DE19525285A1 - In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte - Google Patents

In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte

Info

Publication number
DE19525285A1
DE19525285A1 DE19525285A DE19525285A DE19525285A1 DE 19525285 A1 DE19525285 A1 DE 19525285A1 DE 19525285 A DE19525285 A DE 19525285A DE 19525285 A DE19525285 A DE 19525285A DE 19525285 A1 DE19525285 A1 DE 19525285A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
genes
cells
differentiation
tissue
vitro test
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
DE19525285A
Other languages
English (en)
Other versions
DE19525285C2 (de
Inventor
Anna M Dr Wobus
Wolfgang-Michael Dr Franz
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Original Assignee
Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7766572&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE19525285(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung filed Critical Institut fuer Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung
Priority to DE19525285A priority Critical patent/DE19525285C2/de
Priority to AT96922735T priority patent/ATE199400T1/de
Priority to DE59606520T priority patent/DE59606520D1/de
Priority to PCT/DE1996/001183 priority patent/WO1997001644A1/de
Priority to EP96922735A priority patent/EP0835325B1/de
Priority to US08/983,147 priority patent/US6007993A/en
Priority to ES96922735T priority patent/ES2156283T3/es
Priority to DK96922735T priority patent/DK0835325T3/da
Publication of DE19525285A1 publication Critical patent/DE19525285A1/de
Publication of DE19525285C2 publication Critical patent/DE19525285C2/de
Application granted granted Critical
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/142—Toxicological screening, e.g. expression profiles which identify toxicity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Die Erfindung betrifft ein in vitro-Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer (z. B. auch teratogener) Effekte auf der Basis differenzierender pluripotenter embryona­ ler Stamm(ES)-Zellen der Maus und Ratte sowie an aus primordia­ len Keimzellen etablierten embryonalen Keim(EG)-Zellen.
Der Nachweis teratogener Eigenschaften von chemischen Wirk­ stoffen erfolgt derzeit durch Bestimmungen der Reproduktions­ toxizität von Prüfsubstanzen nach Einfach- und Mehrfachappli­ kation an trächtigen Laborsäugern und durch Prüfungen der Embryotoxizität in frühen Stadien der Schwangerschaft (Holz und Siegemund, Der Einsatz von Tieren in der Forschung und Entwick­ lung im Verbraucher- und Umweltschutz, Abschlußbericht zur Basiserhebung des Batelle-Instituts 1988). Des weiteren werden in vitro-Versuche mit Säuger-Embryonen (Neubert und Merker, Cell culture techniques - applicability for studies on prenatal differentiation and toxicity, de Gruyter, Berlin - New York (1981)) und embryonalen Organen für Teratogenitätsteste einge­ setzt. Diese Testverfahren haben jedoch den großen Nachteil, daß sie nach wie vor den Einsatz einer großen Anzahl von lebenden Säugern, insbesondere Ratten und Mäusen voraussetzen. In vitro- Testverfahren, bei denen Primärzellkulturen aus Extremitäten­ knospen (z. B. "limb buds", Kochhar, Teratology 11, 273-287 (1975)), oder Gehirnanlagen embryonaler Ratten (Flint and Orton, Toxicol. Appl. Pharmacol. 76, 383-395 (1984)) oder permanente Zellinien aus embryonalen oder adulten Säugetiergeweben oder aus menschlichen Geweben, wie Tumorzellen des Ovars oder embryonale Gaumenzellen eingesetzt wurden, erfüllen im engeren Sinn nicht die Anforderungen, die an Teratogenitätstests gestellt werden, nämlich Hinweise auf mögliche Entwicklungsstörungen während der Embryogenese zu geben.
