DE19627474A1 - Isothiocyanato-Cyclodextrin-Derivat - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein neues Isothiocyanato-Cyclodextrin-Derivat, mit dem verschiedene Arten von organischen Verbindungen markiert werden können, die eine Aminogruppe als funktionelle Gruppe enthalten (z. B. ionen­ ausgetauschte Harze, Fasern, Lebensmittelprodukte, Arzneimittel und dgl. und insbesondere die Aminogruppen von biologischen Aminen, wie Aminosäuren, Peptiden, Proteinen und Catecholaminen).

Es ist bereits bekannt, daß Cyclodextrin (nachstehend als "CD" bezeichnet) eine hydrophobe dreidimensionale Konfiguration in Form eines Bechers (oder in Form eines Doughnuts) hat, die durch Wände aus Glucose mit einem Hohl­ raum darin gebildet wird, in dem eine Vielzahl von Gastmolekülen einge­ schlossen sein kann. Aufgrund seiner Eigenschaften wurde CD bisher auf ver­ schiedenen industriellen Gebieten eingesetzt, beispielsweise in Arzneimitteln, landwirtschaftlichen Chemikalien und Kosmetika, in denen Effekte, wie eine Verfestigung von flüssigen Materialien durch Clathratbildung (Bildung von Ein­ schlußverbindungen) und Abschwächung von Reiz-Eigenschaften, bitterem Geschmack, unangenehmem Geruch und dgl. erwünscht sind.

Außerdem wurde das Anwendungsgebiet von CD erweitert, so daß CD- Derivate mit spezifischen Konfigurationen aus Ausgangs-α-, β- und γ-CDs (die Cyclohexamylose, Cycloheptamylose und Cyclooctamylose bezeichnen, die aus 6, 7 bzw. 8 Amylose-Einheiten aufgebaut sind) synthetisiert wurden, um für spezifische Verwendungszwecke geeignet zu sein. Einige von ihnen sind im Handel erhältlich. Unter ihnen sind die CD-Derivate, in denen einige Zuc­ kerketten (Maltose und Glucose) an ein cyclisches Cyclodextrin-Grundgerüst gebunden sind, um so weitere Verzweigungen zu bilden ("Methods Carbohydr. Chem.", 10, 277 (1994)), alkylierte CDs ("J. Pharm. Pharmacol.," 46 (9), 714 (1994)) und dgl. bekannt als Derivate mit einer weiter verbesserten Wasser­ löslichkeit.

Bei verschiedenen Arten von organischen Verbindungen, die Aminogruppen enthalten, besteht andererseits ein großer Bedarf für die Entwicklung der oben erläuterten Eigenschaften, nämlich für ein Verfahren, um sie mit einem CD- Derivat zu markieren, mit dem eine Vielzahl von Gastmolekülen mit einer ge­ eigneten Größe innerhalb seines Hohlraums eingeschlossen werden kann. Dennoch ist bisher kein CD-Derivat bekannt, das mit verschiedenen Arten von Verbindungen, die eine Aminogruppe enthalten, wirksam reagieren und sich damit kombinieren kann. Wenn ein solches Verfahren entwickelt würde könnte ein Markierungs-Reagens hergestellt werden, mit dessen Hilfe funda­ mentale Funktionen (z. B. die Löslichkeits-, Assoziations- und optischen Eigen­ schaften) von Gastmolekülen auf der Basis der obengenannten Clathratbil­ dung verbessert werden könnten.

Als Ergebnis umfangreicher Untersuchungen mit dem Ziel, ein CD-Derivat, das der obengenannten Anforderung genügt, zu entwickeln, ist es den Erfindern gelungen, ein Cyclodextrin-Derivat zu synthetisieren, bei dem mindestens eine der primären Hydroxylgruppen (-CH₂OH-, Hydroxymethylgruppe) verschiede­ ner CD-Derivate durch eine Isothiocyanatgruppe(-CH₂NCS, Isothiocyanatome­ thylgruppe) ersetzt ist, worauf die vorliegende Erfindung beruht.

Erfindungsgemäß werden verschiedene Arten von Cyclodextrin-Derivaten als Ausgangsmaterialien verwendet, wobei mindestens eine ihrer primären Hydro­ xylgruppen (-CH₂OH, Hydroxymethylgruppe) in eine Aminogruppe (-CH₂NH₂, Aminomethylgruppe) umgewandelt wird und dann die so gebildete Aminogrup­ pe in eine Isothiocyanatgruppe (-CH₂NCS, Isothiocyanatomethylgruppe) um­ gewandelt wird durch eine geeignete Dehydratationsreaktion, wodurch ein Verfahren zur Synthese des angestrebten Cyclodextrin-Derivats, das eine Isothiocyanatogruppe aufweist, erzielt wird.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf ein neues Cyclodex­ trin-Derivat, das nach dem vorstehend erwähnten generellen Syntheseverfah­ ren synthetisiert wird und bei dem mindestens eine primäre Hydroxylgruppe eines Cyclodextrin-Derivats durch eine Isothiocyanatgruppe ersetzt ist.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein neues Cyclodextrin-Derivat, das nach dem obengenannten generellen Syntheseverfahren synthetisiert wird und in dem mindestens eine primäre Hydroxylgruppe eines Cyclodextrin-Derivats durch eine Isothiocyanatgruppe substituiert ist.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Cyclodextrin-Derivat, in dem minde­ stens eine primäre Hydroxylgruppe durch eine Isothiocyanatgruppe ersetzt ist.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Verbindung der allgemeinen Formel (I):

worin n für eine ganze Zahl von 5 bis 7 steht.

Die Erfindung betrifft außerdem eine Verbindung der allgemeinen Formel (II):

worin bedeuten:
n eine ganze Zahl von 5 bis 7,
m die Zahl 1 oder 2 und
X OH, NCS, OSO₂C₆H₄CH₃, N₃ oder NH₂, wobei mindestens ein X für NCS, OSO₂C₆H₄CH₃, N₃ oder NH₂ steht.

Die Erfindung wird in der nachfolgenden detaillierten Beschreibung und in den bei liegenden Zeichnungen, die lediglich der Erläuterung dienen und auf die die Erfindung keineswegs beschränkt ist, näher beschrieben.

Ein weiterer Anwendungsbereich der vorliegenden Erfindung geht aus der nachfolgenden detaillierten Beschreibung hervor. Es ist jedoch klar, daß die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, die sich auf bevor­ zugte Ausführungsformen der Erfindung beziehen, nur zur Erläuterung ange­ geben sind, da verschiedene Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der vorliegenden Erfindung für den Fachmann auf diesem Gebiet sich aus der detaillierten Beschreibung ohne weiteres ergeben.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-α- cyclodextrin (NCS-α-CD);

Fig. 2 ein IR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-α-cyclodextrin (NCS-α-CD);

Fig. 3 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-α- cyclodextrin (NCS-α-CD);

Fig. 4 ein IR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β-cyclodextrin (NCS-β-CD);

Fig. 5 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β- cyclodextrin (NCS-β-CD);

Fig. 6 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β- cyclodextrin (NCS-β-CD);

Fig. 7 ein IR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ- cyclodextrin(NCS-γ-CD);

Fig. 8 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ- cyclodextrin (NCS-γ-CD);

Fig. 9 ein TOFMS-Diagramm von Mono6-isothiocyanato-6-deoxy-γ- cyclodextrin (NCS-γ-CD);

Fig. 10 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-6-deoxy- (maltosyl)-β-cyclodextrin (Ts-G2-β-C D);

Fig. 11 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-6-deoxy- (maltosyl )-β-cyclodextrin (Ts-G2-β-C D);

Fig. 12 ein IR-Diagramm von Mono-6-azido-6- deoxy-(maltosyl)-β-cyclodextrin (N3-G2-β-CD);

Fig. 13 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-azido-6-deoxy-(maltosyl)-β- cyclodextrin (N3-G2-β-CD);

Fig. 14 ein ¹³C-NMR -Diagramm von Mono-6-azido-6-deoxy-(maltosyl)-β- cyclodextrin (N3-G2-β-CD);

Fig. 15 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-amino-6-deoxy-(maltosyl)-β- cyclodextrin (NH2-G2-β-CD);

Fig. 16 ein ¹³C-NMR -Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy- (maltosyl)-β-cyclodextrin (NCS-G2-β-CD);

Fig. 17 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-(maltosyl)- β-cyclodextrin (NCS-G2-β-CD);

Fig. 18 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-6-deoxy- (glucosyl)-β-cyclodextrin (Ts-G 1-β-CD);

Fig. 19 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-6-deoxy- (glucosyl)-β-cyclodextrin (Ts-G1 -β-CD);

Fig. 20 ein ¹³C-NMR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy- (glucosyl)-β-cyclodextrin (NCS-G 1-β-CD);

Fig. 21 ein IR-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-(glucosyl)-β- cyclodextrin (NCS-G1 -β-CD);

Fig. 22 ein TOFMS-Diagramm von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-(glucosyl)- β-cyclodextrin (NCS-G1 -β-CD);

Fig. 23 ein TOFMS-Diagramm der Reaktionsprodukte von NCS-α-CD und Glycin;

Fig. 24 ein TOFMS-Diagramm der Reaktionsprodukte von NCS-γ-CD und In­ sulin; und

Fig. 25 einen Weg zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Erfindungsgemäß wird zur Herstellung eines CD-Derivats, das eine Gruppe aufweist, die mit einer Aminogruppe reagieren kann, eine Isothiocyanatgruppe, die mit Aminogruppen reagieren kann, in ein CD-Derivat eingeführt. Das CD- Derivat, bei dem es sich um ein Ausgangsmaterial handelt, und ein Verfahren zur Einführung der Isothiocyanatgruppe in dieses Ausgangsmaterial werden nachstehend näher erläutert.

