DE19618797A1 - Vehikel zum Transport molekularer Substanz - Google Patents

Vehikel zum Transport molekularer Substanz

Info

Publication number
DE19618797A1
DE19618797A1 DE19618797A DE19618797A DE19618797A1 DE 19618797 A1 DE19618797 A1 DE 19618797A1 DE 19618797 A DE19618797 A DE 19618797A DE 19618797 A DE19618797 A DE 19618797A DE 19618797 A1 DE19618797 A1 DE 19618797A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
capsomer
vehicle according
vehicle
capsid
dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19618797A
Other languages
English (en)
Other versions
DE19618797C2 (de
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
RESPONSIF GMBH, 91056 ERLANGEN, DE
Original Assignee
Bertling Wolf Prof Dr
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to DE19618797A priority Critical patent/DE19618797C2/de
Application filed by Bertling Wolf Prof Dr filed Critical Bertling Wolf Prof Dr
Priority to DE59709707T priority patent/DE59709707D1/de
Priority to EP97925841A priority patent/EP0914460B1/de
Priority to BR9708960-5A priority patent/BR9708960A/pt
Priority to AT97925841T priority patent/ATE236264T1/de
Priority to PCT/DE1997/000919 priority patent/WO1997043431A1/de
Priority to JP09540383A priority patent/JP2000510698A/ja
Priority to AU30881/97A priority patent/AU717543B2/en
Priority to US09/155,786 priority patent/US6165772A/en
Priority to CA002247392A priority patent/CA2247392A1/en
Priority to EA199800999A priority patent/EA001609B1/ru
Priority to CZ19983356A priority patent/CZ294762B6/cs
Publication of DE19618797A1 publication Critical patent/DE19618797A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE19618797C2 publication Critical patent/DE19618797C2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F7/00—Heating or cooling appliances for medical or therapeutic treatment of the human body
    • A61F7/02—Compresses or poultices for effecting heating or cooling
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F7/00—Heating or cooling appliances for medical or therapeutic treatment of the human body
    • A61F2007/0001—Body part
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F7/00—Heating or cooling appliances for medical or therapeutic treatment of the human body
    • A61F2007/0054—Heating or cooling appliances for medical or therapeutic treatment of the human body with a closed fluid circuit, e.g. hot water
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
    • A61F7/00—Heating or cooling appliances for medical or therapeutic treatment of the human body
    • A61F7/02—Compresses or poultices for effecting heating or cooling
    • A61F2007/0268—Compresses or poultices for effecting heating or cooling having a plurality of compartments being filled with a heat carrier
    • A61F2007/0273—Compresses or poultices for effecting heating or cooling having a plurality of compartments being filled with a heat carrier with openings in the walls between the compartments serving as passageways for the filler
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/22043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Description