Seit einigen Jahren gibt es Bemühungen, permanente Kulturen totipotenter/pluripotenter embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) auch zum Nachweis embryotoxischer und mutagener Stoffe zu ver­ wenden (Laschinski et al, Reproductive Toxicol. 5, 57-65 (1991), Newall and Beedles, Toxicol. in Vitro 8, 697-701 (1994), Sehl­ meyer and Wobus, Mutation Res. 324, 69-76 (1994)). Embryonale Stammzellen sind die totipotenten Zellen des frühen Embryos, aus denen sich der komplette Säugetierorganismus entwickelt. Störungen während der Keimblatt- und pränatalen Entwicklung kön­ nen zum Absterben der Embryonen (präimplantativem Tod), zu Entwicklungsstörungen, Fehlentwicklungen bzw. Mißbildungen führen.
Als in vitro-Systeme totipotenter bzw. pluripotenter Zellen sind
  • 1. Embryonale Stammzellen (ES-Zellen), permanente Linien toti­ potenter embryonaler Zellen (Evans and Kaufman, Nature 282, 507- 509 (1981)) und
  • 2. Embryonale Keimzellen ("embryonic germ cells", EG-Zellen), die aus primordialen Keimzellen (PGC) ca. 9 Tage alter Embryonen gewonnen und als permanente Zellinien kultiviert werden (Stewart et al, Dev. Biol. 161, 626-628 (1994))
bekannt.
Sowohl ES-Zellen als auch EG-Zellen sind totipotent und nehmen in vivo nach Retransfer in die Blastozyste an der normalen Embryogenese teil und sind in der Lage, die Keimbahn zu kolo­ nisieren (Bradley et al, Nature Bd. 309, 255-256 (1984), Matsui et al, Cell 70, 841-847 (1992)).
In vitro können ES-Zellen nach Differenzierung in Embryo-ähnli­ chen Aggregaten, sogenannten "embryoid bodies" Derivate aller drei Keimblätter bilden, d. h. in kardiogene (Doetschmann et al, J. Embryol. Exp. Morphol. 87, 27-45 (1985)), myogene (Rohwedel et al, Dev. Biol. 164, 87-101 (1994), neuronale und hämatopoie­ tische Zellen (Wiles and Keller, Development 111, 259-267 (1991)) differenzieren.
In bisherigen Experimenten wurde nachgewiesen, daß das Teratogen Retinsäure (RA) zu gravierenden Veränderungen der Expression gewebespezifischer Gene führt, wenn es zu bestimmten Zeiten der "embryoid body"-Differenzierung einwirkte und zu Aktivierung, Hemmung oder Modulation der Expression von Herz- oder Skelett­ muskel-spezifischen Genen führte (Wobus et al., Roux′s Arch. Dev. Biol. 204, 1994, 36-45). Diese Aktivierung, Reprimierung oder Modulation der Genexpression kann auch über Reportergene, z. B. X-Gal oder Luziferase, sichtbar gemacht werden.
Bisherige in vitro-Verfahren mit ES-Zellen betreffen in erster Linie Testverfahren zum Nachweis der zytotoxischen Wirksamkeit embryotoxischer Verbindungen mit Hilfe des MTT-Testes (Laschinski et al s. o.). Dabei wurde in ES-Zellen eine höhere zytotoxische Sensitivität beobachtet als in differenzierten Zellen.
Untersuchungen zur Zytotoxizität mit Hilfe des "stem cell tests" zum Nachweis teratogener Effektivität wurden von Newall and Beedles, Toxicol. in Vitro 8, 697-701 (1994) beschrieben.
In allen diesen Untersuchungen dienten zytotoxische Effekte als Maß für embryoschädigende Eigenschaften teratogener/embryotoxi­ scher Substanzen.
Es ist festzustellen, daß ES-Zellen das zur Zeit wichtigste Zellmodell in der Entwicklungsbiologie sind, vor allem zur Konstruktion transgener Organismen, ihr Einsatz in der Reproduk­ tions- und Gentoxikologie bisher jedoch begrenzt ist.
Die Erfindung hat das Ziel, ein routinemäßig einsetzbares in vitro-Testverfahren zur Ermittlung Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte bereit zu stellen.
Die Aufgabe der Erfindung liegt darin, ein in vitro-Testverfah­ ren zum Nachweis embryotoxischer/teratogener Eigenschaften von chemischen Wirkstoffen an embryonalen Stamm(ES)-Zellen oder an aus primordialen Keimzellen etablierten embryonalen Keim(EG)- Zellen zu entwickeln. Das Testverfahren soll insbesondere geeig­ net sein, Hinweise auf mögliche Entwicklungs- und Differenzie­ rungsstörungen während der Embryogenese zu geben.
Die Erfindung wird gemäß der Ansprüche realisiert.