Ausgangsmaterial

Vom Standpunkt der Verwendbarkeit der Ausgangsmaterialien aus betrachtet ist eine Vielzahl von Cyclodextrinen verwendbar, die im Handel erhältlich und verwendbar sind. So ist beispielsweise je nach Anzahl der darin enthaltenen Glucoseeinheiten α-Cyclodextrin, β-Cyclodextrin oder γ-Cyclodextrin mit hoher Reinheit erhältlich. Diese Cyclodextrine oder Cyclodextrin-Derivate, die ähnli­ che Konfigurationen aufweisen, können daher bevorzugt als Ausgangsmaterial für die Erfindung verwendet werden. Zu Beispielen für Ausgangsmaterialien, die bevorzugt verwendet werden können, gehören α-Cyclodextrin; β-Cyclodex­ trin; γ-Cyclodextrin; diejenigen mit einer verzweigten Konfiguration, wie Gluco­ syl-α-cyclodextrin, Glucosyl-β-cyclodextrin, Glucosyl-γ-cyclodextrin, Maltosyl­ α-cyclodextrin, Maltosyl-β-cyclodextrin und MaItosyl-γ-cyclodextrin; alkylierte Cyclodextrin-Derivate, wie 6-O-Methyl-α-cyclodextrin, 6-O-Methyl-β-cyc­ lodextrin, 6-O-Methyl-γ-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-α-cyclodextrin, 2,6-Di-O- methyl-β-cyclodextrin, 2,6-Di-O-methyl-γ-cyclodextrin, 2,3,6-Tri-O-methyl-α­ cyclodextrin, 2,6-Di-O-ethyl-α-cyclodextrin, 2, 3,6-Tri-O-ethyl-α-cyclodextrin und ihre β-Cyclodextrin- und γ-Cyclodextrin-Äquivalente; hydroxyalkylierte Cyclodextrine, wie 2-Hydroxyethyl-α-cyclodextrin, 2-Hydroxypropyl-α-cyclo­ dextrin, 3-Hydroxypropyl-α-cyclodextrin, 2,3-Dihydroxypropyl-α-cyclodextrin, 2,3,6-Tri-O-acyl(C₂-C₁₈)-α-cyclodextrin, O-Carboxylmethyl-O-ethyl-α-cyclodex­ trin, α-Cyclodextrinsulfat, α-Cyclodextrinphosphat und ihre β-Cyclodextrin- und γ-Cyclodextrin-Äquivalente (Kaneto Uegama, "Summary of Lectures for the Twelfth Cyclodextrin Symposium", 1 (1993)). Insbesondere kann jedes beliebi­ ge Cyclodextrin verwendet werden, so lange es mindestens eine Hydroxyl­ gruppe oder vorzugsweise eine primäre Hydroxylgruppe enthält.

Nachstehend wird das Verfahren zur Einführung einer Isothiocyanatgruppe näher erläutert, wobei alle obengenannten Cyclodextrine praktisch die gleiche Reaktion ergeben.

Verfahren zur Einführung einer Isothiocyanatgruppe

Obgleich erfindungsgemäß eine Isothiocyanatgruppe, die eine hohe Reakti­ onsfähigkeit mit Aminogruppen aufweist, in ein CD-Derivat eingeführt wird, um ein CD-Derivat zu erhalten, das eine Gruppe aufweist, die mit einer Amino­ gruppe reagieren kann, besteht keine spezielle Beschränkung in bezug auf die Bindungsposition, in welche die Isothiocyanatgruppe eingeführt wird, und in bezug auf das Bindungsverfahren.

Bezüglich der Einführungsposition einer Isothiocyanatgruppe ist es bevorzugt, daß eine Hydroxylgruppe des CD-Derivats durch die Isothiocyanatgruppe substituiert wird. Das CD-Derivat kann sowohl eine primäre Hydroxylgruppe (-CH₂OH) als auch eine sekundäre Hydroxylgruppe (-CH(OH)) aufweisen und jede von ihnen kann durch eine Isothiocyanatgruppe substituiert werden unter Bildung von -CH₂NCS bzw. -CH(NCS). Außerdem unterliegt die Anzahl der Isothiocyanatgruppen, die eingeführt werden können, keinen speziellen Be­ schränkungen, so daß auch eine Vielzahl von Isothiocyanatgruppen je nach den angestrebten Zielen eingeführt werden kann.

Obgleich das Verfahren zur Einführung der Isothiocyanatgruppe durch Um­ wandlung einer Hydroxylgruppe des CD-Derivats in dieselbe keinen speziellen Beschränkungen unterliegt, ist ein Verfahren, das auf dem in den Zeichnungen (vgl. Fig. 25) dargestellten Syntheseweg basiert, bevorzugt. Dabei wird eine Hydroxylgruppe eines Ausgangs-CD-Derivats sulfoniert, in ein Azid umgewan­ delt, in eine Aminogruppe überführt und dann in eine Isothiocyanatgruppe um­ gewandelt. Nachstehend werden diese Stufen nacheinander erläutert.

Erste Stufe

Obgleich das Verfahren zur Aktivierung der obengenannten Hydroxylgruppe in bezug auf eine Substitutionsreaktion für den quantitativen Ersatz der Hydroxylgruppe durch die Azidogruppe keinen speziellen Beschränkungen unterliegt, ist das Verfahren zur Aktivierung durch Veresterung mit einem aro­ matischen Sulfonat eines der bevorzugten Verfahren. Eines der bevorzugten Verfahren ist insbesondere die p-Toluolsulfonylierung mit einem p- Toluolsulfonylhalogenid.

Die Reaktionslösungsmittel, die Reaktionskatalysatoren, die Reaktions- Temperatur und dgl. können so ausgewählt werden, daß eine Kontrolle erzielt wird, so daß die obengenannte Aktivierung quantitativ bewirkt werden kann. Erfindungsgemäß sind auch typische Bedingungen für die aromatische Sul­ fonylierung anwendbar (vgl. "Org. Syn.", 20, 50 (1940) und "J. Org. Chem.", 37 1259 (1972)). So können beispielsweise Reaktionsbedingungen von 0°C und die Verwendung von Pyridin als Lösungsmittel bevorzugt angewendet werden. Für die Isolierung und Reinigung des Reaktionsprodukts können nor­ male Verfahren zur Abtrennung, Reinigung und dgl. angewendet werden. Es können beispielsweise angewendet werden eine Trennung, die auf der Kolon­ nenchromatographie unter Verwendung von Silicagel oder dgl. basiert und eine Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder dgl. Die für die vorliegende Erfindung erforderliche Reinheit beträgt mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90%. Das Produkt kann durch normale Struktur­ bestimmungsverfahren bestätigt werden. So kann beispielsweise die Umwand­ lung einer Hydroxylgruppe in eine Sulfonatgruppe durch das Infrarotabsorpti­ onsspektrum(IR)-Verfahren, das kernmagnetische Resonanzabsorptionsspek­ trum(NMR)-Verfahren, das Massenspektrometrie(MS)-Verfahren, durch Ele­ mentaranalyse, durch Schmelzpunkt-Analyse und dgl. bestätigt werden. Die Reinheit des Produkts kann nicht nur durch die obengenannten Spektren, sondern auch durch Dünnschichtchromatographie (TLC), Hochleistungs- Flüssigchromatographie (HPLC) und dgl. bestimmt werden.

Zweite Stufe

Die Umwandlung in eine Azidgruppe kann unter normalen Substitutionsreakti­ onsbedingungen bewirkt werden (vgl. "Carbohydrate Research" 18, 29 (1971)). In diesem Fall ist das Reaktionslösungsmittel vorzugsweise ein pola­ res Lösungsmittel. Beispielsweise handelt es sich dabei um Dimethylformamid (DMF). Zur Einführung einer Azidgruppe können vorzugsweise verschiedene Azidsalze (z. B. Natriumsalze) verwendet werden. Die Reaktion hängt von der Temperatur, der Reaktionszeit und dgl. ab und ihr Fortschreiten kann auf ge­ eignete Weise überwacht werden. Als Methode zur Überwachung können die TLC, HPLC und dgl. angewendet werden. Zur Isolierung und Reinigung des Reaktionsprodukts können normale Verfahren zur (Ab)Trennung, Reinigung und dgl. angewendet werden. Es können beispielsweise angewendet werden eine (Ab)Trennung auf der Basis der Kolonnenchromatographie unter Verwen­ dung von Silicagel oder dgl. und eine Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder dgl. Die für die vorliegende Erfindung erforderliche Rein­ heit beträgt mindestens 80% und vorzugsweise mindestens 90%. Das Pro­ dukt kann durch normale Strukturbestimmungsverfahren bestätigt werden. So kann beispielsweise die Umwandlung einer Hydroxylgruppe in eine Azidgrup­ pe bestätigt werden unter Anwendung des Infrarot-Absorptionsspektrum(IR)- Verfahrens, des kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum(NMR)- Verfahrens, des Massenspektrometrie(MS)-Verfahrens, der Elementaranalyse, der Schmelzpunkt-Analyse und dgl. Die Reinheit des Produkts kann nicht nur durch die obengenannten Spektren, sondern auch durch Dünnschichtchroma­ tographie (TLC), Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und dgl. be­ stimmt werden.

