KR20190061966A - 비타민 c가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제 - Google Patents

비타민 c가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제 Download PDF

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이상훈
노비아나 우란사리
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한양대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 신경계 질환을 예방 또는 치료하기 위한 세포 증식 중에 비타민 C를 처리하여 얻은 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다. 신경줄기세포 증식 배양 시 비타민 c 처리가 중뇌 특이 인자 발현 등 치료기능 관련 신경줄기세포 성상이 세포 증식 배양 중에 손실되는 것을 막아, 치료 기능이 우수된 세포치료제를 대량 생산할 수 있는 안전하고, 간단하고 효율적인 방법을 제시한다.

Description

비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제{Cell Therapy using Midbrain-type Neural Stem Cells Treated with Vitamin C}
본 발명은 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포(ventral midbrain-type NSC; VM-NSC)를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
파킨슨병(PD)은 중뇌 흑질의 도파민 신경세포(mDA 뉴런)의 진행성 퇴행을 특징으로 하는 통상적인 신경-퇴행성 장애이다. 잘 정의된 뇌 영역 및 신경 세포 유형이 영향을 받는다는 것을 감안할 때, PD는 세포-기반 치료법에 대한 주요 대상 질환들 중 하나이다. 태아의 중뇌 이식은 PD 환자들에서 임상적으로 수행되었고, 치료적 효과를 가져왔다. 그러나, 제한된 기증자 조직, 일치하지 않는 치료 결과 및 운동장애 부작용으로 인해 이 접근법은 일반화된 치료 도구가 되지 못하였다. 이런 문제점들은 이식된 DA 뉴런의 품질 및 양을 체계적으로 조작할 수 있는 표준화된 공여 세포 시스템을 개발함으로써 해결할 수 있다. 이와 관련하여, 도파민성 복측 중뇌(ventral midbrain, VM) 조직으로부터 유래된 신경 줄기/전구 세포(NSC)를 배양하는 것이 PD 치료법에 대한 주요 후보 세포 공급원들 중 하나이다.
발달하는 뇌에서, Foxa2, Lmx1a/b 및 Nurr1과 같은 중뇌 특이 인자들을 발현하는 중뇌형(Midbrain-type) DA(mDA) 뉴런은 초기 배아 복측 중뇌(VM) 발달 중에 발생한다. 이것과 일관되게, mDA 뉴런은 in vitro 에서 초기 배아 일, 예컨대 랫트 배아 11 내지 12일(E11-12) 중에 VM으로부터 배양된 NSC에서 효과적으로 생성된다. 그러나, DA 신경성 포텐셜은 in vitro NSC 증식 중에 심각하게 감소한다. 또한, 중뇌 특이 인자 발현은 배양 중에 VM-NSC로부터 분화된 DA 뉴런에서 손실된다. 참고로, 중뇌 특이 인자의 발현은 mDA 뉴런 기능, 생존 및 표현형 유지에 중요하다. 또한, in vitro 에서 장기간 증식된 NSC는 분화 도중/후에 세포 사멸이 증가되며, 따라서 장기간 증식된 NSC를 이식하였을 때는 이식 후 세포사멸에 의해 불량한 이식 형성을 초래한다. 그러므로 PD 치료를 위한 NSC 세포이식 치료법 개발을 위해서는 이들 배양 의존성 변화를 중지시키는 방법을 개발할 필요가 있다.
비타민 C(L-아스코르브산, VC)는 대부분의 조직에서 중요한 미세 구성 성분이다[비특허문헌 1]. VC 농도는 뇌에서 가장 높으며, VC는 항산화제 보호, 신경전달물질 조절, 신경수초(myelin) 형성 및 시냅스 강화와 같은 여러 가지 다중 기능을 지원한다[비특허문헌 2]. 뇌의 VC 수준은 심지어 배아 발달 단계에서 더 높은데, 이는 뇌 발달 중의 특이적인 VC 역할을 시사하나, 아직까지 세포이식치료법 개발에서 VC를 사용하는 것의 실제적인 활용에 대한 체계적인 분석은 아직 알려진 바 없다.
NSC를 세포치료제로 제조하기 위해서 NSC를 배양하여 증식시키는 것이 필요한 실정이다.
Monfort, A., and Wutz, A. (2013). Breathing-in epigenetic change with vitamin C. EMBO reports 14, 337-346. Harrison, F.E., and May, J.M. (2009). Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free radical biology & medicine 46, 719-730.
이에, 본 발명자들은 VM-NSC 증식 중(세포치료제 제조 과정 중)에 VC 처리로 신경계 질환 세포 치료 강화 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 중뇌형 신경줄기세포 증식 시 비타민 C를 처리하는 단계;를 포함하는 중뇌 특이 인자를 발현하는 신경줄기세포의 제조방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.
또한, 본 발명은 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 사용된 용어 "신경줄기세포"는 중뇌특이인자를 발현하거나 발현하지 않는 신경줄기세포를 모두 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, "중뇌형 신경줄기세포는" 중뇌 특이 인자를 발현하는 신경줄기세포일 수 있으며, 상기 중뇌 특이 인자는 Foxa2, Lmx1a 및 Nurr1으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 비타민 C가 처리된 신경줄기세포는 신경줄기세포 증식 시 비타민 C가 처리된 것이다.
본 발명에서 “치료”란 질환과 관련된 임상적 상황을 억제하거나 완화하거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 또한 치료는 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존율과 비교하여 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 수단 이외에 예방적 수단을 동시에 포함한다.
본 발명에서 용어 "비타민 C 처리"는 중뇌형 NSC를 이식하기 전, NSC를 증식 배양할 때 처리하는 것을 의미하며, 즉 이식 후에는 또는 in vitro 분화과정 중에는 처리하지 않았음을 의미한다.
본 발명에서 용어, "세포 치료제"는 질병 치료 등을 목적으로 유전물질 또는 유전물질을 이입한 세포를 인체에 투여하는 의약품을 의미한다.
본 발명의 세포치료제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 세포 치료제에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다.
용어 치료학적으로 유효한 양(therapeutically effective amount)은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 조성물에는 1×104 cell/kg 내지 1×108 cell/kg의 세포치료제가 포함될 수 있다.
본 발명은 또한 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약의 제조를 위한 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 신경계 질환의 예방 또는 치료용 의약품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함한다.
상기 신경계 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증 및 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 신경계 질환의 치료 방법을 제공한다.
본 명세서에 있어서, "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 예를 들어, 개, 고양이, 생쥐, 인간 등일 수 있다.
본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 세포치료제 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여 시, 조성물에 포함되는 세포치료제는 1×104 cell/kg 내지 1×108 cell/kg의 양을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내, 동맥내, 복강 내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 따른 상기 조성물은, 유효성분으로서 상기 줄기세포 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 신경계 질환 치료를 위한 세포 치료제 조성물은 신경계 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은
중뇌형 신경줄기세포 증식 시 비타민 C를 처리하는 단계;
를 포함하는 중뇌특이 인자를 발현하는 신경줄기세포의 제조방법을 포함한다.
상기 비타민 C는 50 μM 내지 300 μM으로 처리되는 것이 바람직하다. 이때, 비타민 c를 50 μM 미만으로 처리되면 비타민 C 처리 효과가 저조한 문제가 있으며, 300 μM 을 초과하면 세포 독성을 유발하는 문제가 있다.
상기 신경줄기세포의 제조방법에 있어서, 신경줄기세포는 위에서 기술한 모든 내용을 그대로 적용 또는 준용할 수 있다.
본 발명은 VM-NSC 증식 중 (공여 세포 제조 배양 중) VC 처리가 신경계 질환 세포 치료에 매우 효과적임을 확인하였다. VC의 효과는 일련의 mDA 뉴런 발달 및 표현형 관련 유전자 발현을 후생유전학적 조절 기전으로 장기 지속적으로 유도함으로써 이루어졌다. 따라서, 공여 세포 준비 중의 일시적인 VC 처리는 신경계 질환 모델 랫트에 이식 후 신경계 질환 관련 행동의 개선을 초래하였다. 이는 중뇌 특이 인자들을 충실하게 발현하는 DA 뉴런의 풍부한 이식을 동반하였다. 이러한 발견으로, 공여 NSC에 대한 VC 처리는 신경계 질환 세포 치료에 매우 유용하리라 기대된다.
도 1 내지 도 4는 VM-NSC 증식 배양 중 비타민 C 처리가 도파민 신경세포(DA 뉴런) 분화능 손실을 방지함을 확인한 것이다.
도 1은 실험 디자인의 개략도이다[표시된 항산화제의 존재 또는 부재(대조군) 하에 E12에서의 랫트 배아 VM 조직 유래 NSC를 NSC 증식 유도 사이토카인 bFGF로 in vitro 증식시켰다. 세포를 표시된 바와 같이, 4일마다 계대 배양하였다. 각 세포 계대 배양에서 증식된 VM-NSC는 bFGF를 제거하여 분화를 유도하며 분화 시에는 VC 및 항산화제를 제거함으로써 세포 분화를 유도하였다].
도 2는 VM-NSC 대조군 배양(항산화제 무처리)에서 일련의 계대 배양으로 in vitro 세포 증식 동안 DA 뉴런 분화 포텐셜의 감소를 나타낸 것이다[계대되지 않은 배양(P0, A), 1회 계대 배양(P1, B) 및 2회 계대 배양(P2, C)에서 분화 6일(D6)째 TH+ DA 뉴런에 대한 대표적인 이미지들을 도시하였다. DA 뉴런 수율의 정량 데이터 (총 DAPI+ 세포 중 %TH+ 세포 수)를 그래프(D)에서 파란색 막대로 나타내었다. P0 내지 P2 동안 VC (200 μM)로 증식된 배양물 중의 TH+ 세포의 백분율을 또한 그래프(D)에서 적색 막대로 나타내었다. 수치: 평균±SEM; p<0.05* 또는 p<0.01**, n=3의 독립 배양물, Student's t-검정 (D), 스케일 바, 50 μm].
도 3은 VC를 비롯한 여러 항산화제 처리 또는 미처리 하에 VM-NSC를 8일 동안 (P1까지) 증식 배양 후 분화 유도한 실험으로서 오직 VC를 처리한 군에서만 세포증식 시 DA 뉴런으로의 분화 수율 손실을 감소하는 효과가 있음을 보여주며, VC 이외의 다른 항산화제 처리는 이와 같은 효과가 전혀 없음을 보여준다 [TH+ DA 뉴런의 대표적인 이미지(A 내지 E)와 정량 그래프(F)가 도시되었다. 수치: 평균±SEM; p<0.05* 또는 p<0.01**, n=3의 독립 배양물, 터키스 사후 비교 분석을 포함하는 1-원 ANOVA(F). 스케일 바, 50 μm].
도 4는 VC 처리로 증식된 VM-NSC는 다른 DA 뉴런 표현형 마커로 장착된 TH+ DA 뉴런을 생산함을 나타낸 것이다[VC로 증식된 P1 배양물을 12일 동안 VC 없이 분화시켰고 TH/DAT(A), TH/AADC(B) 및 TH/VMAT2(C)로 공동-면역염색을 수행하였다. TH mRNA 발현의 증가와 함께, D12에서 다른 DA 표현형 마커의 발현은 증식 기간 중에 VC 처리 시에 증가하였다(D). *P<0.01, n=3 독립 배양물, Student's t-검정. 스케일 바, 50 μm].
도 5a는 도 3과 관련하여, 테스트한 항산화 물질이 NSC 증식 동안 처리 시 항산화제 효과가 있는지 DCF 염색으로 확인한 것으로서, VC 이외의 다른 항산화제에서는 NSC 증식 배양기간 처리로 DA 뉴런 분화 증진 효과가 관찰되지 않았으므로, VC 처리에 의한 NSC DA 뉴런 분화 효과는 VC의 항산화 작용과 무관함을 보여준다. .
도 5b는 VM-NSC 계대 (P0-P2) 중에 세포 증식을 평가하기 위한 세포 성장 곡선을 나타낸 것이다[수치: 평균±SEM; n=3 독립 배양물; 터키스 사후 비교 분석을 포함하는 1-원 ANOVA].
도 5c는 VM-NSC 계대 (P0-P2) 중에 세포 증식을 평가하기 위한 집단배가수(population doubling level, PDL)을 나타낸 것이다[수치: 평균±SEM; n=3 독립 배양물; 터키스 사후 비교 분석을 포함하는 1-원 ANOVA].
도 6은 VM-NSC 증식 배양기간 중에 VC를 처리하고 분화 시 도 3과 도 4에서 보여준 바와 같이 DA 뉴런의 분화 수율 증가 뿐만 아니라 분화된 DA 뉴런에서 DA 뉴런 생존, 기능, 성상 유지에 결정적으로 중요한 인자로 알려져 있는 중뇌 특이 인자인 Nurr1 (도 6a), Foxa2 (도 6b), 및 Lmx1a (도 6c)의 발현이 증가하며 DA 뉴런의 형태학적인 성숙 (도 6d), 시냅스 형성(도 6e), 및 도파민을 분비하는 기능적인 측면에서의 성숙도(도 6f) 가 증가함을, 또한 세포생존 (도 6g와 h)와 여러 독소에 대한 저항력이 증가 (도6 i와 j)됨을 보여준다. VM-NSC는 VC가 처리되거나 미처리되어(대조군) P1까지 in vitro 증식되었고, VC 미처리 시 6 내지 15일 동안 분화되었다[P<0.05 또는 **P<0.01, n=3 독립 배양물, Student's t-검정. 스케일 바, 50 μm].
도 6a 내지 도 6c는 분화된 DA 뉴런에서 중뇌 특이 인자의 공동-발현을 나타낸 것으로, 우측의 그래프는 D6에 TH+ 세포의 총 수 중에서 중뇌 특이 인자 Nurr1(도 6a), Foxa2 (도 6b) 및 Lmx1a (도 6c)를 공동-발현하는 TH+ 세포의 백분율을 나타낸다. *P<0.001, n=30 현미경 시야, Student's t-검정. 이미지에서 화살표는 중뇌 특이 인자들을 공동-발현하는 TH+ DA 뉴런들을 가리킨다.
도 6d는 D15에서 DA 뉴런당 TH+ 섬유 길이에 의해 추정된 DA 뉴런의 형태학적 성숙도를 나타낸 것이다[n=60 세포].
도 6e는 TH+ 신경돌기 (100 μm)를 따르는 시냅신+ 반점의 수를 나타낸 것으로서 시냅스 형성 측면에서의 성숙도를 나타낸 것이다[n=20 신경돌기, n=3 독립 배양물].
도 6f는 배지(48시간), 48시간 동안 분화된 배양물에서 조건화된 배지 중의 DA 수준 (D13 내지 15); 유발된 KCl (30분), 30분 동안 KCl-매개된 탈분극에 의해 유발된 DA 수준을 나타낸 것으로서 분화된 DA 뉴런의 기능적 성숙도를 측정한 것이다 [n=3 독립 배양물 *P<0.001, Student's t-검정].
도 6g 내지 도 6j는 분화된 세포 생존/사멸 및 독소에 대한 내성에 미치는 VM-NSC 증식 중의 VC 처리의 효과를 나타낸 것으로, VC 처리 또는 VC 미처리 증식된 VM-NSC는 8일 동안 VC 없이 분화되었다. 일반적인 세포 사멸(도 6g) 및 DNA 손상(도 6h)을 각각 D8에서 EthD1+에 대해 양성인 세포의 백분율 및 3 보다 큰 γH2AX 병소를 가진 % 세포의 백분율에 의해 추정되었다. D8에서의 분화된 배양물을 H2O2 또는 6-OHDA (500?M 및 1000?M)에 8시간 동안 노출시키고 생존하는 TH+ DA 뉴런을 다음날 계수하였다(도 6i 및 도 6j).
도 7은 일반적인 NSC(Nestin, Sox2) 및 rostral 부위 특이적 NSC (Otx2) 마커의 발현에 VC 처리가 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 7a 및 도 7b는 마커 발현을 면역세포화학법으로 확인한 것이며, 도 7c는 정량적 실시간 PCR　에 의해 측정된 것이다[수치: 평균 ± SEM　n = 3 독립 배양물, t- 검정].
도 8은 VC 처리가 전반적인 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3 수준의 TET1 및 Jmjd-중재된 변화와 함께 VM-NSC의 Foxa2 및 Lmx1a의 발현을 촉진함을 확인한 것이다.
도 8a는 D0 및 D6에서 총 DAPI+ 세포 중에서 면역반응성 세포의 백분율에 의해 추정된 미분화된 및 분화된 VM-NSC 배양물에서의 Foxa2 및 Lmx1a 발현을 나타낸 것이며, 도 8b는 D0에서 실시간 PCR에 의해 추정된 미분화된 및 분화된 VM-NSC 배양물에서의 Foxa2 및 Lmx1a 발현을 나타낸 것이다[*P<0.05, **P<0.01, n=3 독립 배양물, Student's t-검정].
도 8c는 D0에서 핵 부분의 Tet 효소 활성을 나타낸 것이다[* P<0.05, n= 3 독립 배양물 (각 배양물에서 3개 한 벌), t-검정].
도 8d는 D0에서 DNA 돗트 블롯 분석에 의해 추정된 전반적인 5hmC 수준을 나타낸 것이다.
도 8e는 D0에서 면역세포화학 분석에 의해 추정된 전반적인 5hmC 수준을 나타낸 것이다
도 8f는 D0에서 DNA 돗트 블롯 분석에 의해 추정된 전반적인 5mC 수준을 나타낸 것이다.
도 8e는 D0에서 면역세포화학 분석에 의해 추정된 전반적인 5mC 수준을 나타낸 것이다
도 8h는 Jmjd3 효소 활성을 나타낸 것이다[n=독립 배양물, **P<0.01, t-검정].
도 8i는 D0에서 웨스턴-블롯 분석에 의해 추정된 전반적인 H3K27m3 및 H3K9m3 수준에 미치는 VC 효과를 나타낸 것이다[밴드의 세기를 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량하였고, 히스톤 3(H3)으로 표준화된 값을 그래프 우측에 나타낸다. n=3 독립 실험, *P<0.05, t-검정].
도 8j는 D0에서 면역세포화학 분석에 의해 추정된 전반적인 H3K27m3 수준에 미치는 VC 효과를 나타낸 것이다[스케일 바, 50 μm].
도 8k는 D0에서 면역세포화학 분석에 의해 추정된 전반적인 H3K9m3 수준에 미치는 VC 효과를 나타낸 것이다[스케일 바, 50 μm].
도 9는 Foxa2 및 Lmx1a 프로모터 상의 VC-유도된 후생유전학적 변화를 나타낸 것이다.
도 9a는 DIP-PCR 및 ChIP-PCR 분석에 대해 표적화된 CpG 풍부화된 영역(박스 표시)을 가진 랫트 Foxa2 프로모터를 도식화한 것이다.
도 9b는 미분화된(D0) 및 분화된(D6) VM-NSC 배양물에서 Foxa2 (A 및 B)의 프로모터 영역의 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3의 수준을 나타낸 것이다[데이터는 배수 변화의 Log2 값으로서 제공된다(VC+/VC-). N/A, 증폭되지 않음. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001에서 유의미성, n=3 독립 실험, t-검정].
도 9c는 DIP-PCR 및 ChIP-PCR 분석에 대해 표적화된 CpG 풍부화된 영역(박스 표시)을 가진 랫트 Lmx1a 프로모터를 도식화한 것이다[Lmx1a 프로모터에서, 공통 Foxa2 결합 (FB) 부위일 것으로 예상된 CpG 영역이 분석되었다].
도 9d는 미분화된 (D0) 및 분화된 (D6) VM-NSC 배양물에서 Lmx1a (E 및 F)의 프로모터 영역의 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3의 수준을 나타낸 것이다[데이터는 배수 변화의 Log2 값으로서 제공된다 (VC+/VC-). N/A, 증폭되지 않음. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001에서 유의미성, n=3 독립 실험, t-검정].
도 9e는 D0에서 Foxa2 에 대한 TET1, Jmjd3 및 Jmjd2 단백질 보충을 나타낸 것이다.
도 9f는 D0에서 Lmx1a 프로모터에 대한 TET1, Jmjd3 및 Jmjd2 단백질 보충을 나타낸 것이다.
도 9g 및 도 9h는 Foxa2(도 9g) 및 Lmx1a(도 9h) 프로모터 상의 VC-유도된 후생유전학적 변화를 나타낸 것이다[후생유전학적 변화는 pH를 낮춤으로써(pH 5) 및 SVCT2 억제제인 케르세틴(10 μM)에 의한 처리에 의해 SVCT 활성을 차단함으로써 없어졌다. 억제제 및 비히클 (-)은 VC 처리 전에 3시간 동안 처리되었다. 후생유전학적 단백질 및 코드의 수준은 영역에서 측정되었다. *P<0.05; **P<0.01에서 유의미성; n=3 독립 실험, t-검정].
도 10은 후기 발달 및 분화된 mDA 뉴런성 유전자의 VC-처리된 후생유전학적 변화를 나타낸 것이다[미분화된 VM-NSC는 VC의 처리(VC+) 또는 미처리(VC-) 하에 증식되었고, 다음에 6일 동안 VC 없이 분화되었다].
도 10a는 면역세포화학 분석에 의해 평가된 후기 mDA 발달 유전자 Nurr1의 발현을 나타낸 것이다[스케일 바: 50 μm].
도 10b는 실시간 qPCR (B) 분석에 의해 평가된 후기 mDA 발달 유전자 Nurr1의 발현을 나타낸 것이다[*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, n=3 독립 배양물, Student's t-검정].
도 10c~도 10f는 Nurr1 프로모터 상의 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3 수준에 미치는 VC 처리 효과를 나타낸 것이다.
도 10c는 DIP- 및 ChIP-PCR 분석에 대해 표적화된 공통 Foxa2 결합 부위들 (FB)을 가지는 랫트 Nurr1 프로모터를 도식화한 것이며,
도 10d는 5hmC/5mC에 대한 hMeDIP/MeDIP-qPCR(A) 및 H3K27m3/H3K9m3에 대한 ChIP-qPCR(B) 분석을 나타낸 것이다[분화 기간 (D0 내지 D6)에 걸쳐 수행됨].
도 10e는 D2에서 Nurr1 프로모터에 대한 Foxa2 단백질 보충의 증가를 나타낸 것이다[n=3 독립 실험]
도 10f는 총 Nurr1+ 세포 중에서 Foxa2+, Nurr1+ 세포의 비율은 VC가 처리된 NSC로부터 분화된 배양물에서 더 컸음을 확인한 것이다[n=3 독립 배양물, *P<0.001, Student's t-검정].
도 10g 및 도 10h는 Th 유전자 프로모터 영역에서 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3의 수준에 미치는 VC 처리 효과를 나타낸 것이다.
도 10g은 후생유전학적 코드 변화를 평가하기 위한 DIP- 및 ChIP-PCR 분석에 대해 표적화된 공통 Nurr1 결합 부위(NB) 및 10 CpG 부위들을 가지는 랫트 TH 프로모터를 도식화한 것이며,
도 10h는 5hmC/5mC에 대한 DIP-qPCR(A) 및 H3K27m3/H3K9m3에 대한 ChIP-qPCR(B) 분석을 나타낸 것이다[분화 기간 (D0 내지 D6)에 걸쳐 수행됨].
도 10i는 D6에서 TH 프로모터 영역에 대한 Nurr1 단백질 보충 증가를 나타낸 것이다[n=3 독립 실험].
도 10j는 D6에서 총 Nurr1+ 세포 중에서 Nurr1+, TH+ 세포의 비율에 의해 추정된 TH 발현을 유도하는데 있어서 Nurr1 효율을 나타낸 것이다[*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, n= 3 독립 배양물, Student's t-검정].
도 11은 도 10과 관련하여, SVCT 차단제가 Nurr1 및 Th 프로모터에서 VC가 처리된 후생유전학적 변화를 없앴음을 보여준 것이다[Nurr1 프로모터 (A) 및 Th 프로모터 (B)에서의 VC가 처리된 후생유전학적 변화를 pH를 낮춤으로써 및 SVCT2 억제제인 퀘르세틴(10μM)의 처리에 의해 SVCT 활성을 차단함으로써 없어짐, 억제제 및 비히클(DMSO)을 VC 처리 전에 3시간 동안 처리. * P <0.05에서 유의성; ** P <0.01; n = 3 독립 실험, t-검정].
도 12은 도 10과 관련하여, 다른 신경 아형 및 성상세포 유전자에 특이 프로모터에서 VC-처리된 후생유전학적 변화를 나타낸 것이다[VM-NSCs는 VC 처리(VC+) 또는 VC 미처리(VC-)에서 증식하고 VC 없이 분화됨].
도 12a는 GAD67(GABAergic neuron)의 프로모터 영역(프로모터에 대한 개략도에 표시)에서 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3의 수준을 확인한 것이다.
도 12b는 TPH2(serotonergic neuron)의 프로모터 영역(프로모터에 대한 개략도에 표시)에서 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3의 수준을 확인한 것이다.
도 12c는 GFAP(성상 세포)의 프로모터 영역(프로모터에 대한 개략도에 표시)에서 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3의 수준을 확인한 것이다.
도 12d는 GAD67, Tph2 및 GFAP mRNA 발현에 대한 qPCR 분석 결과이다.
도 12e는 성상세포 분화에 대한 VC 효과를 나타낸 것이다[VC 효과는 GFAP + 성상세포 수율에 의해 추가로 확인됨. VM-NSC의 증식은 VC의 처리 또는 미처리에서 계대 배양되었다. 각 세포 구획에서 세포가 분화된 지 6일 후, GFAP+ 세포를 계수하였다. 스케일 바, 100 μm. 데이터는 평균±SEM으로 나타냄. * P <0.05에서 유의성; ** P <0.01; *** P <0.001, n = 3 독립 실험, t- 검정].
도 13는 파킨슨병 랫트 모델로의 VC-처리된 NSC 이식을 나타낸 것이다[E12에서 랫트 배아 VM으로부터 유래된 NSC를 VC 처리(VC+) 또는 VC 미처리(VC-)에서 in vitro에서 8일 동안 증식시킴. 공여 세포는 수득되었고 (P2 배양물과 동등함), 6-OHDA-병변의 PD 모델 랫트에 선조체 내로 이식되었다].
도 13a는, 행동(A 내지 D) 및 조직학적(E 내지 G) 분석이 이식 후 8주 동안 또는 8주째에 수행되었다. A 내지 C, 암페타민-유도된 회전 값. 대조군-NSC(A) 및 VC-NSC(B)로 이식된 개별적인 동물들의 동측 순(net) 회전 값 및 그것들의 평균±SEM (C)이 표시된다. n=8 랫트 (VC-NSC), 7 랫트 (대조군-NSC). 각 이식-후 시점에서의 대조군과 유의한 차이 *P<0.05; **P<0.01, 2-원변량 ANOVA, 이어서 Tukey 사후 분석. 이식-후 8주째의 조직학적 분석. 이식편 부피(E), 동물당 이식편의 TH+ 세포의 총 수(F), 및 이식편의 TH+ 세포 밀도(G). *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t-검정].
도 13b에서, (A, B)는 TH+ 세포 이식의 개요를 보여준다[삽화, 고배율로 도시된 이식편의 TH+ DA 뉴런 형태, 스케일 바, 500 μm].
도 13b에서, (C 내지 K)는 이식 후 8주째에 TH+ DA 세포에서 성숙한 뉴런 (HuC/D 및 NeuN), 중뇌 특이 인자(Foxa2 및 Nurr1) 및 A9 흑질 mDA 뉴런(Girk2) 마커의 공동-발현을 나타내며, (L)은 VC-NSC 이식편의 TH+ 세포에 인접한 DARPP-32+ 선조체 뉴런을 나타낸다[스케일 바, 30 μm].
도 14는 도 13과 관련하여, 이식 후 2개월 째 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 14a는 이식 후 절단된(활성화된) caspase-3+ 세포의 대표 이미지이다[오른쪽: 이식 후 절단된 caspase-3+ 세포/mm3 그래프, 수치는 평균 ± SEM으로 나타냄. n = 3 동물; * P <0.05, t-검정. 스케일 바, 30 μm].
도 14b는 이식 후 증식 세포 특이적 핵 항원(PCNA)+ 세포의 대표 이미지이고, 도 15c는 이식 후 포스포히스톤 H3(pHH3, 유사 분열 표지자)+ 세포의 대표 이미지이다[대조군 VC- 및 VC+ 접힘 모두에서 증식하는 세포 특이적 마커에 양성인 것은 없음을 주목함, 수치는 평균 ± SEM으로 나타냄. n = 3 동물; * P <0.05, t-검정. 스케일 바, 30 μm].
도 14d는 이식 후 HuC/D+ 세포의 이미지이다[오른쪽: 이식 후 HuC/D+ 세포/mm3의 그래프, 수치는 평균 ± SEM으로 나타냄. n = 5 동물; * P <0.05, t-검정. 스케일 바, 30 μm].
도 14e는 이식 후 5-HT+ 세포의 이미지이다[오른쪽: 이식 후 5-HT+ 세포/mm3의 그래프, 수치는 평균 ± SEM으로 나타냄. n = 3 동물; * P <0.05, t-검정. 스케일 바, 30 μm].
도 14f는 이식 후 TH+, GFAP+ 세포의 이미지이다[오른쪽: 이식 후 GFAP+ 세포/mm3의 그래프, 수치는 평균 ± SEM으로 나타냄, n = 5 동물; * P <0.05, t-검정. 스케일 바, 30 μm].
도 15는 도 6 및 도 10과 관련하여, hESC에서 유래된 인간 NSC 배양에서 VC 처리의 효과를 나타낸 것이다[hESCs(H9)에서 유래된 인간 NSC는 VC의 존재(VC +) 또는 VC의 부재(VC-)에서 증식하였고, VC없이 6일 동안 분화가 유도되었다].
도 15a는 VC 처리가 분화된 세포 생존/사명에 미치는 영향을 나타낸 것이다[일반적인 세포 사멸은 분화 6일째 (D6), n = 3 독립 배양에서 EthD1에 양성인 세포의 비율에 의해 평가되었다. 스케일 바, 50 μm].
도 15b는 D6에서 % TH + DA 뉴런을 나타낸 것이다[스케일 바, 50 μm. n = 3 독립 배양].
도 15c는 D15, n = 50 세포에서 DA 뉴런당 TH + 섬유 길이에 의해 추정된 분화된 DA 뉴런의 형태학적 성숙을 나타낸 것이다.
도 15d는 인간 Th 유전자 발현에 VC 효과를 나타내는 qRT-PCR 분석 결과이다[n=3 독립 배양].
도 15e는 인간 Th 프로모터(Consensus NBRE regions)에서 5hmC 수준을 나타낸 것이다[DIP-qPCR은 D6에서 수행되었다. n = 3 개의 독립적인 실험. 수치는 평균 ± SEM을 나타냄. * P <0.05에서 미처리된 대조군(VC-)과 유의한 차이가 있음; ** P <0.01; t-검정].
이하, 본 발명의 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식이 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
[ 실시예 ]
1. 실험 과정
세포 배양 및 화학물질
NSC를 랫트 배아 VM(Sprague Dawley)으로부터 배아일 12일(E12)에 혈청 유리 N2 배지 중의 15 μg/ml 폴리-L-오르니틴(PLO; Sigma)/1 μg/ml 피브로넥틴(FN; Sigma, St. Louis, MO)으로 미리 코팅된 6 cm 접시 또는 24-웰 플레이트에서 배양하였다. NSC를 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 20 ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN)의 유사분열 촉진 작용에 의해 증식하도록 유도하였다. 6 cm 접시에서 배양된 증식하는 VM-NSC를 매 4일마다 비타민 C(VC; Sigma; 200 μM), 글루타티온 환원 형태 (GSH; Sigma; 200 μM), 비타민 E(알파-토코페롤; Sigma; 200 μM) 또는 N-아세틸시스테인(NAc; Sigma; 100 μM)이 있거나 없는 유사분열 촉진물질 보충 배지에서 계대 배양하였다. 각 계대의 마지막 날에 증식된 NSC는 상기 배지로부터 유사분열 촉진물질 및 항산화제들을 제거함으로써 분화하도록 유도되었다(2 내지 16일 동안). 인간 NSC 배양물을 hESC(H9)의 체외 분화에 의해 유도하였고 다음 논문에 기술한 것과 같이 배양하였다[Rhee, Y.H., Ko, J.Y., Chang, M.Y., Yi, S.H., Kim, D., Kim, C.H., Shim, J.W., Jo, A.Y., Kim, B.W., Lee, H., et al. (2011). Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. The Journal of clinical investigation 121, 2326-2335]. 인간 NSC는 bFGF(20 ng/ml)가 보충된 ITS 배지에서 VC의 존재 또는 부재 하에 2회의 NSC 계대를 위해 증식시켰다. 계대 배양된 인간 NSC의 분화를 뇌-유도 신경영양 인자 (20　ng/ml; R&D Systems), 신경 교세포(glial cell) 유도 신경영양 인자(20　ng/ml; R&D Systems) 및 디부티릴 cAMP(0.5　mmol/l; Sigma)가 보충된 ITS에서 bFGF 및 VC의 회수에 의해 유도하였다. 배양물은 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37℃로 유지되었다.
면역형광 염색
배양된 세포 및 동결절편화된 뇌 슬라이스를 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 차단 용액(Blocking solution: 1% BSA+0.3% Triton X-100)에서 40분 동안 차단시켰다. 5hmC 및 5mC 염색을 위해, 고정된 세포를 차단 반응 전에 2N HCl과 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 표 1에 열거된 일차 항체를 포함하는 차단 용액 중에서 밤새 4 ℃로 인큐베이션하였다. Alexa 488 (1:200, Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 Cy3 (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA)으로 표지된 이차 항체들을 적용하였다. 염색된 샘플을 40,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI; Vector Laboratories, West Grove, PA)을 함유한 Vectashield 배지에 넣고 에피형광(Leica, Wetzlar, Germany) 또는 공초점 현미경(Leica TSP SP5) 하에 분석하였다.
항체 정보
Name Company (Cat. No) Dilution
Antibodies used in Immunocytochemistry and Immunohistochemistry
TH (Rabbit) Pel-Freez (P40101-150) 1:1000
TH (Mouse) Sigma (T1299-2ML) 1:1000
TH (Mouse) Immunostar (22941) 1:200
Nurr1 (Mouse) Perseus Proteomics (PP-N1404-00) 1:500
Foxa2 (Goat) Santa Cruz (M-20) 1:500
Lmx1a (Rabbit) Millipore (AB10533) 1:500
DAT (Rat) Abcam (ab5990) 1:200
VMAT2 (Rabbit) Millipore (AB1598P) 1:200
AADC (Rabbit) Protos (CA-201) 1:200
H2AX (Mouse) Millipore (05-636) 1:500
5hmC (Rabbit) Activ Motif (39769) 1:1000
5mC (Mouse) Abcam (ab10805) 1:1000
H3K27m3 (Rabbit) Millipore (07-442) 1:1000
H3K9m3 (Rabbit) Millipore (07-449) 1:1000
HuCD (Mouse) Millipore (MABN153) 1:100
NeuN (Mouse) Millipore (MAB377) 1:200
GFAP (Mouse) MP Biomedicals (08691102) 1:200
GIRK2 (Rabbit) Alomone labs (APC-006) 1:80
DARPP32 (Rat) R&D System (MAB4230) 1:80
Nestin (Mouse) BD Pharmingen (556309) 1:500
OTX2 (Rabbit) Millipore (AB 9566-1) 1:400
SOX2 (Rabbit) Millipore (AB5603) 1:500
Synapsin I BD Biosciences (MAb) 1:200
PHH3 (Rabbit) Millipore (06-570) 1:500
PCNA (Mouse) Upstate (05-347) 1:40
5-HT (Rabbit) Sigma (S5545) 1:2000
Cleaved Caspase 3 (Rabbit) Cell Signalling (D175) 1:1000
Antibodies for ChIP and DIP Analysis
5hmC (Rabbit) Activ Motif (39769) 3 μg
5mC (Mouse) Abcam (ab10805) 3 μg
H3K27m3 (Rabbit) Millipore (07-442) 3 μg
H3K9m3 (Rabbit) Millipore (07-449) 3 μg
Nurr1 (Rabbit) Santa Cruz (N-20) 3 μg
Foxa2 (Rabbit) Abcam (ab83517) 3 μg
Jmjd3 (Rabbit) Abcam (ab85392) 3 μg
Jmjd2 (Mouse) Santa Cruz (D-4) 2.5 μg
TET1 (Rabbit) Millipore (09-872) 3 μg
세포 성장 및 생존율 분석
세포 계대 배양 시 생존 세포의 수를 측정함으로써 증식 중인 신경줄기세포 성장 프로파일을 만들었다. 성장 프로파일에는 PDL(Population Doubling Level; 세포의 수가 두 배 되는 수준) 값을 이용하였고, 이는
Figure pat00001
(N = 계대 배양 시 세포의 수, N0=초기에 배양된 세포의 수(1×10 5 개 세포/cm 2 ))으로 계산하였다. 신경줄기세포 배양 시 500-1000 μM의 H2O2 또는 6-OHDA 처리/비처리 군을 DA 뉴런으로 분화시켜 DA 뉴런의 마커인 TH+ 세포 수를 측정함으로써 신경줄기세포 생존율을 측정하였다. 일반적인 세포 사멸 및 DNA 손상은 각각 에티듐 호모다이머 1(Ethidium homodimer1, (EthD1)[Molecular Probes] 및 γH2AX 염색을 통해 측정하였다.