Es werden stabile transgene ES- oder EG-Stammzellklone konstru­ iert, bei denen ein bakterielles Reportergen LacZ oder das Luziferasegen unter die Kontrolle von gewebespezifischen Promo­ toren oder Entwicklungskontrollgenen gebracht wird. Nach Diffe­ renzierung der ES-Zellen in Anwesenheit teratogener Substanzen in die verschiedenen Keimbahnderivate erfolgt eine differenzie­ rungsanhängige Expression in den Zellen, die die gewebespezi­ fischen Promotoren exprimieren. Die Aktivierung, Reprimierung oder Modulation dieser gewebespezifischen Gene wird mit einer einfachen Färbereaktion, dem X-Gal Assay, bestimmt. Mit der Erfindung wird eine Batterie von relevanten Test-ES-Zellklonen entwickelt, die neben dem Reportergen LacZ (und einer Neomycin­ kassette zur Selektion stabiler Transfektanten) Promotor­ sequenzen enthalten, die charakteristische und wesentliche Merkmale der ektodermalen und mesodermalen Linie regulieren. Das sollten insbesondere Gene sein, die die neuronale, kardiogene, die Muskel- und die Skelettentwicklung determinieren. Nach Transfektion dieser Vektoren in pluripotente ES-/EG-Zellen der Maus oder der Ratte werden stabile Stammzellklone selektiert und diese nach "embryoid body"-Entwicklung zu spezifischen Zeiten in Anwesenheit von Testsubstanzen differenziert (Abb. 1). Danach kann die differenzierungsabhängige Expression der gewebespezi­ fischen Gene mit Hilfe der X-Gal-Färbung in verschiedenen Ent­ wicklungsstadien (unter Zeiteinhaltung und Einsatz dafür geeig­ neter Vektoren) nachgewiesen werden. Diese Färbetechnik ist standardisierbar und über photometrische Verfahren automati­ sierbar.
Mit diesem Testverfahren ist es möglich, in vitro Chemikalien- induzierte Veränderungen der zellulären Differenzierung, die während der Keimblattdifferenzierung und frühen embryonalen Entwicklung stattfinden und zu Entwicklungsstörungen führen, festzustellen. Bei dem erfindungsgemäßen Testverfahren werden keine lebenden Tiere, sondern permanente Zellinien eingesetzt.
Der wesentliche Vorteil der Erfindung besteht darin, daß ein standardisierbares, im Routine-Screening einsetzbares in vitro Modell etabliert wird, das zu einer Einsparung von Versuchstie­ ren führt. So wurden im Bereich der Reproduktionstoxikologie in Deutschland pro Jahr (1987) ca. 20 000 Säugetiere und Vögel ein­ gesetzt. Darüber hinaus werden eine große Anzahl von Säugern zur Entnahme embryonaler Organe und Gewebe (embryonale Herzmuskel­ zellen, "limb bud" Kulturen, "micromass"-Assay u. a.) benötigt, so daß die Gesamtzahl bei Tierzahlen von mindestens 50 000 liegen dürfte.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können im Vorscreening fol­ gende Testverfahren teilweise ersetzt und ergänzt werden:
  • - in vivo-Segment II-Studien,
  • - Teste mit embryonalen Organen ("limb bud" Kulturen) und Pri­ märkulturen
  • - Testverfahren mit artifiziellen Embryonen
Anschließend wird die Erfindung an einem Ausführungsbeispiel nä­ her erläutert, das die Anmeldung jedoch nicht beschränken soll.
Beispiel 1
Das Testverfahren ist in Abb. 1 schematisch dargestellt.
Es werden transgene ES-Zellklone, bei denen LacZ unter der Kontrolle des vetrikelspezifischen MCL-2V Promotors (Franz et al, Circ. Res. 73 (1993) 629-638) exprimiert wird, für die Un­ tersuchung solcher kardiotoxischen Substanzen eingesetzt, die zu Entwicklungsstörungen am Herzen führen.
Zum Einsatz kommen Klone, die mit dem Vektor pGNA-MLC 2.1-LacZ transfiziert wurden und MLC-2V stabil exprimieren.
Während der mesodermalen Differenzierung in embryoid bodies wird die Testsubstanz Retinsäure (RA) zugegeben (z. B. von Tag 5 bis 15) und anschließend eine X-Gal-Färbung der differenzierten em­ bryoid bodies durchgeführt.
Abb. 2 zeigt die Aktivierung der MLC-2V-Expression im MLC-Klon 3 durch 10-8M (E,F)und 10-9M (C,D)RA nach Behandlung zwischen 5. und 15. Tag der embryoid body-Differenzierung. Die Kontrollzel­ len (A,B) zeigen X-Gal-Färbung ohne Induktion durch die terato­ gene Substanz RA.
Die Vektoren werden auch zur Transfektion von EG-Zellen oder von Ratten-ES-Zellen benutzt.

