DE102006005622A1 - In-vitro Verfahren zur Bestimmung der Entwicklungsneurotoxizität (DNT) von Noxen auf humane Gehirnzellen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein In-vitro-Verfahren zur Bestimmung der Entwicklungsneurotoxizität von Noxen auf normale humane neurale Gehirnzellen durch Messung der Migrationsstrecke und Anzahl migrierter Zellen vom auf Objektträgern fixierten Neurosphären.

Description

• Um das Gefährdungspotential von Noxen, z.B. ungeprüften Zusatzstoffen in Lebensmitteln oder Kosmetika insbesondere für die Gehirnentwicklung des im fötal- bzw. Embryonalstadium befindlichen Menschen abschätzen zu können, gibt es bis heute keine aussagefähigen und zufriedenstellenden Testsysteme.
• Bekannte Methoden zur Untersuchung der Entwicklungsneurotoxizität (DNT) von Noxen beruhen auf Tierversuchen und sind dementsprechend nicht nur zeit- und kostenintensiv, sondern stoßen zunehmend auf ethische Bedenken. Zudem können die Daten nur in bestimmten Fällen auf den Menschen übertragen werden. DNT ist somit ein Gebiet, auf dem ein großer Bedarf an einer Entwicklung von In-vitro-Alternativen als Ersatz zum Tierexperiment besteht. Dies gilt insbesondere im Hinblick auf die Chemikalienverordnung (REACH), welche bereits auf EU-Ebene verabschiedet wurde und die Überprüfung von ca. 30.000 bisher ungeprüften aber im täglichen Leben teils in großem Umfang benutzten chemischen Stoffen vorsieht. Die Etablierung und Validierung von In-vitro-Ersatzmethoden ist daher derzeit Gegenstand intensiver Forschungsarbeiten.
• Aus den oben genannten Gründen der mangelnden Übertragbarkeit von Ergebnissen vom Tier auf den Menschen ist die Entwicklung von humanen in vitro Modellen daher Tiermodellen vorzuziehen, denn hier ist auch eine wesentlich höhere Präzision bezüglich der Vorhersage der Toxizität für den Menschen zu erwarten.
• Für eine normale Entwicklung des zentralen Nervensystems ist die Migration von Nerven- und Gliazellen ein essentieller Prozess, welcher die Verteilung neuraler Zellen im Gehirn steuert und dadurch die Ausbildung funktioneller neuronaler Netzwerke gewährleistet. Tritt eine Migrationsstörung während der embryonalen Entwicklung auf, so kommt es zu Fehlbildungen des Gehirns, welche schwerste neurologische Störungen zur Folge haben können. Das fötale Alkoholsyndrom (FAS) ist ein Beispiel für solch eine Zellmigrationsstörung, die sich bereits während der Gehirnentwicklung manifestiert. Weitere Beispiele, bei denen neurologische Entwicklungsfehler auf eine gestörte Migration zurückzuführen sind, sind bei Kindern zu beobachten, deren Mütter eine hohe Belastung mit Quecksilberverbindungen während der Schwangerschaft aufweisen. Auch Fehlfunktionen des Schilddrüsenhormonsystems können unter anderem über diesen Mechanismus die neurale Entwicklung beeinflussen. Aus eingehenden Literaturstudien muss daher geschlossen werden, dass Chemikalien, welche die Zellmigration verändern, durchweg negative Folgen für die Hirnentwicklung im Frühstadium haben.
• Aufgabe der Erfindung ist es, ein verlässliches und aussagekräftiges In-vitro-Modell auf Basis von Studien der Migration menschlicher neuraler Zellen zu entwickeln, das Tierversuche vermeidet und trotzdem verlässliche in vitro Ergebnisse liefert.
• Es ist zwar bereits bekannt, in entarteten Tumorzelllinien oder in in vivo Tiermodellen Versuche durchzuführen, diese bergen allerdings, wie oben erwähnt, das Problem der nur beschränkten Übertragbarkeit auf den Menschen. Untersuchungen an lebenden Zellen unter Einwirkung toxischer Stoffe und die Reaktion primärer, humaner Vorläuferzellen hierauf ist auch bereits auf der Tagung „5th World Congress on Alternatives and Animal Use in Life Sciences" vom 21.–25. August 2005 in Berlin diskutiert worden. Eine quantitative Bestimmung der Daten an primären normalen humanen neuralen Progenitorzellenmodellen war jedoch bisher nicht möglich.
• Zum Schutz des werdenden Lebens ist nämlich ein geeignetes Zellmodell notwendig, das zum Screening für die migrationshemmende Wirkung von Chemikalien eingesetzt werden kann.
• Erfindungsgemäß wurde daher ein Testmodell entwickelt, das auf primären normalen humanen neuralen Progenitorzellen (NHNP Zellen basiert, wobei die NHNP Zellen als Neurosphären kultiviert werden. Solche aus menschlichen Zellen bestehenden Neurosphären sind bekannt und beispielsweise von Cambrex, Verviers, Belgien, im Handel erhältlich. Nach dem Ausplattieren solcher Neurosphären unter Wachstumsfaktorentzug setzen sich die Neurosphären ab und einzelne differenzierende Zellen (hauptsächlich Neurone und Astrozyten) wachsen im Mikroskop erkenn- und messbar radiär aus der Sphäre aus. Eine für die Differenzierung geeignete Kulturbedingung ist beispielsweise das Ausplattieren auf Poly-D-Lysin/Laminin beschichteten Objektträgern in D-MEM/F12 mit N2 versetztem Medium in 5%iger CO₂ Atmosphäre bei 37°C.
• Die Erfindung beruht nun darauf, die Anzahl und/oder Migration sich entwickelnder neuraler Zellen zu untersuchen. Mit Hilfe optischer Verfahren wird nun hierzu die Migrationsstrecke vermessen, welche die Zellen in einer bestimmten Zeit ausgehend vom Sphärenrand zurücklegen. Es wurde gefunden, dass die Migrationsstrecke ohne Einfluss toxischer Stoffe unter üblichen Kulturbedingungen innerhalb von 24 Stunden durchweg im Bereich 0,2 bis 0,5 mm, überwiegend aber im Bereich von 0,3 bis 0,4 mm liegt. Überraschend wird dieser Standardbereich unter dem Einfluss von Noxen deutlich über- oder meist unterschritten, wenn man die Werte mit Tests vergleicht die unter identischen Bedingungen, aber ohne Einfluss toxischer Stoffe parallel durchgeführt werden. Chemikalien, welche die Migrationsstrecke signifikant nach oben oder unten verschieben, können daher potentiell als