JP2021084882A - 脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤及びその使用 - Google Patents
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Abstract
【課題】脊髄損傷を治療する技術を提供する。【解決手段】γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤。【選択図】なし
Description
本発明は、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤、脊髄損傷治療用ニューロスフェア、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法に関する。
脊髄損傷は壊滅的な傷害であり、麻痺、感覚障害、神経疼痛及び腸−膀胱機能障害を引き起こす。脊髄損傷の治療に神経幹細胞又は神経前駆細胞を移植する研究が多数報告されているが、移植のための最適な時間枠は脊髄損傷後の亜急性期であると考えられている。そして、慢性期の脊髄損傷を治療することは、グリア瘢痕や空洞の形成等の骨髄内環境の変化のために困難であると考えられている（例えば、非特許文献１を参照。）。しかしながら、ほとんどの脊髄損傷患者は慢性期にあるため、慢性期の脊髄損傷にも適用可能な治療技術の開発が求められている。
Keirstead H. S., et al., Human Embryonic Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cell Transplants Remyelinate and Restore Locomotion after Spinal Cord Injury, J. Neurosci., 25 (19), 4694-4705, 2005.
本発明は、脊髄損傷を治療する技術を提供することを目的とする。
本発明は以下の態様を含む。
［１］γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤。
［２］対照と比較してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
［３］γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養することにより製造された、［２］に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
［４］多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、請求項２に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
［５］ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、誘導された神経細胞のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
［６］ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する培養工程と、前記培養工程後のニューロスフィアにおけるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
［１］γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤。
［２］対照と比較してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
［３］γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養することにより製造された、［２］に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
［４］多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、請求項２に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
［５］ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、誘導された神経細胞のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
［６］ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する培養工程と、前記培養工程後のニューロスフィアにおけるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
本発明によれば、脊髄損傷を治療する技術を提供することができる。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤］
１実施形態において、本発明は、γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤を提供する。
１実施形態において、本発明は、γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤を提供する。
本明細書において、ニューロスフェアとは、神経幹細胞又は神経前駆細胞の浮遊増殖培養によって形成される球状の細胞凝集塊を意味する。神経幹細胞とは、自己複製能と神経前駆細胞への分化能を持つ細胞を意味する。また、神経前駆細胞とは、未分化ではあるが神経幹細胞から一段階分化した細胞であり、自身の自己増殖を行い、最終的には神経細胞に分化する細胞のことである。
神経幹細胞又は神経前駆細胞は、多能性幹細胞から分化誘導して得られたものであることが好ましい。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。多能性幹細胞はヒトの細胞であることが好ましい。
多能性幹細胞を神経幹細胞又は神経前駆細胞に分化誘導する方法は、特に限定されず、通常行われる方法であってよい。例えば、多能性幹細胞をＢａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）の少なくとも１種を含有する培地中で浮遊培養することによりニューロスフェアを得ることができる。また、得られたニューロスフェアを単一細胞に解離させて再びｂＦＧＦを含有する培地中で浮遊培養し、再びニューロスフェアを形成することを複数回繰り返してもよい。
実施例において後述するように、ニューロスフェアにγセクレターゼ阻害剤を作用させて、慢性期脊髄損傷モデルマウスの脊髄損傷部位に移植することにより、脊髄損傷を治療することができる。したがって、γセクレターゼ阻害剤は、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤であるということができる。
γセクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５−８０−５）、Ｃｏｍｏｕｎｄ ３４（ＣＡＳ番号：５６４４６２−３６−８）等が挙げられる。
γセクレターゼ阻害剤は、ニューロスフェアの培地に添加した場合にニューロスフェアの細胞分裂を効果的に抑制し、ニューロスフェアに顕著な細胞毒性を示さず、また、培地中で沈殿を形成しない最大の濃度で作用させることが好ましい。例えば、γセクレターゼ阻害剤としてＤＡＰＴを用いる場合、ニューロスフェアの培地中のＤＡＰＴの終濃度は、１０〜１０００μＭであることが好ましく、１０〜１００μＭであることがより好ましく、１０μＭであることが更に好ましい。
また、ニューロスフェアにγセクレターゼ阻害剤を作用させる期間としては、２０〜２４時間が好ましい。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェア］
１実施形態において、本発明は、対照と比較してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェアを提供する。
１実施形態において、本発明は、対照と比較してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェアを提供する。
実施例において後述するように、本実施形態のニューロスフェアを慢性期脊髄損傷モデルマウスの脊髄損傷部位に移植することにより、脊髄損傷を治療することができる。また、発明者らは、γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養したニューロスフェアでは、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強していることを明らかにした。また、発明者らは、本実施形態のニューロスフェアから分化誘導して得られた神経細胞において、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強していることを明らかにした。
本実施形態のニューロスフェアにおいて、対照としては、γセクレターゼ阻害剤と接触していないニューロスフェア、又は、γセクレターゼ阻害剤と接触していないニューロスフェアから分化誘導して得られた神経細胞が挙げられる。
ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化は、リン酸化ｐ３８に特異的な抗体を用いた免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
本実施形態のニューロスフェアは、γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養することにより製造された細胞であることが好ましい。γセクレターゼ阻害剤、ニューロスフェアについては、上述したものと同様である。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法］
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、上述した脊髄損傷治療用ニューロスフェアを製造することができる。本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞、ニューロスフェア、γセクレターゼ阻害剤については上述したものと同様である。
１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法を提供する。本実施形態の製造方法により、上述した脊髄損傷治療用ニューロスフェアを製造することができる。本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞、ニューロスフェア、γセクレターゼ阻害剤については上述したものと同様である。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法］
（第１実施形態）
第１実施形態のスクリーニング方法は、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、誘導された神経細胞のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法である。
（第１実施形態）
第１実施形態のスクリーニング方法は、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、誘導された神経細胞のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法である。
実施例において後述するように、発明者らは、脊髄損傷部位に移植することにより、慢性期の脊髄損傷を治療することができるニューロスフェアを分化誘導して得られた神経細胞は、対照と比較してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強していることを明らかにした。したがって、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程の少なくとも一部で細胞に作用させることにより、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を増強させる被験物質は、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤であるということができる。
被験物質は、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程の少なくとも一部で細胞に作用さてもよいし、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程の全部で細胞に作用させてもよい。
例えば、被験物質は、８〜７２時間作用させてもよく、１２〜４８時間作用させてもよく、２０〜２４時間作用させてもよい。
対照としては、γセクレターゼ阻害剤と接触していないニューロスフェアから分化誘導して得られた神経細胞が挙げられる。
また、被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
また、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化は、リン酸化ｐ３８に特異的な抗体を用いた免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
（第２実施形態）
第２実施形態のスクリーニング方法は、ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、培養後の前記ニューロスフィア中のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法である。
第２実施形態のスクリーニング方法は、ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、培養後の前記ニューロスフィア中のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法である。
第１実施形態のスクリーニング方法では、被験物質の存在下で培養したニューロスフェアを神経細胞に分化誘導した後にｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定していたのに対し、第２実施形態のスクリーニング方法は、被験物質の存在下で培養したニューロスフェアを神経細胞に分化誘導させずにｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する点において主に異なる。第２実施形態のスクリーニング方法によっても脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤をスクリーニングすることができる。
第２実施形態のスクリーニング方法において、対照としては、γセクレターゼ阻害剤と接触していないニューロスフェアが挙げられる。また、被験物質、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化の測定方法については第１実施形態のスクリーニング方法と同様である。
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強したニューロスフェアの有効量を、脊髄損傷患者の損傷部位に移植する工程を含む、脊髄損傷の治療方法を提供する。
１実施形態において、本発明は、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強したニューロスフェアの有効量を、脊髄損傷患者の損傷部位に移植する工程を含む、脊髄損傷の治療方法を提供する。
ニューロスフェアは、患者に対する拒絶反応が抑制された細胞であることが好ましい。ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強したニューロスフェアについては、上述したものと同様である。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。全ての動物実験は慶應義塾大学動物実験委員会のガイドライン及びアメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のガイドラインにしたがって行った（慶應義塾大学承認番号１３０２０）。
［実験例１］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植１）
《脊髄損傷モデルマウスの作製》
免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄＪｃＩマウス（８週齢、メス）を麻酔した。続いて、第１０胸椎に椎弓切除術を行い背側の硬膜を露出させた後、挫滅による中等度の脊髄損傷を形成した。脊髄損傷の形成には、ステンレスチップを備えたＩＨインパクター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社製）を用い、力を６０ｋｄｙｎ（０．６Ｎ）に設定した衝撃を与えた。
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植１）
《脊髄損傷モデルマウスの作製》
免疫不全マウスであるＮＯＤ／ＳｈｉＪｉｃ−ｓｃｉｄＪｃＩマウス（８週齢、メス）を麻酔した。続いて、第１０胸椎に椎弓切除術を行い背側の硬膜を露出させた後、挫滅による中等度の脊髄損傷を形成した。脊髄損傷の形成には、ステンレスチップを備えたＩＨインパクター（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ社製）を用い、力を６０ｋｄｙｎ（０．６Ｎ）に設定した衝撃を与えた。
《ニューロスフェアの調製》
ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７及び４１４Ｃ２を、マウス胎児由来線維芽細胞と共に１２日間接着培養した。続いて、３０日間浮遊培養して胚葉体を形成させた。続いて、凝集した細胞をニューロスフェアに分化させた。
ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７及び４１４Ｃ２を、マウス胎児由来線維芽細胞と共に１２日間接着培養した。続いて、３０日間浮遊培養して胚葉体を形成させた。続いて、凝集した細胞をニューロスフェアに分化させた。
《レンチウイルス感染》
２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア及び４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアをそれぞれ解離させ、ＥＦプロモーターの制御下でｆｆＬｕｃを発現するコンストラクトを、レンチウイルスを用いて導入した。ｆｆＬｕｃとは、ホタルルシフェラーゼとＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質との融合タンパク質である。これにより、ルシフェラーゼのシグナル又はＶｅｎｕｓの蛍光シグナルの検出により移植した細胞を特定することができる。
２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア及び４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアをそれぞれ解離させ、ＥＦプロモーターの制御下でｆｆＬｕｃを発現するコンストラクトを、レンチウイルスを用いて導入した。ｆｆＬｕｃとは、ホタルルシフェラーゼとＶｅｎｕｓ蛍光タンパク質との融合タンパク質である。これにより、ルシフェラーゼのシグナル又はＶｅｎｕｓの蛍光シグナルの検出により移植した細胞を特定することができる。
ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応はＡＴＰに依存するため、生きた細胞のみが光子を放出する。このため、生物発光イメージング（ＢＬＩ）システムにより、経時的に移植した細胞の生存を評価することができる。
《脊髄損傷モデルマウスへの細胞移植》
γセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５−８０−５、シグマ−アルドリッチ社）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に終濃度１０ｍＭとなるように溶解して使用した。
γセクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５−８０−５、シグマ−アルドリッチ社）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に終濃度１０ｍＭとなるように溶解して使用した。
移植の前に、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア及び４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを、それぞれ、終濃度１０μＭのＤＡＰＴの存在下で１日間培養した。また、ＤＡＰＴの非存在下で培養した群（ＤＡＰＴを溶解した溶媒のみを培地に添加した群）も用意した。
脊髄損傷から４２日後に、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェア（以下、「ＧＳＩ（＋）群」という場合がある。）、又は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェア（以下、「ＧＳＩ（−）群」という場合がある。）を５×１０５個／２μＬの細胞密度で各マウスの損傷部位の中心部に移植した。マウスは各群ともｎ＝１０であった。ガラス製のマイクロピペットを用い、２５μＬシリンジ（ハミルトン製）及び定位固定のマイクロインジェクター（製品名「ＫＤＳ ３１０」、室町機械製）を用いて１μＬ／分で移植を行った。また、同容量のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を移植した群（以下、「ＰＢＳ群」という場合がある。）も用意した。
《移植した細胞の生存率の評価》
図１（ａ）及び（ｂ）は、細胞の移植後経時的に行った生物発光イメージングにより、移植した細胞から放出された光子を定量した結果を示すグラフである（ｎ＝１０）。図１（ａ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図１（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である。
図１（ａ）及び（ｂ）は、細胞の移植後経時的に行った生物発光イメージングにより、移植した細胞から放出された光子を定量した結果を示すグラフである（ｎ＝１０）。図１（ａ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図１（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である。
図１（ａ）及び（ｂ）中、横軸は細胞の移植からの日数を示し、縦軸は検出された光子数を示す。また、「ＧＳＩ（＋）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（−）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、ＤＡＰＴ処理を行った場合及び行わなかった場合のいずれにおいても移植後７日間は光子数が減少し、移植から１４日後にプラトーに達し、その後移植から３か月後まで光子数が維持されたことが明らかとなった。
この結果から、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェア、及び、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアのいずれも、移植後、脊髄損傷の慢性期においても生存し続け、目立った腫瘍原性も認められないことが明らかとなった。
《移植した細胞の分化状態の評価》
損傷部位の中心部に移植した細胞の分化状態を評価するために、移植から８４日後の脊髄切片を用いて様々な細胞マーカーの免疫染色を行い定量的な解析を行った。細胞マーカーとして、ヒト核抗原（ＨＮＡ）、Ｋｉ６７、Ｎｅｓｔｉｎ、ｐａｎ−ＥＬＡＶＬ（Ｈｕ）、ＧＦＡＰ、ＡＰＣを免疫染色した。
損傷部位の中心部に移植した細胞の分化状態を評価するために、移植から８４日後の脊髄切片を用いて様々な細胞マーカーの免疫染色を行い定量的な解析を行った。細胞マーカーとして、ヒト核抗原（ＨＮＡ）、Ｋｉ６７、Ｎｅｓｔｉｎ、ｐａｎ−ＥＬＡＶＬ（Ｈｕ）、ＧＦＡＰ、ＡＰＣを免疫染色した。
図２（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを脊髄損傷部位へ移植した組織の免疫染色の結果である。図２（ａ）は免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真であり、図２（ｂ）は図２（ａ）のＨＮＡ陽性細胞における各種マーカー陽性細胞数の割合（％）をグラフにしたのものである（ｎ＝１０）。
また、図３（ａ）及び（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを脊髄損傷部位へ移植した組織の免疫染色の結果である。図３（ａ）は免疫染色の結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真であり、図３（ｂ）は図３（ａ）のＨＮＡ陽性細胞における各種マーカー陽性細胞数の割合（％）をグラフにしたのものである（ｎ＝１０）。
図２（ａ）、図２（ｂ）、図３（ａ）及び図３（ｂ）中、「ＧＳＩ（−）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（＋）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示す。また、図２（ｂ）、図３（ｂ）の縦軸はＨＮＡ陽性細胞における各種マーカー陽性細胞数の割合（％）であり、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、移植した、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア、及び、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアのいずれも、ｐａｎ−ＥＬＡＶＬ（Ｈｕ）陽性の成熟神経細胞、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイト、ＡＰＣ陽性のオリゴデンドロサイトの３つの神経系の細胞系譜に分化したことが明らかとなった。
また、ＧＳＩ（＋）群では、ＧＳＩ（−）群と比較して、ｐａｎ−ＥＬＡＶＬ（Ｈｕ）陽性の成熟神経細胞の割合が有意に増加し、Ｎｅｓｔｉｎ陽性細胞の割合が有意に減少したことが明らかとなった。一方、ＧＦＡＰ陽性のアストロサイト、ＡＰＣ陽性のオリゴデンドロサイトの割合は、ＧＳＩ（＋）群及びＧＳＩ（−）群のいずれにおいても有意な差は認められなかった。
［実験例２］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植２）
実験例１における、移植から８４日後の各マウスの脊髄切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色及びルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）染色し、脊髄の切片の形状を観察し、ミエリン化された領域を検討した。
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植２）
実験例１における、移植から８４日後の各マウスの脊髄切片を、ヘマトキシリン・エオシン染色及びルクソール・ファスト・ブルー（ＬＦＢ）染色し、脊髄の切片の形状を観察し、ミエリン化された領域を検討した。
図４（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図４（ａ）はヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図４（ｂ）は図４（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図５（ａ）及び（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図５（ａ）はヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図５（ｂ）は図５（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図４（ａ）、図４（ｂ）、図５（ａ）及び図５（ｂ）中、「ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ」は、細胞を移植せずＰＢＳを注入した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（−）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（＋）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示す。
また、「Ｒｏｓｔｒａｌ ＋４ｍｍ」は、脊髄損傷部位から吻側に４ｍｍ離れた部位の切片の結果であることを示し、「Ｅｐｉ−ｃｅｎｔｅｒ」は脊髄損傷部位の切片の結果であることを示し、「Ｃａｕｄａｌ ＋４ｍｍ」は脊髄損傷部位から尾側に４ｍｍ離れた部位の切片の結果であることを示す。
また、図４（ｂ）、図５（ｂ）の縦軸は脊髄の面積を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
定量的な解析を行った結果、脊髄損傷部位の脊髄断面の面積、及び、脊髄損傷部位から尾側に４ｍｍ離れた部位の脊髄断面の面積は、ＧＳＩ（＋）群において、ＧＳＩ（−）群及びＰＢＳ群と比較して有意に大きいことが明らかとなった。
図６（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図６（ａ）はＬＦＢ染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図６（ｂ）は図６（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図７（ａ）及び（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図７（ａ）はＬＦＢ染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図７（ｂ）は図７（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図６（ａ）、図６（ｂ）、図７（ａ）及び図７（ｂ）中、「ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ」は、細胞を移植せずＰＢＳを注入した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（−）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（＋）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示す。
また、「Ｒｏｓｔｒａｌ ＋Ｘｍｍ」は、脊髄損傷部位から吻側にＸｍｍ離れた部位の切片の結果であることを示し、「Ｅｐｉ−ｃｅｎｔｅｒ」は脊髄損傷部位の切片の結果であることを示し、「Ｃａｕｄａｌ ＋Ｘｍｍ」は脊髄損傷部位から尾側にＸｍｍ離れた部位の切片の結果であることを示す。
また、図６（ｂ）、図７（ｂ）の縦軸はＬＦＢ染色陽性領域の面積を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
定量的な解析を行った結果、ＧＳＩ（＋）群において、脊髄損傷部位から尾側に１ｍｍ離れた部位にわたってＬＦＢ染色陽性のミエリン化された領域の面積が、ＧＳＩ（−）群及びＰＢＳ群と比較して有意に大きいことが明らかとなった。
これらの結果は、γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが、慢性期の脊髄損傷部位の再ミエリン化を導いたことを示す。
［実験例３］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植３）
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植による軸索再生の効果を、脊髄切片の免疫染色及び免疫電子顕微鏡観察により検討した。免疫染色では、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ２００ｋＤａ（ＮＦ−Ｈ）及び５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）を染色した。
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植３）
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植による軸索再生の効果を、脊髄切片の免疫染色及び免疫電子顕微鏡観察により検討した。免疫染色では、ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ２００ｋＤａ（ＮＦ−Ｈ）及び５−ヒドロキシトリプタミン（５ＨＴ）を染色した。
《ＮＦ−Ｈの免疫染色》
図８（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図８（ａ）はＮＦ−Ｈを免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図８（ｂ）は図８（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図８（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図８（ａ）はＮＦ−Ｈを免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図８（ｂ）は図８（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図９（ａ）及び（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図９（ａ）はＮＦ−Ｈを免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図９（ｂ）は図９（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図８（ａ）、図８（ｂ）、図９（ａ）及び図９（ｂ）中、「ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ」は、細胞を移植せずＰＢＳを注入した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（−）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（＋）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示す。
また、図８（ｂ）及び図９（ｂ）中、「Ｒｏｓｔｒａｌ ＋４ｍｍ」は、脊髄損傷部位から吻側に４ｍｍ離れた部位の切片の結果であることを示し、「Ｅｐｉ−ｃｅｎｔｅｒ」は脊髄損傷部位の切片の結果であることを示し、「Ｃａｕｄａｌ ＋４ｍｍ」は脊髄損傷部位から尾側に４ｍｍ離れた部位の切片の結果であることを示す。
また、図８（ｂ）及び図９（ｂ）の縦軸はＮＦ−Ｈ陽性領域の面積を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、脊髄損傷部位、脊髄損傷部位から吻側に４ｍｍ離れた部位及び脊髄損傷部位から尾側に４ｍｍ離れた部位において、ＧＳＩ（＋）群では、ＮＦ−Ｈ陽性の神経線維が、ＧＳＩ（−）群及びＰＢＳ群と比較して有意に多いことが明らかとなった。
《５ＨＴの免疫染色》
図１０（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図１０（ａ）は腰膨大における５ＨＴ陽性のセロトニン作動性神経線維を免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図１０（ｂ）は図１０（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図１０（ａ）及び（ｂ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図１０（ａ）は腰膨大における５ＨＴ陽性のセロトニン作動性神経線維を免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図１０（ｂ）は図１０（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図１１（ａ）及び（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植したマウスの結果である。図１１（ａ）は腰膨大における５ＨＴ陽性のセロトニン作動性神経線維を免疫染色した結果を示す代表的な顕微鏡写真である。スケールバーは２００μｍである。図１１（ｂ）は図１１（ａ）の結果を数値化したグラフである（ｎ＝１０）。
図１０（ａ）、図１０（ｂ）、図１１（ａ）及び図１１（ｂ）中、「ＰＢＳ ｇｒｏｕｐ」は、細胞を移植せずＰＢＳを注入した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（−）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示し、「ＧＳＩ（＋）ｇｒｏｕｐ」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した群の結果であることを示す。
また、図１０（ｂ）及び図１１（ｂ）の縦軸は５ＨＴ陽性領域の面積を示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、ＧＳＩ（＋）群では、５ＨＴ陽性のセロトニン作動性神経線維が、ＧＳＩ（−）群及びＰＢＳ群と比較して有意に多いことが明らかとなった。
《免疫電子顕微鏡観察》
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植したマウスの脊髄の凍結切片をブロッキングした後、抗ヒト細胞質抗体（ＳＴＥＭ１２１、マウスＩｇＧ１）を反応させた。続いて、ナノゴールド標識ヤギ抗マウス抗体を反応させた。
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植したマウスの脊髄の凍結切片をブロッキングした後、抗ヒト細胞質抗体（ＳＴＥＭ１２１、マウスＩｇＧ１）を反応させた。続いて、ナノゴールド標識ヤギ抗マウス抗体を反応させた。
続いて、試料を２．５％グルタルアルデヒド固定し、市販のキット（製品名「Ｒ−Ｇｅｎｔ ＳＥ−ＥＭ Ｓｉｌｖｅｒ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔｓ」、Ａｕｒｉｏｎ社）を用いてナノゴールドのシグナルを増強した。続いて、試料を１％ＯｓＯ４で固定し、脱水処理し、エポンに包埋した。続いて、ウルトラミクロトーム（製品名「ＵＣ７」、ライカ製）を用いて薄切切片（７０ｎｍ）を調製し、酢酸ウラン及びクエン酸鉛で染色し、透過型電子顕微鏡（製品名「モデル１４００プラス」、ＪＥＯＬ製）を用いて観察した。
図１２（ａ）及び（ｂ）は免疫電子顕微鏡観察の結果を示す代表的な写真である。図１２（ａ）のスケールバーは２μｍであり、図１２（ｂ）のスケールバーは２００ｎｍである。図１２（ａ）及び（ｂ）中、矢印はミエリンラメラを示す。
その結果、慢性期脊髄損傷において、移植細胞に由来する多数の再生軸索が、ホストに由来するグリア細胞によって積極的に再ミエリン化されていることが明らかとなった。
［実験例４］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの解析１）
《サイトカインの解析》
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが、γセクレターゼ阻害剤で処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアと比較して、何らかの神経栄養因子を分泌している可能性を検討した。
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの解析１）
《サイトカインの解析》
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが、γセクレターゼ阻害剤で処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアと比較して、何らかの神経栄養因子を分泌している可能性を検討した。
具体的には、抗サイトカイン抗体アレイ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェア及びγセクレターゼ阻害剤で処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが分泌する、ＢＤＮＦ、ｂ−ＮＧＦ、ＨＧＦ、ＣＴＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ−４、ＮＴ−３、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＶＥＧＦの発現量を定量した。
その結果、γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが、γセクレターゼ阻害剤で処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアと比較して、顕著に発現量を増大させた因子は認められなかった。
《ｐ３８リン酸化の検討》
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが、慢性期脊髄損傷における軸索再生を誘導する機構として、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を検討した。
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアが、慢性期脊髄損傷における軸索再生を誘導する機構として、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を検討した。
具体的には、インビトロ実験系において、γセクレターゼ阻害剤及びｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤でヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを処理し、神経細胞への分化を誘導した。続いて、神経突起の長さを測定し評価した。
γセクレターゼ阻害剤としてはＤＡＰＴを使用した。また、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤としてはＳＢ２０３５８０（ＣＡＳ番号：１５２１２１−４７−６）を使用した。まず、ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを、γセクレターゼ阻害剤のみの存在下、ｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤のみの存在下、又は、γセクレターゼ阻害剤及びｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤の存在下で１日間培養した。
続いて、各細胞をポリ−Ｌ−オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（コースター社製）に１×１０５個／ｍＬの細胞密度で播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。続いて、分化誘導開始後７日目及び１４日目に細胞を０．１Ｍ ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経突起の長さを測定した。
図１３（ａ）は２０１Ｂ７細胞由来の神経細胞の結果を示すグラフである（ｎ＝５）。また、図１３（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来の神経細胞の結果を示すグラフである（ｎ＝５）。図１３（ａ）及び（ｂ）中、「ＧＳＩ」はＤＡＰＴを示し、「ｐ３８ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」はＳＢ２０３５８０を示し、「（−）」は添加しなかったことを示し、「（＋）」は添加したことを示す。また、縦軸は神経突起の長さを示し、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
その結果、ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤で処理すると、処理しなかった群と比較して神経突起の伸長が有意に大きいことが明らかとなった。これに対し、ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアをｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤で処理すると、神経突起の伸長が有意に低下したことが明らかとなった。
また、ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤とｐ３８ ＭＡＰＫ阻害剤の双方で処理した場合、神経突起の伸長は処理しなかった群と同等であることが明らかとなった。
分化誘導開始後１４日目の細胞を用いて、ｐ３８ ＭＡＰＫ、リン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫ及びβＩＩＩ−チュブリンの免疫染色を行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ＣＡＳ番号：２３４９１−５２−３）を用いて細胞核を染色した。
図１４（ａ）及び（ｂ）はＧＳＩ（＋）群の細胞の免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。図１４（ａ）及び（ｂ）中、「Ｐｐ３８」はリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は顕微鏡写真を重ね合わせた結果であることを示す。スケールバーは２０μｍである。
その結果、γセクレターゼ阻害剤で処理した細胞では、βＩＩＩ−チュブリン陽性の神経細胞とｐ３８陽性領域が共局在することが明らかとなった。また、リン酸化ｐ３８陽性領域は核に認められた。
続いて、ウエスタンブロッティングにより、リン酸化されていないｐ３８及びリン酸化されたｐ３８を定量した。図１５（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ローディングコントロールとしてβ−アクチンのウエスタンブロッティングを行った。図１５（ｂ）は、リン酸化されていないｐ３８ ＭＡＰＫを定量した結果を示すグラフである。図１５（ｃ）は、リン酸化されたｐ３８ ＭＡＰＫ（Ｐｐ３８）を定量した結果を示すグラフである。
図１５（ａ）〜（ｃ）中、「ＧＳＩ（＋）」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＳＩ（−）」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、リン酸化されていないｐ３８の量は、ＧＳＩ（−）群とＧＳＩ（＋）群の間で同程度であったのに対し、リン酸化されたｐ３８は、ＧＳＩ（＋）群で上方制御されたことが明らかとなった。
続いて、上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植から８４日後の脊髄切片を用いて、抗ヒト細胞質抗体（ＳＴＥＭ１２１）及びリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫの免疫染色を行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２を用いて細胞核を染色した。
図１６（ａ）及び（ｂ）は免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。図１６（ａ）はＧＳＩ（−）群の結果であり、図１６（ｂ）はＧＳＩ（＋）群の結果である。図１６（ａ）及び（ｂ）中、「Ｐｐ３８」はリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は顕微鏡写真を重ね合わせた結果であることを示す。スケールバーは２０μｍである。
その結果、ＧＳＩ（＋）群では、ＳＴＥＭ１２１陽性の移植細胞とリン酸化ｐ３８陽性領域が共局在することが明らかとなった。
図１６（ｃ）は、図１６（ａ）及び（ｂ）に基づいて、ＳＴＥＭ１２１陽性の移植細胞におけるリン酸化ｐ３８陽性細胞の割合を算出した結果を示すグラフである（ｎ＝１０）。図１６（ｃ）中、「ＧＳＩ（−）」は、ＤＡＰＴ処理していないヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した結果であることを示し、「ＧＳＩ（＋）」は、ＤＡＰＴ処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアを移植した結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
その結果、ＧＳＩ（＋）群では、ＧＳＩ（−）群と比較して、ＳＴＥＭ１２１陽性の移植細胞におけるリン酸化ｐ３８陽性細胞の割合が有意に増加したことが明らかとなった。
以上の結果は、ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤で処理することにより、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が促進され、軸索再生につながることを示す。
［実験例５］
（移植した細胞由来の成熟神経細胞の解析）
脊髄損傷後のセロトニン作動性活性への介入が中枢パターン発生器（ＣＰＧ）の活性化を通じて運動機能を回復させることが報告されている。そこで、γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植がＣＰＧに及ぼす有効性を免疫染色により検討した。
（移植した細胞由来の成熟神経細胞の解析）
脊髄損傷後のセロトニン作動性活性への介入が中枢パターン発生器（ＣＰＧ）の活性化を通じて運動機能を回復させることが報告されている。そこで、γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植がＣＰＧに及ぼす有効性を免疫染色により検討した。
図１７（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。その結果、ＳＴＥＭ１２１陽性／ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−１（ＶＧＬｕＴ１）陽性の興奮性神経細胞はほとんど観察されなかった。
これに対し、定量的な解析の結果、ＳＴＥＭ１２１陽性細胞のうち７８％がｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ６７（ＧＡＤ６７）陽性の抑制性神経細胞であることが明らかとなった。この結果は、移植した細胞に由来する神経細胞はＧＡＢＡ作動性であることを示す。
また、図１７（ｂ）に示すように、ＳＴＥＭ１２１陽性の移植細胞は、ＳＴＥＭ１２１陰性／ＧＡＤ６７陽性のホストのマウス細胞に接続していることが明らかとなった。
続いて、γセクレターゼ阻害剤で処理した移植細胞由来の神経細胞がホストの神経回路に組み込まれているか否かを検討するために、更なる免疫染色を行った。図１８（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。
その結果、実質部に移植されたβＩＩＩ−チュブリン陽性／ヒト核抗原（ＨＮＡ）陽性の移植細胞は、マウス特異的なプレシナプスマーカーであるＢａｓｓｏｏｎ（Ｂｓｎ）陽性のホストの神経線維の末端と共局在することが明らかとなった。
また、ヒト特異的なプレシナプスマーカーであるｓｙｎａｐｔｏｐｈｙｓｉｎ（ｈＳｙｎ）陽性の神経線維の末端は、βＩＩＩ−チュブリン陽性／ヒト核抗原（ＨＮＡ）陰性のホストのマウス神経細胞と近接していることが明らかとなった。
図１９（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。その結果、興奮性シナプスの末端のポストシナプスマーカーである、ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ９５（ＰＳＤ９５）陽性のシナプス末端は非常にまれであることが明らかとなった。また、抑制性シナプスの末端のポストシナプスマーカーであるＧｅｐｈｒｙｉｎ陽性のシナプス末端は、ＳＴＥＭ１２１陽性の移植細胞に近接していることが明らかとなった。
図２０（ａ）及び（ｂ）は移植細胞に由来するヒト神経細胞とホストのマウス神経細胞との間に形成されたシナプスの免疫電子顕微鏡観察の結果を示す代表的な写真である。スケールバーは５００ｎｍである。図２０（ａ）及び（ｂ）中、「Ｔ」は移植細胞に由来する神経細胞を示し、「Ｈ」はホストの神経細胞を示す。また、黒い点は移植細胞に由来するＳＴＥＭ１２１陽性細胞であることを示す。
その結果、移植細胞に由来するＳＴＥＭ１２１陽性のプレシナプス構造及びポストシナプス構造が多数観察され、脊髄損傷部位に、移植細胞に由来するヒト神経細胞とホストのマウス神経細胞との間のシナプス結合が観察された。
［実験例６］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植による網様体脊髄路の再生）
網様体脊髄路（ＲｔＳＴ）は、網様体から下行して脊髄内で終結する神経線維であり、自発運動の開始及び姿勢の制御に重要な役割を果たしていることが知られている。
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植による網様体脊髄路の再生）
網様体脊髄路（ＲｔＳＴ）は、網様体から下行して脊髄内で終結する神経線維であり、自発運動の開始及び姿勢の制御に重要な役割を果たしていることが知られている。
脳幹からの網様体脊髄路の再生を評価するために、上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植から７７日後に、ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ）染色による、神経線維トレースを行った。
図２１（ａ）及び（ｂ）は、ＢＤＡ染色した網様体脊髄路を観察した脊髄切片の代表的な顕微鏡写真である。図２１（ａ）は、ＧＳＩ（−）群の脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置の代表的な写真である。右側の写真は左側の写真の四角で囲んだ領域を拡大したものである。スケールバーは５００μｍである。
図２１（ｂ）は、ＧＳＩ（＋）群の脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置の代表的な写真である。右側の写真は左側の写真の四角で囲んだ領域を拡大したものである。スケールバーは５００μｍである。矢頭は網様体脊髄路線維を示す。
図２１（ｃ）は、脊髄損傷部位の吻側に４ｍｍの位置から脊髄損傷部位の尾側に４ｍｍまでにわたる各位置における、ＢＤＡ染色された網様体脊髄路線維の面積の割合の相対値を測定した結果を示すグラフである（ｎ＝４）。図２１（ｃ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
その結果、ＧＳＩ（＋）群では、脊髄損傷部位の吻側から尾側にわたって伸長した、ＢＤＡ標識された網様体脊髄路線維が観察された。また、ＧＳＩ（＋）群では、ＧＳＩ（−）群及びＰＢＳ群と比較して、脊髄損傷部位、及び、脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置において、網様体脊髄路線維の面積の割合が有意に増大したことが明らかとなった。
［実験例７］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植による運動機能の回復）
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの慢性期脊髄損傷モデルマウスへの移植による運動機能の回復）
《ＢＭＳスコアによる評価》
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植後、経時的にマウスの運動機能を評価した。図２２（ａ）及び（ｂ）は、各群のマウスのＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）スコアの測定結果を示すグラフである（各群それぞれｎ＝１０）。図２２（ａ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図２２（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である。
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植後、経時的にマウスの運動機能を評価した。図２２（ａ）及び（ｂ）は、各群のマウスのＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）スコアの測定結果を示すグラフである（各群それぞれｎ＝１０）。図２２（ａ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図２２（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である。
その結果、ＧＳＩ（−）群では、ＰＢＳ群と比較して、有意な運動機能の回復は認められなかった。これに対し、ＧＳＩ（＋）群では、細胞移植の５６日後に、ＰＢＳ群と比較して、有意な運動機能の回復が認められ、回復した運動機能はその後も維持された。
《トレッドミルによる評価》
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植から８４日後に、ＤｉｇｉＧａｉｔシステム（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓ社製）を用いて歩行機能を評価した。
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植から８４日後に、ＤｉｇｉＧａｉｔシステム（Ｍｏｕｓｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｓ社製）を用いて歩行機能を評価した。
図２３（ａ）〜（ｄ）は、歩行機能の評価結果を示すグラフである。図２３（ａ）及び（ｃ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図２３（ｂ）及び（ｄ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である（各群それぞれｎ＝１０）。また、図２３（ａ）及び（ｂ）は歩長の解析結果を示し、図２３（ｃ）及び（ｄ）はスタンス角の解析結果を示す。図２３（ａ）〜（ｄ）中、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、ＧＳＩ（＋）群のマウスは、ＧＳＩ（−）群及びＰＢＳ群のマウスと比較して有意に長い歩長及び有意に短いスタンス角を示した。また、ＧＳＩ（＋）群のマウスは全てトレッドミル上で十分によく歩き７ｃｍ／秒の速度で歩いた。
《ロータロッド試験による評価》
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植から８４日後に、ロータロッド装置（室町機械製）を用いて運動機能を評価した。ロータロッド装置は、直径３ｃｍ、長さ８ｃｍのプラスチック製の棒の両端に直径４０ｃｍの円盤を有する装置である。ロータロッド装置を２０ｒｐｍで回転させ、マウスを装置の棒に置き、棒上に残存できた時間（秒）を測定した。５回試験を行い、最も長時間残存できた時間（秒）を記録した。
上述した慢性期脊髄損傷モデルマウスへのヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの移植から８４日後に、ロータロッド装置（室町機械製）を用いて運動機能を評価した。ロータロッド装置は、直径３ｃｍ、長さ８ｃｍのプラスチック製の棒の両端に直径４０ｃｍの円盤を有する装置である。ロータロッド装置を２０ｒｐｍで回転させ、マウスを装置の棒に置き、棒上に残存できた時間（秒）を測定した。５回試験を行い、最も長時間残存できた時間（秒）を記録した。
図２４（ａ）及び（ｂ）は、ロータロッド試験の結果を示すグラフである。図２４（ａ）は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを移植した結果であり、図２４（ｂ）は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを移植した結果である（各群それぞれｎ＝１０）。図２４（ａ）及び（ｂ）中、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「Ｎ．Ｓ．」は有意差がないことを示す。
その結果、ＧＳＩ（＋）群のマウスは、ＧＳＩ（−）群のマウス及びＰＢＳ群のマウスと比較してロータロッド装置上に有意に長時間残存することができた。
《ＢＭＳスコアと網様体脊髄路線維の面積の割合の解析》
図２５は、脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置において測定した、ＢＤＡ標識した網様体脊髄路線維の面積の割合と、上述したＢＭＳスコアの関連を示す代表的なグラフである（ｎ＝１４）。
図２５は、脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置において測定した、ＢＤＡ標識した網様体脊髄路線維の面積の割合と、上述したＢＭＳスコアの関連を示す代表的なグラフである（ｎ＝１４）。
その結果、脊髄損傷部位と脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置において、両者の有意な相関が観察された。脊髄損傷部位から尾側に３ｍｍ離れた位置において、最も高い相関係数が得られ、Ｒ２＝０．８５５であった。
［実験例８］
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの解析２）
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアにおけるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を検討した。
（γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアの解析２）
γセクレターゼ阻害剤で処理したヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアにおけるｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を検討した。
具体的には、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを、終濃度１０μＭのセクレターゼ阻害剤の存在下で１日間培養した。続いて、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。続いて、分化誘導開始後１４日目に、細胞を０．１Ｍ ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し観察した。γセクレターゼ阻害剤としてはＤＡＰＴを使用した。リン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫ及びβＩＩＩ−チュブリンの免疫染色を行った。また、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（ＣＡＳ番号：２３４９１−５２−３）を用いて細胞核を染色した。
図２６は免疫染色の結果を示す代表的な顕微鏡写真である。図２６中、「Ｐｐ３８」はリン酸化ｐ３８ ＭＡＰＫを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は顕微鏡写真を重ね合わせた結果であることを示す。スケールバーは２０μｍである。
その結果、γセクレターゼ阻害剤で処理したニューロスフィアから分化誘導した神経細胞では、ｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強していることが明らかとなった。
本発明によれば、脊髄損傷を治療する技術を提供することができる。
Claims (6)
- γセクレターゼ阻害剤を有効成分とする、脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤。
- 対照と比較してｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が増強している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
- γセクレターゼ阻害剤の存在下で培養することにより製造された、請求項２に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
- 多能性幹細胞由来ニューロスフェアをγセクレターゼ阻害剤の存在下で培養する工程を含む、請求項２に記載の脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
- ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程であって、当該工程の少なくとも一部を被験物質の存在下で行う工程と、
誘導された神経細胞のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、
測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、
脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。 - ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、
培養後の前記ニューロスフィア中のｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化を測定する工程と、
測定されたｐ３８ ＭＡＰＫのリン酸化が対照と比較して増強していた場合に、前記被験物質を脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤として選択する工程と、を含む、
脊髄損傷治療用ニューロスフェア誘導剤のスクリーニング方法。
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