DE19632075A1 - Diagnostisches Verfahren zum Nachweis der rheumatoiden Arthritis - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und ein Diagnostikum zur in vitro Diagnose von rheumatoider Arthritis, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Abwesenheit oder eine Verringerung der Anzahl von CD21 auf B-Zellen in synovialer Flüssigkeit nachgewiesen wird.

Die rheumatoide Arthritis betrifft circa 1 bis 2% der Bevölkerung. In der Praxis ist es jedoch sehr schwer, die rheumatoide Arthritis von anderen entzündlichen Erkrankungen der Gelenke, wie z. B. der reaktiven Arthritis oder der Psoriasis, zu unterscheiden. Im allgemeinen werden eine Reihe von Kriterien herangezogen, die mehr oder weniger subjektiv sind und auch zusammen keinen eindeutigen Hinweis auf die jeweilige Form der Krankheit geben (siehe hierzu z. B. Arnett F.C. et al. (1988) "Arthritis and Rheumatism", Vol. 31, 315-324, No. 3, oder Seitz M. (1995), "Rheumatoide Arthritis" in Klinische Immunologie (Peter, H. H. ed.), 327-337, Kapitel 23), Urban und Schwarzenberg Verlag München - Wien - Baltimore). Im einzelnen handelt es sich hierbei um folgende Kriterien:

• 1. Morgensteifigkeit von mindestens einer Stunde;
• 2. Weichteilschwellung oder Gelenkerguß gleichzeitig in wenigstens drei Gelenksregionen;
• 3. Weichteilschwellung oder Gelenkerguß wenigstens in einem Bereich von Handgelenken, PIP- oder MCP-Gelenken;
• 4. symmetrische Schwellungen/Arthritis derselben Gelenk­ bereiche auf beiden Seiten des Körpers;
• 5. subkutane Rheumaknoten über Knochenvorsprüngen, Streckseiten oder in gelenknahen Regionen;
• 6. Nachweis von Rheumafaktortitern; und
• 7. typische radiologische Veränderungen.

Hierbei müssen die Kriterien Nr. 1-4 wenigstens sechs Wochen lang vorhanden gewesen sein. Die Sensitivität dieser Methode liegt bei 91-94%, die Spezifität bei 89% im Vergleich zu nicht-rheumatoiden entzündlich-rheumatischen Erkrankungen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein in vitro Diagnoseverfahren zur Verfügung zu stellen, das eine höhere Sensitivität und Spezifität als bekannte Methoden besitzt.

CD21, der auch als Komplementrezeptor 2 bezeichnet wird, ist der Rezeptor für den Komplementbestandteil der Immunkomplexe (Fearon, D.T. & Carter, R.H. (1995), Annu. Rev. Immunol. 13, 127-149). Die Immunkomplexe, die aus Komplement und Antikörper, an denen das Antigen gebunden ist, bestehen, wirken regulierend auf die B-Zellen. Hierbei ist CD21 essentiell für das Funktionieren der Immunabwehr. So inhibiert beispielsweise gentechnisch hergestelltes lösliches CD21 in Mäusen die T-zellabhängige Immunantwort. CD21 ist auf reifen B-Zellen ausgeprägt und wird bei der Differenzierung zur Plasmazelle abgeschaltet. Darüber hinaus ist CD21 der Rezeptor für das Epstein-Barr-Virus, ein Rezeptor für HIV und er bindet α-Interferon.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß sich bei der Analyse der lymphoiden Zellen aus Synovialpunktaten von Patienten verschiedener Erkrankungen der Gelenke CD21 nicht bzw. in einer verringerten Anzahl auf der Oberfläche synovialer B-Zellen von Patienten mit rheumatoider Arthritis befindet. Das Synovialpunktat besteht aus der Synovialflüssigkeit, der sogenannten Gelenkschmiere.

Im Unterschied dazu befindet sich CD21 auf den synovialen B-Zellen von nicht rheumatoiden Arthritiserkrankungen. Zudem trugen die B-Zellen des peripheren Blutes der untersuchten Patienten und von gesunden Probanden CD21 auf ihrer Oberfläche, was bedeutet, daß es sich bei den Patienten mit rheumatoider Arthritis nicht um einen genetischen Defekt handelt, sondern daß das Fehlen von CD21 auf der Oberfläche synovialer B-Zellen ursächlich mit der rheumatoiden Arthritis zusammenhängt. Ebenso wurde gefunden, daß bei der Verwendung von verschiedenen monoklonalen Antikörpern gegen verschiedene Epitope von CD21 die gleichen Reaktivitäten festgestellt wurden, was bedeutet, daß CD21 nicht durch einen Liganden blockiert ist.

Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zur in vitro-Diagnose von rheumatoider Arthritis, welches folgende nacheinander ausgeführte Schritte enthält:

• a) Isolieren mononukleärer Zellen, insbesondere B-Zellen aus der synovialen Flüssigkeit; und
• b) Nachweis auf Abwesenheit bzw. eine Verringerung der Anzahl von CD21 auf B-Zellen.

Vorzugsweise werden die mononukleären Zellen, welche einkernige Immunzellen sind, vor der Nachweisreaktion auf B-zellspezifisches CD21, insbesondere über einen Ficollgradienten oder durch Sortierung auf beispielsweise CD19⁺-Zellen im Durchflußcytometer, vor allem durch magnetische Sortierung anhand magnetischer Antikörper gegen z. B. CD19 bzw. eine Kombination dieser Methoden angereichert. Bei der Anreicherung über einen Ficollgradienten befinden sich die mononukleären Zellen in der Interphase des Gradienten. Die Zahl der angereicherten mononukleären Zellen aus Punktaten liegt hierbei in einem Bereich von 10⁶ bis 10⁷ Zellen. Bei der Anreicherung im Durchflußcytometer lassen sich die B-Zellen auf eine sehr hohe Reinheit bringen, was die Auswertung sehr erleichtert. Bevorzugt ist vor allem ein magnetisches Sortiersystem, bei dem Antikörper gegen CD19 mit winzigen magnetischen Partikeln gekoppelt sind, da diese Methode sehr schnell ist und eine ausreichend hohe Reinheit an B-Zellen liefert. Aufgrund der Bindung der magnetisierten Antikörper an CD19 auf B-Zellen lassen sich diese leicht beispielsweise innerhalb von ca. 30 Minuten auf über ca. 50%ige Reinheit ausgehend von ca. 1% B-Zellen im Punktat anreichern. Die magnetische Sortierung ermöglicht auch eine mehrmalige Anreicherung von B-Zellen aus 10⁹ oder mehr Zellen.

Es ist weiterhin vorteilhaft, die angereicherten mononukleären Zellen beispielsweise zweimal mit PBS, einer isotonischen phosphatgepufferten Salzlösung, zu waschen.

Im allgemeinen wird das CD21 mit monoklonalen Antikörpern, welche vorzugsweise markiert, beispielsweise fluoreszenzmarkiert, sind, nachgewiesen. Ein Beispiel für geeignete fluoreszenzmarkierte Antikörper sind die von der Fa. Halan Sera-Lab Ltd., England hergestellten fluorescein­ markierten Anti-CD21-Antikörper. Weitere Beispiele von Fluoreszenzfarbstoffen sind Phycoerythrin oder Rhodamin. Die Markierung der Zellen wird vorzugsweise in einer Pufferlösung, beispielsweise PBS in Anwesenheit von ca. 5-10% Fremdprotein wie z. B. fötalem Kälberserum (FCS), und Azid, einem Atmungsketteninhibitor, in einer Konzentration von vorzugsweise ca. 0,01% durchgeführt. Bei dieser Konzentration bleiben die Zellen noch am Leben, jedoch haben sie die Fähigkeit verloren, Oberflächenmoleküle wie z. B. das CD21 zu internalisieren, so daß die Ergebnisse hierdurch nicht verfälscht werden können. Nach der Inkubation mit den markierten Antikörpern werden die Zellen vorzugsweise mit dem gleichen Puffer gewaschen und anschließend analysiert.

Als Analysemethoden eignen sich beispielsweise die Analyse im Durchflußcytometer oder unter dem Fluoreszenzmikroskop oder der ELISA-Test. Der Nachweis von fluoreszenz-markierten B-Zellen erfolgt vorzugsweise im Durchflußcytometer oder unter dem Fluoreszenzmikroskop. Im Durchflußcytometer können beispielsweise mit hoher Auflösung mehr als 1000 Zellen pro Sekunde analysiert werden, wobei in der Regel das gesamte Verfahren nur ca. eine Stunde dauert.

