WO2022250127A1 - 神経突起伸長促進用キット及びその使用 - Google Patents

神経突起伸長促進用キット及びその使用 Download PDF

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栄之 岡野
義高 加瀬
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慶應義塾
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Definitions

  • the present invention relates to a kit for promoting neurite outgrowth and its use. More specifically, the present invention relates to a kit for promoting neurite outgrowth, a method for producing neurospheres for treating spinal cord injury, a neurosphere for treating spinal cord injury, and a method for screening a neurite outgrowth promoting agent.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2021-089367 filed in Japan on May 27, 2021, the content of which is incorporated herein.
  • Non-Patent Document 2 The inventors have previously clarified that chronic spinal cord injury can be treated by treating neurospheres with DAPT (CAS number: 208255-80-5) and then transplanting them to the site of spinal cord injury.
  • DAPT CAS number: 208255-80-5
  • neurite outgrowth was promoted and phosphorylation of p38 MAPK was increased in neurons induced to differentiate from neurospheres exposed to DAPT.
  • Non-Patent Document 2. Non-Patent Document 2.
  • Keirstead H. S., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cell Transplants Remyelinate and Restore Locomotion after Spinal Cord Injury, J. Neurosci., 25 (19), 4694-4705, 2005.
  • Okubo T., et al. Treatment with a Gamma-Secretase Inhibitor Promotes Functional Recovery in Human iPSC- Derived Transplants for Chronic Spinal Cord Injury, Stem Cell Reports. 11 (6), 1416-1432, 2018.
  • the purpose of the present invention is to provide a technique for promoting neurite outgrowth of pluripotent stem cell-derived neurons.
  • the present invention includes the following aspects.
  • [7] comprising the step of measuring the expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B in neurospheres, wherein the measured expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B is increased compared to a control
  • [8] comprising the steps of culturing neurospheres in the presence of a test substance, and measuring the expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B in the neurospheres, wherein the expression level or phosphorylation of GADD45G
  • a technique for promoting neurite outgrowth of pluripotent stem cell-derived neurons can be provided.
  • FIG. 1(a) to (g) are representative fluorescence micrographs showing the results of immunostaining of ⁇ III-tubulin in Experimental Example 1.
  • FIG. FIG. 2 is a graph quantifying the results of FIGS. 1(a) to (g).
  • 3 is a graph showing the results of quantifying the expression level of GADD45G in Experimental Example 2.
  • FIG. 4(a) to (c) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated p38 in Experimental Example 3.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of quantifying the amount of phosphorylated p38 in Experimental Example 3.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of quantifying the expression level of p38 in Experimental Example 3.
  • FIG. 7(a) to (c) are photographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated CDC25B in Experimental Example 4.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of quantifying the amount of phosphorylated CDC25B in Experimental Example 4.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of quantifying the expression level of CDC25B in Experimental Example 4.
  • FIG. 10 is a diagram showing the signal cascade involved in neurite outgrowth.
  • 11(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated p38 in Experimental Example 5.
  • FIG. 11(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in Experimental Example 5.
  • FIG. 12(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated CDC25B in Experimental Example 6.
  • FIG. 12(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated CDC25B in Experimental Example 6.
  • FIG. 13(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of ⁇ III-tubulin in Experimental Example 7.
  • FIG. 13(c) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of nerve cells in Experimental Example 7.
  • FIG. 14(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of ⁇ III-tubulin in Experimental Example 8.
  • FIG. 14(c) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of nerve cells in Experimental Example 8.
  • FIG. 15(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated p38 in Experimental Example 9.
  • FIG. 15(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in Experimental Example 9.
  • FIG. 16(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated CDC25B in Experimental Example 9.
  • FIG. FIG. 16(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated CDC25B in Experimental Example 9.
  • FIG. 17(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of ⁇ III-tubulin in Experimental Example 10.
  • FIG. 17(c) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of nerve cells in Experimental Example 10.
  • FIG. 18 is a cluster analysis diagram of all fluctuated genes obtained by RNA-seq analysis in Experimental Example 11.
  • FIG. 19(a) and (b) are diagrams showing the results of analyzing the expression patterns of marker genes of neural stem cells and neural progenitor cells in Experimental Example 11.
  • FIG. 20(a) to (f) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining in Experimental Example 12.
  • FIG. 21(a) is a fluorescence micrograph showing a representative result of immunostaining of phosphorylated p38 on neurospheres derived from 201B7 cells in Experimental Example 13.
  • FIG. 21(b) is a graph showing the results of quantifying the amount of phosphorylated p38 in neurospheres derived from 201B7 cells in Experimental Example 13.
  • FIG. 22(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of p38 immunostaining of 201B7 cell-derived neurospheres in Experimental Example 13.
  • FIG. FIG. 22(b) is a graph showing the results of quantifying the abundance of p38 in neurospheres derived from 201B7 cells in Experimental Example 13.
  • FIG. 23(a) is a fluorescence micrograph showing a representative result of immunostaining of phosphorylated p38 on 414C2 cell-derived neurospheres in Experimental Example 13.
  • FIG. 23(b) is a graph showing the results of quantifying the amount of phosphorylated p38 in neurospheres derived from 414C2 cells in Experimental Example 13.