Dritte Stufe

Das Verfahren zur Umwandlung der auf diese Weise erhaltenen Azidgruppe in eine Aminogruppe unterliegt keinen speziellen Beschränkungen und dafür können typische Hydrierungs- und Reduktionsbedingungen angewendet wer­ den (vgl. "Can. J. Chem.", 50, 3886 (1972)). Erfindungsgemäß können vor­ zugsweise normale katalytische Hydrierungsreaktionen angewendet werden. Zweckmäßig kann beispielsweise ein Hydrierungsverfahren mit Palladium auf Kohlenstoff als Katalysator angewendet werden. Der Ablauf der Reaktion kann auf geeignete Weise überwacht werden. Als Überwachungsverfahren können die TLC, die HPLC und dgl. angewendet werden. Zur Isolierung und Reinigung des Reaktionsprodukts können normale Verfahren zur (Ab)Trennung, Reini­ gung und dgl. angewendet werden.

Es kann beispielsweise eine (Ab)Trennung auf der Basis der Kolonnenchroma­ tographie unter Verwendung von Silicagel oder dgl. und eine Umkristallisation aus einem geeigneten Lösungsmittel oder dgl. angewendet werden. Die für die vorliegende Erfindung erforderliche Reinheit beträgt mindestens 80%, vor­ zugsweise mindestens 90%. Das Produkt kann durch normale Strukturbe­ stimmungsverfahren bestätigt werden. So kann beispielsweise die Umwand­ lung einer Hydroxylgruppe in eine Aminogruppe durch das Infrarotabsorptions­ spektrum( IR)-Verfahren, das kernmagnetische Resonanzabsorptionsspek­ trum(NMR)-Verfahren, das Massenspektrometrie(MS)-Verfahren, durch Ele­ mentaranalyse, durch Schmelzpunkt-Analyse und dgl. bestätigt werden. Die Reinheit des Produkts kann nicht nur durch die obengenannten Spektren, sondern auch durch Dünnschichtchromatographie (TLC), Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) und dgl. bestimmt werden. Vorzugsweise wird auch ein Verfahren angewendet, bei dem eine Sulfonatgruppe mit wasserfrei­ em Ammoniak umgesetzt wird, um diese direkt in eine Aminogruppe zu über­ führen (vgl. "Aust. J. Chem.", 46, 953 (1993)).

Vierte Stufe

Erfindungsgemäß unterliegt das Verfahren zur Dehydratisierung der auf diese Weise erhaltenen Aminogruppe und zur Umwandlung desselben in eine Isothiocyanatgruppe keinen speziellen Beschränkungen und vorzugsweise können dafür die normalen Bedingungen angewendet werden (vgl. "J. Am. Chem. Soc." 80, 3332 (1958), und "Org. Syn.". 21, 81(1941)). Unter den ver­ schiedenen Dehydratisierungs-Reagentien können insbesondere die Carbodi­ imide (z. B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)) bevorzugt verwendet werden. In diesem Fall kann als Reaktionslösungsmittel Schwefelkohlenstoff, DMF oder dgl. bevorzugt verwendet werden. Das Fortschreiten der Reaktion kann auf geeignete Weise überwacht werden. Als Überwachungsverfahren können die TLC, HPLC und dgl. angewendet werden.

Für die Isolierung und Reinigung eines Isothiocyanato-CD-Derivats, bei dem es sich um ein Reaktionsprodukt handelt, können normale Verfahren zur (Ab)Trennung, Reinigung und dgl. angewendet werden. So kann beispielswei­ se eine (Ab)Trennung auf der Basis der Kolonnenchromatographie unter Ver­ wendung von Silicagel oder dgl. und eine Umkristallisation aus einem geeigne­ ten Lösungsmittel oder dgl. angewendet werden. Die für die vorliegende Erfin­ dung erforderliche Reinheit beträgt mindestens 80% und vorzugsweise min­ destens 90%. Wenn das erfindungsgemäße Isothiocyanato-CD-Derivat zur Markierung eines Amino-enthaltenden Materials verwendet wird, kann im we­ sentlichen nur die Isothiocyanatgruppe umgesetzt werden. Wenn nämlich das Isothiocyanato-CD-Derivat gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann es, selbst wenn es im Gemisch mit anderen Materialien vorliegt oder selbst wenn es ein Gemisch von Isomeren darstellt, die jeweils unterschiedli­ che Positionen aufweisen, an die eine Isothiocyanatgruppe gebunden ist oder die eine unterschiedliche Anzahl von Isothiocyanatgruppen aufweisen, in einer Reaktion zur Markierung des gewünschten Materials verwendet werden, ohne daß irgendeine spezielle Beschränkung in bezug auf seine Reinheit besteht.

Das Produkt kann durch normale Strukturbestimmungsverfahren bestätigt wer­ den. So können beispielsweise die Positionen, an die eine Isothiocyanatgrup­ pe gebunden ist, und die Anzahl der Isothiocyanatgruppen durch Bestimmung der Daten unter Anwendung des Infrarotabsorptionsspektrum (IR)-Verfahrens, des kernmagnetischen Resonanzabsorptionsspektrum (NMR)-Verfahrens, des Massenspektrometrie(MS)-Verfahrens, der Elementaranalyse, der Schmelz­ punkt-Analyse und dgl. sowie durch Vergleich der so ermittelten Daten bestä­ tigt werden. Die Reinheit des Produktes kann nicht nur durch die obengenann­ ten Spektren, sondern auch durch Dünnschichtchromatographie (TLC), Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und dgl. bestimmt werden. Auch in einem Gemisch, welches des erfindungsgemäße Isothiocyanato-CD- Derivat enthält, kann die Anwesenheit des gewünschten Derivats und dessen Konzentration auf ähnliche Weise bestätigt werden nicht nur durch die oben­ genannten Spektren, sondern auch durch Dünnschichtchromatographie (TLC), Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und dgl.

Die nachstehend angegebenen Beispiele sollen die Erfindung zwar erläutern, ohne sie jedoch darauf zu beschränken. Obgleich der Syntheseweg zur Her­ stellung des erfindungsgemäßen Isothiocyanato-CD-Derivats der Einfachheit halber durch Unterteilung in vier Stufen erläutert worden ist, ist er darauf nicht beschränkt. Im allgemeinen wurde die in jeder Reaktionsstufe isolierte Verbin­ dung unter den nachstehend angegeben HPLC-Analyse-Bedingungen bestä­ tigt. Obgleich das nachstehend beschriebene Verfahren auf der Basis der Melton-Methode ("Carbohydr. Res.", 18, 29 (1971)) und der Brown-Methode ("Aust. J. Chem.", 46, 953 (1993)) durchgeführt wurde, wurden die jeweiligen Bedingungen für die Experimente je nach Bedarf Verbesserungen oder dgl. unterworfen.
Kolonne: Kaseisorb LC NH2 SUPER, 4.6 I.D. *250 mm (Tokyokasei)
Kolonnen-Temperatur: 35°C
Eluat: 70% Acetonitril,
Strömungsgeschwindigkeit 1 ml/min
Nachweis: Absorption bei 254 nm (UV) oder Brechungsindex.