Um die Anwesenheit von B-Zellen, die kein CD21 tragen, nachzuweisen, ist es weiterhin vorteilhaft, die B-Zellen beispielsweise über andere B-Zell-spezifische Antigene, wie CD19 oder CD20, nachzuweisen. Hierbei ist es insbesondere bevorzugt, wenn die Markierung von CD21 eine andere ist, als die Markierung von CD19 und/oder CD20. Durch beispielsweise unterschiedliche Fluroeszenzmarkierungen, vorzugsweise Fluorescein in Kombination mit Phycoerythrin, können die verschiedenen Moleküle gleichzeitig nachgewiesen werden. Der Nachweis der B-Zellen über CD19 und/oder CD20 dient auch insbesondere als Kontrolle für eine erfolgreiche Markierung der B-Zellen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung von Antikörpern, insbesondere monoklonalen Antikörpern, gegen CD21 zur Herstellung eines Diagnostikums zur Diagnose der rheumatoiden Arthritis. Vorzugsweise enthält das Diagnostikum nicht nur Anti-CD21-Antikörper, sondern auch Antikörper gegen andere B-Zell-spezifischen Antigene, wie CD19 und/oder CD20. Daher ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung auch ein Diagnostikum enthaltend Antikörper gegen CD21 und Antikörper gegen andere B-Zell-spezifischen Antigene, vorzugsweise gegen CD19 und/oder CD20. Die Antikörper sind wiederum vorzugsweise monoklonale Antikörper, die insbesondere markiert, vorzugsweise fluoreszenzmarkiert sind. Es ist vor allem bevorzugt, wenn die Markierung der gegen CD21-gerichteten Antikörper eine andere ist als die Markierung der Antikörper gegen das oder die anderen B-Zell-spezifischen Antigene.

Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum umfaßt im wesentlichen markierte Antikörper und gegebenenfalls dem Fachmann bekannte Zusatz- bzw. Hilfsstoffe. Ist das Diagnostikum beispielsweise ein Immunofluoreszenz-Testkit, so sind an die Antikörper Fluoreszenzfarbstoffe, beispielsweise Fluorescein, gebunden bzw. konjugiert. Dieses Diagnostikum eignet sich insbesondere für die Analyse der B-Zell-spezifischen Antigene im Durchflußcytometer oder unter dem Fluoreszenzmikroskop. Ist das Diagnostikum beispielsweise ein Radioimmuno-Testkit, so sind die Antikörper mit radioaktiven Isotopen markiert. Über die radioaktive Markierung der Antikörper lassen sich die B-Zell-spezifischen Antigene mit hoher Sensitivität nachweisen. Das Diagnostikum kann auch ein Enzymimmuno-Testkit (ELISA) sein, bei dem die Antikörper mit einem Enzym gekoppelt werden, beispielsweise mit der alkalischen Phosphatase. In Anwesenheit von 4-Nitrophenylphosphat als ein mögliches Substrat entsteht durch das Antikörper-gebundene Enzym eine gelbe Farbe. Über die Farbmarkierung lassen sich die Antikörper-gebundenen B-Zell-spezifischen Antigene leicht im Spektrophotometer nachweisen.

Die Figur und das folgende Beispiel sollen nun die Diagnosemethode näher erläutern:

Beschreibung der Figur

Fig. 1: Schematische Darstellung des Verlaufs des Diagnoseverfahrens:
Schritt 1 stellt das Punktieren und die Entnahme der jeweiligen Probe dar.
Schritt 2 stellt die Anreicherung der mononukleären Zellen über einen Ficollgradienten dar. Hierbei bedeutet SFL synoviale Flüssigkeitslymphozyten und PBL periphere Blutlymphozyten.
Schritt 3 stellt die Färbung der B-Zellen mit spezifischen, gegen CD21 gerichtete Antikörper dar. Die dicken Kreise entsprechen den B-Zellen, die dünnen Kreise anderen Zellen und die gefüllten Kreise den durch Anti-CD21-Antikörper gefärbten B-Zellen.