  • FIG. 24(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of p38 immunostaining of 414C2 cell-derived neurospheres in Experimental Example 13.
  • FIG. 24(b) is a graph showing the results of quantifying the abundance of p38 in 414C2 cell-derived neurospheres in Experimental Example 13.
  • FIG. 25(a) is a fluorescence micrograph showing typical results of Tau protein immunostaining of 201B7 cell-derived nerve cells in Experimental Example 14.
  • FIG. 25(b) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of neurons derived from 201B7 cells in Experimental Example 14.
  • FIG. 26(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of immunostaining of Tau protein in 414C2 cell-derived nerve cells in Experimental Example 14.
  • FIG. 26(b) is a graph showing the results of quantification of neurite length in 414C2 cell-derived neurons in Experimental Example 14.
  • the present invention contains a ⁇ -secretase inhibitor or a GADD45G expression vector, and acts on neurospheres to induce differentiation of the neurospheres into neurons, thereby inhibiting neurite outgrowth of the neurons.
  • a kit for promoting neurite outgrowth is provided for promoting compared to.
  • the kit for promoting neurite outgrowth of the present embodiment contains a ⁇ -secretase inhibitor or a GADD45G expression vector, and acts on neurospheres to induce differentiation of the neurospheres into nerve cells, thereby neurite outgrowth of the nerve cells. It can also be said to be a neurite outgrowth-promoting agent for promoting neurite outgrowth compared to controls.
  • neurospheres refer to spherical cell aggregates formed by suspension culture of neural stem cells or neural progenitor cells.
  • Neural stem cells mean cells having self-renewal ability and differentiation ability to neural progenitor cells.
  • neural progenitor cells are undifferentiated cells that have undergone one-stage differentiation from neural stem cells, and are cells that self-proliferate and ultimately differentiate into nerve cells.
  • Neural stem cells or neural progenitor cells are preferably obtained by differentiation induction from pluripotent stem cells.
  • Pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), and the like.
  • Pluripotent stem cells are preferably human cells.
  • neurospheres can be obtained by suspension culture of pluripotent stem cells in a medium containing at least one of basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF).
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • the obtained neurospheres may be dissociated into single cells and subjected to suspension culture again in a medium containing bFGF to form neurospheres again, which may be repeated multiple times.
  • neurospheres are treated with a ⁇ -secretase inhibitor to induce differentiation into neurons, neurite outgrowth of neurons can be promoted compared to controls.
  • the expression vector may be a viral vector, a plasmid vector, or a transposon vector.
  • controls include nerve cells differentiated from neurospheres not treated with a ⁇ -secretase inhibitor, nerve cells differentiated from neurospheres not introduced with a GADD45G expression vector, and the like.
  • the expression that neurite outgrowth is promoted means that the number of neurites of neurons is increased compared to controls when neurospheres are induced to differentiate into neurons, and/or Longer neurite length compared to controls.
  • ⁇ -secretase inhibitors include Compound 34 (CAS number: 564462-36-8), DAPT (CAS number: 208255-80-5), and the like.
  • Compound 34 is preferable in that a neurite outgrowth-promoting effect can be obtained at a lower concentration than DAPT.
  • the kit for promoting neurite outgrowth of the present embodiment preferably further contains a phosphorylated p38 MAPK dephosphorylation inhibitor.
  • the combined use of a ⁇ -secretase inhibitor and a dephosphorylation inhibitor of phosphorylated p38 can further improve the effect of promoting neurite outgrowth of neurons.
  • a dephosphorylation inhibitor of phosphorylated p38 includes RK-682 (CAS number: 150627-37-5).
  • the kit for promoting neurite outgrowth of the present embodiment contains a ⁇ -secretase inhibitor and a p38 dephosphorylation inhibitor, both may be housed in separate containers, or they may be mixed and housed in the same container. may When the ⁇ -secretase inhibitor and the p38 dephosphorylation inhibitor are mixed to form a composition, the kit for promoting neurite outgrowth of the present embodiment contains the ⁇ -secretase inhibitor and the p38 dephosphorylation inhibitor. a composition for promoting neurite outgrowth for promoting neurite outgrowth of said nerve cells as compared with a control by acting on the neurospheres to induce differentiation of said neurospheres into nerve cells. be able to.
  • the present invention provides a method for producing neurospheres for treating spinal cord injury, comprising the step of allowing the above-described kit for promoting neurite outgrowth to act on pluripotent stem cell-derived neurospheres.
  • a neurosphere for treating spinal cord injury can be manufactured by the manufacturing method of the present embodiment.
  • the pluripotent stem cells, neurospheres, and kit for promoting neurite outgrowth are the same as those described above.
  • the ⁇ -secretase inhibitor effectively suppresses neurosphere cell division when added to the neurosphere medium, does not exhibit significant cytotoxicity to the neurospheres, and It is preferred to work at a concentration that does not form a precipitate at .
  • the final concentration of DAPT in the neurosphere medium is preferably 10-100 ⁇ M, more preferably about 10 ⁇ M.
  • the final concentration of Compound 34 in the neurosphere medium is preferably 1 to 10 ⁇ M, more preferably about 1 ⁇ M.