Beispiel 1 Synthese von Mono-6-O-(2-naphthalinsulfonyl)-6-deoxy-α-cyclodextrin

In einer Stickstoffatmosphäre wurden 1,0 g (1,0 mmol) -Cyclodextrin zu 70 ml Pyridin zugegeben und vollständig darin gelöst. Während die so gebildete Mi­ schung bei Raumtemperatur gerührt wurde, wurden 0,58 g (2,5 mmol) Naph­ thalinsulfonylchlorid in mehreren Portionen innerhalb von etwa 1 h zugegeben. Nachdem die Zugabe beendet war, wurde durch TLC bestätigt, daß das Spot- (Fleck)-Verhältnis zwischen dem Mononaphthylsulfonyl-Derivat und dem Di­ naphthylsulfonyl-Derivat und dgl. etwa 1 : 1 geworden war, und dann wurden sofort 50 ml Wasser zu der Mischung zugegeben, um die Reaktion abzustop­ pen. Die Reaktionsflüssigkeit wurde eingeengt und dann fraktioniert und auf­ getrennt durch Mitteldruck-Flüssigchromatographie. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen entfernt und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 0,19 g (Ausbeute: 15%) Mono-6-O-(2-naphtha­ linsulfonyl)-6-deoxy-α-cyclodextrin in Form eines weißen Pulvers erhielt.
TLC-Analyse:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Rf-Wert:
0,66 (Mononaphthalinsulfonyl-Derivat)
0,83 (Dinaphthalinsulfonyl-Derivat) und
0,35 ((α-CD)
Massenspektrometrie-Bedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, Laserionisierungszeit des Flug-Massen­ spektrometers (MALDI IV)
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1187

Beispiel 2 Synthese von Mono-6-azido-6-deoxy-α-cyclodextrin

In 10 ml Wasser wurden 0,5g (0,45 mmol) des in Beispiel 1 erhaltenen Mo­ nonaphthylsulfonyl-Derivats gelöst. Zu dieser Mischung wurden 0,32 g (4,9 mmol) Natriumazid zugegeben. Die resultierende Mischung wurde auf 80°C erhitzt und 4 h lang gerührt. Danach wurde durch TLC bestätigt, daß der Deri­ vat-Fleck verschwunden war und dann wurde die Reaktion beendet. Das Lö­ sungsmittel wurde durch Verdampfen entfernt und der Rückstand wurde aus Acetonitril ausgefällt, wobei man Mono-6-azido-6-deoxy-α-cyclodextrin (Aus­ beute: etwa 16%) erhielt.
TLC-Analyse:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Rf-Wert:
0,48 (Mono-6-azido-6-deoxy-α-cyclodextrin) und
0,66 (Mononaphthalinsulfonyl-Derivat)

Beispiel 3 Synthese von Mono-6-amino-6-deoxy-α-cyclodextrin

In 20 ml Wasser wurden 0,5 g (0,52 mmol) des in Beispiel 2 erhaltenen Mo­ noazid-Derivats gelöst. Zu dieser Mischung wurden 40 mg Palladi­ um/Kohlenstoff zugegeben und dann wurde 3 h lang Wasserstoffgas bei Raumtemperatur eingeleitet. Die Reaktionsflüssigkeit wurde positiv bei der Ninhydrin-Färbung.

Der Katalysator wurde durch Abfiltrieren unter vermindertem Druck entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann aus Aceton ausgefällt, wobei man 0,41 g (Ausbeute 81%) Mono-6-amino-6-deoxy-α- cyclodextrin erhielt.
TLC-Analyse:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Rf-Wert:
0,43 (Mono-6-amino-6-deoxy-α-cyclodextrin) und
0,49 (Monoazido-Derivat)
TLC: Merck, Kieselgel 60F 254
Massenspektrometrie-Bedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, Laserionisierungszeit des Flug-Massenspek­ trometers (MALDI IV)
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[(M-1)+Na]⁺: 994

Beispiel 4 Synthese von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-α-cyclodextrin (NCS-α-CD)

In 25 ml DMF wurden 0,4 g (0,42 mmol) des durch die Reaktion gemäß Bei­ spiel 3 erhaltenen Monoamino-Derivats gelöst und es wurden 0,5 ml Schwe­ felkohlenstoff zugegeben. Die resultierende Lösung wurde unter einem Stick­ stoffstrom auf 3°C abgekühlt und während des Rührens der Lösung wurden 90 mg (0,44 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in einer DMF-Lösung zugetropft. Nachdem die Zugabe beendet worden war, wurde die Reaktionstemperatur wieder auf Raumtemperatur gebracht und dann wurde die Mischung etwa 4 h lang gerührt. Wenn die Ninhydrin-Färbung negativ geworden war, wurde die Reaktion beendet. Es wurde bestätigt, daß die Ninhydrin-Färbung negativ ge­ worden war, der Fleck des Aminoderivats bei der TLC berschwunden war und ein neuer Fleck, der auf das Produkt zurückzuführen war, aufgetreten war.

Das DMF wurde durch Verdampfen entfernt und es wurde Aceton zu dem Rückstand zugegeben, um einen Niederschlag zu bilden. Dieses Verfahren wurde einmal wiederholt und dann wurde der gesammelte Niederschlag in Wasser gelöst und dann aus Aceton ausgefällt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 0,27 g (Ausbeute 65 %, Reinheit nicht unter etwa 80% (gemäß TLC)) Mono-6-isothiocyanato-6- deoxy-α-cyclodextrin in Form eines blaßgelben Pulvers erhielt.
TLC-Analyse:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Rf-Wert:
0,47 (Monoisothiocyanato-Derivat) und
0,43 (Monoamino-Derivat)
Massenspektrometrie-Bedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, Laserionisierungszeit des Flug-Massenspek­ trometers (MALDI IV)
Matrix: DHBA (Gentisinsäure) (Fig. 1)
[M+Na]⁺: 1036, [(M-HNCS)+Na]⁺: 977, [NH₂-α-CDM+Na]⁺: 995 (vgl. Fig. 1)
IR-Analysen-Bedingung:
Apparatur: JIR-WINSPEC Fourier-Transformations-Infrarot-Absorptionsspek­ trophotometer, hergestellt von der Firma JEOL Co., Ltd.
2 100 cm^-1 (KBr, Isothiocyanat-Gruppe, vgl. Fig. 2)
NMR-Analysenbedingungen:
Apparatur: kernmagnetische Resonanzapparatur vom Typ LA300, hergestellt von der Firma JEOL Co., Ltd. Das gleiche analytische System wurde auch in den folgenden Versuchen verwendet.
¹³C (DMSO-d₆, TMS, δ ppm): 129,4 (NCS-Gruppe, vgl. Fig. 3).

Beispiel 5 Synthese von Mono-6-O-(4-tolylsulfonyl)-6-deoxy-β-cyclodextrin

In einer Stickstoffatmosphäre wurden 200 ml Pyridin und 20 g (17,6 mmol) -β- Cyclodextrin auf etwa 30°C erhitzt und vollständig aufgelöst. Nachdem sie sich aufgelöst hatten, wurde die Mischung mit einem Eisbad auf etwa 0°C abge­ kühlt. Dann wurden, während die Mischung ausreichend gerührt wurde, 6,7 g (35 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid auf einmal zugegeben. Nachdem die Mi­ schung 2 h gerührt worden war, wurde das Ende der Reaktion durch TLC be­ stätigt und dann wurden 5 ml Wasser zu der Mischung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt, wobei man 42 g eines transparenten und farblo­ sen sirupartigen Materials erhielt, das eine große Menge Lösungsmittel ent­ hielt. Von diesem sirupartigen Material wurden 3 g einer Trennung und Reini­ gung durch Kolonnenchromatographie unterworfen und dann gefriergetrock­ net, wobei 640 mg Mono-6-O-(4-tolylsulfonyl)-6-deoxy-β-cyclodextrin (Monotosyl-Derivat) in Form eines weißen Pulvers erhielt.
TLC-Analyse:
Platte: Fuji Silysia Chem. Co., Silikagel NH2 TLC Platte
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton (2 : 2 : 15 : 100)
Monotosyl-Derivat: Rf = 0,45
Ditosyl-Derivat: Rf=0,70
β-Cyclodextrin: Rf=0,35
Kolonnenchromatographie-Analysebedingungen:
Kolonne: Fuji Silysia Chem. Co., Silikagel
Chromatorex NH-DM1020
silanierter Aminopropyl-Typ, 100-200 mesh (0,147-0,074 mm)
Porengröße 100A 50ID*400 mm
Eluat: 60% Acetonitril, Strömungsgeschwindigkeit 20 ml/min
Nachweis: entsprechend der obengenannten TLC-Analyse
IR-Analyse (FT/IR-200, hergestellt von der Firma JASCO Corporation Co.,
Ltd., KBr): 1340 cm^-1 (ν_als SO₂ der Sulfonatgruppe)

Beispiel 6 Synthese von Mono-6-azido-6-deoxy-β-cyclodextrin

In einer Mischung von 50 ml Dimethylformamid und 2 ml Wasser wurden 1,0 g (0,78 mmol) des in Beispiel 5 erhaltenen Monotosyl-Derivats und 900 mg (13,8 mmol) Natriumazid etwa 3 h bei 90 bis 100°C gerührt. Dann wurde das Ende der Reaktion durch TLC bestätigt. Nachdem das Lösungsmittel durch Ein­ dampfen unter vermindertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Trennung und Reinigung durch Kolonnenchromatographie unterworfen. Die so erhaltene abgetrennte Fraktion wurde gefriergetrocknet, wobei man 860 mg (Ausbeute: 96%) eines Azidderivats in Form eines weißen Pulvers erhielt.
TLC-Analyse:
Platte: Fuji Silysia Chem. Co., Silikagel NH2 TLC-PIatte
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton (2 : 2 : 15 : 100)
Monotosylderivat: Rf=0,45
Azidderivat: Rf=0,40
Kolonnenchromatographie-Analysebedingungen:
Kolonne: Fuji Silysia Chem. Co., Silikagel Chromatorex NH-DM1020
silanierter Aminopropyl-Typ, 100 bis 200 mesh (0,147-0,074 mm), Porengröße 100A 50ID*400 mm
Eluat: 60% Acetonitril, Strömungsgeschwindigkeit 20 ml/min
Nachweis: entsprechend der obengenannten TLC-Analyse
IR-Analyse (Nippon Bunko Kogyo, FT/IR-200, KBr wie nachstehend):
2120 cm^-1 (Azidgruppe)