Die anschließende Graphik zeigt sogenannte Konturplots, wobei die B-Zellen sowohl mit Antikörper gegen CD21 und gegen CD19 unterschiedlich durch Fluorochrome gefärbt worden sind. Die Antikörper gegen CD21 trugen Fluorescein (FL) und die Antikörper gegen CD19 trugen Phycoerythrin (PE) als Fluoreszenzfarbstoffe. Der fluoreszenzaktivierte Zellsortierer (FACScan) mißt die Fluoreszenzintensität einzelner Zellen, in diesem Fall gleichzeitig die Fluoreszenzintensität von Fluorescein und Phycoerythrin. Dabei sind ca. 10.000 gemessene Zellen in diesen Konturplots aufgezeichnet, wobei die Linien ähnlich den Höhenlinien einer topographischen Karte der Menge an Einzelpunkten entspricht. Im linken Diagramm sieht man die Zellen aus dem Synovialpunktat, die keine CD21-Markierung tragen. Im rechten Diagramm sieht man solche B-Zellen, die mit Anti-CD21-Antikörper markiert worden sind, wobei sich das Signal von dem linken in den rechten unteren Quadranten verschob.

Beispiel

Einem Patienten wurde Synovialpunktat und Blut entnommen und getrennt auf Ficollkissen aufgetragen. Danach wurde bei 2.300 Umdrehungen/Minute für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert und anschließend ließ man den Rotor ohne Bremse auslaufen. Die mononukleären Zellen, die sich in der Interphase befanden, wurden entnommen und die B-Zellen mittels eines magnetischen Sortiersystems weiter angereichert. Hierzu wurden Anti-CD19-Antikörper verwendet, an die winzige magnetische Partikel gekoppelt sind. Der Anreicherungsgrad betrug ca. 50% ausgehend von ca. 1% B-Zellen im Punktat. Anschließend wurden 1-3 × 10⁵ Zellen in 96 Loch-Mikrotiterplatten durch Zentrifugation gesammelt. Die Zellen wurden auf Eis und im Dunkeln mit austitrierten fluorescein­ markierten Anti-CD21-Antikörper (VTF-598, Halan Sera-Lab Ltd. England) und mit Phycoerythrin markierten Anti-CD19-Antikörper (Dako-CD19, Dako, Dänemark) für 20 Minuten in PBS (8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na₂HPO₄, 0,24 g KH₂PO₄, pH 7,4 mit HCl eingestellt und auf 1 l mit destilliertem Wasser aufgefüllt) + 2% FCS mit 0,01% Natriumazid inkubiert. Danach wurden die Zellen mit dem gleichen Puffer gewaschen, resuspendiert und im FACScan (Becton Dickinson) oder unter dem Fluoreszenzmikroskop analysiert.

Dabei zeigte sich, daß die B-Zellen aus dem Synovialpunktat sich nicht mit Anti-CD21-Antikörper färben lassen. Demgegenüber lassen sich die B-Zellen aus dem Blut mit Anti-CD21-Antikörper anfärben. Andere Zellarten zeigten in den untersuchten Proben aus Blut und Synovialpunktat keine Färbung mit Anti-CD21-Antikörper.

Claims (17)

1. Verfahren zur in vitro Diagnose von rheumatoider Arthritis, enthaltend folgende Schritte:

• a) Isolieren mononukleärer Zellen aus der synovialen Flüssigkeit; und
• b) Nachweis auf Abwesenheit von CD21 auf B-Zellen bzw. auf eine Verringerung der Anzahl von CD21 auf B-Zellen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären Zellen vor dem Nachweis angereichert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären Zellen über einen Ficollgradienten angereichert werden.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die angereicherten mononukleären Zellen vor dem Nachweis gewaschen werden.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Nachweis in Anwesenheit von Azid durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis von CD21 auf B-Zellen mit Antikörpern gegen CD21 erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Antikörper markiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper fluoreszenzmarkiert ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die mononukleären Zellen B-Zellen sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen zusätzlich über ein anderes B-zellspezifisches Antigen nachgewiesen werden.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das andere B-zellspezifische Antigen CD19 oder CD20 ist.

13. Verwendung von Antikörper gegen CD21 zur Herstellung eines Diagnostikums zum in vitro Nachweis der rheumatoiden Arthritis.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

15. Diagnostikum enthaltend Antikörper gegen CD21 und Antikörper gegen ein anderes B-Zell-spezifisches Antigen.

16. Diagnostikum nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das andere B-Zell-spezifische Antigen CD19 oder CD20 ist.

17. Diagnostikum nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper monoklonale Antikörper sind.