  • the period for allowing the ⁇ -secretase inhibitor to act on the neurospheres may be 8 to 72 hours, 12 to 48 hours, or 20 to 24 hours.
  • the final concentration of RK-682 in the neurosphere medium is preferably 10 to 20 ⁇ M, more preferably about 10 ⁇ M. .
  • the period for allowing the dephosphorylation inhibitor of phosphorylated p38 to act on neurospheres is preferably 10 to 100 hours, more preferably 20 to 24 hours.
  • the ⁇ -secretase inhibitor and the phosphorylated p38 dephosphorylation inhibitor may act on the neurospheres at the same time, or the ⁇ -secretase inhibitor may act on the neurospheres before the phosphorylated p38 dephosphorylation inhibitor acts on the neurospheres. You may let
  • the invention provides neurospheres for treating spinal cord injury that have increased expression of GADD45G or increased abundance of phosphorylated CDC25B compared to a control.
  • the control includes neurospheres not treated with a ⁇ -secretase inhibitor.
  • neurospheres treated with Compound 34 or DAPT showed a significantly increased expression of GADD45G compared to neurospheres not treated with Compound 34 or DAPT. It was found that the abundance of phosphorylated p38 was significantly increased, and the abundance of phosphorylated CDC25B was significantly increased. Therefore, the neurospheres of this embodiment promote neurite outgrowth when induced to differentiate into nerve cells.
  • the inventors also revealed that neurospheres overexpressing GADD45G had a significantly increased abundance of phosphorylated p38, and that neurite outgrowth was significantly promoted when induced to differentiate into neurons. did.
  • spinal cord injury can be effectively treated by transplanting the neurospheres of this embodiment to the spinal cord injury site of chronic spinal cord injury patients.
  • the expression level of GADD45G may be measured at the mRNA level or at the protein level.
  • the expression level of GADD45G mRNA can be measured by quantitative RT-PCR or the like.
  • the expression level of GADD45G protein can be measured by cell immunostaining, Western blotting, or the like.
  • the abundance of phosphorylated CDC25B can be measured by cell immunostaining, Western blotting, or the like.
  • the neurospheres of this embodiment are preferably manufactured by the above-described method for manufacturing neurospheres for treating spinal cord injury.
  • the present invention comprises the step of measuring the expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B in neurospheres, wherein the measured expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B is compared to a control
  • a method for selecting neurospheres for treating spinal cord injury is provided, wherein the increase in the number of cells indicates that the neurospheres are suitable for spinal cord injury treatment.
  • the control includes neurospheres not treated with a ⁇ -secretase inhibitor.
  • Spinal cord injury can be effectively treated by transplanting neurospheres that have been shown to be suitable for spinal cord injury treatment by the screening method of this embodiment to the site of spinal cord injury in patients with chronic spinal cord injury.
  • the method for measuring the expression level of GADD45G and the method for measuring the abundance of phosphorylated CDC25B are the same as those described above.
  • the present invention comprises the steps of culturing neurospheres in the presence of a test substance, and measuring the expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B in the neurospheres, wherein the GADD45G The expression level of or the abundance of phosphorylated CDC25B increased compared to the absence of the test substance, indicating that the test substance is a neurite outgrowth promoter, Screening for a neurite outgrowth promoter provide a way.
  • the inventors found that when neurospheres with an increased expression level of GADD45G or an increased abundance of phosphorylated CDC25B were induced to differentiate into neurons, neurite outgrowth of neurons increased compared to controls. showed that it could be promoted.
  • nerve cells induced to differentiate from neurospheres not treated with a ⁇ -secretase inhibitor can be mentioned.
  • a test substance that increases the expression level of GADD45G or the abundance of phosphorylated CDC25B in neurospheres when the neurospheres are cultured in the presence of the test substance is a neurite outgrowth promoting agent.
  • the method for measuring the expression level of GADD45G and the method for measuring the abundance of phosphorylated CDC25B are the same as those described above.
  • test substance is not particularly limited, and examples include natural compound libraries, synthetic compound libraries, existing drug libraries, and metabolite libraries.
  • the test substance may act on neurospheres, may act on at least part of the process of inducing differentiation of neurospheres into nerve cells, or may act on all of the process of inducing differentiation of neurospheres into nerve cells.
  • the test substance may be allowed to act, for example, for 20-24 hours.
  • ⁇ -secretase inhibitors include DAPT (CAS number: 208255-80-5), Compound 34 (CAS number: 564462-36-8), L-685,458 (CAS number: 292632-98-5), LY411575 ( CAS number: 209984-57-6), Sulindac (CAS number: 38194-50-2, which is also an anti-inflammatory agent), and Compound E (CAS number: 209986-17-4).
  • 201B7 cells a human iPS cell line, were differentiated into neurospheres.
  • the cells were dissociated and seeded in a cell culture dish (product name “ultralow-attachment culture dish”, Corning Inc.) at a cell density of 1 ⁇ 10 5 cells/mL in nerve induction medium, and placed in a hypoxic and humid environment. They were cultured under (4% O 2 , 5% CO 2 ) for 6 days to differentiate into neurospheres.
  • a cell culture dish product name “ultralow-attachment culture dish”, Corning Inc.