Claims (7)

1. In vitro-Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte auf der Basis differenzie­ render pluripotenter embryonaler Stamm(ES)-Zellen oder an aus primordialen Keimzellen etablierten embryonalen Keim(EG)-Zellen der Maus und Ratte durch
  • - Selektion stabiler transgener ES-/EG-Zell-Klone,
  • - differenzierungsabhängige Expression gewebespezifischer Gene von ES-/EG-Zell-Klonen in Anwesenheit von zu bestimmten Zei­ ten der in vitro Differenzierung einwirkenden teratogenen Sub­ stanzen und nachfolgende Differenzierung in die verschiedenen Keimbahnderivate und
  • - Nachweis der Chemikalien-induzierten Aktivierung, Repri­ mierung oder Modulation von gewebespezifischen und die Embryo­ nalentwicklung beeinflussenden Genen.
2. In vitro-Testverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß zur Konstruktion der transgenen Zell-Klone belie­ bige Reportergene, z. B. LacZ oder Luciferase, unter die Kon­ trolle von gewebespezifischen Promotoren, die zellspezifische Strukturgene, Transkriptionsfaktoren oder Entwicklungskontroll­ gene kontrollieren, gebracht werden.
3. In vitro-Testverfahren nach Anspruch 1 + 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zell-Klone
  • - das Reportergen LacZ und eine Neomycinkassette zur Selektion stabiler Transfektanten sowie
  • - Promotorsequenzen von Genen, die charakteristische und wesent­ liche Merkmale der ektodermalen und mesodermalen Linie kodie­ ren,
enthalten.
4. In vitro-Testverfahren nach Anspruch 1 + 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Promotoren solche eingesetzt werden, die gewebespezifische Gene kodieren, wie z. B. Gene, die die neuro­ nale Herz-, Muskel- oder Skelettentwicklung determinieren, oder Promotoren anderer Entwicklungskontrollgene (Hox oder Pax-Gene).
5. In vitro-Testverfahren nach Anspruch 1 + 2, dadurch gekenn­ zeichnet, daß im Verlauf der Differenzierung durch exogene Testsubstanzen die Reportergenkonstrukte spezifisch aktiviert, reprimiert oder moduliert werden und daß die differenzierungs­ abhängige Expression im Testverfahren über "embryoid body"- Differenzierung in verschiedene Linien, siehe 4, erfolgt.
6. In vitro-Testverfahren nach Anspruch 1-6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß durch Einwirkung von Chemikalien das Expressions­ muster der Promotor-Reportergenkonstrukte beeinflußt und mit Hilfe der X-Gal-Färbung bestimmt wird.
DE19525285A 1995-06-28 1995-06-28 In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte Expired - Fee Related DE19525285C2 (de)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19525285A DE19525285C2 (de) 1995-06-28 1995-06-28 In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte
EP96922735A EP0835325B1 (de) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro-testverfahren zum nachweis chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener effekte
DE59606520T DE59606520D1 (de) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro-testverfahren zum nachweis chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener effekte
PCT/DE1996/001183 WO1997001644A1 (de) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro-testverfahren zum nachweis chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener effekte
AT96922735T ATE199400T1 (de) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro-testverfahren zum nachweis chemikalien- induzierter embryotoxischer/teratogener effekte
US08/983,147 US6007993A (en) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro test for embryotoxic and teratogenic agents using differentiation-dependent reporter expression in pluripotent rodent embryonic cells
ES96922735T ES2156283T3 (es) 1995-06-28 1996-06-27 Procedimiento de ensayo in vitro para la deteccion de efectos embriotoxicos/teratogenicos inducidos por sustancias quimicas.
DK96922735T DK0835325T3 (da) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro testmetode til påvisning afkemikalieinducerede embryotoksiske/teratogene virkninger

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19525285A DE19525285C2 (de) 1995-06-28 1995-06-28 In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE19525285A1 true DE19525285A1 (de) 1997-01-02
DE19525285C2 DE19525285C2 (de) 1999-04-15

Family

ID=7766572

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19525285A Expired - Fee Related DE19525285C2 (de) 1995-06-28 1995-06-28 In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte
DE59606520T Expired - Fee Related DE59606520D1 (de) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro-testverfahren zum nachweis chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener effekte

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE59606520T Expired - Fee Related DE59606520D1 (de) 1995-06-28 1996-06-27 In vitro-testverfahren zum nachweis chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener effekte