Beispiel 7 Synthese von Mono-6-amino-6-deoxy-β-cyclodextrin

In einer Stickstoffatmosphäre wurden 860 mg (0,74 mmol) des in Beispiel 6 erhaltenen Monoazid-Derivats (6-Azido-6-deoxycyclohexamylose) und 200 mg 10% Palladium auf Kohlenstoff (enthaltend 50% Wasser, hergestellt von der Firma Wako Pure Chemical Corporation) in einem Gemisch von 50 ml Wasser und 50 ml Ethanol bei Raumtemperatur gerührt, es wurde Wasserstoffgas ein­ geleitet und etwa 4 h lang damit reagieren gelassen. Das Ende der Reaktion wurde durch TLC bestätigt. Der Katalysator wurde herausfiltriert und das Lö­ sungsmittel in dem Filtrat wurde durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde gefriergetrocknet, wobei man 750 mg (Ausbeute: 89%) eines Monoamin-Derivats in Form eines weißen Feststof­ fes erhielt.
TLC-Analysebedingungen:
Platte: Fuji Silysia Chem. Co., Silikagel NH2 TLC-Platte
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton (2 : 2 : 15 : 100)
Monoamin-Derivat: Rf=0,35
Azidderviat: Rf=0,40
MS-Analyse (JEOL JMS/AX-505, hergestellt von der Firma JEOL Co., Ltd.): 1134(M⁺)

Beispiel 8 Synthese von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β-cyclodextrin

In einer Stickstoffatmosphäre wurden 300 mg (0,265 mmol) des in Beispiel 7 erhaltenen Monoamin-Derivats in 15 ml DMF gelöst. Dann wurden, während die Mischung mit Eis gekühlt wurde, 23 mg (0,3 mmol) Schwefelkohlenstoff und 62 mg (0,3 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nachdem die re­ sultierende Mischung etwa 6 h gerührt worden war, wurde durch TLC bestätigt, daß das Monoamin-Derivat verschwunden war. Nachdem 1 ml Wasser zu dem Reaktionssystem zugegeben worden war, wurde die Mischung über Nacht in einem Kühlschrank stehen gelassen. Der dadurch ausgefallene Dicyclohexyl­ harnstoff wurde herausfiltriert. Dann wurde das Filtrat zu 50 ml Wasser zuge­ geben, während gerührt wurde, und die Mischung wurde gefriergetrocknet, wodurch 215 mg Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β-cyclodextrin (mit einer Reinheit von nicht weniger als 80% gemäß TLC-Analyse) erhalten wurden.
TLC-Analyse:
Platte: Fuji Silysia Chem. Co., Silikagel NH2 TLC-Platte
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton (2 : 2 : 15 : 100)
Monoamin-Derivat: Rf=0,35
Isothiocyanat-Derivat: umgesetzt auf einer TLC-Platte und zurückgeblieben auf der ursprünglichen Position
IR-Analyse: 2120 cm^-1 (Isothiocyanat-Gruppe, vgl. Fig. 4).
NMR-Analyse:
¹³C (DMSO-d₆, TMS, δ ppm): 129,4 (NCS-Gruppe, vgl. Fig. 5)
Massenspektrometrie-Bedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, Laserionisierungszeit des Flug- Massenspektrometers (MALDI IV) (das gleiche analytische System wurde auch in den folgenden Versuchen verwendet).
Matrix: DHBA (Gentisinsäure) (vgl. Fig. 6)
[M+Na]⁺: 1 200 (vgl. Fig. 6).

Beispiel 9 Synthese von Mono-6-O-(2-naphthalinsulfonyl)-6-deoxy-γ-cyclodextrin

In einer Stickstoffatmosphäre wurden 50 g (38,6 mmol) γ-Cyclodextrin zu 300 ml Pyridin zugegeben und dann wurde die Mischung mit einem Eisbad auf 5°C abgekühlt. Die Reaktionstemperatur wurde bei 5 bis 7°C gehalten und wäh­ rend die Mischung gerührt wurde, wurden 20 g (88,2 mmol) Naphthalinsul­ fonylchlorid in mehreren Portionen innerhalb etwa 1 h zugegeben. Unmittelbar nachdem diese Zugabe beendet worden war, wurden 50 ml Wasser zu der Mischung zugegeben, um die Reaktion abzustoppen. Die Reaktionslösung wurde eingeengt und dann wurde ein großer Überschuß an Aceton zugege­ ben. Ein dadurch erhaltener weißer Niederschlag wurde abfiltriert und abge­ trennt. Das resultierende Pulver wurde getrocknet und dann in 200 ml DMF gelöst. Während diese Mischung gerührt wurde, wurde Acetonitril aus einem Scheidetrichter zugetropft. Danach wurde der sich abscheidende anfängliche Niederschlag (der hauptsächlich aus nicht-umgesetztem γ-Cyclodextrin be­ stand) abfiltriert, es wurde weiteres Acetonitril zu dem Filtrat zugetropft, wo­ durch eine Fraktion, die hauptsächlich aus einem Mononaphthylsulfonyl- Derivat bestand, in Form eines weißen Pulvers erhalten wurde.

Dieses Pulver wurde in 500 ml Wasser suspendiert und die Mischung wurde über Nacht bei 50°C gerührt, wodurch das zurückbleibende nicht-umgesetzte γ-Cyclodextrin gelöst wurde. Der resultierende Niederschlag wurde abfiltriert, getrocknet und dann in DMF gelöst. Zu dieser Lösung wurde Aceton zugetropft und der dadurch abgeschiedene Niederschlag wurde abfiltriert und getrocknet, wobei man 5,3 g (Ausbeute: 9,3%) praktisch reines Mono-6-O-(2-naphthalin­ sulfonyl)-6-deoxy-γ-cyclodextrin erhielt.
HPLC-Analyse:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Nachweis: Brechungsindex-Detektor RID-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Retentionszeit des Mononaphthalinsulfonyl-Derivats: 4,8 min

Beispiel 10 Synthese von Mono-6-azido-6-deoxy-γ-cyclodextrin

In einer Mischung von 100 ml Dimethylformamid und 10 ml Wasser wurden 9,1 g (6,1 mmol) des in Beispiel 1 erhaltenen Mononaphthalinsulfonyl-Derivats und 3,9 g (60 mmol) Natriumazid gelöst und die resultierende Mischung wurde auf 95 bis 100°C erhitzt und 4 h lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen entfernt. Aus dem so erhaltenen sirupartigen Rückstand wurde durch präparative HPLC eine Peak-Komponente mit einer Retentionszeit von 4,7 min konzentriert. Die resultierende Konzentration wurde aus Aceton ausge­ fällt, wodurch man 1,4 g (Ausbeute: 16%) Mono-6-azido-6-deoxy-γ- cyclodextrin erhielt.
HPLC-Analysen-Bedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Nachweis: Brechungsindexdetektor RID64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Retentionszeit von N3-γ-CD: 4,7 min
Präparative HPLC-Bedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1 000 mm
Füllung: Fuji Chemical Industry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
IR-Analyse: 2 100 cm^-1 (Azidogruppe)

Beispiel 11 Synthese von Mono-6-amino-6-deoxy-γ-cyclodextrin

In 100 ml Wasser wurden 3,2 g (2,4 mmol) des in Beispiel 10 erhaltenen Mo­ noazid-Derivats gelöst. Zu dieser Mischung wurden 600 mg Palladium auf Kohlenstoff zugegeben und bei Raumtemperatur wurde 2 h lang Wasserstoff­ gas eingeleitet. Die Reaktionsflüssigkeit wurde bei der Ninhydrin-Färbung positiv.

Der Katalysator wurde durch Filtrieren unter vermindertem Druck entfernt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann aus Aceton aus­ gefällt, wobei man Mono-6-amino-6-deoxy-γ-cyclodextrin erhielt. Der so erhal­ tene weiße Niederschlag wurde unter vermindertem Druck getrocknet und dann so wie er vorlag in der nächsten Reaktion verwendet.

Beispiel 12 Synthese von Mono-6-isothiocyanato-6-γ-deoxcyclodextrin (NCS-γ-CD)

In 100 ml DMF wurde das bei der Reaktion des Beispiels 11 erhaltene Mono­ amino-Derivat gelöst und es wurden 10 ml (etwa 0,16 mol) Schwefelkohlen­ stoff zugegeben. Die resultierende Lösung wurde unter einem Stickstoffstrom auf 3°C abgekühlt und während sie gerührt wurde, wurden 570 mg (3,00 mmol) N-Ethyl-N′-(N,N-dimethyl-3-aminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid (hergestellt von der Firma Osaka Organic Chemical Laboratory) in einer DMF-Lösung zu­ getropft. Nachdem diese Zugabe beendet worden war, wurde die Reaktion­ stemperatur wieder auf Raumtemperatur zurückgeführt und dann wurde die Mischung etwa 4 h lang gerührt. Nachdem bestätigt worden war, daß die Nin­ hydrin-Färbung negativ geworden war, wurde die Reaktion beendet.

Das DMF wurde durch Eindampfen entfernt. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge DMF gelöst und es wurde ein großer Überschuß an Aceton zugegeben, wodurch ein Niederschlag ausfiel. Nachdem diese Arbeitsweise einmal wiederholt worden war, wurde der gesammelte Niederschlag in Wasser gelöst und dann aus Aceton ausgefällt. Der so erhaltene Niederschlag wurde unter vermindertem Druck getrocknet, wobei man 2,00 g (Ausbeute: 62%) Mono-6-isothiocyanato-6-γ-deoxycyclodextrin in Form eines weißen Pulvers erhielt.
IR-Analyse:
2 100 cm^-1 (Isothiocyanat(NCS)-Gruppe, vgl. Fig. 7)
NMR-Analyse
¹³C (DMSO-d₆, TMS, δ ppm): 129,5 (NCS-Gruppe, vgl. Fig. 8)
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1361 [NH₂-γ-CD-Na]⁺: 1320 (vgl. Fig. 9).

Beispiel 13 Synthese von Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl )-6-deoxy-(maltosyl)-β-cyclodextrin (Ts-G2-β-CD)

In einer Stickstoffatmosphäre wurden, während 30 g (20,6 mmol) Maltosyl-β- cyclodextrin in 300 ml Pyridin bei Raumtemperatur gerührt wurden, 6,0 g (31,5 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid in mehreren Portionen zugegeben. Die resultie­ rende Mischung wurde so wie sie erhalten wurde über Nacht bei Raumtempe­ ratur gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt, wodurch ein sirupartiges Rohprodukt erhalten wurde. Bei der HPLC- Analyse wurden 4 Peaks in diesem Rohprodukt festgestellt. Der erste, der letzte und der dritte Peak stammten, wie bestätigt wurde, von überschüssigem p-Toluolsulfonat, nicht-umgesetztem Maltosyl-β-cyclodextrin bzw. von dem Hauptprodukt. Dieses Hauptprodukt wurde entfernt und durch präparative HPLC gereinigt. Aus der Fraktion, mit der die dem dritten Peak entsprechende Komponente, d. h. das Hauptprodukt oder Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-6-de­ oxy-(maltosyl)-β-cyclodextrin eluiert worden war, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Dann wurde die restliche wäßrige Lösung gefriergetrocknet, wodurch 8,9 g (Ausbeute: 27%) eines weißen Pulvers erhal­ ten wurden.
Instrumente der H PLC-Analyse und Anwendungsbedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation Co., Ltd., LC-64
Nachweis: Brechungsindex-Detektor RID-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Retentionszeit von Ts-G2-β-CD: 4,7 min
Instrumente der präparativen HPLC und Anwendungsbedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1000 mm
Füllung: Fuji Chemical Industry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
NMR-Analyse:
¹³C (DMSO-d₆, TMS, δ ppm): 21,0 (Methyl der Tosylgruppe, vgl. Fig. 11)
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+1- Na]⁺: 1637 [M-Glu(Glucosyl-Gruppe)+Na]⁺: 1438 (vgl. Fig. 10).

Beispiel 14 Synthese von Mono-6-azido-6-dioxy-(maltosyl)-β-cyclodextrin (N3-G2-β-CD)

In einer Mischung von 100 ml Dimethylformamid und 10 ml Wasser wurden 8,2 g (5,1 mmol) des in Beispiel 13 erhaltenen Monotosyl-Derivats und 2,0 g (30,8 mmol) Natriumazid gelöst. Während die Mischung gerührt wurde, wurde sie auf 95 bis 100°C erhitzt. Die Reaktion wurde durch HPLC verfolgt und etwa 3 h später, als der Peak des Monotosyl-Derivats verschwand und ein neuer Peak mit einer Retentionszeit von 4,9 min entstanden war, wurde die Reaktion be­ endet. Dann wurde das Lösungsmittel durch Eindampfen entfernt und aus dem resultierenden sirupartigen Rückstand wurde die p-Toluolsulfonsäure isoliert und durch präparative HPLC entfernt. Der Rest wurde gefriergetrocknet, wobei man 6,5 g (Ausbeute: 86%) Mono-6-azido-6-deoxy-(maltosyl)-β-cyclodextrin erhielt.
Instrumente zur Durchführung der HPLC-Analyse und Anwendungsbedingun­ gen:
Apparatur: Shimadzu Corporation Co., Ltd., LC-64
Nachweis: Brechungsindexindex-Detektor RI D-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Retentionszeit von N3-G2-β-CD: 4,9 min
Instrumente zur Durchführung der präparativen HPLC und Anwendungsbedin­ gungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1000 mm
Füllung: Fuji Chemical lndustry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
IR-Analyse: 2100 cm¹ (Azidogruppe) (vgl. Fig. 12)
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1483, [(M+1+Na)]⁺: 1509 (vgl. Fig. 13)
¹³C (DMSO-d₆, TMS, δ ppm): (vgl. Fig. 14)

Beispiel 15 Synthese von Mono-6-amino-6-deoxy-(maltosyl)-β-cyclodextrin (NH2-G2-β- CD)

In 200 ml Wasser wurden 6,2 g (4,2 mmol) des in Beispiel 14 erhaltenen Mo­ noazid-Derivats gelöst. Zu dieser Mischung wurden 1,5 g Palladium auf Koh­ lenstoff (hergestellt von der Firma Wako Pure Chemicals Corporation) zuge­ geben und während die Mischung stark gerührt wurde, wurde Wasserstoffgas eingeleitet. Während die Reaktion durch HPLC überwacht wurde, wurde be­ stätigt, daß der Peak des Azid-Derivats innerhalb von etwa 2 h verschwunden war und dann wurde die Reaktion beendet. Die Reaktionsflüssigkeit wurde positiv gegenüber der Ninhydrin-Färbung.

Nachdem der Katalysator durch Filtrieren unter vermindertem Druck entfernt worden war, wurde das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und dann gefriergetrocknet, wobei 5,7 g (Ausbeute: 94%) Mono-6-amino-6-deoxy-(mal­ tosyl)-β-cyclodextrin erhalten wurden.
HPLC-Analysenbedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Nachweis: Brechungsindex-Detektor RID 64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Retentionszeit von NH2-G2-γ-CD: 3,2 min
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA
[M+Na]⁺: 1482, [M-Glu(Glucosyl-Gruppe)]⁺: 1319
NMR-Analyse: vgl. Fig. 15.

Beispiel 16 Synthese von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-maltosyl-β-cyclodextrin (NCS- G2-β-DC)

In 100 ml DMFF wurden 5,7 g (4,2 mmol) des in Beispiel 15 erhaltenen Mono­ amino-Derivats gelöst und es wurden 0,5 ml (etwa 8 mmol) Schwefelkohlen­ stoff zugegeben. Die resultierende Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und wäh­ rend sie gerührt wurde, wurden 0,97 g (4,7 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid in einer DMF-Lösung innerhalb von etwa 1 h zugetropft. Nach 6-stündigem Rüh­ ren bei 0°C wurde die Mischung wieder auf Raumtemperatur gebracht und dann so wie sie erhalten worden war über Nacht kontinuierlich gerührt. Es wurde bestätigt, daß die Reaktionsflüssigkeit gegenüber der Ninhydrinfärbung negativ war. Nach der Reaktion wurde durch HPLC-Analyse bestätigt, daß ein neuer Peak bei einer Retentionszeit von 5,0 min nachgewiesen waren war.

Die Reaktionsflüssigkeit wurde eingeengt. Zu dem resultierenden sirupartigen Rückstand wurde Wasser zugegeben und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die dadurch ausgefallenen Kristalle wurden abfiltriert. Das Filtrat wurde weiter eingeengt, in einem Lösungsmittel aus Acetonitril/Wasser = 3 : 2 gelöst und dann durch präparative HPLC gereinigt, wobei man 3,45 g (Ausbeute: 59%) Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-maltosyl- β-cyclohdextrin erhielt.

Das so erhaltene Produkt wurde unter vermindertem Druck getrocknet und dann einer NMR-Messung in DMSO unterworfen (vgl. Fig. 16). Ein von C6 stammendes Signal, ein von C2, C3 und C4 stammendes Signal, ein von C5 stammendes Signal und ein von C1 stammendes Signal wurden bestätigt bei 61,0 bis 60,1 ppm, 73,5 bis 66,7 ppm, 83,2 bis 79,8 ppm bzw. 102,1 bis 99,2 ppm (vgl. Formel (III)).

Außerdem wurden zwei neue Signale bestätigt bei 128 bis 126 ppm und es wurde gefunden, daß sie zu dem Kohlenstoffatom der Isothiocyanatgruppe gehörten. Auf diese Weise wurden mindestens zwei Signale unter diesen Ver­ suchsbedingungen bestätigt, was anzeigt, daß ein Gemisch vorlag aus einer Isothiocyanatgruppe, die durch eine primäre Hydroxylgruppe von Glucose in einem cyclischen Abschnitt substituiert war, und einer Isothiocyanatgruppe die durch eine primäre Hydroxylgruppe von Glucose in einem verzweigten Ab­ schnitt substituiert war.
Instrumente zur Durchführung der HPLC-Analyse und Anwendungsbedingun­ gen:
Apparatur: Shimadzu Corporatiop, LC-64
Nachweis: Brechungsindex-Detektor RID-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Instrumente zur Durchführung der präparativen HPLC und Anwendungsbedin­ gungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1000 mm
Füllung: Fuji Chemical Industry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1523, [(M-HNCS)⁺: 1464, [NH2-G2-β-CD (Hydrolyseprodukt)]⁺:1481, [M-H₂O+Na]⁺: 1505 (vgl. Fig. 17).

Beispiel 17 Synthese von Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-8-deoxy(glucosyl)-β-cyclodextrin (Ts-G1 -β-CD)

In einer Stickstoffatmosphäre wurden, während 30 g (23,1 mmol) Glucosyl-β- cyclodextrin in 300 ml Pyridin bei Raumtemperatur gerührt wurden, 6,61 g (34,7 mmol) p-Toluolsulfonylchlorid in mehreren Portionen zugegeben. Die resultierende Mischung wurde so wie sie erhalten worden war über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde das Lösungsmittel unter verminder­ tem Druck entfernt, wodurch ein sirupartiges Rohprodukt erhalten wurde. Bei der HPLC-Analyse wurden 4 Peaks in diesem Rohprodukt festgestellt. Der er­ ste, der letzte und der dritte Peak waren, wie bestätigt wurde, zurückzuführen auf überschüssiges p-Toluolsulfonat, nicht-umgesetztes Glucosyl-β-cyclodex­ trin bzw. das Hauptprodukt. Dieses Hauptprodukt wurde abgetrennt und durch präparative HPLC gereinigt. Aus der Fraktion, die dem dritten Peak, d. h. dem Hauptprodukt oder Mono-6-O-(4-toluolsulfonyl)-6-deoxy-(glucosyl)-β-cyclodex­ trin entsprach, wurde das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Dann wurde die zurückbleibende wäßrige Lösung gefriergetrocknet, wodurch 11,2 g (Ausbeute: 33,4%) eines weißen Pulvers erhalten wurden.
Instrumente zur Durchführung der HPLC-Analyse und Anwendungsbedingun­ gen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Nachweis: Brechungsindex-Detektor RID-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Retentionszeit von Ts-G1-β-CD: 5,0 min
Instrumente zur Durchführung der präparativen HPLC und Anwendungsbedin­ gungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1000 mm
Füllung: Fuji Chemical lndustry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetontril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M-1+Na]⁺: 1474, [(M-Glu+Na]⁺: 1300, (vgl. Fig. 18)
NMR-Analyse:
¹³C (DMSO-d₆, TMS, δ ppm): 21,0 (Methylgruppe von Tosyl) (vgl. Fig. 19)

Beispiel 18 Synthese von Mono-6-azido-6-deoxy-(glycosyl)-β-cyclodextrin N3-G1-β-CD

In einer Mischung von 100 ml Dimethylformamid und 10 ml Wasser wurden 11,0 g (7,58 mmol) des in Beispiel 17 erhaltenen Monotosyl-Derivats und 1,5 g (23 mmol) Natriumazid gelöst. Während die Mischung gerührt wurde, wurde sie auf 95 bis 100°C erhitzt. Während die Reaktion durch HPLC überwacht wurde, wurde nach etwa 3 h, als der dem Monotosyl-Derivat entsprechende Peak verschwunden war und ein neuer Peak mit einer Retentionszeit von 4,9 min beobachtet worden war, die Reaktion beendet. Dann wurde das Lö­ sungsmittel durch Eindampfen entfernt und aus dem resultierenden siruparti­ gen Rückstand wurde p-Toluolsulfonsäure isoliert und durch präparative HPLC entfernt. Der Rest wurde gefriergetrocknet, wobei man 9,5 g (Ausbeute: 95%) Mono-6-azido-6-deoxy-(glucosyl )-β-cyclodextrin erhielt.
Instrumente für die HPLC-Analyse und Anwendungsbedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Nachweis: Brechungsindexdetektor RID-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Instrumente für die präparative HPLC und Anwendungsbedingungen:
Apparatur: Shamidzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1000 mm
Füllung: Fuji Chemical Industry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
IR-Analyse: 2100 cm^-1 (Azidogruppe)
Massenspektrometrie-Analyse:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1345

Beispiel 19 Synthese von Mono-6-amino-6-deoxy-(glucosyl)-β-cyclodextrin (NH2-G1-β- CD

In 200 ml Wasser wurden 8,7 g (6,56 mmol) des in Beispiel 18 erhaltenen Mo­ noazid-Derivats gelöst. Zu dieser Mischung wurden 800 mg Palladium- Kohlenstoff (hergestellt von der Firma Wako Pure Chemicals Corporation) zu­ gegeben und während die Mischung stark gerührt wurde, wurde Wasserstoff­ gas eingeleitet. Während die Reaktion durch HPLC überwacht wurde, wurde bestätigt, daß der dem Azid-Derivat entsprechende Peak innerhalb von etwa 2 h verschwunden war und somit die Reaktion beendet war. Die Reaktionslö­ sung wurde gegenüber der Ninhydrin-Färbung positiv.

Nachdem der Katalysator durch Filtrieren unter vermindertem Druck entfernt worden war, wurde das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und dann gefriergetrocknet, wobei man 8,04 g (Ausbeute: 91,5%) Mono-6-amino-6- deoxy-(glucosyl)-β-cyclodextrin erhielt.
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+1+Na]⁺: 1320

Beispiel 20 Synthese von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-glucosyl-β-cyclodextrin (NCS- G1-β-CD)

In 100 ml DMF wurden 8,04 g (6,02 mmol) des in Beispiel 19 erhaltenen Mo­ noamino-Derivats gelöst und es wurde 1,0 ml (etwa 16 mmol) Schwefelkoh­ lenstoff zugegeben. Die resultierende Lösung wurde auf 0°C abgekühlt und während sie gerührt wurde, wurden 1,38 g (7,22 mmol) N-Ethyl-N′-(N,N- dimethyl-3-aminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid in einer DMF-Lösung inner­ halb von etwa 1 h zugetropft. Danach wurde die Mischung wieder auf Raum­ temperatur gebracht und dann so wie sie erhalten worden war kontinuierlich über Nacht gerührt.

Die Reaktionslösung wurde eingeengt und der resultierende sirupartige Rück­ stand wurde in einer geringen Menge DMF gelöst. Dann wurde ein großer Überschuß Aceton zugegeben, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Die­ ser Niederschlag wurde in Wasser gelöst, auf eine Sephadex G-25-Kolonne (20 mm × 200 mm) aufgegeben und dann mit Wasser eluiert, wodurch braune Verunreinigungen, die durch das Harz absorbiert wurden, entfernt wurden. Ein transparentes blaßgelbes Eluat wurde gesammelt und gefriergetrocknet, wobei man 2,51 g (Ausbeute: 31%) Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-glucosyl-β- cyclodextrin in Form eines gelben Pulvers erhielt.

Die HPLC-Analyse des obengenannten Produkts bestätigte nach der Reini­ gung einen neuen Peak bei einer Retentionszeit von 5,7 min. Außerdem wur­ den bei der NMR-Messung ein von C6 stammendes Signal, ein von C2, C3 und C4 stammendes Signal, ein von C5 stammendes Signal und ein von C1 stammendes Signal bestätigt bei 60,6 bis 59,6 ppm, 72,8 bis 66,4 ppm, 82,7 bis 80,8 ppm bzw. 102,3 bis 98,9 ppm (vgl. Formel (III)).

Außerdem wurden zwei neue Signale bestätigt bei 129,0 bis 128,8 ppm und es wurde gefunden, daß sie zu dem Kohlenstoffatom der Isothiocyanatgruppe gehören. Dieses Produkt ist daher eine Mischung, in der die Isothiocyanat­ gruppe, die durch die primäre Hydroxylgruppe von Glucose in dem cyclischen Teil substituiert ist, und die Isothiocyanatgruppe, die durch die primäre Hydroxylgruppe von Glucose in dem verzweigten Teil substituiert ist, im Ver­ hältnis von etwa 1 : 1 vorliegen.
HPLC-Analysenbedingungen:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Nachweis: Brechungsindexdetektor RID-64
Kolonne: Kaseisorb LC-NH2, Super, 6 mm (Durchmesser) × 250 mm
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 1,0 ml/min
Präparative HPLC:
Apparatur: Shimadzu Corporation, LC-64
Kolonne: 40 mm (Durchmesser) × 1000 mm
Füllung: Fuji Chemical Industry Co., Ltd., NH-DU 3050
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Strömungsgeschwindigkeit: 30 ml/min
IR-Analyse: 2100 cm^-1 (Isothiocyanatogruppe, vgl. Fig. 21)
NMR-Analyse: vgl. Fig. 20 (¹³CNMR-Diagramm)
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1361, [(M-HNCS)+Naj+: 1302, [NH2G1-β-CD(Hydrolysepro­ dukt)+Na]⁺: 1319 (vgl. Fig. 22).

