JP2021084882A - 脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤及びその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤。
[2]対照と比較してp38 MAPKのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
[3]γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養することにより製造された、[2]に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
[4]多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、請求項2に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
[5]ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、誘導された神経細胞のp38 MAPKのリン酸化を測定する工程と、測定されたp38 MAPKのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
[6]ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する培養工程と、前記培養工程後のニューロスフィアにおけるp38 MAPKのリン酸化を測定する工程と、測定されたp38 MAPKのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
1実施形態において、本発明は、γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤を提供する。
1実施形態において、本発明は、対照と比較してp38 MAPKのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェアを提供する。
1実施形態において、本発明は、多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、上述した脊髄損傷治療用ニューロスフェアを製造することができる。本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞、ニューロスフェア、γセクレターゼ阻害剤については上述したものと同様である。
(第1実施形態)
第1実施形態のスクリーニング方法は、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、誘導された神経細胞のp38 MAPKのリン酸化を測定する工程と、測定されたp38 MAPKのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法である。
第2実施形態のスクリーニング方法は、ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、培養後の前記ニューロスフィア中のp38 MAPKのリン酸化を測定する工程と、測定されたp38 MAPKのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法である。
1実施形態において、本発明は、p38 MAPKのリン酸化が増強したニューロスフェアの有効量を、脊髄損傷患者の損傷部位に移植する工程を含む、脊髄損傷の治療方法を提供する。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植1)
《脊髄損傷モデルマウスの作製》
免疫不全マウスであるNOD/ShiJic−scidJcIマウス(8週齢、メス)を麻酔した。続いて、第10胸椎に椎弓切除術を行い背側の硬膜を露出させた後、挫滅による中等度の脊髄損傷を形成した。脊髄損傷の形成には、ステンレスチップを備えたIHインパクター(Precision Systems and Instrumentation社製)を用い、力を60kdyn(0.6N)に設定した衝撃を与えた。
ヒトiPS細胞株である201B7及び414C2を、マウス胎児由来線維芽細胞と共に12日間接着培養した。続いて、30日間浮遊培養して胚葉体を形成させた。続いて、凝集した細胞をニューロスフェアに分化させた。
201B7細胞由来のニューロスフェア及び414C2細胞由来のニューロスフェアをそれぞれ解離させ、EFプロモーターの制御下でffLucを発現するコンストラクトを、レンチウイルスを用いて導入した。ffLucとは、ホタルルシフェラーゼとVenus蛍光タンパク質との融合タンパク質である。これにより、ルシフェラーゼのシグナル又はVenusの蛍光シグナルの検出により移植した細胞を特定することができる。
γセクレターゼ阻害剤であるDAPT(CAS番号:208255−80−5、シグマ−アルドリッチ社)をジメチルスルホキシド(DMSO)に終濃度10mMとなるように溶解して使用した。
図1(a)及び(b)は、細胞の移植後経時的に行った生物発光イメージングにより、移植した細胞から放出された光子を定量した結果を示すグラフである(n=10)。図1(a)は201B7細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図1(b)は414C2細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である。
損傷部位の中心部に移植した細胞の分化状態を評価するために、移植から84日後の脊髄切片を用いて様々な細胞マーカーの免疫染色を行い定量的な解析を行った。細胞マーカーとして、ヒト核抗原(HNA)、Ki67、Nestin、pan−ELAVL(Hu)、GFAP、APCを免疫染色した。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植2)
実験例1における、移植から84日後の各マウスの脊髄切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色及びルクソール・ファスト・ブルー(LFB)染色し、脊髄の切片の形状を観察し、ミエリン化された領域を検討した。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植3)
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの移植による軸索再生の効果を、脊髄切片の免疫染色及び免疫電子顕微鏡観察により検討した。免疫染色では、neurofilament 200kDa(NF−H)及び5−ヒドロキシトリプタミン(5HT)を染色した。
図8(a)及び(b)は201B7細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図8(a)はNF−Hを免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは200μmである。図8(b)は図8(a)の結果を数値化したグラフである(n=10)。
図10(a)及び(b)は201B7細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図10(a)は腰膨大における5HT陽性のセロトニン作動性神経線維を免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは200μmである。図10(b)は図10(a)の結果を数値化したグラフである(n=10)。
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアを移植したマウスの脊髄の凍結切片をブロッキングした後、抗ヒト細胞質抗体(STEM121、マウスIgG1)を反応させた。続いて、ナノゴールド標識ヤギ抗マウス抗体を反応させた。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの解析1)
《サイトカインの解析》
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアが、γセクレターゼ阻害剤で処理していないヒトiPS細胞由来ニューロスフェアと比較して、何らかの神経栄養因子を分泌している可能性を検討した。
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアが、慢性期脊髄損傷における軸索再生を誘導する機構として、p38 MAPKのリン酸化を検討した。
(移植した細胞由来の成熟神経細胞の解析)
脊髄損傷後のセロトニン作動性活性への介入が中枢パターン発生器(CPG)の活性化を通じて運動機能を回復させることが報告されている。そこで、γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの移植がCPGに及ぼす有効性を免疫染色により検討した。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植による網様体脊髄路の再生)
網様体脊髄路(RtST)は、網様体から下行して脊髄内で終結する神経線維であり、自発運動の開始及び姿勢の制御に重要な役割を果たしていることが知られている。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植による運動機能の回復)
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの移植後、経時的にマウスの運動機能を評価した。図22(a)及び(b)は、各群のマウスのBasso Mouse Scale(BMS)スコアの測定結果を示すグラフである(各群それぞれn=10)。図22(a)は201B7細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図22(b)は414C2細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である。
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの移植から84日後に、DigiGaitシステム(Mouse Specifics社製)を用いて歩行機能を評価した。
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの移植から84日後に、ロータロッド装置(室町機械製)を用いて運動機能を評価した。ロータロッド装置は、直径3cm、長さ8cmのプラスチック製の棒の両端に直径40cmの円盤を有する装置である。ロータロッド装置を20rpmで回転させ、マウスを装置の棒に置き、棒上に残存できた時間(秒)を測定した。5回試験を行い、最も長時間残存できた時間(秒)を記録した。
図25は、脊髄損傷部位から尾側に3mm離れた位置において測定した、BDA標識した網様体脊髄路線維の面積の割合と、上述したBMSスコアの関連を示す代表的なグラフである(n=14)。
(γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアの解析2)
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトiPS細胞由来ニューロスフェアにおけるp38 MAPKのリン酸化を検討した。
Claims (6)
- γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤。
- 対照と比較してp38 MAPKのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
- γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養することにより製造された、請求項2に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
- 多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、請求項2に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
- ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、
誘導された神経細胞のp38 MAPKのリン酸化を測定する工程と、
測定されたp38 MAPKのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、
脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。 - ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、
培養後の前記ニューロスフィア中のp38 MAPKのリン酸化を測定する工程と、
測定されたp38 MAPKのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、
脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
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