Country Status (7)

Country Link
US (1) US6007993A (de)
EP (1) EP0835325B1 (de)
AT (1) ATE199400T1 (de)
DE (2) DE19525285C2 (de)
DK (1) DK0835325T3 (de)
ES (1) ES2156283T3 (de)
WO (1) WO1997001644A1 (de)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2270196A2 (de) 2004-05-11 2011-01-05 Axiogenesis Ag Methoden zur Medikamentenaufspürung auf der Basis von in vitro differenzierten Zellen
EP2578676A1 (de) 2003-06-20 2013-04-10 Axiogenesis Ag Formgebung zu Gewebe in einem embryonischen Stammzellen (ES) System

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002531852A (ja) * 1998-12-09 2002-09-24 ビスタジェン インコーポレイテッド 胚様体を用いる毒性の分類
EP1290444B1 (de) * 2000-06-14 2009-10-07 Vistagen, Inc. Toxizitätstypisierung unter verwendung von leberstammzellen
US20020115059A1 (en) * 2000-10-26 2002-08-22 Naohiro Terada Drug screening system
MXPA04001725A (es) * 2001-08-24 2005-04-11 Advanced Cell Tech Inc ANáLISIS DE SELECCION PARA IDENTIFICAR AGENTES INDUCTORES DE DIFERENCIACION Y PRODUCCION DE CELULAS DIFERENCIADAS PARA TERAPIA CELULAR.
ITMI20040467A1 (it) * 2004-03-12 2004-06-12 Istituto Sperimentale Italiano Uso di gameti ed embrioni preimpianto per la determinazione della tossicita' di composti biologicamente attivi
WO2006032054A2 (en) * 2004-09-14 2006-03-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Differentiation of human mesenchymal stem cells to cardiac progenitor cells that promote cardiac repair
US8431397B2 (en) * 2004-09-14 2013-04-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Differentiation of human mesenchymal stem cells to cardiac progenitor cells that promote cardiac repair
US20060292694A1 (en) * 2005-06-22 2006-12-28 Roslin Institute Reporter hepatocytes and other cells for drug screening and toxicity testing
EP1893749A1 (de) * 2005-06-22 2008-03-05 Geron Corporation Reporterhepatozyten und andere zellen für arzneistoff screening und tests zum nachweis von toxizität
US20060292695A1 (en) * 2005-06-22 2006-12-28 Roslin Institute Methods and kits for drug screening and toxicity testing using promoter-reporter cells derived from embryonic stem cells
CN101573441A (zh) * 2005-12-08 2009-11-04 路易斯维尔大学研究基金会有限公司 非常小的胚胎样（vsel）干细胞及分离和利用其的方法
US9155762B2 (en) * 2005-12-08 2015-10-13 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Uses and isolation of stem cells from bone marrow
WO2007084585A2 (en) * 2006-01-19 2007-07-26 Magee-Womans Health Corporation Non-human primate embryonic stem and germ cells: methods of use and methods of making same
GB0911060D0 (en) 2009-06-26 2009-08-12 Ge Healthcare Uk Ltd Methods for predicting the toxicity of a chemical
US20130005588A1 (en) * 2010-03-15 2013-01-03 Thomas Hartung Method for determining substance non-toxicity
DK2550365T3 (en) * 2010-03-22 2018-09-10 Stemina Biomarker Discovery Inc PREVENTION OF HUMAN DEVELOPMENTAL TOXICITY OF MEDICINAL PRODUCTS USING HUMAN STEM CELL-LIKE CELLS AND METABOLOMICS
RU2725520C2 (ru) 2013-12-11 2020-07-02 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
EP3999660A1 (de) * 2019-07-19 2022-05-25 Toxys B.V. Verfahren zur bestimmung der wirkung eines mittels auf die embryonale entwicklung von säugetieren

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4744909A (en) * 1987-02-02 1988-05-17 Vertech Treatment Systems, Inc. Method of effecting accelerated oxidation reaction
EP0370813A2 (de) * 1988-11-25 1990-05-30 Exemplar Corporation Rascher Überprüfungstest der Mutagenesis und Tetratogenesis
US5346812A (en) * 1989-09-07 1994-09-13 The University Of Miami Teratogen assay

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1989005864A1 (en) * 1987-12-15 1989-06-29 The Trustees Of Princeton University Transgenic testing systems for mutagens and carcinogens