Die Erfindung betrifft ein Vehikel zum Transport von moleku­ larer Substanz wie DNA, RNA, Protein, PNA, Arzneistoffe lipo­ philen und lipophoben Charakters in eukaryontische Zellen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung des Vehikels, dessen Verwendung sowie Zusammenstellungen von Mitteln zur Anwendung bzw. Durchführung der Erfindung.
Eukaryontische Zellen nehmen unter bestimmten Bedingungen DNA, Proteine und andere Moleküle auf. Die Aufnahmerate ist allerdings meist gering. Außerdem ist der Transport der mole­ kularen Substanz in bezug auf die Art der Zellen sowie die Zellkompartimente bzw. den Ort im Intrazellulärbereich nicht vorherbestimmbar.
Um insbesondere die Aufnahme von DNA in eukaryontische Zellen zu verbessern, ist es bekannt, virale Vektoren als Vehikel zum Transport in die Zelle zu verwenden. - Die Verwendung vi­ raler Vektoren ist nachteilig, weil es dabei zur Kotransfektion viraler Genome kommen kann.
Aus der US 4,950,599 ist des weiteren bekannt, molekulare Substanz wie DNA unter Verwendung leerer Viruskapside, insbe­ sondere Polyomakapside, in eukaryontische Zellen zu schleu­ sen. - Auch bei diesem Verfahren kann eine Kotransfektion vi­ raler Genome nicht ausgeschlossen werden. Außerdem können Moleküle, deren Größe das Innenvolumen des Polyomakapsids übertreffen, darin nicht verpackt werden. Schließlich ist ei­ ne synthetische Herstellung von Polyomakapsiden, die als Möglichkeit der Vermeidung einer Kotransfektion in Betracht kommt, äußerst schwierig und kostenaufwendig.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen, insbesondere ein Vehikel zum Transport molekularer Substanz in eukaryontische Zellen anzu­ geben, das universell verwendbar sowie einfach und kostengün­ stig herstellbar ist.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 16 und 19-21 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2-15 sowie 17 und 18.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Vehikel vorgesehen, das mindestens ein von einem Virus abgeleitetes oder stammendes Kapsomer aufweist, das an seiner einen Seite eine mit der mo­ lekularen Substanz in Wechselwirkungen tretende Struktur auf­ weist, so daß die molekulare Substanz an das Kapsomer bind­ bzw. anlagerbar ist.
Das erfindungsgemäße Vehikel hat den Vorteil, daß es relativ einfach synthetisch herstellbar ist. Somit kann eine Kotransfektion viraler Genome vermieden werden. Außerdem kann wegen des Vorsehenes der mit der molekularen Substanz in Wechselwirkung tretenden Struktur molekulare Substanz jegli­ cher Größe gebunden und damit verpackt und in Zellen ge­ schleust werden. Dazu muß die typische Kapsidform nicht mehr gewahrt werden. Unter Verwendung erfindungsgemäßer Vehikel bilden sich neben Kapsomeren auch andersartige schützende Formen aus. Ein besonderer Vorteil der Erfindung ist darin zu sehen, daß es mit dem erfindungsgemäßen Vehikel je nach Ausbildung des mindestens einen Kapsomers möglich ist, die molekulare Substanz spezifisch in bestimmte Zellen und/oder an einen vorgegebenen Ort im Intrazellulärbereich zu trans­ portieren.
Das Kapsomer ist vorzugsweise so ausgebildet, daß es zum Aufbau eines Kapsids oder eines kapsidartigen Gebildes geeig­ net ist. Von besonderem Vorteil ist es, wenn das Kapsomer spontan Kapside bildet.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal der Erfindung ist das Kapsomer vom Polyomavirus abgeleitet, wobei es aus dem VP1-Pentamer des Polyomavirus gebildet sein kann.
Alternativ dazu kann das Kapsomer aus "non-enveloped" Viren wie DNA-haltigen Papovaviridae, insbesondere Polyoma- und den Papillomaviren, lridoviridae, Adenoviridae, Parvoviridae oder RNA-haltigen Picornaviridae, insbesondere Polioviren, Caliciviridae, Reoviridae und Birnaviridae gewonnen oder da­ von abgeleitet sein. Je nach Art der zu transportierenden mo­ lekularen Substanz kann es auch von Vorteil sein, das Kapsomer aus der äußeren und/oder inneren Hülle von "enveloped" Viren wie DNA-haltigen Poxviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae oder RNA-haltigen Retroviridae, Paramyxoviridae, Sendaiviren, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Toroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae und Filoviridae zu gewinnen oder davon abzulei­ ten.
Bei den Wechselwirkungen handelt es sich zweckmäßigerweise um lipophile Wechselwirkungen und/oder Wechselwirkungen, die auf kovalenten, ionischen oder Wasserstoffbrücken-Bindungen beruhen. Damit ist sichergestellt, daß die molekulare Substanz beim Transport in die Zelle sicher am Vehikel gebun­ den bzw. angehaftet bleibt, sich jedoch nach vollzogenem Transport in die Zelle vom Vehikel löst bzw. durch zelluläre Systeme abgelöst werden kann.
Die Struktur kann bifunktionelle, vorzugsweise heterolog bi­ funktionelle Gruppen umfassen, wobei die bifunktionellen Gruppen vorzugsweise aus der Stoffgruppe der Maleinimid-Derivate, Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate, Glutardialdehyde, acrylierenden Reagentien und Imidoester ausgewählt sind. Dadurch wird insbesondere die Abgabe der molekularen Substanz im Lysosom, im zytoplasmatischen Raum oder im Kern erreicht.
Als besonders zweckmäßig hat es sich erwiesen, wenn die bi­ funktionellen Gruppen mit Cystein-Resten am Kapsomer reagie­ ren. Als vorteilhaft wird des weiteren angesehen, wenn die in Wechselwirkung tretende Struktur affinitätserhöhende Gruppen wie 4-Iodoacetamido-salicylsäure und/oder p-Arsonsäure­ phenyldiazonium-fluoroborat und/oder Derivate davon umfaßt. - Die Struktur kann auch durch Epitope des VP1-Pentamers ge­ bildet sein.
Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist ein Vehikel vorgesehen, wobei mit mindestens einem weiteren Kapsomer ein kapsidartiges Gebilde zum Transport der moleku­ laren Substanz in eine vorgegebene Art von Zellen bzw. an einen vorgegebenen Ort im Intrazellulärbereich herstellbar ist. Das weitere Kapsomer kann mindestens ein erfindungsgemäßes Kapsomer sein. Das kapsidartige Gebilde kann aber auch unter Verwendung nicht erfindungsgemäßer Kapsomere hergestellt werden. Die Wahl der Art der Kapsomere und deren Kombination zur Herstellung des kapsidartigen Gebildes hängt von der Art der Zelle bzw. vom vorgegebenen Ort im Intrazellulärbereich ab, in die bzw. an den die molekulare Substanz transportiert werden soll.
Zweckmäßigerweise ist die eine Seite des Kapsomers Bestandteil der Innenseite des kapsidartigen Gebildes, wobei das kapisidartige Gebilde vorzugsweise vom Polyomavirus abge­ leitet ist. Schließlich kann das kapsidartige Gebilde minde­ stens ein VP-2 und/oder VP-3 Protein umfassen.
Zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Vehikels ist ein die folgenden Schritte umfassendes Verfahren vorgesehen:
  • i) Synthetisieren, Aufreinigen oder Isolieren des Kapsomers und
  • ii) Komplexieren der molekularen Substanz unter Verwendung des Kapsomers.
Eine Weiterbildung des Verfahrens besteht darin, nach dem Schritt lit.i geeignete Reste des Kapsomers, insbesondere dessen Cystein-Reste, mit bifunktionellen Gruppen zu modifi­ zieren. Die Modifizierung kann zweckmäßigerweise unter Verwendung einer oder mehrerer der folgenden Stoffe durchge­ führt werden: Maleinimid-Derivate, Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate, Glutardialdehyde sowie acrylierenden Reagentien.
Das erfindungsgemäße Vehikel kann vorzugsweise als Arzneistoffträger zur Applikation von Molekülen wie DNA, RNA, Oligonukleotiden, PNA, Proteinen, Peptiden sowie von nieder­ molekularen lipophilen und lipophoben Reagenzien, von kolloi­ dalem Gold, Gold-markierten Proteinen und Peptiden in euka­ ryontische Zellen verwendet werden.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ferner einen Zusammenstellung des erfindungsgemäßen Vehikels mit zur Applikation geeigneten oder notwendigen Mitteln, bsp. Reagentien, Lösungsmitteln u.ä. vorgesehen. Gleichfalls ist eine Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen. Diese Zusammenstellung kann auch Geräte u. dgl. umfassen.
Folgende Beispiele zeigen Anwendungen dieser Erfindung:
1) Expression des VP1-Proteins von Polyomavirus in E.coli
Es wird ein Gen des VP1 Hüllproteins des murinen Polyomavirus hergenommen, das sowohl Sequenzmerkmale des Stammes A2 als auch des Stammes A3 aufweist. Die kodierende Sequenz begin­ nend mit dem ATG bzw. der darauf folgenden Aminosäure wird unmittelbar hinter einer Faktor Xa Schnittstelle in ein Derivat des kommerziell erhältlichen Vektors pQE 10 der Fa. Quiagen kloniert. Dieser Vektor versieht das Fusionsprotein Xa Schnittstelle-VP1 am Aminoterminus mit einer Histidinabfolge. Das so gewonnene Fusionskonstrukt ist inner­ halb eines Markergens (lacZ-Komplementation) kloniert und ist über den lacZ Promotor induzierbar. Das Endkonstrukt wird in für die Expression von pQE-Vektoren geeignete E.coli Zellen transformiert. Wenn die Zellen nach vorheriger Anzüchtung in der logarithmischen Phase sind, werden sie durch Zugabe eines geeigneten Induktors, bsp. IPTG, induziert. Sie exprimieren daraufhin große Mengen eines das VP1-Protein enthaltenden Fusionsproteins. Das Fusionsprotein wird nach 6-stündiger Induktion geerntet. Es liegt in löslicher Form vor und kann ohne größere Änderungen des Aufreinigungsprotokolls der Firma Quiagen über Nickelchelatsäulen rein dargestellt werden. Durch Inkubation mit Faktor Xa kann das reine VP1-Proteinanteil des Fusionsproteins von der Nickelchelatsäule wieder abgetrennt werden. Das erhaltene VP1-Protein liegt in sehr reiner Form vor und bildet von sich aus Pentamere. ana­ log können die Proteine VP2 und VP3 dargestellt werden.
Fig. 1 zeigt den gelelektrophoretischen Nachweis der VP3, VP2 und VP1-Fusionsproteine.
Fig. 2 zeigt links eine elektronenmikroskopische Ansicht von aus dem VP1-Protein gebildeten Pentameren und rechts eine computerunterstützte Darstellung der 5-fachen Symmetrie der Pentamere.
2) Modifikation der Cystein-Reste an der einen Seite der Pentamere vor deren Assemblierung
Die nach Beispiel 1 gewonnenen VP1-Pentamere besitzen mehrere Strukturen, die durch Reaktion mit geeigneten Reagenzien in bifunktionelle Gruppen umwandelbar sind. Die Strukturen be­ finden sich auf der Seite der Pentamere, die nach Assemblierung zum Kapsid dessen Innenseite entspricht. Als Reagenz wird ein in einer Aceton-Methanol-Wasser-Mischung dispergierter 3-Maleinimidobenzoyl-N-hydroxy-succinimidester verwendet, der auf der einen Seite des Reaktionszentrums als reaktive Gruppen 5H-Gruppen und auf der anderen Seite eine Reaktivestergruppe, nämlich einen aminogruppenreaktiven Succinimidester trägt. Die Dispersion wird mit den gelösten VP1-Proteinen gemischt, so daß eine quantitative Umsetzung erfolgt.
Aus Tabelle 1 sind die Loop-Strukturen ersichtlich, die auf der einer Seite der Kapsomere zu finden sind, welche nach der Assemblierung zur Innenseite des Kapsids bzw. der kapsidarti­ gen Struktur weisen:
Tabelle 1: Bevorzugte Reaktionsstellen auf der einen Seite von Polyomakapsomeren.
Loop 1: Asp 38, Leu 39, Val 40, Thr 41, Gly 42, Pro 43, Asp 44, Ser
Loop 2: Asn 109, Glu 110, Asp 111, Leu 112, Thr 113, Lys 114, Asp 115, Thr 116, Leu 117
Tail: N-Terminus von Aminosäurerest 1 bis Rest 29 (zumindest aber ab der in der Strukturanalyse gut lo­ kalisierten Aminosäure 18 vom N-Terminus bis zu Rest 29): Lys 18, Ala 19, Cys 20, Pro 21, Arg 22, Pro 23, Ala 24, Pro 25, Val 26, Pro 27, Lys 28 Leu 29
Toop 3: Tyr 354, Asp 355, Gly 356, Thr 357, Gln 358, Pro 359, Val 360.
3) Die Assemblierung von VP1-Pentameren zu VP1-Kapsiden
Die VP1-Pentamere liegen in einer Pufferlösung vor, die EGTA zur Stabilisierung des pentameren, nicht assemblierten Zustands enthält. Ferner sind der Pufferlösung Magnesium-Ionen, Natrium-Ionen und Tris/HCl pH 7,6 zur Stabilisierung des pH zugesetzt. Die Proteinlösung wird in eine Dialysekammer überführt und gegen eine 2M Ammoniumsulfatlösung dialysiert. Nach mehrfachem Wechsel des Dialysepuffers bilden die VP1-Pentamere Kapside. Diese unter­ scheiden sich weder bei Betrachtung im Elektronenmikroskop noch im Durchmesser, noch in Stabilität von leeren Kapsiden des Polyomavirus, obwohl ihnen die inneren Hüllproteine VP2 und VP3 fehlen.
Fig. 3 zeigt die hergestellten Pentamere und daraus gebildete Kapside.
4) Die Verpackung von DNA Oligonukleotiden in Polyoma-VP1 Kapside
Konventionelle, d. h. in ihrer chemischen Struktur nicht ver­ änderte Oligonukleotide, lassen sich nach folgendem Protokoll mit hoher Ausbeute in Polyoma-VP1 Kapside verpacken: Kapsidstrukturen, wie sie im Beispiel 3 gewonnen worden sind, werden auf pH 5,5 umgepuffert. Anschließend werden sie in ei­ ner osmotischen Schockprozedur mit einer equi- oder höher mo­ laren Menge, typischerweise mit einem zweifachen molaren Überschuß an Oligonukleotiden umgesetzt. Für die in diesem Beispiel verwendeten Oligonukleotide (20-mere) ergibt sich damit ein Gewichtsverhältnis von ca. 1 : 6 gegenüber dem VP1-Protein. Die Form der so erhaltenen, mit Oligonukleotiden be­ ladenen Kapside läßt sich im Elektronenmikroskop nicht von der unbeladener VP1-Kapside unterscheiden.
Fig. 4 zeigt eine elektronenmikroskopische Ansicht beladener VP1-Kapside.