DA 뉴런의 형태 및 기능적 성숙
DA 뉴런의 형태학적인 성숙 정도를 측정하기 위해, TH+ DA 뉴런의 신경섬유 길이를 측정하였다. 도파민 신경세포의 시냅스 전 활성(pre-synaptic activity)을 측정하기 위해 복측 중뇌 신경줄기세포(VM-NSC) 분화 시작일로부터 13일 후 2일(분화 후 13일~15일) 동안 배양된 배지를 모아 ELISA kit(BA E-5300, LDN)를 이용해 배양 배지에 방출된 도파민 신경전달물질의 양을 측정하였다. 또한, 분화 15일에 56mM의 KCl을 넣어준 N2 배지와 일반 N2 배지를 각각 넣고 30분 동안 배양 후 KCl을 넣어준 배지로부터 측정된 도파민 신경전달물질의 값에서 일반 배지로부터 측정된 도파민 신경전달물질의 값을 빼 줌으로써 막 탈분극에 의해 유발된 도파민 신경전달물질의 방출량을 측정하였다.
효소 활성 분석
TET 및 JMJD3의 활성을 각각 측정하기 위해 두 개의 10cm 세포배양 디쉬에 VC 처리(200μM)/비처리 군을 나눠 배양하고 4일 동안 증식시킨 뒤 EpiQuik nuclear extraction kit(Epigentek)로 세포 핵 분획을 수행하여 핵을 얻었다. 얻은 핵을 Epigenase™　5mC-Hydroxylase TET Activity/Inhibition Assay Kit 와 Epigenase™ JMJD3/UTX Demethylase Activity/Inhibition Assay Kit (Epigentek, Farmingdale, NY)를 사용해 각 효소의 활성 분석을 수행했다.
후생유전학적 코드( Epigenetic code ) 측정
5hmC/5mC에 대한 DNA dot blot 분석을 다음 논문에 기술한 것과 같이 수행하였다[He, X.B., Kim, M., Kim, S.Y., Yi, S.H., Rhee, Y.H., Kim, T., Lee, E.H., Park, C.H., Dixit, S., Harrison, F.E., et al . (2015). Vitamin C facilitates dopamine neuron differentiation in fetal midbrain through TET1- and JMJD3-dependent epigenetic control manner. Stem Cells 33, 1320-1332]. Genomic DNA를 추출 및 정량하고 80ng을 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 spotting하여 건조시킨 후 20분 동안 UV를 방사하였다. Blocking solution(5% BSA/Tris-buffered saline-Tween20)으로 상온에서 2시간 동안 blocking 과정을 거치고 멤브레인을 항-5hmC(Active Motif, Carlsbad, CA)와 항-5mC(Abcam, Cambridge, UK) 항체 처리 후 4℃ overnight 하였다. 전반적인 histone modification의 변화를 측정하기 위해 western blot을 다음 논문에 기술한 것과 같이 수행하였다[Rumbaugh, G., and Miller, C.A. (2011). Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications. Methods Mol Biol 670, 263-274]. 히스톤을 세포 샘플부터 추출하고 추출한 histone 샘플(1 μg)을 15% SDS-Polyacrylamide gel에서 전기영동 하고 blotting된 멤브레인을 항-H3K4m3, H3K9m3 , H3K27m3 , H3K36m3 및 H3 항체(Millipore, Billerica, MA)와 함께 반응시켰다. ChemiDoc(Bio-Rad, Hercules, CA)를 이용하여 양성 밴드를 확인한 뒤 각 밴드의 세기를 ImageJ 소프트웨어(http://imageh.hih.gov/ij)를 사용하여 정량화하였다.
Chip - qPCR 및 DIP- qPCR
Foxa2와 Nurr1 결합 부위를 Jasper 데이터베이스(http://jaspar.genereg.net/)를 사용하여 80% 임계치를 적용해 확인하였다. 예측된 Foxa2 및 nurr1 결합 부위를 다음 논문에서와 같이 계통 발생적 족문과 결합시켜 명시된 PWM(position weight matrix) 설정으로 잘못된 예측을 제거하였다[Sandelin, A., and Wasserman, W.W. (2004). Constrained binding site diversity within families of transcription factors enhances pattern discovery bioinformatics. Journal of molecular biology 338, 207-215] (표 2). ChiP 및 DIP 분석을 다음 논문에 기술한 것과 같이 수행하였다[Prolonged membrane depolarization enhances midbrain dopamine neuron differentiation via epigenetic histone modifications. Stem Cells 29, 1861-1873]. Chromatin 또는 Genomic DNA를 Bioruptor(BMS, Seoul, Korea)를 사용해 초음파 처리하여 평균 200-500 bp 길이로 절단하고 상기 표 1에 열거된 항체들을 사용해 면역 침전시켰다. 면역 침전된 DNA 단편을 magnetic bead(Invitrogen)을 사용해 수집한 뒤 정제해 하기 표 3에 열거된 프라이머를 이용해 real-time PCR을 수행하였다. 비교 주기 임계치 방법을 사용해 결과를 정량화 하고 데이터를 입력 DNA로 표준화하였다.
유전자 프로모터에 대한 전사 인자 결합 부위의 예측
TF Gene Promoter Score Threshold Prediction Binding Sites
Predicted Sequence Strand
Foxa2 Lmx1a 80% GAAAGTTGATTT
(SEQ ID NO:1)		 +
Nurr1 80% CTCTATTGTTTT
(SEQ ID NO: 2)		 +
TATTATTTATAT
(SEQ ID NO: 3)		 -
TAATATTTCCTT
(SEQ ID NO:4)		 +
Nurr1 Th
80%		 AAGGTTAA
(SEQ ID NO:5)		 +
AAGGTCAC
(SEQ ID NO:6)		 +
CTGGCCTT
(SEQ ID NO:7)		 +
GAGGTCAG
(SEQ ID NO:8)		 +
STAT3 GFAP 85% TTCCGAGAAG
(SEQ ID NO:9)		 +
본 실험에서 사용된 PCR 프라이머
Gene Expression Analysis
Gene Forward Reverse
Gapdh CTCATGACCACAGTCCATGC
(SEQ ID NO:10)		 TTCAGCTCTGGGATGACCTT
(SEQ ID NO:11)
Th AAGGGCCTCTATGCTACCCAA
(SEQ ID NO:12)		 TGCATTGAAACACGCGGAAG
(SEQ ID NO:13)
Dat GGACCAATGTTCTTCAGTGGTGGC
(SEQ ID NO:14)		 GGGCCGGCGAGGGGCTTGAC
(SEQ ID NO:15)
Vmat2 GGCTTCCTTCTCAACTCCCC
(SEQ ID NO:16)		 GGCTCTGACGTCACGGATAG
(SEQ ID NO:17)
Aadc TGGCAATTTAAAGGCTCTGGAC
(SEQ ID NO:18)		 CAGAAAAAGGCTGTCCTGGGG
(SEQ ID NO:19)
Foxa2 TATGTGGGCGCTGGAATGAG
(SEQ ID NO:20)		 GGCACCTTGAGAAAGTCGTTG
(SEQ ID NO:21)
Lmx1a TATACAACGTTGCCCACCCC
(SEQ ID NO:22)		 GATGGGGTTTCCCACTCTGG
(SEQ ID NO:23)
Nurr1 CGGTTTCAGAAGTGCCTAGC
(SEQ ID NO:24)		 TTGCCTGGAACCTGGAATAG
(SEQ ID NO:25)
Human U6 snRNA TCGCTTCGGCAGCACATATAC
(SEQ ID NO:26)		 TGCGTGTCATCCTTGCGCAG
(SEQ ID NO:27)
Human Th GAGTACACCGCCGAGGAGATT
(SEQ ID NO:28)		 GCGGATATACTGGGTGCACTGG
(SEQ ID NO:29)
ChIP - qPCR and DIP- qPCR Analysis
Region Forward Reverse
Foxa2 Promoter I CCACCTACTGCCCTGTTTGT
(SEQ ID NO:30)		 CTCAGGCCTTTTTCTGGCTA
(SEQ ID NO:31)
II TCTCTGGGTTCCCTGTGTTC
(SEQ ID NO:32)		 CACTTGGGTCTGCATCCTTT
(SEQ ID NO:33)
III AGAGGGACGGGGGAATAGAC
(SEQ ID NO:34)		 GTACTGGACTCCCGAGATGC
(SEQ ID NO:35)
Lmx1a Promoter FB AGCTCGCCCATCAGGTAAG
(SEQ ID NO:36)		 GAACGTCTGCAGGCGCAAAG
(SEQ ID NO:37)
Nurr1 Promoter FB1 CCACCCTCGCACCCAAATTA
(SEQ ID NO:38)		 AAACACAGCATCAAAGCCGC
(SEQ ID NO:39)
FB2 AGCATTGTGGAGAAGGTGCTAA
(SEQ ID NO:40)		 GGGCAAGTGAATTGGTGTTC
(SEQ ID NO:41)
Th Promoter NB1 AGAGGATGCGCAGGAGGTAG
(SEQ ID NO:42)		 GTCCCGAGTTCTGTCTCCAC
(SEQ ID NO:43)
NB2 TCCTGGAGGGGACTTTATGA
(SEQ ID NO:44)		 CTGGATTTCCTAAGGGCTCA
(SEQ ID NO:45)
NB3 GGGTGTGGATGCTAACTGGA
(SEQ ID NO:46)		 AGTGGTAGCCCCATTCTCAG
(SEQ ID NO:47)
10CpG TCTCAGAGCAGGATGCCAAC
(SEQ ID NO:48)		 ACAAGATGGGACCAAGAACC
(SEQ ID NO:49)
Gfap Promoter STAT3 Binding TGACTCACCTTGGCATAGACA
(SEQ ID NO:50)		 CAGTGAGGCATACGGCAAG
(SEQ ID NO:51)
Human Th
Promoter 		NRBE1 GGGTTGTCCTCAAGGGAGTT
(SEQ ID NO:52)		 CTATGGCCCACTGCTAGCTC
(SEQ ID NO:53)
NRBE2 TCCCTTTGCTTTGACTGAGC
(SEQ ID NO:54)		 GACTTCTCGAAGGCCTACCC
(SEQ ID NO:55)
Tph2 Promoter CAAAGGGCTACTCGACCTAT
(SEQ ID NO:56)		 GTGCTGAAGAGCAGTGCGCT
(SEQ ID NO:57)
Gad67 Promoter AGACACCTGCAAAGGAGCCC
(SEQ ID NO:58)		 ACAGGGAGCTGGACCCTCCC
(SEQ ID NO:59)
이식 및 조직학적 과정
동물 실험에 대한 모든 절차는 한양대학교 의과대학의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인받았다(승인번호 2014-0212A). 또한 모든 시험은 국립보건원(NIH) 지침에 따라 수행하였다. 성인 암컷 Sprague-Dawley 랫트(무게 200-250g)에 3㎕의 6-하이드록시도파민(6-OHDA, 8ug/ul)을 흑질의 우측(Bregma로부터 AP:-4.8mm, ML:1.5mm, V:8.2mm) 및 MFB(Median forebrain bundle; Bregma로부터 AP:-1.8mm, ML:1.8mm, V:8.0mm)에 stereotactic injection으로 hemi-파킨슨병을 유도하였다. 브레그마 좌표는 Incisor bar를 -3.5mm에 설치 후 Ear bar를 이용해 랫트 머리를 고정시켜 얻었다. 파킨슨병 유도 여부를 판별하기 위해 암페타민 유도 회전 검사(rotation test)를 실시했고 시간 당 300 바퀴의 회전을 보이는 랫트를 파킨슨병 모델로 선별했다. 세포 이식을 위해 럼푼(Pompun) 100㎕/100g(23.32mg/ml)과 졸레틸 100㎕/100g(50mg/ml) 혼합물을 이용해 파킨슨병 모델 랫트를 마취하고 랫트 E12(Embryonic day 12일)의 VM-NSC를 8일(4일째에 1계대 포함)동안 비타민C 처리/비처리 군으로 나눠서 배양 및 증식 시킨 세포를 3㎕에 단일 세포로 풀어(1.5x105 세포/㎕) 10분에 걸쳐 선조체의 두 부위에 각각 주입하였다. (Bregma AP:0.07, ML:-0.30, DV:-0.55, 경막(dura) AP:-0.10, ML:-0.40, DV:-0.50; 인시저 막대는 -3.5mm에 설치됨). 22게이지의 주사기를 이용해 각 주입이 끝난 후 제자리에 5분동안 두었다. 랫트에 이식 1일 전부터 이식 후 1개월 동안 지속적으로 면역반응 억제제인 사이클로스포린 A(10 mg/kg, 복강 내)를 매일 주사하였고, 이어서 나머지 시간 동안에는 감소된 용량(5 mg/kg)으로 주사했다. 이식 8주 후 랫트를 마취시키고 4% 파라포름알데하이드로 심장을 가로질러 관류하였다. 뇌를 적출하고 30% 수크로오스/PBS 용액에 밤새 담근 후 Tissue-Tek(Sakura Finetek, USA)에서 냉동시킨 후 마이크로톰(Leica, CM1850)을 사용하여 절편 했다. 뇌 절편(30um 두께)에 상기 언급한 것과 같이 면역조직화학 분석을 수행했고 공초점 현미경(Leica TSP SP5)으로 영상을 얻었다. 이식된 세포(Graft)의 부피를 다음 논문에 기술된 것과 같이 측정하였다[Antidepressants increase neural progenitor cells in the human hippocampus. Neuropsychopharmacology : official publication of the American College of Neuropsychopharmacology 34, 2376-2389, Direct comparison of autologous and allogeneic transplantation of iPSC-derived neural cells in the brain of a non-human primate. Stem cell reports 1, 283-292, Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. The Journal of clinical investigation 121, 2326-2335, Effects of Rho Kinase Inhibitors on Grafts of Dopaminergic Cell Precursors in a Rat Model of Parkinson's Disease. Stem cells translational medicine 5, 804-815]. 파킨슨병 동물 모델에서 도파민성 신경세포 섬유가 소실되는 선조체 절편에서 TH+ 염색을 확인함으로써 이식된 세포를 확인했고 5번째 절편으로부터 TH 발현 이식세포를 디지털화 된 이미지로 윤곽을 나타내고 LAS 이미지 분석기를 사용하여 계산하였다. 이식된 세포의 부피를 Calvalieri’s method 를 사용하여 다음 수학식 1로 계산하였다. 수학식 1에서 T는 평행한 절편들 사이의 거리이고 (본 실험에서의 값: 0.15mm = 30 μm [절편 두께] x 5) A는 절편 면적, n은 절편의 총 수 이다
[수학식 1]
Figure pat00002
행동 실험
다음 논문에 기술된 것과 같이, 동물 행동실험으로 암페타민 유도 회전 실험과 stepping test을 진행하였다[Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. The Journal of clinical investigation 121, 2326-2335].
세포계수 및 통계학적 분석
면역 염색된 세포를 각 커버슬립의 10-20개의 임의 영역에서 200x 배율로 계수하였다. 데이터는 3~8개의 독립된 실험군의 평균±SEM으로 표시하였다. 모든 수치는 통계학적 시험을 거쳐 타당성을 확인하였고 통계학적 비교를 위해 Student t-test(unpaired) 또는 One way ANOVA, Post-mortem 비교분석법(SPSS® Statistics21; IBM Inc.)을 사용하였다. 관련된 n수, p-값 및 통계학적 분석 방법은 각 데이터 범례에 표시되어 있다.
2. 실험 결과
VC는 VM -NSC의 in vitro 증식 중에 DA 신경성 포텐셜의 손실로부터 구하였다
PD에 대한 줄기세포-기반 치료에서, 줄기세포로부터 중뇌형 DA 뉴런으로 분화능이 가장 중요하다. NSC를 배아일(E12)에 배아 VM 조직으로부터 분리하고, in vitro에서 유사분열 촉진물질인 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 존재 하에서 증식시켰다. VM-NSC 증식을 4일 마다 계대 배양하였고, 각 계대 배양에서의 세포를 유사분열 촉진물질을 제거함으로써 분화하도록 유도하였다(도 1). VM 조직에서 분리한 VM-NSC를 단기간 (4일, 계대되지 않음, P0) 증식시킨 후 분화 유도 시 DA 생합성을 위한 핵심 효소인 티로신 하이드록실라제(TH)를 발현하는 DA 뉴런으로 효과적으로 분화되었다; 그러나, VM-NSC가 체계적인 세포 공급원이 되기 위해서는 세포수를 더 많이 얻어야 하며 그러기 위해 계대 배양하면서 보다 장기간 VM-NSC 증식을 유도하면 장기간 증식된(계대 배양된) VM-NSC로부터 DA 뉴런으로의 분화능이 급격하게 감소되었다(도 2의 A~D). in vitro 증식 중에 감소된 분화 가능성을 포함하여 세포 특성의 변화는 통상적으로, 조직 기원과 상관 없이 포유류 조직으로부터 유래된 거의 모든 줄기/전구 세포 배양에서 관찰되는 일반적인 현상이다. 또한 이와 같은 배양 시 관찰되는 줄기세포 특성의 변화가 생체 내 노화 중 조직 내에 존재하는 조직특이줄기세포에 일어나는 세포특성 변화와 유사하다는 점을 고려하면 세포 노화와 관련된 현상으로 간주될 수 있다 (어린 조직 대비 노화된 조직에서의 조직 특이적 줄기세포 비교를 기반으로). 활성산소종(ROS)이 세포 노화(cellular aging) 및 노화(senescence)의 주요 원인이기 때문에, 본 발명자들은 VM-NSC 배양물에서 항산화제 처리에 의한 ROS 제거가 DA 신경성 포텐셜의 배양-의존성 손실로부터 구할 수 있는지 시험하였다. 이를 위해, in vitro VM-NSC 증식 배양 기간 동안 보충제로 항산화제인 비타민 C(VC), 비타민 E(VE), 환원된 글루타티온(GSH) 또는 N-아세틸시스테인(NAc)을 사용하였고, 후속적인 배양 분화 시에는 항산화제 없이 유도하였다(도 1). 시험된 모든 항산화제의 ROS 소거 효과는 2',7'-디클로로플루오레신(DCF) 염색에 의해 확인되었다(도 5a). 그러나, 시험된 항산화제들 중에서 VC의 처리만이 계대된 VM-NSC를 분화 유도하였을 때 DA 뉴런으로 분화효율이 감소되는 현상을 막을 수 있었다(도 3의 A-F). 그러므로, 이는 일반적인 항산화제 효과라기보다는 VC 특이적 작용이 관찰된 VC 효과에 원인이 있음을 나타낸다. NSC 증식 중에 VC 처리는 P1 배양물을 생산하는 계대 1(P1)까지의 배양에서 극적이었는데, 이때 TH+ 세포 수율(총 DAPI+ 세포의 10.85±1.2%)은 계대 0(P0)에서의 미처리 배양에서 얻은 수율(12.5%±0.35%) 만큼 컸다(도 2의 D). 실제로 P1에서 VC로 처리된 VM-NSC에서 분화된 모든 TH+ 세포는 유전자 발현의 증가(도 4의 D)와 함께 다른 DA 표현형(VMAT2, AADC, DAT)을 나타났으므로(도 4의 A-C), 이는 VC 처리가 단순히 TH 유전자 발현을 유도한 현상이 아니라, 진정한 DA 뉴런 분화에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
VC 처리의 극적인 효과는 하나의 추가 계대를 진행한 배양물에서 (P2에서) 지속되지 않았는데, 이때 VC가 처리된 NSC로부터의 TH+ DA 뉴런 수율은 또한 1.22±0.1%로 급격히 감소되었다; 그러나 이는 VC-미처리 대조군 보다 여전히 유의하게 더 컸다 (0.44± 0.22%, p<0.05, n=3 독립 배양물) (도 2의 D). 그러나 TH+ DA 뉴런이 수율을 감안할 때, 줄기세포 치료제 개발에서 VC 처리 효과가 P1 배양까지 효과적이라 판단하여 다음 모든 실험은 P1 배양까지 VC 효과를 관찰하기 위하여 수행하였다.
VC가 처리된 VM -NSC로부터 분화된 mDA 뉴런의 중뇌 특이 인자 발현, 도파민 신경전달물질 분비능 및 세포 독소 처리에 대한 저항성
DA 뉴런 분화에 미치는 VC의 효과는 이전 연구들에서 보고되어 왔다[Bagga, V., Dunnett, S.B., and Fricker-Gates, R.A. (2008). Ascorbic acid increases the number of dopamine neurons in vitro and in transplants to the 6-OHDA-lesioned rat brain. Cell transplantation 17, 763-773; He, X.B., Kim, M., Kim, S.Y., Yi, S.H., Rhee, Y.H., Kim, T., Lee, E.H., Park, C.H., Dixit, S., Harrison, F.E., et al . (2015). Vitamin C facilitates dopamine neuron differentiation in fetal midbrain through TET1- and JMJD3-dependent epigenetic control manner. Stem Cells 33, 1320-1332; Lee, J.Y., Koh, H.C., Chang, M.Y., Park, C.H., Lee, Y.S., and Lee, S.H. (2003). Erythropoietin and bone morphogenetic protein 7 mediate ascorbate-induced dopaminergic differentiation from embryonic mesencephalic precursors. Neuroreport 14, 1401-1404; Lee, S.H., Lumelsky, N., Studer, L., Auerbach, J.M., and McKay, R.D. (2000). Efficient generation of midbrain and hindbrain neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Biotechnol 18, 675-679; Yan, J., Studer, L., and McKay, R.D. (2001). Ascorbic acid increases the yield of dopaminergic neurons derived from basic fibroblast growth factor expanded mesencephalic precursors. Journal of neurochemistry 76, 307-311]. 그러나, DA 뉴런 수율 외에도, 성공적인 세포 치료 결과는 중뇌 표현형의 발현, 뉴런 성숙, 도파민 신경전달물질 분비 기능 및 분화된 DA 뉴런의 세포 생존에 의존한다. 이러한 측면에서 VC 효과를 조사하기 위하여, 본 발명자들은 VM-NSC 증식 중에 VC를 처리하고 이어서 분화 중에 VC를 제거하였다. 분화 중에 VC 제거에 대한 근거는 분화된 세포를 이식하였을 때 이식된 세포가 잘 살아남지 못하는 이유로, 증식 단계의 NSC가 적절한 세포이식 단계로 여겨지기 때문이다 (이식 후에는 이식된 세포에 VC를 처리할 수 없음).
중뇌형 DA(mDA) 뉴런은 성숙한 중뇌에서 발달이 종결된 후, Foxa2, Lmx1a 및 Nurr1과 같은 중뇌 특이적 발달 인자의 지속적인 발현을 특징으로 한다. mDA 뉴런에서 중뇌 특이 인자 발현은 뉴런의 생존과 기능에 매우 결정적으로 중요한데, 나이가 들수록, 그리고 독소에 노출되는 등 세포외 환경이 나쁘면 이 중뇌 특이 인자는 쉽게 소멸되는 것이 알려져, 이점이 나이가 들수록 또한 신경독소에 노출 시 PD가 쉽게 발생되는 이유로 여겨지고 있다. 마찬가지로 중뇌 특이 인자 발현의 손실은 VM-NSC를 장기간 증식 배양 후 분화된 mDA 뉴런에서, 또는 이식 후 이식조직에 생존한 mDA 뉴런에서도 관찰됨으로써, 중뇌특이인자의 발현소실 문제는 성공적인 PD 세포 기반 치료를 가능하게 하기 위해 해결해야 할 주요한 문제임을 나타낸다. VM-NSC P1까지 증식 배양기간 중 VC가 처리하지 않고 6일간 분화 유도된 대조군에서는 분화된 TH+DA 뉴런의 일부에서만 중뇌 특이 인자 발현이 검출되었다(중뇌 특이 인자 Nurr1 (62%), Foxa2 (73%) 및 Lmx1a (63%), 도 6a 내지 도 6c). 반면에 증식 배양 시 VC가 처리된 P1 배양에서는 향상된 DA 뉴런 수율과 더불어, 거의 대부분의 TH+ DA 뉴런이 중뇌 특이 인자를 발현하였다 (93% (Nurr1), 98% (Foxa2) 및 91% (Lmx1a)).
분화된 TH+ DA 뉴런의 형태학적인 성숙도를 그 신경세포에서 뻗어나온 총 세포돌기의 길이로 계측하였을 때, VC가 처리된 배양에서 그 형태학적인 성숙도가 처리하지 않은 대조 배양보다 현저히 더 컸다 (164 ㎛ 대비 134 ㎛, 도 6d). 공초점 현미경을 사용하여 포착된 이미지에서 시냅스 소포-특이적 마커인 시냅신+ 반점(synapse puncta)은 VC가 처리된 NSC로부터 분화된 TH+ DA 뉴런 신경돌기에서 더 풍부하게 국지화되어 있어(도 6e), VC 처리에 의해 시냅스 형성 측면에서의 뉴런 성숙도도 현저히 증가됨을 보여주었다. 본 발명자들은 VC 처리에 의해 분화된 mDA 뉴런의 DA 신경전달물질 배출도 현저히 증가됨을 관찰하여 (도 6f), 시냅스 전 DA 뉴런 기능이 VC가 처리된 NSC로부터 분화된 배양물에서 더 컸음을 추가로 관찰하였다. 함께 고려하면 이는 DA 뉴런의 성숙이 VC처리에 의해 형태적으로, 시냅스적으로 및 기능적으로 강화되었음을 나타낸다.
NSC 장기간 증식 계대 배양 후 분화 중 또는 분화 후 세포사멸이 증가하는데, 다음 결과들은 증식 계대 배양 중 VC처리로 분화된 세포에서의 세포사멸이 현저히 감소됨을 보여준다. 먼저, 분화 8일에 세포사멸을 에티듐 호모다이머 1(EthD-1)+ 죽은 세포 계수로 측정한 바, NSC 증식 계대 배양 시 VC 처리로 분화 중 또는 분화 후 세포사멸이 현저히 감소됨도 관찰되었다(도 6g). 또한, 분화된 세포에서 DNA 손상 지표인 γH2AX 병소(foci)도 증식 계대 배양 시VC처리로 크게 감소되었다 (D12에서 3 보다 큰 병소를 가지는 세포%: 35.5% 대비 24.3%) (도 6h). 예상대로, VC-처리된 NSC로부터 분화된 mDA 뉴런은 H2O2 또는 6-하이드록시 DA (6-OHDA)에 의해 유도된 독성 자극에 노출 후에 현저하게 더 낮은 비율로 사멸되었다 (도 6i 및 도 6j). 또한, VC-처리된 배양물에서 독소 처리에도 생존했던 TH+ 세포들은 광범위한 신경돌기 생장을 포함한 건강한 뉴런 형상을 나타낸 한편, 대조군 배양물에서 생존하는 TH+ 세포들은 대부분 끝이 둔화되거나 단편화된 신경돌기 (도 6i 및 도 6j의 삽화), 신경 노화 및 퇴행성 표현형을 나타내었다. 본 발명자들은 분화된 배양물에서 관찰된 모든 효과가 분화된 세포들이 VC 부재 시에 배양되었기 때문에, VC에 의해 직접적으로 영향을 주지 않았음을 다시금 강조한다.
mDA 뉴런 발달 및 표현형 유전자 범위 내에서 VC - 매개된 후생유전학적 조절
VC의 항산화제 작용의 관점에서, VC 처리에 의해 강화된 mDA 뉴런 분화는 VC가 DA 뉴런 계통 세포에서 선택적으로 세포 생존 및 증식을 증진시키는 선택적 메커니즘에 의해 달성될 수 있다. 그러나, VC 처리에 의해 VM-NSC 생존과 증식이 유의미하게 변경되지 않았으므로(도 5b 및 도 5c), VC 처리에 의한 mDA 뉴런 분화 기전은 선택적 메커니즘에 의하지 않음을 보여준다.
일반적인 NSC-특이적(Nestin, Sox2) 및 전뇌 영역-특이적(Otx2) 마커들의 발현은 VM-NSC 증식 배양 시 VC 처리에 의해 변경되지 않았다 (도 7a 내지 도 7C). 대조적으로, VM-NSC 증식 중에 VC 처리는 VM-특이적 NSC 중뇌 특이 인자 Foxa2 및 Lmx1a를 발현하는 세포의 비율을 증가시켰다 (도 8a). Foxa2 및 Lmx1a는 초기 발달중인 VM의 도파민성 NSC에서 발현되며, 일련의 후기 발달 유전자, 예컨대 Nurr1, Pitx3 및 뉴로제닌2(Ngn2)의 발현을 유도함으로써 mDA 뉴런 발달의 주된 조절자 (master regulator) 역할을 한다. 또한, 앞서 언급된 것과 같이, Foxa2 및 Lmx1a는 분화발달 이후에도 성체 중뇌의 mDA 뉴런에서 지속적으로 발현되며, mDA 뉴런의 생존, 표현형 유지 및 기능에 결정적인 역할을 한다. 주지할 것은, NSC 단계 중에 VC 처리에 의해 증가된 Foxa2+ 및 Lmx1a+ 세포의 비율은 분화 후(VC 제거 후)에도 유지되었다 (도 8a 그래프); 이는 분화된 DA 뉴런의 증가된 Foxa2/Lmx1a 발현 (도 6b 및 도 6c)과 DA 뉴런 생존 및 기능 강화(도 6f 내지 도 6j)와도 관련이 있을 것으로 추정된다.
다음으로, 본 발명자들은 VC가 어떻게 증식하는 VM-NSC에서 Foxa2 및 Lmx1a 발현을 촉진시키는지를 측정하고자 하였다. 정량적인 실시간 PCR 분석 결과, VC 처리가 Foxa2 및 Lmx1a의 mRNA 수준을 향상시켰으며(도 8b), 이는 VC가 유전자 전사 수준에서 작용하였음을 나타낸다. VC는 항산화제 역할 외에도, Tet1-3(ten-eleven-translocation 1-3) 및 JmjC(Jumonji C)-도메인-함유 히스톤 탈메틸효소(Jmjds)와 같은 후생유전자 조절 효소를 포함하여, Fe(II)-2-옥소글루타레이트 의존성 디옥시게나제 부류에 대한 보조인자로서 작용한다. 증식하는 VM-NSC에 VC 처리는 핵 분획에서 Tet 효소 활성을 크게 증가시켰고(도 8c), 이때 DNA의 CpG 부위 상에서 메틸화된 시토신(5-메틸시토신; 5 mC)은 감소하고 5-하이드록시메틸시토신(5hmC)는 증가하였다 (도 8d, e, f, g). 또한 VC 처리에 의해 핵 분획에서 Jmjd 효소 활성이 증가하였고(도 8h), 시험된 히스톤 메틸화 중에서, H3K27m3 및 H3K9m3의 전반적인 수준이 VC 처리에 의해 감소되었다 (도 8i 내지 도 8k).
이러한 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 Foxa2 및 Lmx1a의 프로모터 영역의 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3 수준을 평가하였다(도 9a 및 도 9c). hMeDIP-qPCR 및 MeDIP-qPCR 분석에서 Foxa2 와 Lmx1a 프로모터의 여러 영역에서 5hmC가 VC가 처리된 NSC에서 증가하고, 5mC 수준은 감소되었음을 나타내었다(도 9b 및 도 9d). 이와 함께 VC가 처리된 VM-NSC의 Foxa2 및 Lmx1a 프로모터 영역에서 Tet1, Jmjd3 및 Jmjd2 단백이 더 많은 양으로 결합함을 ChIP-qPCR분석으로 확인하였다(도 9e 및 도 9f), 이는 이들 후생유전학적 효소에 의해 관찰된 후생유전적 변화가 일어났음을 보여준다. 뇌에서, VC는 세포막단백인 나트륨-의존성 VC 트랜스포터 2(SVCT2)에 의해 세포 내로 이동된다. pH를 낮추거나 특이적인 SVCT2 억제제인 Quercetin 처리하여 SVCT2 작용을 차단하면 Foxa2 및 Lmx1a 유전자에서 5mC/5hmC와 H3K27m3/H3K9m3에 대한 VC-매개 변화는 없어졌다 (도 9g 및 도 9h). 이러한 결과는 관찰된 후생유전학적 변화가 VM-NSC 세포 안에서 직접적인 작용에 의함을 보여주며, 종합적으로 VC 처리 시 VC가 VM-NSC 세포 안으로 이동하여 핵 안에서 TET, Jmjd2/3 활성을 촉진시켜 관찰된 5mC/5hmC 및 H3K27m3/H3K9m3 변화를 Foxa2 및 Lmx1a 프로모터에서 유도함으로써, 본 유전자를 후생유적학적으로 열어 유전자 발현을 증가시켰음을 보여준다. 또한, Foxa2 및 Lmx1a의 작용을 mDA 뉴런 발달의 주된 조절인자로 고려할 때, 이들 주된 유전자들에서 VC-처리된 후생유전학적 제어는 강화된 mDA 뉴런 분화에 미치는 VC의 효과를 대한 중심 메커니즘으로 제안된다. 흥미롭게도, Foxa2 및 Lmx1a에서 5mC/5hmC 및 H3K27m3/H3K9m3의 VC-매개 변화는 VC 제거 후에도 오랫동안 분화된 세포에서 유지되었다(도 9b의 A, B 및 도 9 d의 A, B). 이들 유전자의 지속적인 오픈 DNA/크로마틴 구조는 도 6b 및 6c에 나타낸 바와 같이, 분화된 배양에서 DA 뉴런의 지속적인 Foxa2 및 Lmx1a 발현에 기여한 것으로 보인다.