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4744909A (en) * 1987-02-02 1988-05-17 Vertech Treatment Systems, Inc. Method of effecting accelerated oxidation reaction
EP0370813A2 (de) * 1988-11-25 1990-05-30 Exemplar Corporation Rascher Überprüfungstest der Mutagenesis und Tetratogenesis
US5346812A (en) * 1989-09-07 1994-09-13 The University Of Miami Teratogen assay

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Datenbank TOXYLINE bei STN: AN 95:260288, Lai C.-C. *
Experimental Biology 95, Part II, Atlanta, Georgia, USA, April 9-13, 1995, FASEB Journal, (1995), Vol.9, No.4 A 942 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2578676A1 (de) 2003-06-20 2013-04-10 Axiogenesis Ag Formgebung zu Gewebe in einem embryonischen Stammzellen (ES) System
EP3184629A1 (de) 2003-06-20 2017-06-28 Axiogenesis Ag Arzneimittelentdeckung basierend auf in-vitro-erzeugtem gewebe
EP2270196A2 (de) 2004-05-11 2011-01-05 Axiogenesis Ag Methoden zur Medikamentenaufspürung auf der Basis von in vitro differenzierten Zellen
EP3070174A1 (de) 2004-05-11 2016-09-21 Axiogenesis Ag Medikamentenaufspürung auf der basis von in vitro differenzierten zellen

Also Published As

Publication number Publication date
EP0835325B1 (de) 2001-02-28
DE59606520D1 (de) 2001-04-05
US6007993A (en) 1999-12-28
ATE199400T1 (de) 2001-03-15
DE19525285C2 (de) 1999-04-15
WO1997001644A1 (de) 1997-01-16
ES2156283T3 (es) 2001-06-16
DK0835325T3 (da) 2001-07-16
EP0835325A1 (de) 1998-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE19525285C2 (de) In vitro Testverfahren zum Nachweis Chemikalien-induzierter embryotoxischer/teratogener Effekte
Yasuo et al. Conservation of the Developmental Role ofBrachyuryin Notochord Formation in a Urochordate, the AscidianHalocynthia roretzi
Land et al. Expression of the transcription factor, tailless, is required for formation of superficial cortical layers
Seaberg et al. Intrinsic differences distinguish transiently neurogenic progenitors from neural stem cells in the early postnatal brain
EP1002080B9 (de) Fluoreszierende proteine als zelltypspezifische reporter
DE3427553C2 (de) Verfahren zum Sichtbarmachen von Genmaterial
WO2003010304A2 (de) Verfahren zur herstellung isolierter zellkulturen, kulturmedium zur kultivierung von zellkulturen und zellkultur
Ortega et al. Live imaging of adult neural stem cells in rodents
Papagiannouli et al. Shaping the niche: Lessons from the Drosophila testis and other model systems
US4346070A (en) Test for teratogenic potential employing hydra
Evercooren Future prospects in transplantation
US20210261917A1 (en) Spinal cord injury treatment neurosphere
DE60132466T2 (de) Verfahren zur Herstellung menschlicher Lungenmastzell-Kulturen
Qü et al. Aging of nucleolar organizer region in rat basal forebrain neurons related to learning and memory
Sinnott The problem of internal differentiation in plants
Jasnic-Savovic et al. Human embryonal carcinoma cells in serum-free conditions as an in vitro model system of neural differentiation
DE102006005622A1 (de) In-vitro Verfahren zur Bestimmung der Entwicklungsneurotoxizität (DNT) von Noxen auf humane Gehirnzellen
DE102009058634B4 (de) Toxizitätstest
Stockdale Myogenesis–the early years
Yuasa Studies in the Cytology of Reproductive Cells IV. FEULGEN'S nucleal-staining applied to the blepharoplast
AT396941B (de) Verfahren zur bestimmung von phagozytoseaktiven zellen
DE10220480C1 (de) Verfahren zur Herstellung von Zellen mit erhöhtem Entwicklungspotential
WO2020069918A1 (de) ANALYSEVERFAHREN FÜR mRNA EINZELN LICHTBESTRAHLTER ZELLEN
Ro TRACING CLONAL LINEAGES OF STEM CELLS IN VIVO: THE STOP-EGFP MOUSE
EP0197489A2 (de) Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase-negative Mutante einer histiozytischen permanenten humanen Zellinie

Legal Events

Date Code Title Description
OP8 Request for examination as to paragraph 44 patent law
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee