschung entgegen, die sich vielfach mit den Eigenschaften von Zelloberflächen-Proteinen beschäftigt.

Sämtliche Elemente der Vektoren wurden gezielt hinsichtlich ihrer artunabhängigen Einsatzmöglichkeit ausgewählt (s. auch Stand der Technik):

a) Jeder Vektor wird mit zwei alternativen Resistenzmarkern (ermAM bzw. aphA-3) angeboten, die sich in einer Vielzahl von Bakterienarten bereits bewährt haben. Eine Anwendungseinschränkung aufgrund natürlicher Resistenz des zu untersuchenden Organismus gegen eines dieser Antibiotika kann so weitgehend ausgeschlossen werden.
b) Die Anordnung der Resistenzen auf den Vektoren hat eine weitergehende, funktionelle Bedeutung:
- - Für jene Anwendungen, die eine Expression von Amylase bzw. Fremdgenen bezwecken, sind sie dem Amylase-Gen in gleicher Orientierung vorgeschaltet, und zwar aufgrund folgender Überlegung. Bisher konnte ein speziesunabhängiger idealer Promotor noch nicht eindeutig definiert werden, die Promiskuität der verwendeten Resistenzgene (deren Funktion eine Expression voraussetzt) erlaubt jedoch die Schlußfolgerung, daß sie jeweils über einen solchen Promotor verfügen müssen. Ihre Anordnung in einem künstlichen Operon vor amyL führt folglich auch zu dessen Expression. Deren absolute Stärke ist von Spezies zu Spezies sicherlich verschieden, da aber für die meisten Arten überhaupt kein definierter Promotor bekannt ist, scheint dies von eher sekundärer Bedeutung.
  Gleichzeitig kann durch die Einheit von Resistenzgen und Expressionssignal auf zusätzliche Vektorsequenzen verzichtet werden.
- - In den Promotor-Testvektoren sind die Resistenzen dem Amylase-Gen nachgeschaltet. Das vor MCS u zusätzlich vorhandene, promotorlose cat-Gen ist gegenläufig angeordnet, damit mögliche Gegentranskripte infolge bidirektionaler Promotoraktivität gleichzeitig analysiert werden können (durch Auftreten einer Chloramphenicol-Resistenz bzw. Standard-Assays). Mehrere transkriptionelle Terminatoren verhindern in beiden Richtungen ein unerwünschtes Durchlesen. Diese Genanordnung ermöglicht auch die Klonierung toxischer Gene (sofern diese nicht über Expressionssignale verfügen).
c) Da die α-Amylase aus der Zelle ausgeschleust wird, sind für den Aktivitätstest keine präparativen Maßnahmen nötig. So sind auch die i.d.R. schwer aufschließbaren Wildtyp-Stämme vieler Bakterienarten einer Analyse zugänglich.
d) Die extreme Hitzetoleranz der gewählten α-Amylase läßt ihren Einsatz auch dann möglich erscheinen, wenn der zu untersuchende Organismus selbst über eine entsprechende Aktivität verfügt ohne daß diese zuvor durch Mutagenese entfernt werden muß. Eine Hitzebehandlung von 2 h bei 95°C zerstört nahezu alle Amylasen, so daß danach nur noch die Vektor-kodierte Aktivität nachzuweisen ist.

Zu Forderung II

Für einen exklusiven Einsatz in E. coli bieten die Vektoren folgende Eigenschaften:

a) Bei der Konstruktion wurde großer Wert auf Kompaktheit (d. h. Entfernung nicht essentieller Sequenzen) sowie das Vorliegen einer Vielzahl einzigartiger Restriktionsschnittstellen gelegt.
b) Alle Anwendungen mit Ausnahme der Zellwandverankerung sind auch in E. coli möglich. Damit bieten sich die Vektoren als sinnvolle Ergänzungen zu den vielen bereits existierenden E. coli-Vektoren an.
c) Die Klonierung von DNA unter Inaktivierung des Amylase-Gens stellt eine preisgünstige Alternative zur üblichen lacZ'-Selektion dar: Statt teurer Chemikalien (z. B. "X-GaI") ist hierfür nur billige Stärke nötig.
d) Da sämtliche Vektoren nicht nur mit zwei alternativen Selektionsmarkern, sondern auch mit unterschiedlichen Replikationseinheiten (aus pBR322 bzw. pACYC184) erhältlich sind, gibt es praktisch keine Kompatibilitätsprobleme, falls sie gemeinsam mit bereits existierenden Vektorkonstrukten zum Einsatz kommen sollen (z. B. zur Analyse von in-trans-Effekten). In gleichem Sinn ist zu werten, daß Amylase als Marker in diesem Organismus bislang noch kaum verwendet worden ist.

Zu Forderung III

In der vorliegenden Form können die Vektoren nur in E. coli unabhängig replizieren. Ein Sicherheitsproblem durch unerwünschten Gentransfer außerhalb des Verantwortungsbereiches der Kundenlabors kann somit weitgehend ausgeschlossen werden.

Die Anwendung in anderen Mikroorganismen ist dadurch zwar mit einem zusätzlichen Arbeitsaufwand verbunden; dieser wird jedoch durch die große Flexibilität für den Anwender wieder wettgemacht:

a) Ein beidseitig durch Terminatoren begrenzter Polylinker (MCS i, für "integration") ermöglicht die stabile Integration der Basisvektoren in beliebige Replikons der Zielorganismen.
b) s. Nebenanspruch 3.
c) s. Nebenanspruch 4.

Fertigmedium Problem

Zur Detektion von Amylase-Aktivität auf Agarplatten sind zwei Methoden üblich:

a) Herstellung des Agars zusammen mit unlöslicher Stärke (z. B. 1%) führt zur Trübung der Platten. Amylase-produzierende Bakterienkolonien sind unmittelbar am klaren Hof erkennbar. Nachteil: Die unregelmäßig einpolymerisierte Stärke erschwert die Erkennung Amylase-negativer Kolonien.
b) Bei Hinzufügen von 0,2% löslicher Stärke bleiben die Platten klar. Erst durch Besprühen mit Lugol'scher Lösung wird die Stärke durch Blaufärbung sichtbar. Um Amylase-bildende Kolonien bleiben klare Höfe erhalten. Nachteile: I₂ ist bei zu langer Einwirkung toxisch für die Bakterien. Darüber hinaus führt die wäßrige Lösung zu einem Auswaschen des Kolonieverbandes und damit zu einer Kontamination benachbarter Kolonien.

Lösung

Statt 0,2%werden unlösliche Konzentrationen löslicher Stärke (≧ 1,5%) zugesetzt, und zwar derart, daß das Stärkepulver möglichst feinverteilt dem ebenfalls pulverisierten Restmedium untergemischt wird, um Klumpenbildung zu vermeiden. Beim Autoklavieren löst sich die Stärke rückstandsfrei und führt zunächst zu klaren Platten. Nach ein- bis mehrtägiger Aufbewahrung bei 4-8°C werden die Platten gleichmäßig trüb. Damit sind sowohl Amylase-bildende als auch Amylase-negative Kolonien ohne weiteres erkennbar.

Entsprechende Gemische können mit unterschiedlichen Spezifitäten für diverse Bakterienarten als Fertigmedium verkauft werden.

Klonierungsverfahren mit Hilfe von prälinearisierten Vektoren Problem

Die nachträgliche Integration der Vektoren aus Anspruch 1 in Replikons des Zielorganismus - sei es nun vor oder nach der versuchsspezifischen Klonierung - kann sich u. U. als schwieriges Unterfangen herausstellen, das möglicherweise zeitaufwendige DNA/DNA-Hybridisierungen nötig macht. Darüber hinaus kann nicht immer mit sowohl in E. coli als auch im Zielorganismus stabilen Produkten gerechnet werden.