entwicklungsneurotoxisch eingestuft werden. Dabei ist das Ausmaß der Migrationsveränderung durch eine Substanz mit ihrer neurotoxischen Potenz korrelierbar. Überraschend hat sich darüber hinaus auch die Anzahl der beobachteten ausgewachsenen Zellen als ein Maß für die Zelldifferenzierung herausgestellt. Dabei wird die Anzahl ausdifferenzierter Zellen einer Neurosphäre in unterschiedlichen Gesichtsfeldern mit Hilfe optischer Verfahren bestimmt. Verändert eine Substanz die Anzahl der ausdifferenzierten Zellen signifikant, ist ein weiteres Beurteilungskriterium für einen als potentiell neurotoxisch einzustufenden Stoff. Dabei ist das Ausmaß der Veränderung der Zellzahl durch eine Substanz mit ihrer neurotoxischen Substanz korrelierbar. Bei den differenzierenden Zellen handelt es sich um Neurone, Astrozyten und Oligodendrozyten. Durch die technisch an sich sehr einfachen Durchführungsschritte eignen sich diese Methoden besonders zur Automatisierung, wodurch sie für den Einsatz in industriellen ‚High-Throughpuf'-Techniken, bei der oben erwähnten Untersuchung einer großen Zahl von Substanzen sehr wertvoll sind.
• Bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung wurde der Einfluss verschiedener Substanzen, welche entweder bekannte entwicklungsneurotoxische Eigenschaften besitzen (Methylquecksilber, Quecksilberchlorid, Ethanol) oder welche die zelluläre Signaltransduktion beeinflussen (PMA [Phorbolester], Tyrphostin [Epidermal growth factor receptor tyrosin kinase inhibitor], PD98059 [MEK-inhibitor]) mit dem neuen Zellmigrationssystem untersucht. Eine Belastung der Zellen erfolgte entweder vor dem Ausplattieren (die Zellen wurden der Substanz ausgesetzt und die anschließende Differenzierung der Zellen erfolgt in nicht belastetem Medium) oder während der Differenzierung (die Zellen wurden der Substanz während der Entwicklung ausgesetzt). Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt:
  Die Behandlung von NHNP Zellen während der Differenzierung mit 4 μM HgCl₂ und 1 μM CH₃HgCl für zwei Tage resultierte in einer verringerten Migrationsstrecke. Eine Exposition mit 4 μM HgCl₂ führte zu einer 28%igen und 1 μM MeHgCl zu einer 65%igen Reduktion der Migrationsstrecke. Diese unterscheiden sich signifikant von der jeweiligen Kontrolle ohne Noxe.
• Wurden undifferenzierte Neurosphären für nur 30 Minuten bei 37°C/5%CO₂ mit 200 mM Ethanol belastet und anschließend ohne Ethanolzugabe ausplattiert, so wurde die Migrationsstrecke innerhalb von 24 Stunden signifikant um 20% (n = 5) reduziert. Die Hemmung der Migration war mit einer Hemmung der Mitogen aktivierten Proteinkinase (MAPK)-Aktivität (Endpunkt: Phosphorylierung der extracellular signal-regulated Kinase (ERK1/2) korreliert. Ein Zusammenhang zwischen dem Einfluss von Chemikalien, welche die zelluläre Signaltransduktion beeinflussen und der Migration von NHNP Zellen wurde gezeigt, da eine 30 minütige Belastung mit 100 nM PMA, welche zu einer verstärkten Phosphorylierung von ERK1/2 führt, nach einer Differenzierungszeit von 24 Stunden die Migration signifikant um 60% erhöhte. Zusätzlich wurde die Zellzahl von 110 Zellen/Gesichtsfeld auf 195 Zellen/Gesichtsfeld (Faktor 1,7) erhöht. Wurden die Zellen jedoch mit Substanzen belastet, welche einen hemmenden Einfluss auf ERK1/2 ausübten, so wurde die Migrationsstrecke signifikant verringert: eine Belastung mit 10 μM Tyrphostin resultierte in einer 25%igen und 50 μM Tyrphostin in einer 65%igen Inhibierung der Migrationsstrecke. 10 μM Tyrphostin führte außerdem zu einer Veränderung der Anzahl differenzierter Zellen: die Zellzahl wurde von 119 Zellen/Gesichtsfeld auf 87 Zellen/Gesichtsfeld (Faktor 0,7) erniedrigt. Eine Belastung mit 10 μM PD98059 resultierte in einer 34%igen Reduktion der Migrationsstrecke. Ein Einfluss auf die Phosphorylierung von ERK1/2 ist jedoch nicht zwingend notwendig für eine Migrationsstörung, da weitere Signalwege an der Zellmigration beteiligt sind.
• Dies konnten wir am Beispiel von SU6656 (10 μM; src Kinase Inhibitor) zeigen, welcher ohne Beeinflussung von ERK1/2 die Migration signifikant um 41% hemmte.
• Gegenstand der Erfindung ist somit ein in vitro-Verfahren zur Bestimmung der Entwicklungsneurotoxizität (DNT) von Noxen auf normale humane neurale Gehirnzellen, die während ihrer natürlichen Entwicklung im Gehirn neurale funktionale Netzwerke ausbilden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man kultivierte Neurosphären unter Entzug von Wachstumsfaktoren und unter Zugabe der geeignet konzentrierten Noxen auf geeignet beschichteten Objektträgern kultiviert und fixiert und den Abstand und/oder die Zahl der in einer bestimmten Zeit aus den Neurosphären auswachsenden und radiär vom Sphärenrand weg migrierenden Zellen vom Sphärenkern miktroskopisch bestimmt und mit dem unter identischen Kulturbedingungen in noxenfreien Kulturen erreichten Abstand der migrierten Zellen vom Shpärenrand und/oder mit deren Zahl vergleicht.
• Zusammenfassend ist es nun erfindungsgemäß möglich, den Einfluss von potentiellen Noxen auf die Migration sich entwickelnder neuraler Zellen zumindest halbquantitativ untersuchen. Die Veränderung der Migrationsstrecke der Zellen und die Anzahl ausdifferenzierter Zellen dienen dabei als Maß für den neurotoxischen Effekt einer Substanz, gegenüber einer neutralen, nicht toxisch belasteten Blind- oder Lösungsmittelprobe.
• Die 1 stellt schematisch eine Sphäre dar. Unter Wachstumsfaktorentzug und Ausplattieren auf einem nicht dargestellten Objektträger in einem nichttoxischen Medium befinden sich migrierte Zellen zwischen den schematisch eingezeichneten Abständen 2 und 3 (idealerweise 0,3–0,4 mm) radiär von Sphärenoberfläche 6 entfernt. Unter dem Einfluss von Noxen werden signifikant auch die Gebiete 4 und 5 belegt.