Claims (21)

1. Vehikel zum Transport von molekularer Substanz wie DNA, RNA, Protein, PNA, Arzneistoffe lipophilen und lipo­ phoben Charakters, in eukaryontische Zellen umfassend mindestens ein von einem Virus abgeleitetes oder stam­ mendes Kapsomer, das an seiner einen Seite eine mit der molekularen Substanz in Wechselwirkungen tretende Struktur aufweist, so daß die molekulare Substanz an das Kapsomer bind- bzw. anlagerbar ist.
2. Vehikel nach Anspruch 1, wobei das Kapsomer so ausge­ bildet ist, daß es zum Aufbau eines Kapsids oder eines kapsidartigen Gebildes geeignet ist.
3. Vehikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Kapsomer vom Polyomavirus abgeleitet ist.
4. Vehikel nach Anspruch 3, wobei das Kapsomer aus dem VP1-Pentamer des Polyomavirus gebildet oder davon ab­ geleitet ist.
5. Vehikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Kapsomer aus "non-enveloped" Viren wie DNA-haltigen Papovaviridae, insbesondere Polyoma- und Papillomaviren, Iridoviridae, Adenoviridae, Parvoviridae oder RNA-haltigen Picornaviridae, insbesondere Polioviren, Caliciviridae, Reoviridae und Birnaviridae gewonnen oder davon abge­ leitet ist.
6. Vehikel nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Kapsomer aus der äußeren und/oder inneren Hülle von "enveloped" Viren wie DNA-haltigen Poxviridae, Herpesviridae, Hepadnaviridae oder RNA-haltigen Retroviridae, Paramyxoviridae, Sendaiviren, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Toroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Rhabdoviridae und Filoviridae gewonnen bzw. davon abgeleitet ist.
7. Vehikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Wechselwirkungen lipophile Wechselwirkungen sind und/oder auf kovalenten, ionischen oder Wasserstoffbrücken-Bindungen beruhen.
8. Vehikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Wechselwirkung tretende Struktur bifunktionelle, vorzugsweise heterolog bifunktionelle Gruppen umfaßt.
9. Vehikel nach Anspruch 8, wobei die bifunktionellen Gruppen aus der Stoffgruppe der Maleinimid-Derivate, Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate, Glutardialdehyde, acrylierenden Reagentien und Imidoester ausgewählt sind.
10. Vehikel nach Anspruch 8 oder 9, wobei die bifunktionel­ len Gruppen mit Cystein-Resten am Kapsomer reagieren.
11. Vehikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die in Wechselwirkung tretende Struktur affinitätserhö­ hende Gruppen wie 4-Iodoacetamido-salicylsäure und/oder p-Arsonsäure-phenyldiazonium-fluoroborat und/oder Derivate davon umfaßt.
12. Vehikel nach einem der Ansprüche 4-11, wobei die in Wechselwirkung tretende Struktur durch Epitope des VP1-Pentamers gebildet ist.
13. Vehikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei mit mindestens einem weiteren Kapsomer ein kapsidarti­ ges Gebilde zum Transport der molekularen Substanz in eine vorgegebene Art von Zellen bzw. an einen vorgege­ benen Ort im Intrazellulärbereich herstellbar ist.
14. Vehikel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die eine Seite des Kapsomers Bestandteil der Innenseite des kapsidartigen Gebildes ist.
15. Vehikel nach Anspruch 14, wobei das kapsidartige Gebilde mindestens ein VP-2 und/oder VP-3 Protein um­ faßt.
16. Verfahren zur Herstellung des Vehikels nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:
  • i) Synthetisieren, Aufreinigen oder Isolieren des Kapsomers und
  • ii) Komplexieren der molekularen Substanz unter Verwendung des Kapsomers.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei nach dem Schritt lit.i die geeigneten Reste des Kapsomers, insbesondere dessen Cystein-Reste, mit bifunktionellen Gruppen modi­ fiziert werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Modifikation un­ ter Verwendung einer oder mehrerer der folgenden Stoffe durchgeführt wird: Maleinimid-Derivate, Alkylhalide, Arylhalide, Isocyanate, Glutardialdehyde, acrylierenden Reagentien und Imidoester.
19. Verwendung des Vehikels nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-15 als Arzneistoffträger zur Applikation von Molekülen wie DNA, RNA, Oligonukleotiden, PNA, Proteinen, Peptiden sowie niedermolekularen lipophilen und lipophoben Reagenzien, kolloidalem Gold und Gold­ markierten Proteinen und Peptiden in eukaryontische Zellen.
20. Zusammenstellung von Mitteln zur Applikation des Vehikels nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1-15.
21. Zusammenstellung von Mitteln zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 16-18.
DE19618797A 1996-05-10 1996-05-10 Vehikel zum Transport molekularer Substanz Expired - Fee Related DE19618797C2 (de)

Priority Applications (12)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19618797A DE19618797C2 (de) 1996-05-10 1996-05-10 Vehikel zum Transport molekularer Substanz
US09/155,786 US6165772A (en) 1996-05-10 1997-05-07 Vehicle for the transport of molecular substances
BR9708960-5A BR9708960A (pt) 1996-05-10 1997-05-07 Veìculo para o transporte de substâncias moleculares, processo para a sua preparação e uso do mesmo
AT97925841T ATE236264T1 (de) 1996-05-10 1997-05-07 Vehikel zum transport von molekularer substanz
PCT/DE1997/000919 WO1997043431A1 (de) 1996-05-10 1997-05-07 Vehikel zum transport von molekularer substanz
JP09540383A JP2000510698A (ja) 1996-05-10 1997-05-07 分子物質の輸送のための媒体
DE59709707T DE59709707D1 (de) 1996-05-10 1997-05-07 Vehikel zum transport von molekularer substanz
EP97925841A EP0914460B1 (de) 1996-05-10 1997-05-07 Vehikel zum transport von molekularer substanz
CA002247392A CA2247392A1 (en) 1996-05-10 1997-05-07 Vehicle for the transport of molecular substances
EA199800999A EA001609B1 (ru) 1996-05-10 1997-05-07 Переносчик для доставки вещества в эукариотические клетки и способ его получения
CZ19983356A CZ294762B6 (cs) 1996-05-10 1997-05-07 Způsob přípravy vehikula pro dopravu molekulární látky
AU30881/97A AU717543B2 (en) 1996-05-10 1997-05-07 Vehicle for the transport of molecular substances

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19618797A DE19618797C2 (de) 1996-05-10 1996-05-10 Vehikel zum Transport molekularer Substanz

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE19618797A1 true DE19618797A1 (de) 1997-11-13
DE19618797C2 DE19618797C2 (de) 2000-03-23

Family

ID=7793905

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19618797A Expired - Fee Related DE19618797C2 (de) 1996-05-10 1996-05-10 Vehikel zum Transport molekularer Substanz
DE59709707T Expired - Fee Related DE59709707D1 (de) 1996-05-10 1997-05-07 Vehikel zum transport von molekularer substanz

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE59709707T Expired - Fee Related DE59709707D1 (de) 1996-05-10 1997-05-07 Vehikel zum transport von molekularer substanz

Country Status (11)

Country Link
US (1) US6165772A (de)
EP (1) EP0914460B1 (de)
JP (1) JP2000510698A (de)
AT (1) ATE236264T1 (de)
AU (1) AU717543B2 (de)
BR (1) BR9708960A (de)
CA (1) CA2247392A1 (de)
CZ (1) CZ294762B6 (de)
DE (2) DE19618797C2 (de)
EA (1) EA001609B1 (de)
WO (1) WO1997043431A1 (de)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19750354A1 (de) * 1997-11-13 1999-05-27 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Applikation von Wirkstoffen
DE19829005A1 (de) * 1998-06-29 1999-12-30 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Transport molekularer Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen
WO2002002737A2 (de) * 2000-07-06 2002-01-10 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Hoch-durchsatz-verfahren zur untersuchung der wirkung nicht-membranpermeabler und kein gen enthaltender verbindungen
WO2005033310A1 (de) * 2003-10-01 2005-04-14 Grünenthal GmbH Pim-1-spezifische dsrna-verbindungen
WO2007126764A2 (en) * 2006-03-27 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Chemically modified viral capsids as targeted delivery vectors for diagnostic and therapeutic agents
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7893245B2 (en) 2002-08-05 2011-02-22 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft (Ag) Interfering RNA molecules
US8101742B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9074213B2 (en) 2001-01-09 2015-07-07 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19916224C1 (de) * 1999-04-10 2000-06-21 November Ag Molekulare Medizin Synthetisches biologisch aktives Molekül
DE19952957B4 (de) * 1999-11-03 2006-08-31 Acgt Progenomics Ag Modulare Transportsysteme für molekulare Substanzen und deren Herstellung und Verwendung
CA2404890C (en) 2000-03-30 2013-11-19 Whitehead Institute For Biomedical Research Rna sequence-specific mediators of rna interference
BRPI0115814B8 (pt) 2000-12-01 2021-05-25 Europaeisches Laboratorium Fuer Molekularbiologie Embl moléculas de rna de filamento duplo, seu método de preparação e composição farmacêutica compreendendo as mesmas
CA2693525C (en) 2007-06-07 2020-09-29 Agriculture And Agri-Food Canada Nanocarrier based transfection and transduction of plant gametophytic cells
JP5523411B2 (ja) * 2010-08-24 2014-06-18 インダストリー−アカデミック コーオペレイション ファウンデーション， チョソン ユニヴァーシティー バイオナノカプシドを用いた有害藻類の制御方法
US8501930B2 (en) * 2010-12-17 2013-08-06 Arrowhead Madison Inc. Peptide-based in vivo siRNA delivery system

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4339922C1 (de) * 1993-09-03 1994-10-06 Max Planck Gesellschaft Vektor für Leber-Gentherapie

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1319101C (en) * 1986-09-03 1993-06-15 Marta Iris Sabara Rotavirus nucleocapsid protein with or without binding peptides as immunologic carriers for macromolecules
US4950599A (en) * 1987-01-29 1990-08-21 Wolf Bertling Method for exchanging homologous DNA sequences in a cell using polyoma encapsulated DNA fragments
GB9114003D0 (en) * 1991-06-28 1991-08-14 Mastico Robert A Chimaeric protein
GB9213601D0 (en) * 1992-06-26 1992-08-12 Mastico Robert A Protein based delivery system
DE4335025A1 (de) * 1993-10-14 1995-04-20 Boehringer Ingelheim Int Endosomolytisch wirksame Partikel

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4339922C1 (de) * 1993-09-03 1994-10-06 Max Planck Gesellschaft Vektor für Leber-Gentherapie

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Chemical Abstract 117 (1992): 227328w, Wagner E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (1992) 7934-7938 *

Cited By (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19750354A1 (de) * 1997-11-13 1999-05-27 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zur Applikation von Wirkstoffen
DE19829005A1 (de) * 1998-06-29 1999-12-30 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Transport molekularer Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen
DE19829005C2 (de) * 1998-06-29 2000-08-31 November Ag Molekulare Medizin Verfahren zum Transport molekularer Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen
US8183362B2 (en) 1999-01-30 2012-05-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8101742B2 (en) 1999-01-30 2012-01-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US9902955B2 (en) 1999-01-30 2018-02-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
EP3018207A1 (de) 1999-01-30 2016-05-11 Alnylam Europe AG Oligoribonukleotid zur hemmung der expression eines vorgegebenen gens
US9133454B2 (en) 1999-01-30 2015-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8729037B2 (en) 1999-01-30 2014-05-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8119608B2 (en) 1999-01-30 2012-02-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8114851B2 (en) 1999-01-30 2012-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8202980B2 (en) 1999-01-30 2012-06-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US8168776B2 (en) 1999-01-30 2012-05-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method for making a 21 nucleotide double stranded RNA chemically linked at one end
US8114981B2 (en) 1999-01-30 2012-02-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Method and medicament for inhibiting the expression of a given gene
US7829693B2 (en) 1999-11-24 2010-11-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
WO2002002737A3 (de) * 2000-07-06 2003-03-27 November Ag Molekulare Medizin Hoch-durchsatz-verfahren zur untersuchung der wirkung nicht-membranpermeabler und kein gen enthaltender verbindungen
WO2002002737A2 (de) * 2000-07-06 2002-01-10 november Aktiengesellschaft Gesellschaft für Molekulare Medizin Hoch-durchsatz-verfahren zur untersuchung der wirkung nicht-membranpermeabler und kein gen enthaltender verbindungen
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US9074213B2 (en) 2001-01-09 2015-07-07 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7868160B2 (en) 2001-01-09 2011-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US9587240B2 (en) 2001-01-09 2017-03-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US9695423B2 (en) 2002-08-05 2017-07-04 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US9790505B2 (en) 2002-08-05 2017-10-17 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US11578328B2 (en) 2002-08-05 2023-02-14 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US9222092B2 (en) 2002-08-05 2015-12-29 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US10774332B2 (en) 2002-08-05 2020-09-15 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US8324370B2 (en) 2002-08-05 2012-12-04 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft (Ag) Interfering RNA molecules
US7893245B2 (en) 2002-08-05 2011-02-22 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft (Ag) Interfering RNA molecules
US9758784B1 (en) 2002-08-05 2017-09-12 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US9783802B2 (en) 2002-08-05 2017-10-10 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US8933215B2 (en) 2002-08-05 2015-01-13 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft (Ag) Interfering RNA molecules
US9790501B2 (en) 2002-08-05 2017-10-17 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US10329568B2 (en) 2002-08-05 2019-06-25 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US10266829B2 (en) 2002-08-05 2019-04-23 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
US10323246B2 (en) 2002-08-05 2019-06-18 Silence Therapeutics Gmbh Interfering RNA molecules
WO2005033310A1 (de) * 2003-10-01 2005-04-14 Grünenthal GmbH Pim-1-spezifische dsrna-verbindungen
WO2007126764A2 (en) * 2006-03-27 2007-11-08 The Regents Of The University Of California Chemically modified viral capsids as targeted delivery vectors for diagnostic and therapeutic agents
WO2007126764A3 (en) * 2006-03-27 2008-05-02 Univ California Chemically modified viral capsids as targeted delivery vectors for diagnostic and therapeutic agents

Also Published As

Publication number Publication date
CZ335698A3 (cs) 1999-03-17
DE19618797C2 (de) 2000-03-23
EA001609B1 (ru) 2001-06-25
ATE236264T1 (de) 2003-04-15
DE59709707D1 (de) 2003-05-08
CA2247392A1 (en) 1997-11-20
US6165772A (en) 2000-12-26
WO1997043431A1 (de) 1997-11-20
EP0914460B1 (de) 2003-04-02
EP0914460A1 (de) 1999-05-12
EA199800999A1 (ru) 1999-04-29
CZ294762B6 (cs) 2005-03-16
AU3088197A (en) 1997-12-05
JP2000510698A (ja) 2000-08-22
BR9708960A (pt) 2000-05-09
AU717543B2 (en) 2000-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19618797A1 (de) Vehikel zum Transport molekularer Substanz
EP0862633A1 (de) Vp-antigene des jc-virus
EP0771325A1 (de) Verfahren zur modifizierung der stabilität von antikörpern
WO2001032684A2 (de) Verfahren zur verbindung von molekularen substanzen basierend auf der affinität der prolinreichen aminosäure-sequenzen und proteindomänem vom typ ww
Mukherjee et al. Uncatalyzed assembly of spherical particles from SV40 VP1 pentamers and linear dsDNA incorporates both low and high cooperativity elements
Völkner et al. Accessory Gvp proteins form a complex during gas vesicle formation of haloarchaea
DE10131145A1 (de) Zusammensetzung zum zellspezifischen Transfer von Wirkstoffen
EP1232257B1 (de) Modulare transportsysteme für molekulare substanzen und deren herstellung und verwendung
EP0603672B1 (de) Verfahren zur Herstellung von rekombinanten und synthetischen Peptiden und deren Verwendung
DE69728447T2 (de) Veränderte, kleine rna-viren
DE10113042B4 (de) HIV-Inhibitor Screening-System
DE19749277C2 (de) Peptid der Sequenz NH¶2¶-Phe-His-Glu-Asn-Trp-Pro-Ser-COOH und seine Verwendung
EP1888620A1 (de) Verfahren zur herstellung von einen wirkstoff enthaltenden virusartigen partikeln
DE19829005C2 (de) Verfahren zum Transport molekularer Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen
WO2005059129A2 (de) Adapter zum ankoppeln einer an einer zelloberfläche anzukoppelnden substanz
DE102004032888B4 (de) Rekombinante ScV-Partikel, ihre kodierenden Nukleinsäuren und ihre Verwendungen
DE19952982B4 (de) Verfahren zur gerichteten Verpackung von molekularen Substanzen in Proteinhüllen
EP1507851B1 (de) Verfahren zum assemblieren von untereinheiten zu kapsoiden
DE69932351T2 (de) DNS-kodierende Fusionsproteine, die durch Kupfer(II)-Ionen spezifisch spaltbar sind
EP1030656A1 (de) Verabreichung der wirkstoffen durch verwendung des aus polyoma virus vp1 protein hergestellten kapsids
WO2004020615A1 (de) Verfahren zur herstellung von virusanalogen partikeln zur verpackung von biologisch aktiven makromolekülen durch in vitro-assemblierung von kapsomeren an die die makromoleküle gebunden sind

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: NOVEMBER AKTIENGESELLSCHAFT GESELLSCHAFT FUER MOLE

8381 Inventor (new situation)

Free format text: BERTLING, WOLF,PROF.-DR., 91056 ERLANGEN, DE

8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: RESPONSIF GMBH, 91056 ERLANGEN, DE

8339 Ceased/non-payment of the annual fee