Lösung

Für die Anwendung in Gram-positiven Organismen wird folgendes Verfahren angeboten, das zum einen auf drei altbewährten, als ungewöhnlich stabil bekannten shuttle-Vektoren beruht die zu drei unterschiedlichen Kopienzahlen im Zielorganismus führen. Zum anderen wird die Entstehung falscher Konstrukte von vornherein praktisch ausgeschlossen.

Die Vektoren pWM401 (12,1 kb; ca. 2 Kopien pro Zelle), pAM401 (10,4 kb; ca. 40 Kopien) und pVA838 (9,2 kb; < 50 Kopien) kommen prälinearisiert in den Handel, wobei der P15A-ori (zur Selektion in E. coli) durch Restriktion mit NheI (pAM401 und pWM401) bzw. NheI + XbaI (pVA838) entfernt wurde. Die Vektoren aus Anspruch 1 können vom Anwender mit XbaI, SpeI oder AvrII an nicht essentieller Stelle linearisiert und aufgrund der Schnittstellen-Kompatibilität direkt mit obigen Vektorfragmenten ligiert werden. Bei geeigneter Doppelselektion in E. coli können nur die erwünschten rekombinanten Produkte replizieren, da jeder Ligationspartner nur eines der beiden erforderlichen Antibiotikaresistenzen zur Verfügung stellt. Dieselbe Doppelselektion kann später im Zielorganismus verwendet werden und trägt dann wesentlich zur Stabilität der Plasmide bei.

Aufgrund der Chloramphenicol-Resistenzmarker kann pWM401 und pAM401 mit allen Amylase-Vektoren kombiniert werden (bei Verwendung des cat-Gens zur Promotoranalyse ist deren Expression als Basisaktivität abzuziehen). Um pVA838 mit den auf ermAM basierenden Vektoren kompatibel zu machen, ist ein Derivat (pVA838-k) anzubieten, bei dem die Erythromycin-Resistenz von pVA838 gegen aphA-3 ausgetauscht wurde. Dies erfolgt durch Ersatz des EcoRI/HincII-Fragmentes von pVA838 durch ein ApoI/RsaI-Fragment, das aphA-3 mitsamt seines Promotors enthält.

Hilfsvektoren und degenerierte Oligonukleotide Problem

Obwohl das in Nebenanspruch 3 beschriebene Verfahren eine weitgehende Erfolgsgarantie bietet, bleibt der Zeitaufwand nicht unerheblich. Falls ein kloniertes DNA-Fragment zwar für den Zielorganismus tolerabel, für E. coli aber toxisch ist, erweist es sich sogar als ungeeignet. Von Interesse wäre deshalb der direkte Einsatz der Amylase-Vektoren im Gram-positiven Zielorganismus ohne den Umweg über E. coli.

Lösung

Statt MCS i wird der pIP501-Replikationsursprung in die Amylase-Vektoren integriert. Weist der Zielorganismus einen genügend hohen Titer des zugehörigen RepA-Proteins auf, so sorgt dessen in tians-Wirkung für die Replikation der Vektoren in Gram-positiven Wirtsorganismen (s. Stand der Technik). Vorteil dieser Methode ist daß sobald einmal ein entsprechender Klonierungsstamm konstruiert wurde jeder beliebige, den pIP501-Replikationsursprung tragende Vektor direkt appliziert werden kann. Ein Nachteil ist allerdings, daß die Stabilität der Konstrukte nicht in allen Fallen garantiert werden kann. Die Einführung des repA-Genes bedarf des Einsatzes von Hilfsvektoren (pREP), die das Gen in exprimierbarer Form stabil in die Zelle integrieren. Zwei Wege sind hierzu möglich.

a) Präsentation auf einem eigenständigen extrachromosomalen Replikon

Hierfür wurde auf das pVA380.1-Replikon zurückgegriffen, dem pVA838 seinen breiten Wirtsbereich verdankt. Durch den zusätzlich vorhandenen P15A-ori können die Plasmide auch in E. coli vermehrt werden.