1

Sphäre

2

Äußere Migrationsgrenze (Normal)

3

Innere Migrationsgrenze (Normal)

4

Migrationsgebiet unter dem Einfluss hemmender Substanzen

5

Migrationsgebiet unter dem Einfluss stimulierender Substanzen

6

Sphärenoberfläche

Claims (6)

1. In vitro-Verfahren zur Bestimmung der Entwicklungsneurotoxizität (DNT) von Noxen auf normale humane neurale Gehirnzellen, die während ihrer natürlichen Entwicklung im Gehirn neurale funktionale Netzwerke ausbilden, dadurch gekennzeichnet, dass man kultivierte Neurosphären unter Entzug von Wachstumsfaktoren und unter Zugabe der geeignet konzentrierten Noxen auf geeignet beschichteten Objektträgern kultiviert und fixiert und den Abstand und/oder die Zahl der in einer bestimmten Zeit aus den Neurosphären auswachsenden und radiär vom Sphärenrand weg migrierenden Zellen vom Sphärenkern miktroskopisch bestimmt und mit dem unter identischen Kulturbedingungen in noxenfreien Kulturen erreichten Abstand der migrierten Zellen vom Sphärenrand und/oder mit deren Zahl vergleicht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Objektträger mit Poly-D-Lysin/Laminin beschichtet sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1–2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den abgesetzten Zellen um Neurone und/oder Astrozyten handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass der Abstand ausgewachsener und toxisch nicht beeinflusster Zellen radiär vom Zellenrand etwa 0,2 bis 0,5, bevorzugt 0,3 bis 0,4 mm, nach einer Kultivierungszeit von 24 Stunden beträgt.
5. Verfahren nach Anspruch 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren als Screeningverfahren durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren als automatisch durchgeführt wird.