후기 발달/분화된 표현형 유전자에 대한 개방된 후생유전학적 특징들은 실제적인 발현 없이 줄기세포 분화의 초기 단계에서 빈번하게 확립되는 것으로 보고되었다 (Mikkelsen, T.S., Ku, M., Jaffe, D.B., Issac, B., Lieberman, E., Giannoukos, G., Alvarez, P., Brockman, W., Kim, T.K., Koche, R.P., et al . (2007). Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells. Nature 448, 553-560). 그러므로, 본 발명자들은 후기 mDA 발달 및 분화된 유전자들에서 후생유전학적 변화에 미치는 VC의 효과를 추가로 조사하였다. DA 표현형 유전자 발현에 중요한 전사 인자인 Nurr1은 후기 mDA 뉴런 전구 세포로부터 발현되기 시작한다. 이것과 일관되게, Nurr1-발현 세포들은 VM-NSC 증식 단계(D0)에서는 검출되지 않았지만, 분화 2일째(D2)로부터 검출되기 시작하였다(도 10a, 도 10b). D2에서의 Nurr1+ 세포의 비율은 NSC 증식 단계 동안 VC로 처리된 배양에서 더 컸고, Nurr1 발현의 이러한 증가는 후기 분화 기간 중에 지속되었다(도 10a, 도 10b). 흥미롭게도, Nurr1 발현이 검출되지 않았을 때(도 10a의 그래프), 미처리된 대조군과 비교하여, Nurr1 프로모터 영역에서 5mC 감소와 함께 증가된 5hmC 수준 및 H3K27m3/H3K9m3의 감소(공통 Foxa2 결합 부위, 도 10c)가 미분화 단계(D0에서)로부터의 VC-처리된 배양물에서 관찰되었다(도 10d의 A, B). 이러한 후생유전학적 코드 변화는 D2에서 더 커졌고 적어도 D6까지 유지되었다. 오픈 DNA/염색질 구조와 관련된 활성화된 후생유전학적 패턴과 함께, Nurr1 전사를 직접 유도하는 것으로 알려져 있는 전사 인자인 Foxa2가 VC로 처리된 배양에서 D2의 Nurr1 프로모터 영역에 보다 더 풍부하게 동원 (관찰)되었다 (도 10e). 따라서, D2에서 Nurr1을 공동 발현하는 Foxa2+ 세포의 비율은 VC가 처리된 배양에서 유의하게 증가되었다 (도 10f).
증식 기간 중의 VC 처리는 또한 TH 프로모터 상에서 유사한 후생유전학적 변화 (D0에서 5hmC/5mC 제외)를 유도하였고(도 10g), D0에서 DA 표현형 유전자는 최종 분화된 DA 뉴런에서 발현되었다(도 10h의 A, B). 분화 6일 동안, 활성화된 후생유전학적 코드 수준에서, 특히 TH 프로모터에서의 5hmC에서 증가하는 경향이 있었다. 이것과 일관되게, ChIP-qPCR 분석은 VC-처리된 배양에서 D6에서의 TH 프로모터의 Nurr1 결합 부위 및 CpG-풍부화 부위(TSS에 가까움)에서의 Nurr1 단백의 동원이 유의미하게 증가됨을 나타내었고(도 10i), 따라서 VC 처리 시 전체 Nurr1+ 세포들 중에서 Nurr1+, TH+ 세포들의 비율도 의미있게 증가하였다(도 10j). 또한, Nurr1 및 TH 유전자 프로모터에 대한 VC-처리된 후생유전학적 변화는 SVCT2 활성을 차단함으로써 없어졌다 (도 11).
VM-NSC 증식 배양 시 VC 투여는 트립토판 하이드록실라제 2(TPH2, 세로토닌 작동성 뉴런) 및 글루탐산 탈카르복실화제 67(GAD67, GABAergic)과 같은 다른 뉴런 유형 유전자의 mRNA 발현(도 12d) 및 후생유전적 코드에 전혀 영향을 미치지 못하였는 것으로 관찰되어(도 12a, 12b), VC 후생유전학적인 유전자 발현은 mDA 뉴런에만 특이하게 관찰됨을 의미한다. 대조적으로, VC처리에 의해 관찰된 5hmC/5mC 및 H3K27m3/H3K9m3 변화가 성상세포(astrocyte) 특이 유전자인 신경교원섬유 산성 단백질(GFAP, glial fibrillary acidic protein)의 프로모터 영역((STAT-결합 영역)에서도 유사하게 관찰되었다(도 12c). 일관되게, VM-NSC 증식 단계 중에 VC 처리에 의해 GFAP+ 성상세포 수율 뿐만 아니라 GFAP의 mRNA 발현도 유의하게 향상되었다 (도 12d 및 도 12e). 성상세포 분화에 대한 VC 효과는 하기 논의 섹션에서 더 상세히 설명된다. 요약하면, 본 발명자들은 증식하는 VM-NSC의 VC 처리가 초기(Foxa2, Lmx1a), 중간(Nurr1) mDA 뉴런 전구체 및 최종 분화된 DA 뉴런 (TH)에 특이적인 다양한 DA 뉴런 발달 유전자들의 오픈 DNA/염색질 구조로의 후생유전적 변화를 유도하였음을 보였다. 이들 유전자의 VC-매개된 후생유전학적 변화는 VC를 처리를 중단한 후에도 최종 분화된 mDA 뉴런에 까지 오랫동안 지속되었다. 그러므로, VM-NSC 증식의 일시적인 VC 처리로 인한 지속적인 후생유전학적 변화는 분화된 mDA 뉴런 세포에서 향상된 DA 뉴런 분화 그리고 유지된 중뇌 특이 인자 발현의 원인임을 알 수 있었다.
PD 랫트에서 세포 이식
시험관 내 결과를 바탕으로, 본 발명자들은 궁극적으로 PD 동물 모델에서 VC 처리로 증식된 VM-NSC의 치료 기능을 평가하였다.
이를 실시하기 위해, 랫트 E12 VM-NSC를 in vitro 에서 VC의 처리 또는 미처리 하에 8일 동안 (증식 4일째에 계대됨) 증식시킨 수(P1D0), 수확하고 헤미-파킨슨병 랫트 모델에 선조체 내로 이식하였다. PD 랫트의 기능 회복은 초기 배아 VM 조직으로부터 유래된 단기간 증식된 NSC의 이식을 사용하여 입증되었지만[Jensen, P., Pedersen, E.G., Zimmer, J., Widmer, H.R., and Meyer, M. (2008). Functional effect of FGF2- and FGF8-expanded ventral mesencephalic precursor cells in a rat model of Parkinson's disease. Brain research 1218, 13-20; Kim, J.Y., Koh, H.C., Lee, J.Y., Chang, M.Y., Kim, Y.C., Chung, H.Y., Son, H., Lee, Y.S., Studer, L., McKay, R., et al . (2003). Dopaminergic neuronal differentiation from rat embryonic neural precursors by Nurr1 overexpression. Journal of neurochemistry 85, 1443-1454.; Studer, L., Tabar, V., and McKay, R.D. (1998). Transplantation of expanded mesencephalic precursors leads to recovery in parkinsonian rats. Nat Neurosci 1, 290-295; Timmer, M., Grosskreutz, J., Schlesinger, F., Krampfl, K., Wesemann, M., Just, L., Bufler, J., and Grothe, C. (2006). Dopaminergic properties and function after grafting of attached neural precursor cultures. Neurobiol Dis 21, 587-606], 본 실험에서처럼 VC 처리 없이 장기간 증식 계대 배양된 VM-NSC는 앞의 실험결과에서 보여준 바와 같이 DA 신경성 전위의 손실, 중뇌-특이적 인자 발현의 손실 및 분화 중 및 후의 세포 생존율 저하로 인해 달성될 것으로 예상되지는 않았다. 예상대로, 암페타민-유도된 회전 테스트는 대조군 NSC가 이식된 PD 랫트의 이식 전 값과 비교하여 회전수에 유의한 감소를 나타내지 않았다(n=7). 대조적으로, VC의 처리 하에 증식된 VM-NSC로 이식된 동물에서 극적인 행동 회복이 이루어졌다. VC-처리된 NSC로 이식된 8마리의 랫트 전부에서, 예외 없이, 회전은 이식 후 8주째에 감소되었다 (평균 NET 회전; 2.1±0.6 (VC) vs 13.3±1.3 (대조군) 회전/분; 도 13a의 A 내지 C). 본 발명자들은 또한 이식 후 8주째에 비약리학적 행동 분석법을 사용하여 PD 행동을 평가하였다. 스텝핑 검사에서(도 13a의 D), VC-처리된 NSC로 이식된 랫트들은 대조군 NSC로 이식된 랫트들 보다 병변이 있는 (좌측) 앞다리를 더 자주 사용하였다. 병변이 있는 발 (좌측)의 스텝 수는 병변이 없는 건강한 우측 발의 스텝 수의 37.3±3.9 % (VC) 대비 9.7±2.2% (대조군), n=7 (대조군) 및 n=8 (VC)이었고, ANOVA와 이어서 Tukey의 사후 분석에 의해 p=7.3e-8이었다 (도 13a의 D).
이식 후 8주에 수행된 조직학적 분석은 대조 NSC 보다 VC-처리된 NSC로 이식된 랫트에서 훨씬 더 큰 이식편 (graft volume) 형성을 나타내었다(VC 그룹에서 0.95 ±0.11mm3, n=8 대비 대조군에서 0.13±0.04, n=7, p=1.4 e-4, Student 's t-시험, 도 13a의 E, G, 도 13b의 A, B). 일관되게, VC 처리군과 비교하여 대조군에서 이식편의 더 풍부한 절단된(활성화된) 카스파제 3+(caspase 3+) 세포사멸 세포가 검출되었다 (도 14a). 대조군 및 VC가 처리된 NSC 이식편에서 어느 것도 증식하는 세포 핵 항원 (PCNA) 및 포스포-히스톤 H3 (pHH3)의 증식하는 세포 마커에 대해 음성이었다 (도 14b, 도 14c). 동물당 이식편에는 1802±338 TH+ 세포(VC) 대비 260±78 TH+ 세포 (대조군)가 생존되어 검출되었다 (도 13a의 F). 그러나, 일반적인 뉴런(HuC/D+, 도 14d) 및 세로토닌성 뉴런 세포(5-하이드록시-트립타민, 5-HT+, 도 14e)의 세포 밀도는 대조군과 VC 이식편 사이에서 유의하게 차이가 없었다. 성상세포 분화에 관찰된 in vitro VC 효과(도 12d 및 도 12e)와 일치되게, GFAP+ 성상세포는 VC가 처리된 NSC에 의해 생성된 이식편에서 더 컸다(도 14f). VC가 처리된 NSC에 이식편에서 TH+ 세포는 대조군 이식편 보다 다중 및 광범위한 신경돌기로 더 성숙한 뉴런 형상을 나타내었다 (도 15b의 A, B, 삽화). 또한, TH+ 세포의 성숙한 뉴런 및 mDA 뉴런에 대해 특이적인 마커들의 공동-발현에 매우 분명한 차이가 있었는데, 대조군에서는 TH+ 세포에 성숙한 뉴런 및 mDA 뉴런 특이 마커가 거의 검출되지 않는 반면 (도 13b의 C~F), VC 처리된 VM-NSC 이식 동물군에서는 거의 모든 TH+ 세포에 성숙한 뉴런(NeuN 및 HuC/D) 및 mDA 뉴런(Foxa2, Nurr1, Girk2) 특이 인자들의 발현되어 검출되었다 (도 13b의 G~K). 이식편의 TH+ mDA 뉴런은 흑질 mDA 뉴런으로부터의 신호를 받는 선조체 시냅스-후 뉴런에 대한 마커인 도파민 및 cAMP-조절된 인단백질-32(DARPP-32)에 대해 양성인 세포들과 인접하였다(도 13b의 L). 이러한 결과는 종합적으로 VM-NSC 증식 중의 VC 처리가 PD를 치료 시 보다 우수한 치료력이 확보된 세포 치료제 개발에 이용될 수 있음을 보여준다.
3. 논의
연구 및 치료에서 조직 특이적 줄기세포 배양을 활용하는 것과 관련된 가장 심각한 결점은 이들의 원래 특성들이 in vitro 배양 중에 변경된다는 것이다. 배양된 세포들은 시험관 내 세포 증식 및 계대 중에 세포 스트레스에 노출될 것으로 예상된다. ROS가 손상 및 노화와 관련된 세포 기능성의 손실을 일으키는 주요 요인이기 때문에, 본 발명들은 항산화제 처리에 의한 ROS 제거가 VM-NSC의 배양 중에 발생하는 DA 뉴런 분화능 손실을 방지할 수 있는지 테스트하였다. 본 발명자들의 데이터는 VC를 제외하고 테스트한 항산화제들 중 어느 것도 이런 배양-의존성 변화를 막지 못함을 보여주었다. 이런 결과는 ROS 또는 세포 노화/노쇠가 VM-NSC 배양에서 DA 뉴런 수율의 감소의 원인이 되는 메커니즘이 아니라는 것을 시사한다. 대조적으로, 세포의 노화/노쇠는 성인 조직에 존재하는 줄기세포의 기능 상실을 야기하는 선두적인 분자 메커니즘이고, 노화 방지 시약은 성인 조직으로부터 유래된 줄기 세포 배양에서 배양-의존성 변화를 예방할 수 있다고 보고되었다. DA 뉴런 형성이 초기 배아 단계에 VM 조직에서 발생하였기 때문에, 본 발명자들의 배양물은 배아 VM 조직으로부터 유래되었다. 이러한 결과를 바탕으로, 세포 노화/노쇠는 성인 조직으로부터 유도된 줄기세포 기능의 손실에 대한 주요 메커니즘일지라도, 배아 조직으로부터 유래된 배양된 줄기세포의 기능성 변화에 대한 기전은 아닌 것으로 사료된다. 대신, 배아의 VM 조직으로부터 유래된 NSC의 배양 의존성 변화는 배아 발달 프로그램과 관련이 있을 것으로 보인다.