  • MHM medium As the nerve induction medium, MHM medium whose composition is shown in Table 1 below, 2% B27 supplement (Vitamin A-free, Thermo Fisher Scientific, catalog number “17504-044”), 20 ng/mL FGF2 (Peprotech) ), 10 ⁇ M Y27632 (Sigma-Aldrich, catalog number "146986-50-7"), 1 ⁇ M retinoic acid (RA, Sigma, catalog number "R2625-1G”), 3 ⁇ M CHIR 99021 (Reprocell, catalog number "04 -0004") and 10 ⁇ M SB431542 (Calbiochem, catalog number "301836-41-9”) were added to the medium.
  • the formed neurospheres were subsequently dissociated into single cells, passaged in modified neural induction medium, and cultured in a hypoxic environment (4% O 2 ) for 6 days.
  • modified nerve induction medium MHM medium whose composition is shown in Table 1 above, 2% B27 supplement (vitamin A-free, catalog number “17504-044", Thermo Fisher Scientific), 20 ng / mL FGF2 ( Peprotech), 10 ⁇ M Y27632 (catalog number “146986-50-7”, Sigma-Aldrich) and 1 ⁇ M retinoic acid (RA, catalog number “R2625-1G”, Sigma) were used.
  • the neurospheres were cultured for 24 hours in the presence of each ⁇ -secretase inhibitor.
  • DAPT was added to the neurosphere medium at final concentrations of 10 ⁇ M, Compound 34 at 1 ⁇ M, L-685,458 at 10 ⁇ M, LY411575 at 10 ⁇ M, Sulindac at 10 ⁇ M, and Compound E at 5 ⁇ M.
  • a control group was also prepared which was cultured in the absence of the ⁇ -secretase inhibitor.
  • each neurosphere was seeded on a poly-L-ornithine/fibronectin-coated 48-well chamber slide (Iwaki) in a growth factor-free medium at 37°C, 5% CO 2 , 95% air. for 14 days to differentiate into neurons.
  • each nerve cell obtained was fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS, and immunostained for ⁇ III-tubulin, a nerve cell marker, and Tau protein, which is abundantly distributed in axons, respectively. The length of the projection was measured.
  • FIG. 1(a) to (g) are representative fluorescence micrographs of neurons immunostained for ⁇ III-tubulin. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 1(a) is a photograph of control neurons
  • FIG. 1(b) is a photograph of neurons induced to differentiate from DAPT-treated neurospheres
  • FIG. 1(c) is a photograph of Compound 34-treated neurospheres.
  • Fig. 1(d) is a photograph of differentiation-induced neurons of L-685,458-treated neurospheres
  • Fig. 1(e) is a photograph of differentiation-induced neurons of LY411575-treated neurospheres.
  • FIG. 1(f) is a photograph of nerve cells induced to differentiate Sulindac-treated neurospheres
  • FIG. 1(g) is a photograph of nerve cells induced to differentiate Compound E-treated neurospheres. is.
  • Figure 2 is a graph that quantifies the results of Figures 1(a) to (g).
  • Ctl indicates the result of control
  • DAPT indicates the result of DAPT treatment
  • C.34 indicates the result of Compound 34 treatment
  • L -685 indicates that it is the result of L-685,458 treatment
  • LY indicates that it is the result of LY411575 treatment
  • Suli indicates that it is the result of Sulindac treatment
  • “Com. ” indicates the result of Compound E processing.
  • ** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01
  • * indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05
  • N indicates that there is no significant difference. indicates that
  • neurospheres derived from 414C2 cells were prepared by the following method. First, 414C2 cells were adherently cultured with fetal mouse fibroblasts for 12 days. Subsequently, the cells were cultured in suspension for 30 days to form embryoid bodies. Subsequently, the aggregated cells were dissociated and cultured in a medium supplemented with 20 ng/mL FGF2 (Peprotech) in the MHM medium whose composition is shown in Table 1 above to differentiate into neurospheres.
  • each iPS cell-derived neurosphere was treated with DAPT and Compound 34, respectively.
  • one neurosphere with a diameter of about 100 ⁇ m was selected from each group of neurospheres and subjected to RNA-seq analysis.
  • Fig. 3 is a graph showing the results of quantifying the expression level of GADD45G based on transcriptome data obtained by treating 201B7 cell-derived neurospheres with DAPT and Compound 34, respectively, performing RNA-seq analysis.
  • Ctl indicates the result of control
  • DAPT indicates the result of DAPT treatment
  • C.34 indicates the result of Compound 34 treatment.
  • *** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.001.
  • FIG. 4(a) to (c) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining.
  • FIG. 4(a) is the result of control
  • FIG. 4(b) is the result of DAPT treatment
  • FIG. 4(c) is the result of Compound 34 treatment.
  • P-p38 indicates phosphorylated p38.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in neurospheres treated with each ⁇ -secretase inhibitor.
  • Ctl indicates the result of control
  • DAPT indicates the result of DAPT treatment
  • C.34 indicates the result of Compound 34 treatment
  • L -685 indicates that it is the result of L-685,458 treatment
  • LY indicates that it is the result of LY411575 treatment
  • “Suli” indicates that it is the result of Sulindac treatment
  • “Com. ” indicates the result of Compound E processing.
  • ** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01
  • “NS” indicates that there is no significant difference.