Das repA-Gen aus pIP501 wurde von dem ihm benachbarten Replikationsursprung getrennt und zur Herbeiführung seiner konstitutiven Expression hinter das ermAM bzw. aphA-3-Gen kloniert. Die Expression basiert also auf demselben Prinzip wie bei den pAMY-Vektoren, bei jeweils reziproker Anwendung der beiden Resistenzen entstehen aber keine Kompatibilitätsprobleme. Aufgrund der geringen Aktivität des aphA-3-Promotors wurde diesem allerdings der stärkere ermAM-Promotor vorgelagert, um den RepA-Titer in der Zelle zu erhöhen.

Desweiteren wurde stromab von repA das Gen für eine pIP501-spezifische Resolvase (resIP) hinzugefügt, das die Stabilität von pIP501-Abkömmlingen durch Auflösung von Multimeren erhöht, sofern die zugehörige Erkennungsstelle vorhanden ist (s. Stand der Technik). Diese Erkennungsstelle befindet sich auf den Amylase-Vektoren in unmittelbarer Nachbarschaft zum pIP501-ori.

b) Integration ins Chromosom

Statt des unter a) genannten pVA380-1-Replikons kann ein für die zu untersuchende Art spezifisches chromosomales DNA-Fragment integriert werden, das durch homologe Rekombination eine zielgerichteten Integration des repA-Vektors ins Chromosom verursacht. Hierzu stehen an entsprechender Stelle einzigartige Schnittstellen zur Verfügung (u. a. XbaI, PstI).

Zusätzlich zur Möglichkeit, ein beliebiges chromosomales Fragment zu verwenden, werden dem Anwender zwei spezifische Oligonukleotide angeboten. Diese dienen zur Gewinnung eines für das recA-Gen der jeweiligen Art spezifischen PCR-Produktes (s. Stand der Technik). Da die Oligonukleotide darüber hinaus zu einer XbaI- bzw. PstI-Schnittstelle an den Enden des PCR-Produktes führen, kann das recA-Fragment an genannter Stelle eingefügt werden. Die Integration unter Zerstörung des recA-Genes bietet den zusätzlichen Vorteil, daß spätere homologe Rekornbinationsereignisse nicht mehr stattfinden können. Dadurch wird die Stabilität später transformierter Konstrukte wesentlich erhöht Der entstandene Klonierungsstamm genügt darüber hinaus sicherheitsrelevanten Forderungen, da unerwünschte Rekombinationsereignisse kaum noch auftreten können.

Vektoren und Selektionsverfahren für regulierte Promotoren Problem

Die meisten Gene einer Zelle werden unter verschiedenen Lebensbedingungen nicht in gleicher Stärke exprimiert, sondern unterliegen vielfältigen Kontrollen. Oftmals dienen einzelne chemische (z. B. Lactose) oder physikalische (z. B. Temperatur) Effektoren als positive oder negative Regulatoren. Deren Zielgene wiederum liegen haufig weit verstreut auf dem Chromosom. Oft ist es das Anliegen der Forscher, die einzelnen Gene eines solchen Regulons ausfindig zu machen. Sie waren dabei aber bislang auf zeitintensive und fehleranfällige Mutagenesen angewiesen.

Lösung

Eine geringfügige Abwandlung der o.g. Promotor-Testvektoren ermöglicht das selektive Auffinden gleichartig regulierter Gene aus einer Genbank durch gezielte Isolierung ihrer Promotor/Operator-Elemente unter Verwendung des jeweiligen (beliebigen) Effektors. In der beschriebenen Form ist die Anwendung allerdings auf Gram-positive Bakterien beschränkt.

Das Prinzip beruht darauf, daß das promotorlose cat-Gen "in Reihe geschaltet" ist mit dem Amylase- Gen, welches wiederum einen Zellwandanker trägt. Nach Integration chromosomaler DNA-Fragmente in den davor liegenden Polylinker und Transformation in den zu untersuchenden Organismus erfolgt das "Herausfischen" der erwünschten Zellen aus einer Zellsuspension auf folgende Weise:

a) Isolierung induzierbarer Promotoren:
- Plasmidfreie Zellen werden durch Zusatz von Erythromycin bzw. Kanamycin eliminiert.
- Zellen mit konstitutiven Promotoren werden durch Adsorption der Zelloberflächen-gebundenen Amylase an unlösliche (Träger-gebundene) Stärke bei 4°C und anschließendes Absetzenlassen entfernt.
- Anschließend werden die im Überstand verbliebenen Zellen mit dem gewünschten Effektor induziert. Durch zeitlich versetzte Selektion mit Chloramphenicol (in minimaler Hemmkonzentration, MHK) werden alle Zellen ohne induzierbaren Promotor eliminiert, die verbleibenden Zellen in geeignetem Medium vermehrt.
- Die genannten Schritte werden zyklisch wiederholt, die selektiv vermehrten Zellen schließlich in geeigneten Verdünnungen plattiert.
b) Isolierung reprimierbarer Promotoren:
- Zunächst erfolgt hier die Chloramphenicol-Selektion zur Entfernung von Zellen ohne entsprechende Promotoraktivität.
- Nach einem Waschschritt zur Entfernung des Chloramphenicols wird der spezifische Repressor zugesetzt. In gewissem zeitlichen Abstand erfolgt die Stärkeadsorption zur Entfernung der Zellen mit konstitutiven Promotoren.
- Die im Überstand verbleibenden Zellen werden zyklisch vermehrt und schließlich plattiert.

Durch Variation der Stringenzbedingungen (z. B. über Temperaturvariation oder Zusatz löslicher Stärke in verschiedenen Konzentrationen) bei der Stärkeadsorption sollte auch die Isolierung nur partiell regulierter Promotoren möglich sein. Die Bedingungen müssen dabei von Fall zu Fall den Erfordernissen angepaßt werden.

Ausführung Bakterielle Plasmidvektoren basierend auf α-Amylase mit breitem Wirtsspektrum

Die Vektoren aus Anspruch 1 sind zusammen mit ihren Namen und Einsatzmöglichkeiten in Fig. 1 zusammenfassend dargestellt. Die Balkenschemata entsprechen den jeweils mit XbaI linearisierten Vektoren. Diese XbaI-Schnittstelle dient bei allen Angaben als Bezugspunkt für den Vektoranfang, gefolgt vorn E. coli-Replikationsursprung. Desweiteren bedeuten

- Pfeile mit durchgezogener Linie: aktive Transkriptionseinheit (konstitutiver Promotor)
- Pfeile mit gestrichelter Linie: inaktive Transkriptionseinheit (ohne Promotor)
- Pfeile innerhalb Kästchen: Wirkrichtung der Terminatoren, Leserichtung des cat-Gens
- gerasterte Flächen: Translationseinheit

Alle weiteren Symbole sind in Tab. 1 erklärt.

Nomenklatur

Dem gemeinsamen Vektornamen "pAMY-" schließt sich ein Code aus Kleinbuchstaben gemäß Tab. 1 an, der die spezifische Ausstattung des jeweiligen Vektors eindeutig charakterisiert. Die kennzeichnenden Merkmale sind in Fig. 1 fettgedruckt. Die Reihenfolge der Buchstaben entspricht der Anordnung der entsprechenden Sequenzen ausgehend vom E. coli-Replikationsursprung. In Fig. 1 übereinander angeordnete Buchstaben stellen alternative Ausführungen dar. Z.B. bedeutet "", daß folgende Ausführungen erhältlich sind: pAMY-aeui, pAMY-beui, pAMY-akui, pAMY-bkui, pAMY-aeuo, pAMY-beuo, pAMY-akuo und pAMY-bkuo.

Restriktionsschnittstellen der Polylinker (MCS)

(Schnittstellen in runden Klammern sind nicht in allen Vektoren einzigartig; Schnittstellen in eckigen Klammern sind in keinem der Vektoren einzigartig; Schnittstellen in geschweiften Klammern sind nicht in allen entsprechenden MCS bzw. Vektoren enthalten.)

MCS u: {[PstI]}-HindIII-(BstBI)-EcoRI-SacI-SmaI-BsoBI-[KpnI]-(NcoI)-SphI-NsiI-[ClaI]-BgIII-XhoI- (StuI)-[EagI]-NotI-(EcoRV)-BamHI-NdeI
MCS u': {f[HindIII]}-[ClaI]-BgIII-XhoI-(StuI)-[EagI]-NotI-(EcoRV)-BamHI-NdeI
MCS s+: SphI-(NcoI)-[KpnI]-SmaI-BsoBI-SacI-EcoRI-(BstBI)-(HindIII)-PstI
MCS s-: PstI-(HindIII)-(BstBI)-EcoRI-SacI-SmaI-BsoBI-[Kpn]-(NcoI)-SphI
MCS w1: BgIII-[ClaI]-NsiI-SphI-(NcoI)-[KpnI]-SmaI-BsoBI-SacI-EcoRI-(BstBI)-(HindIII)-[PstI]-MluI- [SaII]-AatII-(BsaHI)-NdeI-BamHI-(EcoRV)-NotI-[EagI]-[XbaI]-SpeI
MCS w2: MscI-PmII-FspI-(NheI)
MCS i. (ApaLI)-BspLU11I-BsrGI-NarI-AvrII-ApaI-BcII-HpaI
MCS (pREP): [PstII-[HindIII]-(BstBI)-EcoRI-SacI-.

Außerhalb der MCS existieren weitere nützliche einzigartige Schnittstellen, z. B.:
BseRI (knapp hinter amyL-Startcocon); BsiWI (innerhalb amyL); (BspHI) (enthält amyL-Starlcocon); BssHII (innerhalb amylL); NaeI (innerhalb amyL); (SacII) (innerhalb amyL); {SapI} (knapp vor Stopcodon von amyL).

Nukleotidsequenz

Die Nukleotidsequenzen der jeweiligen Vektoren sind (mit Ausnahme von Teilbereichen des pVA380-1-Re plikons) vollständig bekannt. Da sie sich aber in vielen Einzelheiten voneinander unterscheiden, lassen sie sich nur als Abfolge von Teilsequenzen (Tab. 3) beschreiben, die mit Hilfe der Angaben in Fig. 1 u. 2 sowie Tab 1 u. 2 zusammengefügt werden können. (Dies ist zwar mühsam, aber kaum anders zu lösen. Allerdings sei darauf hingewiesen, daß dieses Verfahren lediglich der exakten Offenlegung aller Einzelheiten dient. Für das Verständnis der Erfindung ist es überflüssig).

Den Plasmidnamen sowie den Balkenschemata in Fig. 1 ist die jeweilige Zusammensetzung der Vektoren zu entnehmen. In der rechten Spalte von Tab. 1 wird der genaue Bezug zu den Sequenzen in Tab. 3 hergestellt: Die Numerierung ist identisch mit jener aus der linken Spalte in Tab. 2, die Reihenfolge wird durch Pfeile charakterisiert. Dahinter folgt in Klammern gegebenenfalls die Beschränkung auf bestimmte Vektortypen.

Beispiel

"1f → 2a → 1e (sonstige k)" in Zeile 3 (mit Bezeichnung b) bedeutet, daß sich die Sequenz des pBR322-Replikationsursprungs bei aphA-3-haltigen (also Kanamycin-Resistenz vermittelnden) Vektoren ("k") aus den Teilsequenzen 1f + 2a + 1e in der angegebenen Reihenfolge zusammensetzt. Das "sonstige" läßt erkennen, daß zuvor ein weiter einschränkender Spezialfall (für alle "'c" in ihrem Namen tragenden Vektoren) angegeben wurde. Bei den Erythromycin-Resistenz exprimierenden Vektoren ("e"; mit Ausnahme von "'c. . .e") besteht die entsprechende Sequenz aus 1f + 2a + 1d + 9c; usw.