중뇌 특이 인자 Foxa2 및 Nurr1의 발현은 mDA 뉴런 생존, 기능 및 표현형 유지에 중요하다. 그러나, 이들 인자의 발현은 나이가 들수록 또는 독소 노출 시 중뇌에서 존재하는 mDA 뉴런에서 그 발현이 감소된다. 세포 이식 후 면역. 염증 반응 등으로 뇌조직 환경은 이식된 세포에 호전적인 독성환경일 것으로 여겨지므로, 이러한 호전적인 뇌 환경이 대조군에서 이식된 mDA 뉴런에 중뇌 특이 인자 발현이 거의 검출되지 않는(도 13b의 C-F) 주된 이유일 것으로 보여진다. 그러므로, 이식된 mDA 뉴런의 중뇌 특이 인자들의 발현은 PD에 대한 세포 치료의 성공에 중요하다. 증가된 DA 뉴런 수율 이외에, 공여 NSC의 VC 처리는 이식 후 오랫동안 이식된 mDA 뉴런에서 중뇌 마커 발현을 유지시켰으며, 이는 이식된 세포 생존 및 기능의 증진과 궁극적으로 향상된 치료 결과와 밀접하게 관련이 있다. in vivo 뇌 발달뿐만 아니라 in vitro 증식 중에 변형된 NSC의 또 다른 특징은 NSC 분화 경향이 뉴런으로부터 성상세포 분화로 전이되는 것이다(도 12d, 도 12e). 배양 의존성 변화를 방지하는데 있어 VC의 관찰된 효과를 기반으로, VC가 또한 in vitro 배양 중에 뉴런에서 성상세포로의 전이를 방지할 수 있을 것으로 기대되었다. 그러나, 본 발명자들의 기대와는 달리, VC 처리는 GFAP 프로모터 영역에서 DNA/히스톤 탈메틸화를 통해 배양된 VM-NSC로부터 성상세포 분화를 향상시켰고(도 12c), 이는 VM-NSC 배양에 대한 VC-처리 효과가 배양- 또는 발달-의존성 과정의 예방과 완전히 일치하지 않음을 나타낸다. 뇌 성상세포의 생리적 신경 영양성 작용을 바탕으로, 성상세포 단독 또는 신경성 공여 세포와 함께 이식하는 것은 난치성 뇌 질환을 치료를 위해 새로이 제시되는 치료 방향으로 대두되고 있다. 그러므로, VC 처리를 NSC에 처리 시 성상세포의 분화가 증가되는 현상은 VC가 처리된 NSC 이식 시 DA 뉴런의 생존력을 증가시키는데 또 다른 공헌을 하였을 것으로 보여진다. 실제로 VC가 처리된 NSC에 의해 형성된 이식편에서 TH+ DA 뉴런 세포는 GFAP+ 성상세포에 의해 보다 더 풍부하게 둘러싸여 있음이 주목되었다 (도 14f).
본 발명에서, 발명자들은 VC가 DA 뉴런 발달, 생존, 기능 등의 결정적인 유전자들에 대한 DNA/히스톤 탈메틸화-기저 후생유전학적 조절을 통해 관찰된 효과를 발휘하였음을 입증하였다. 유사한 후생유전학적 제어 메커니즘이 본 발명자들의 이전 연구에서 NSC 분화 중에 VC로의 처리에 의해 입증되었다[He, X.B., Kim, M., Kim, S.Y., Yi, S.H., Rhee, Y.H., Kim, T., Lee, E.H., Park, C.H., Dixit, S., Harrison, F.E., et al. (2015). Vitamin C facilitates dopamine neuron differentiation in fetal midbrain through TET1- and JMJD3-dependent epigenetic control manner. Stem Cells 33, 1320-1332]. 그러나, VC를 NSC 분화 중에 처리하였을 때는 후생유전학적 조절 및 유전자 발현이 TH 및 DAT와 같은 최종 분화된 DA 뉴런 유전자들에 국한되었다. 그러므로, 이전에 보고한 NSC 분화 기간 중에 VC를 처리하는 방법으로는 DA 뉴런의 생존 및 기능에 중요한 중뇌 특이 인자들의 발현에 영향을 주지 않기 때문에, 그 치료적 가치는 미미한 것으로 보인다. 대조적으로, 본 발명에서 NSC 증식 중의 VC 처리의 효과는 광범위한 mDA 뉴런 발달 및 표현형 유전자들, 예컨대 VM-NSC의 초기 미분화 단계에서 작용하는 것들(Foxa2, Lmx1a), 중간 mDA 뉴런 전구체(Nurr1) 및 최종 분화된 mDA 뉴런(TH)의 변화를 포함하였다. 흥미롭게도, 증식/미분화 NSC에서 Tet 및 Jmjd 효소 활성을 활성화시킴으로써 VC가 후생유전학적 변화를 유도한 후에, 그 유전자들의 후생유전학적 상태는 VC 제거 후에도 오랫동안 분화된 mDA에서 유지되었다. 이러한 결과는 일시적인 VC 처리가 mDA 뉴런 유전자에서 안정되고 오래 지속되는 후생유전학적 변화를 유도할 수 있음을 시사한다. 또한 VC 처리만이 미분화된 VM-NSC에서 발현된 마스터 조절자인 Foxa2 및 Lmx1a의 발현을 직접적으로 촉진함으로써 mDA 뉴런 발달의 연속단계를 유발할 수 있다. 후기 발달 인자 발현의 유도는 촉진된 발달 연속단계에서 계속된다. 후기 발달 인자들은 VC-매개된 후생유전학적 조절 작용을 이어 받아 후기 분화 단계 중의 후생유전적 상태의 유지에 기여할 수 있다. 지속적인 오픈 DNA/염색질 구조는 분명히 중뇌 특이 인자를 발현하는 mDA 뉴런의 생성에 기여하였으며, 이식 후 in vitro 및 in vivo 모두에서 독성 자극에 대한 내성을 촉진시켰다.
관찰된 VC 효과를 PD 환자 세포 치료에 적용하기 위해서는, 본 발명에서 관찰된 VC 효과가 인간 NSC 배양에서도 재현되어야 하며, 따라서, 본 발명자들은 인간 배아 줄기세포(hESC)[Rhee, Y.H., Ko, J.Y., Chang, M.Y., Yi, S.H., Kim, D., Kim, C.H., Shim, J.W., Jo, A.Y., Kim, B.W., Lee, H., et al . (2011). Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. The Journal of clinical investigation 121, 2326-2335.]에서 유래한 NSC 증식 시 VC로 처리하였고, VC 없이(미처리) NSC의 분화를 유도하였다. 설치류 VM-NSC 배양과 유사하게, VC 처리는 hESC-NSC 배양에서 분화하는/분화된 세포 생존을 크게 촉진시켰다(도 15a). 또한, TH+ DA 뉴런 수율은 VC-처리된 인간 NSC로부터 분화된 배양에서 유의하게 향상되었다 (도 15b). 미처리 대조군 배양과 비교하여, VC-처리된 배양에서 TH+ 세포는 보다 광범위한 신경돌기 분지화를 나타내었다(도 15c). TH mRNA 발현의 증가(도 15d)와 함께, 인간 TH 프로모터 영역(두 개의 공통 Nurr1 결합 부위; NGFI-B 반응 요소)에서 5hmC의 수준은 VC 처리에 의해 향상되었다(도 16e), 이는 VC-처리된 후생유전학적 제어에서 설치류와 인간 TH 프로모터 사이의 유사성을 나타낸다. 인간 NSC-DA 분화 및 분화된 세포 생존에서 VC 처리의 관찰된 유익은 PD 세포 치료 접근법에서 적어도 적용 가능하다. 정상적으로 뇌 세포에 VC가 높은 농도로 존재함을 고려할 때, 공여 세포의 VC 처리는 생리적 환경과 같을 뿐 아니라 간단하고, 안전하다. 그러므로, 공여 NSC의 제조 중에 이 VC 처리 전략의 사용은 임상 환경에서 PD 세포 치료 옵션이 될 수 있다.
4. 결론
배양된 신경줄기세포(NSC)는 파킨슨병(PD)을 치료하기 위한 체계적인 세포 공급원으로 간주된다. 그러나, 이러한 NSC로부터 치료 기능 관련 NSC 성상이 배양 중에 손실된다. 본 발명자들은 복측 중뇌(ventral midbrain, VM) 유래 NSC 증식 계대 배양 중 비타민 C(VC)의 처리가 중뇌형 도파민(mDA) 뉴런으로의 분화 수율, 분화된 mDA 뉴런에 중뇌 특이 인자의 발현, 분화된 세포의 생존력등 치료 기능 관련 NSC 성상의 손실을 방지하여 장기간 배양 후에도 치료능이 우수한 VM-NSC를 증식 배양할 수 있음을 확인하였다. VC는 관련된 유전자 프로모터 영역에서 DNA 하이드록시메틸화/탈메틸화 및 억제 히스톤 코드(H3K9m3, H3K27m3) 탈메틸화를 통해 일련의 mDA 뉴런 특이적 발달 및 표현형 유전자를 상향 조절함으로써 작용하였다. 특히, 일시적인 VC 처리에 의해 유도된 후생유전학적 변화는 VC 제거 후에 오랫동안 지속되었다. 따라서, PD 모델 랫트에서 중뇌 특이 인자를 충실하게 발현하는, 풍부화된 DA 뉴런 이식과 함께, VC-처리된 NSC의 이식은 개선된 행동 복원을 초래하였다. 이러한 결과는 공여 NSC에 대한 VC 처리가 향후 PD에 대한 간단하고, 효과적이며, 안전한 치료 전략이 될 수 있음을 나타낸다.
<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Cell Therapy using Midbrain-type Neural Stem Cells Treated with Vitamin C <130> P17U10C0994 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 1 gaaagttgat tt 12 <210> 2 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 2 ctctattgtt tt 12 <210> 3 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 3 tattatttat at 12 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 4 taatatttcc tt 12 <210> 5 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 5 aaggttaa 8 <210> 6 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 6 aaggtcac 8 <210> 7 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Prediction Binding Sites <400> 7 ctggcctt 8 <210> 8 <211> 8 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Claims (8)

  1. 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 세포 치료제.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 중뇌형 신경줄기세포는 신경줄기세포 특이인자를 포함하는 중뇌 특이 인자를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 중뇌 특이 인자는 Foxa2, Lmx1a 및 Nurr1으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  4. 제 1 항에 있어서,
    중뇌형 신경줄기세포 증식 시 비타민 C가 처리된 것을 특징으로 하는 세포 치료제.
  5. 중뇌형 신경줄기세포 증식 시 비타민 C를 처리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는, 중뇌특이 인자를 발현하는 신경줄기세포의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 비타민 C는 50μM 내지 300μM로 처리되는 것을 특징으로 하는 신경줄기세포의 제조방법.
  7. 비타민 C가 처리된 중뇌형 신경줄기세포를 포함하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 신경계 질환은 파킨슨씨병, 알츠하이머병, 헌팅톤병, 근위축성 측면경화증 및 뇌졸증, 국소빈혈 및 척수손상에 의한 신경질환으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 신경계 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Harrison, F.E., and May, J.M. (2009). Vitamin C function in the brain: vital role of the ascorbate transporter SVCT2. Free radical biology & medicine 46, 719-730.
Monfort, A., and Wutz, A. (2013). Breathing-in epigenetic change with vitamin C. EMBO reports 14, 337-346.

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