Beispiel 21 Markierung einer Aminosäure mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-α- cyclodextrin

Zu 1 ml (10 mM) DM50-Lösung von Mono-6-isothiocyanato-α-cyclodextrin wurde 1 ml (50 mM, pH 9) einer wäßrigen Glycinlösung zugegeben. Die resul­ tierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reakti­ onslösung war bei der Ninhydrin-Färbung negativ und ein von dem Isothiocya­ nat-Derivat verschiedener Fleck wurde bestätigt. Auch durch das Massenspek­ trum wurde der Stammpeak des Reaktionsprodukts, das durch das Isothiocya­ nato-Derivat und Glycin gebildet worden war, bestätigt.
TLC-Analysenbedingungen:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Reaktionsprodukt: Rf-Wert bei 0,47
TLC: Merck, Kieselgel 60 F254
Lösungsmittel: Chloroform/Methanol/Wasser = 8 : 3 : 1
Nachweis: Ninhydrin-Färbung
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1 111, [(NCS-α-CD-1+Na]⁺: 1036, [NCS-α-CD-HNCS-1+Na]⁺: 977 (vgl. Fig. 23).

Beispiel 22 Markierung von Benzylamin mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β-cyclodextrin

Zu 1 ml (10 mM) einer DM50-Lösung von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-β- cyclodextrin wurden 0,1 ml (10 mM) einer DM50-Lösung von Benzylamin zu­ gegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionslösung war bei der Ninhydrinfärbung negativ und es wurde ein von dem Isothiocyanato-Derivat verschiedener Fleck bestätigt. Au­ ßerdem wurde durch Massenspektrum der Stammpeak des Reaktionsprodukts bestätigt, der sich durch das Isothiocyanato-Derivat und Benzylamin gebildet hatte.
TLC-Analysenbedingungen:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 70% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Reaktionsprodukt: Rf-Wert bei 0,24
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1305

Beispiel 23 Markierung einer Aminosäure mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ- cyclodextrin

Zu 1 ml (0,5 mM, pH 9) einer wäßrigen Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ- cyclodextrinlösung, wurden 0,1 ml (0,5 mM, pH 9) einer wäßrigen L-Phenylala­ ninlösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch TLC überwacht. Es wurde bestätigt, daß der auf das Isothiocyanat-Derivat zurückzuführende Fleck ver­ schwunden war und daß ein neuer Fleck in einer davon verschiedenen Positi­ on festgestellt wurde. Die Reaktionslösung war bei der Ninhydrin-Färbung ne­ gativ. Auch durch das Massenspektrum wurde der Stammpeak des Reaktions­ produkts bestätigt, der sich durch das Isothiocyanat-Derivat und Phenylalanin gebildet hatte.
TLC-Analysenbedingungen:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Reaktionsprodukt: Rf-Wert bei 0,35
TLC: Merck, Kieselgel 60 F254
Lösungsmittel: Chloroform/Methanol/Wasser = 8 : 3 : 1
Nachweis: Ninhydrin-Färbung
Der Ninhydrin-Färbungstext wurde negativ als Folge der Reaktion mit der Isothiocyanatgruppe.
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1527

Beispiel 24 Markierung einer Aminosäure mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ-cyclo­ dextrin

Zu 1 ml (10 mM) einer DM50-Lösung von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ- cyclodextrin wurde 1 ml (50 mM, pH 9) einer wäßrigen Glycinlösung zugege­ ben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur ge­ rührt. Die Reaktionslösung war bei der Ninhydrinfärbung negativ. Es wurde bestätigt, daß sich ein neuer Fleck in einer von dem Isothiocyanato-Derivat verschiedenen Position gebildet hatte. Auch durch das Massenspektrum wur­ de der Stammpeak des Reaktionsprodukts bestätigt, das sich durch das Isothiocyanato-Derivat und Glycin gebildet hatte.
TLC-Analysenbedingungen:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Reaktionsprodukt: Rf-Wert bei 0,59
TLC: Merck, Kieselgel 60 F254
Lösungsmittel: Chloroform/Methanol/Wasser = 8 : 3 : 1
Nachweis: Ninhydrinfärbung
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1 111

Beispiel 25 Markierung einer Aminosäure mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-maltosyl-β- cyclodextrin

Zu 1 ml (0,5 mM, pH 9) einer wäßrige Lösung von Mono-6-isothiocyanato-6- dioxy-maltosyl-β-cyclodextrin wurden 0,1 ml (0,5 mM, pH 9) einer wäßrigen L- Phenylalaninlösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde durch TLC überwacht. Es wurde bestätigt, daß der auf das Isothiocyanato-Derivat zurückzuführende Fleck verschwunden war und daß ein neuer Fleck an einer davon verschiede­ nen Position entstanden war. Die Reaktionslösung war bei der Ninhydrin- Färbung negativ. Das Isothiocyanato-Derivat wurde mit dem TLC-Träger kom­ biniert und wanderte nicht aus dem Ursprung heraus (da die TLC-Oberfläche durch Erhitzen getrocknet worden war). Außerdem wurde durch das Massen­ spektrum der Stammpeak des Reaktionsprodukts bestätigt, das sich aus dem Isothiocyanato-Derivat und Phenylalanin gebildet hatte.
TLC-Analysenbedingungen:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Reaktionsprodukt: Rf-Wert bei 0,35
TLC: Merck, Kieselgel 60 F254
Lösungsmittel: Chloroform/Methanol/Wasser = 8 : 3 : 1
Nachweis: Ninhydrin-Färbung
Die Ninhydrin-Färbung wurde negativ als Folge der Reaktion mit der Isothiocyanatgruppe.
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1 687

Beispiel 26 Markierung einer Aminosäure mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-alucosyl-β- cyclodextrin

Zu 1 ml (0,5 mM, pH 9) einer wäßrigen Lösung von Mono-6-isothiocyanato-6- deoxy-glucosyl-β-cyclodextrin wurden 0,1 ml (0,5 mM, pH 9) einer wäßrigen L- Phenylalaninlösung zugegeben. Die resultierende Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Die Reaktion wurde durch TLC über­ wacht. Es wurde bestätigt, daß der auf das Isothiocyanato-Derivat zurückzu­ führende Fleck verschwunden war und daß ein neuer Fleck an einer davon verschiedenen Position festgestellt wurde. Die Reaktionslösung war bei der Ninhydrin-Färbung negativ. Auch durch das Massenspektrum wurde der Stammpeak des Reaktionsprodukts bestätigt, das sich aus dem Isothiocya­ nato-Derivat und Phenylalanin gebildet hatte.
TLC-Analysenbedingungen:
TLC: Merck, HPTLC-Fertigplatten NH₂
Lösungsmittel: 60% Acetonitril
Nachweis: Diphenylamin/Anilin/Phosphorsäure/Aceton = 2 : 2 : 15 : 100
Reaktionsprodukt: Rf-Wert bei 0,35
TLC: Merck, Kieselgel 60 F254
Lösungsmittel: Chloroform/Methanol/Wasser = 8 : 3 : 1
Nachweis: Ninhydrin-Färbung
Die Ninhydrin-Färbung wurde negativ als Folge der Reaktion mit der Isothiocyanatgruppe.
Massenspektrometrie:
Matrix: DHBA (Gentisinsäure)
[M+Na]⁺: 1526

Beispiel 27 Markierung von Insulin mit Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ-cyclodextrin

1 mg Insulin wurde in 0,01 N HCI vollständig gelöst. Dann wurde die resultie­ rende Lösung mit einem Puffer von pH 9 auf 1110 verdünnt. Von der auf diese Weise verdünnten Lösung wurde 1 ml mit 20 pl (10 mM) einer DM50-Lösung von Mono-6-isothiocyanato-6-deoxy-γ-cyclodextrin gemischt. Die resultierende Mischung wurde 3 Tage lang gerührt. Dann wurde die Reaktionslösung einer TOFMS-Messung unterworfen (vgl. Fig. 24) und es wurde der Stammpeak des markierten Insulins bestätigt.
Massenspektrometrie:
Matrix: SA (Sinapinsäure)
[M+Na]⁺: 7170, [Insulin]⁺: 5821, [Insulin-Dimer]: 11663.

Aus der vorstehend beschriebenen Erfindung geht hervor, daß sie in vielerlei Weise variiert werden kann. Diese Variationen werden nicht als Abweichung von dem Rahmen der vorliegende Erfindung angesehen und alle derartigen Modifikationen, die für den Fachmann auf diesem Gebiet offensichtlich sind, gehören in den Rahmen der vorliegende Erfindung und der nachfolgenden Patentansprüche.

Claims (3)

1. Cyclodextrin-Derivat, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eine primäre Hydroxylgruppe durch eine Isothiocyanatgruppe substituiert ist.

2. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeinen Formel (I): worin n für eine ganze Zahl von 5 bis 7 steht.

3. Verbindung, gekennzeichnet durch die allgemeine Formel (II): worin bedeuten:
n eine ganze Zahl von 5 bis 7,
m die Zahl 1 oder 2 und
X OH, NCS, OSO₂C₆H₄CH₃, N₃ oder NH₂, wobei mindestens ein X für NCS, OSO₂C₆H₄CH₃, N₃ oder NH₂ steht.