Erläuterungen zu Tab. 3

Die meisten Teilsequenzen sind über kompatible Restriktionsschnittstellen miteinander verknüpft. Deren Position in der aus der EMBL-Genbank erhältlichen Sequenz ist in Spalte 3 ("Zuordnung gemäß Genbank") jeweils angegeben, wobei stets der Mittelpunkt der palindromischen Erkennungssequenzen als Zuordnungspunkt dient. Erscheint die höhere Zahl zuerst, so weist die Genbank-Sequenz eine reverse Orientierung auf. Restriktionsschnittstellen in eckigen Klammern deuten auf ihre Zerstörung während der Klonierung hin; bei Vorliegen von runden Klammen bleiben sie erhalten.

Sequenzen, die sich nicht unmittelbar aus diesem Prinzip heraus erklären, sind im folgenden beschrieben:

zu 3a) Das ermAM-haltige HinP1-Fragment wurde in pUC19:AccI kloniert, anschließend als XbaI/PstI-Fragment weitergeführt. Sämtliche Schnittstellen außer PstI gingen dabei verloren. Die 3'-seitig gelegene HaeII-Schnittstelle (fällt mit HinPI zusammen) kam in einer anderen Klonierung (s. 15b) zum Einsatz.

zu 9b) Ein amyL-haltiger Vektor wurde mit SapI (Schnittstelle überlappend mit Stopcodon) und SpeI geschnitten mit Hilfe des "Klenow"-Fragments von DNA-Polymerase aufgefüllt und religiert. In die resultierende BgIII-Schnittstelle wurde (unter Verlust des Stopcodons) Polylinker d eingesetzt.

zu 11b) Bei der Fusion von Polylinker w1 (EcoRV-Schnittstelle) an den Zellwandanker von orf8 (PmII- Schnittstelle) kam es zu einer zufälligen Leseraster-Verschiebung um -1, die durch einzusetzende Fremd-DNA ausgeglichen werden kann (falls kein sekretorisches Protein erwünscht ist).

zu 12) Zur Wiederherstellung des richtigen Leserasters (vgl. 12a) wird w2 in Form eines künstlichen Adapters in die BgIII/BamHI-Schittstellen von w1 eingeführt:

Oligo1: 5'-GATCGTGGCCACGTGCGCATGC-3'
Oligo2: 3'-CACCGGTGCACGCGTACGCTAG-5'

zu 18) Künstlicher Adapter als Polylinker i, integriert in die ApaLI/HpaI-Schnittstellen:

Oligo1: 5'-TGCACATGTACAGGCGCCTAGGGCCCTGATCAGTT-3'
Oligo2: 3'-GTACATGTCCGCGGATCCCGGGACTAGTCAA-5'

zu 19) PCR-Produkt, das sowohl den pIP501-Replikationsursprung als auch die ResIP-Erkennungsstelle mit einschließt. Nach Doppelverdau mit ApaLI und HpaI mit entsprechenden Vektorstellen kompatibel.

Primer1: 5'-ACGGGTGCACAACTCGATTTGTTTAGCTAC-3'
Primer2: 5'-TCAAGTTAACTGCTAAAATCATATTAGG-3'

zu 24) PCR-Produkt, welches das resIP-Gen vollständig abdeckt. Nach Doppelverdau mit FspI (schneidet außerhalb der Primer1-Region) und PstI mit entsprechenden Vektorstellen kompatibel. Außerdem wird durch Primer2 die 3'-terminale RsaI-Schnittstelle in eine ScaI-Schnittstelle umgewandelt.

Primer1: 5'-GCTCTAGATTTAAGTTGGGCATAA-3'
Primer2: 5'-AACTGCAGTACTCATTAACTATCC-3'

zu 26) jeweils artspezifisches PCR-Produkt mit degenerierten Primern (vgl. Stand der Technik: J Bacteriol (1992) 174: 5171). Nach Doppelverdau mit XbaI und PstI mit entsprechenden Vektorstellen kompatibel.