  • Fig. 6 is a graph showing the results of treating 201B7 cell-derived neurospheres with DAPT and Compound 34, respectively, performing RNA-seq analysis, and quantifying the expression level of p38 based on transcriptome data.
  • Ctl indicates the result of control
  • DAPT indicates the result of DAPT treatment
  • C.34 indicates the result of Compound 34 treatment.
  • NS indicates that there is no significant difference.
  • FIG. 7(a) to (c) are fluorescence micrographs showing representative results of DAPT treatment and Compound 34 treatment.
  • FIG. 7(a) is the result of the control
  • FIG. 7(b) is the result of the DAPT treatment
  • FIG. 7(c) is the result of the Compound 34 treatment.
  • P-CDC25B indicates phosphorylated CDC25B.
  • the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated CDC25B in neurospheres treated with each ⁇ -secretase inhibitor.
  • Ctl indicates the result of control
  • DAPT indicates the result of DAPT treatment
  • C.34 indicates the result of Compound 34 treatment
  • L -685 indicates that it is the result of L-685,458 treatment
  • LY indicates that it is the result of LY411575 treatment
  • “Suli” indicates that it is the result of Sulindac treatment
  • “Com. ” indicates the result of Compound E processing.
  • “*” indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05
  • ** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01
  • NS indicates that there is no significant difference. indicates that
  • Fig. 9 is a graph showing the results of quantifying the expression level of CDC25B based on the transcriptome data obtained by treating 201B7 cell-derived neurospheres with DAPT and Compound 34, respectively, performing RNA-seq analysis.
  • Ctl indicates the result of control
  • DAPT indicates the result of DAPT treatment
  • C.34 indicates the result of Compound 34 treatment.
  • *** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.001.
  • each neurosphere was cultured in the presence of DAPT and Compound 34 for 24 hours.
  • DAPT and Compound 34 were used at the same concentrations as in Experimental Example 1.
  • FIGS. 11(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining.
  • FIG. 11(a) shows the results of DAPT treatment after introduction of control siRNA
  • FIG. 11(b) shows the results of DAPT treatment after introduction of siRNA against GADD45G. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • P-p38 indicates phosphorylated p38.
  • FIG. 11(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in each group.
  • "DAPT” indicates the result of the control siRNA introduced and then subjected to DAPT treatment
  • "DAPT + siRNA (GADD45G)” indicates that siRNA against GADD45G was introduced and then DAPT treatment. This indicates that the In addition, "**" indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01.
  • FIGS. 12 (a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining.
  • FIG. 12(a) shows the control results of DAPT treatment in the absence of SB203580
  • FIG. 12(b) shows the results of DAPT treatment in the presence of SB203580.
  • Scale bar is 100 ⁇ m.
  • P-CDC25B indicates phosphorylated CDC25B.
  • FIG. 12(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated CDC25B in each group.
  • “DAPT” indicates the results of control DAPT treatment in the absence of SB203580
  • “DAPT+SB203580” indicates the results of DAPT treatment in the presence of SB203580. show.
  • “*” indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • each neurosphere was seeded on a poly-L-ornithine/fibronectin-coated 48-well chamber slide (Iwaki) in a growth factor-free medium at 37°C, 5% CO 2 , 95% air. for 14 days to differentiate into neurons.
  • each nerve cell obtained was fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS, and immunostained for ⁇ III-tubulin, a nerve cell marker, and Tau protein, which is abundantly distributed in axons, respectively. The length of the projection was measured.
  • FIG. 13(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of ⁇ III-tubulin.
  • FIG. 13(a) shows the control results of DAPT treatment in the absence of SB203580
  • FIG. 13(b) shows the results of DAPT treatment in the presence of SB203580.
  • Scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 13(c) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of nerve cells in each group.
  • “DAPT” indicates the results of control DAPT treatment in the absence of SB203580
  • “DAPT+SB203580” indicates the results of DAPT treatment in the presence of SB203580. show.
  • “*” indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • each neurosphere was cultured in the presence of DAPT and Compound 34 for 24 hours.
  • DAPT and Compound 34 were used at the same concentrations as in Experimental Example 1.
  • each neurosphere was seeded on a poly-L-ornithine/fibronectin-coated 48-well chamber slide (Iwaki) in a growth factor-free medium at 37°C, 5% CO 2 , 95% air. for 14 days to differentiate into neurons.
  • each nerve cell obtained was fixed with 4% paraformaldehyde, and immunostained for ⁇ III-tubulin, which is a nerve cell marker, and Tau protein, which is abundantly distributed in axons, respectively, to determine the length of neurites. It was measured.
  • FIG. 14(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining.
  • FIG. 14(a) shows the results of DAPT treatment after introduction of control siRNA
  • FIG. 14(b) shows the results of DAPT treatment after introduction of siRNA against CDC25B.
  • Scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 14(c) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of neurons in each group.
  • "DAPT + siRNA (control)” indicates the result of the control siRNA was introduced and then subjected to DAPT treatment
  • "DAPT + siRNA (CDC25B)” was introduced with siRNA against CDC25B. It indicates the result of DAPT processing.
  • “*” indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • neurospheres derived from 201B7 cells, a human iPS cell line were prepared. Neurospheres were then cultured for 24 hours in the presence of RK-682 at a final concentration of 20 ⁇ M. A group without addition of RK-682 was also prepared as a control. Subsequently, each neurosphere was fixed with paraformaldehyde and immunostained for phosphorylated p38 and phosphorylated CDC25B, respectively.
  • FIGS. 15(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated p38.
  • FIG. 15(a) is the result of control
  • FIG. 15(b) is the result of RK-682 treatment. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • P-p38 indicates phosphorylated p38.
  • FIG. 15(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in each group.
  • Control indicates the result of control without RK-682 treatment
  • RK-682 indicates the result of RK-682 treatment.
  • * indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • FIGS. 16(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of phosphorylated CDC25B.
  • FIG. 16(a) is the result of control
  • FIG. 16(b) is the result of RK-682 treatment. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • P-CDC25B indicates phosphorylated CDC25B.
  • FIG. 16(c) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated CDC25B in each group.
  • Control indicates the result of control without RK-682 treatment
  • RK-682 indicates the result of RK-682 treatment.
  • * indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.05.
  • each neurosphere was seeded on a poly-L-ornithine/fibronectin-coated 48-well chamber slide (Iwaki) in a growth factor-free medium at 37°C, 5% CO 2 , 95% air. for 14 days to differentiate into neurons.
  • each nerve cell obtained was fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1 M PBS, and immunostained for ⁇ III-tubulin, a nerve cell marker, and Tau protein, which is abundantly distributed in axons, respectively. The length of the projection was measured.
  • FIGS. 17(a) and (b) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining of ⁇ III-tubulin.
  • FIG. 17(a) is the result of control
  • FIG. 17(b) is the result of RK-682 treatment.
  • Scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 17(c) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of nerve cells in each group.
  • Control indicates the result of control without RK-682 treatment
  • RK-682 indicates the result of RK-682 treatment.
  • ** indicates that there is a significant difference at p ⁇ 0.01.
  • RNA-seq analysis was used to examine comprehensive gene transcription level changes when they acted on neurospheres.
  • neurospheres derived from the human iPS cell line 201B7 cells and neurospheres derived from the human iPS cell line 414C2 cells were prepared. Subsequently, each iPS cell-derived neurosphere was treated with DAPT and Compound 34, respectively. Subsequently, one neurosphere with a diameter of about 100 ⁇ m was selected from each group of neurospheres and subjected to RNA-seq analysis.
  • Fig. 18 is a cluster analysis diagram of all fluctuated genes obtained by RNA-seq analysis.
  • B7 indicates the results of neurospheres derived from 201B7 cells
  • 414C2 indicates the results of neurospheres derived from 414C2 cells
  • Control indicates that both DAPT and Compound 34 act.
  • DAPT indicates the results of the action of DAPT
  • C34 indicates the results of the action of Compound 34.
  • Figures 19(a) and (b) show the expression patterns of NESTIN, MUSASHI1, HES1, SOX2, SOX3, PAX6, FABP7 and ID1, which are marker genes for neural stem cells and neural progenitor cells, in neurospheres derived from 201B7 cells. It is a figure which shows the result of having analyzed.
  • B7 indicates the results of neurospheres derived from 201B7 cells
  • Control indicates the results of a control in which neither DAPT nor Compound 34 was allowed to act
  • DAPT indicates the results of DAPT.
  • C34 indicates the result of the action of Compound 34.
  • each neurosphere was seeded on a poly-L-ornithine/fibronectin-coated 48-well chamber slide (Iwaki) in a growth factor-free medium at 37°C, 5% CO 2 , 95% air. for 14 days to differentiate into neurons.
  • each nerve cell obtained was fixed with 4% paraformaldehyde and immunostained for the nerve cell marker ⁇ III-tubulin and phosphorylated CDC25B.
  • Figures 20(a) to (f) are fluorescence micrographs showing representative results of immunostaining. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Figures 20(a) and (b) are the results of control without DAPT treatment or Compound 34 treatment
  • Figures 20(c) and (d) are the results of DAPT treatment
  • Figure 20(e) and (f) are the results of Compound 34 processing.
  • 20(a), (c), and (e) are the results of immunostaining for ⁇ III-tubulin
  • FIGS. 20(b), (d), and (f) are the results of immunostaining for phosphorylated CDC25B. be.
  • 201B7 cell-derived neurospheres and 414C2 cell-derived neurospheres were prepared. Subsequently, a GADD45G expression construct was introduced into each group of neurospheres using a lentiviral vector to overexpress GADD45G. A group into which an empty lentiviral vector was introduced was also prepared as a control. Each neurosphere was then fixed with paraformaldehyde and immunostained for phosphorylated p38 and p38.
  • FIG. 21(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of immunostaining of phosphorylated p38 on neurospheres derived from 201B7 cells. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Control indicates the results for control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G
  • Phospho-p38 indicates the results for phosphorous. This is the result of detecting oxidized p38.
  • 'Venus' was used as an empty lentiviral vector reporter.
  • EGFP was used as a reporter in the lentiviral vector for GADD45G expression.
  • FIG. 21(b) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in neurospheres derived from 201B7 cells in each group.
  • “Ctl” indicates the results for control neurospheres
  • “GADD45G OE” indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G.
  • FIG. 22(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of p38 immunostaining of 201B7 cell-derived neurospheres. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Control indicates the results of control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results of neurospheres overexpressing GADD45G
  • p38 indicates the detection of p38. indicates that the result is 'Venus' was used as an empty lentiviral vector reporter.
  • EGFP was used as a reporter in the lentiviral vector for GADD45G expression.
  • FIG. 22(b) is a graph showing the results of quantifying the abundance of p38 in neurospheres derived from 201B7 cells in each group.
  • Ctl indicates the results for control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G.
  • FIG. 23(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of immunostaining of phosphorylated p38 on neurospheres derived from 414C2 cells. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Control indicates the results for control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G
  • Phospho-p38 indicates the results for phosphorous. This is the result of detecting oxidized p38.
  • 'Venus' was used as an empty lentiviral vector reporter.
  • EGFP was used as a reporter in the lentiviral vector for GADD45G expression.
  • FIG. 23(b) is a graph showing the results of quantifying the abundance of phosphorylated p38 in neurospheres derived from 414C2 cells in each group.
  • “Ctl” indicates the results for control neurospheres
  • “GADD45G OE” indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G.
  • FIG. 24(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of p38 immunostaining of 414C2 cell-derived neurospheres. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Control indicates the results of control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results of neurospheres overexpressing GADD45G
  • p38 indicates the detection of p38. indicates that the result is 'Venus' was used as an empty lentiviral vector reporter.
  • EGFP was used as a reporter in the lentiviral vector for GADD45G expression.
  • FIG. 24(b) is a graph showing the results of quantifying the abundance of p38 in the 414C2 cell-derived neurospheres of each group.
  • Ctl indicates the results for control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G.
  • 201B7 cell-derived neurospheres and 414C2 cell-derived neurospheres were prepared. Subsequently, a GADD45G expression construct was introduced into each group of neurospheres using a lentiviral vector to overexpress GADD45G. A group into which an empty lentiviral vector was introduced was also prepared as a control.
  • each neurosphere was seeded on a poly-L-ornithine/fibronectin-coated 48-well chamber slide (Iwaki) in a growth factor-free medium at 37°C, 5% CO 2 , 95% air. for 14 days to differentiate into neurons.
  • each nerve cell obtained was fixed with 4% paraformaldehyde in 0.1M PBS, immunostained for Tau protein, and the length of neurites was measured.
  • FIG. 25(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of Tau protein immunostaining of 201B7 cell-derived neurons. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Control indicates the results for control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G.
  • 'Venus' was used as an empty lentiviral vector reporter.
  • EGFP was used as a reporter in the lentiviral vector for GADD45G expression.
  • FIG. 25(b) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of the 201B7 cell-derived neurons of each group.
  • “Ctl” indicates the results for control neurons
  • “GADD45G OE” indicates the results for neurons overexpressing GADD45G.
  • FIG. 26(a) is a fluorescence micrograph showing representative results of Tau protein immunostaining of 414C2 cell-derived nerve cells. Scale bar is 100 ⁇ m.
  • Control indicates the results for control neurospheres
  • GADD45G OE indicates the results for neurospheres overexpressing GADD45G.
  • 'Venus' was used as an empty lentiviral vector reporter.
  • EGFP was used as a reporter in the lentiviral vector for GADD45G expression.
  • FIG. 26(b) is a graph showing the results of quantifying the neurite length of 414C2 cell-derived neurons in each group.
  • “Ctl” indicates the results of control neurons
  • “GADD45G OE” indicates the results of neurons overexpressing GADD45G.
  • a technique for promoting neurite outgrowth of pluripotent stem cell-derived neurons can be provided.

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Abstract

γセクレターゼ阻害剤又はＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを含み、ニューロスフェアに作用させて前記ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導することにより、前記神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して有意に促進させるための、神経突起伸長促進用キット；多能性幹細胞由来ニューロスフェアに、上記神経突起伸長促進用キットを作用させる工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法；脊髄損傷治療用ニューロスフェア；脊髄損傷治療用ニューロスフェアの選別方法及び神経突起伸長促進剤のスクリーニング方法。

Description

神経突起伸長促進用キット及びその使用
　本発明は、神経突起伸長促進用キット及びその使用に関する。より詳細には、本発明は、神経突起伸長促進用キット、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法、脊髄損傷治療用ニューロスフェア、及び、神経突起伸長促進剤のスクリーニング方法に関する。本願は、２０２１年５月２７日に、日本に出願された特願２０２１－０８９３６７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　脊髄損傷は壊滅的な傷害であり、麻痺、感覚障害、神経疼痛及び腸－膀胱機能障害を引き起こす。脊髄損傷の治療に神経幹細胞又は神経前駆細胞を移植する研究が多数報告されているが、移植のための最適な時間枠は脊髄損傷後の亜急性期であると考えられている。そして、慢性期の脊髄損傷を治療することは、グリア瘢痕や空洞の形成等の骨髄内環境の変化のために困難であると考えられている（例えば、非特許文献１を参照。）。しかしながら、ほとんどの脊髄損傷患者は慢性期にあるため、慢性期の脊髄損傷にも適用可能な治療技術の開発が求められている。
　発明者らは、以前に、ニューロスフェアにＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）を作用させた後に脊髄損傷部位に移植することにより、慢性期の脊髄損傷を治療することができることを明らかにした（例えば、非特許文献２を参照。）。また、ＤＡＰＴを作用させたニューロスフェアから分化誘導した神経細胞は、神経突起伸長が促進されていること、ｐ３８　ＭＡＰＫのリン酸化が増加していることを明らかにした。（例えば、非特許文献２を参照。）
Keirstead H. S., et al., Human Embryonic Stem Cell-Derived Oligodendrocyte Progenitor Cell Transplants Remyelinate and Restore Locomotion after Spinal Cord Injury, J. Neurosci., 25 (19), 4694-4705, 2005. Okubo T., et al., Treatment with a Gamma-Secretase Inhibitor Promotes Functional Recovery in Human iPSC- Derived Transplants for Chronic Spinal Cord Injury, Stem Cell Reports. 11 (6), 1416-1432, 2018.