Primer1: 5'-CGTTCTAGACTTYATHGAYGCNGARCAYGC-3'
Primer2: 5'-CTCCTGCAGTGRTTDATRAADATNGC-3'.

Fertigmedium Klonierungsverfahren mit Hilfe von prälinearisierten Vektoren

Die Ausführungen der Nebenansprüche 2. u 3. ergeben sich aus deren Beschreibung.

Hilfsvektoren und degenerierte Oligonucleotide

Die pREP-Hilfsvektoren sind in Fig. 2 dargestellt. Ihre Sequenzen ergeben sich wie oben beschrieben aus Tab. 2 und 3.

Vektoren und Selektionsverfahren

Die zugehörigen Vektoren entsprechen dem untersten Balkenschema in Fig. 1. Die Sequenzen ergeben sich analog zu den übrigen pAMY-Vektoren aus Tab. 2 und 3.

Tabelle 1

Bestandteile der pAMY-Vektoren

Tabelle 2

Bestandteile der pREP-Hilfsvektoren gemäß Fig. 2

Tabelle 3a

Sequenz-Zusammensetzung der pAMY-Vektoren

Tabelle 3b

Sequenzen der pREP-Hilfsvektoren

Claims

1. Bakterielle Plasmidvektoren basierend auf α-Amylase mit breitem Wirtsspektrum und multiplen Anwendungen, unter besonderer Berücksichtigung Gram-positiver Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß sie in ihrer Gesamtheit und artunabhängig folgende Zielsetzungen unterstützen:

a) Klonierung von Fremd-DNA mit positiver Selektion.
b) Isolierung beliebiger konstitutiver Promotoren.
c) Isolierung beliebiger induzierbarer/reprimierbarer Promotoren, für die lediglich das regulatorische Agens bekannt ist.
d) Quantitative und qualitative Analyse von Promotoraktivitäten, Operatorsequenzen, Ribosomenbindestellen, Startcodons, Signalpeptiden, Verankerungssignalen für Zellwand-Proteinen u. ä.
e) Konstitutive Expression von Fremdproteinen.
f) Konstitutive Expression von Fusionsproteinen mit α-Amylase, wobei gewählt werden kann, ob das Produkt cytoplasmatisch oder extrazellulär, und ob die Fusion 5'- oder 3'-terminal vorliegen soll.
g) Zelloberflächen-Verankerung ("surface display") von Fusionsproteinen bei Gram-positiven Bakterien.
h) α-Amylase-Aktivitätstest ohne Zellaufschluß.
i) α-Amylase-Aktivitätstest auch bei Organismen mit eigener α-Amylase, sofern diese nicht hitzestabil ist.
j) Reinigung von Fusionsproteinen durch Stärkeadsorption.
k) Nachweis von α-Amylase bzw. deren Fusionsderivaten durch einfache Aktivitätsfärbung in nativen oder denaturierenden Polyacrylamid-Gelen.
l) Verfügbarkeit für Escherichia coli mit zwei alternativen Replikationsursprüngen und zwei alternativen Resistenzmarkern.
m) Einsatz in anderen Bakterien durch drei alternative Methoden (s.a. Nebenansprüche 3. und 4.).

2. Fertigmedium, das die unter 1.a) genannte positive Selektion auf α-Amylase-Aktivität ohne Verwendung von Lugol'scher Lösung (I₂/I⁻) ermöglicht.

3. Klonierungsverfahren mit Hilfe von prälinearisierten Vektoren zur fehlerfreien Konstruktion von shuttle-Vektoren gemäß 1.m) für den Einsatz der Vektoren in Gram- positiven Bakterien, unter Auswahl zwischen drei unterschiedlichen Kopienzahlen im Zielorganismus.

4. Hilfsvektoren und degenerierte Oligonucleotide, die eine direkte Anwendung der unter 1. genannten Vektoren in Gram-positiven Bakterien ermöglichen.

5. Vektoren und Selektionsverfahren zur Isolation von regulierten Promotoren gemäß 1.c) über selektive Zellsortierung.