　本発明は、多能性幹細胞由来神経細胞の神経突起伸長を促進する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］γセクレターゼ阻害剤又はＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを含み、ニューロスフェアに作用させて前記ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導することにより、前記神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させるための、神経突起伸長促進用キット。
［２］前記γセクレターゼ阻害剤が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４又はＤＡＰＴである、［１］に記載の神経突起伸長促進用キット。
［３］リン酸化ｐ３８　ＭＡＰＫの脱リン酸化阻害剤を更に含む、［１］又は［２］に記載の神経突起伸長促進用キット。
［４］前記リン酸化ｐ３８　ＭＡＰＫの脱リン酸化阻害剤が、ＲＫ－６８２である、［３］に記載の神経突起伸長促進用キット。
［５］多能性幹細胞由来ニューロスフェアに、［１］～［４］のいずれかに記載の神経突起伸長促進用キットを作用させる工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
［６］対照と比較して、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が増加している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
［７］ニューロスフェアにおけるＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を測定する工程を含み、測定された前記ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が、対照と比較して増加していることが、前記ニューロスフェアが脊髄損傷治療に適していることを示す、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの選別方法。
［８］ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、前記ニューロスフェアの、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を測定する工程と、を含み、前記ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が、前記被験物質の非存在下と比較して上昇したことが、前記被験物質が神経突起伸長促進剤であることを示す、神経突起伸長促進剤のスクリーニング方法。
　本発明によれば、多能性幹細胞由来神経細胞の神経突起伸長を促進する技術を提供することができる。
図１（ａ）～（ｇ）は、実験例１においてβＩＩＩ－チュブリンを免疫染色した結果を示す代表的な蛍光顕微鏡写真である。 図２は、図１（ａ）～（ｇ）の結果を定量化したグラフである。 図３は、実験例２において、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量を定量した結果を示すグラフである。 図４（ａ）～（ｃ）は、実験例３におけるリン酸化ｐ３８の免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 図５は、実験例３において、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図６は、実験例３において、ｐ３８の発現量を定量した結果を示すグラフである。 図７（ａ）～（ｃ）は、実験例４におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの代表的な免疫染色の結果を示す写真である。 図８は、実験例４において、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図９は、実験例４において、ＣＤＣ２５Ｂの発現量を定量した結果を示すグラフである。 図１０は、神経突起伸長に関わるシグナルカスケードを示す図である。 図１１（ａ）及び（ｂ）は、実験例５におけるリン酸化ｐ３８の免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１１（ｃ）は、実験例５において、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図１２（ａ）及び（ｂ）は、実験例６におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１２（ｃ）は、実験例６において、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図１３（ａ）及び（ｂ）は、実験例７におけるβＩＩＩ－チュブリンの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１３（ｃ）は、実験例７において、神経細胞の神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。 図１４（ａ）及び（ｂ）は、実験例８におけるβＩＩＩ－チュブリンの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１４（ｃ）は、実験例８において、神経細胞の神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。 図１５（ａ）及び（ｂ）は、実験例９におけるリン酸化ｐ３８の免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５（ｃ）は、実験例９において、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図１６（ａ）及び（ｂ）は、実験例９におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６（ｃ）は、実験例９において、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図１７（ａ）及び（ｂ）は、実験例１０におけるβＩＩＩ－チュブリンの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ｃ）は、実験例１０において、神経細胞の神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。 図１８は、実験例１１におけるＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られた、変動した全遺伝子のクラスター解析図である。 図１９（ａ）及び（ｂ）は、実験例１１において、神経幹細胞及び神経前駆細胞のマーカー遺伝子の発現パターンを解析した結果を示す図である。 図２０（ａ）～（ｆ）は、実験例１２における免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。 図２１（ａ）は、実験例１３において、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２１（ｂ）は、実験例１３において、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図２２（ａ）は、実験例１３において、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２２（ｂ）は、実験例１３において、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図２３（ａ）は、実験例１３において、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２３（ｂ）は、実験例１３において、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図２４（ａ）は、実験例１３において、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２４（ｂ）は、実験例１３において、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。 図２５（ａ）は、実験例１４において、２０１Ｂ７細胞由来の神経細胞について、Ｔａｕタンパク質の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２５（ｂ）は、実験例１４において、２０１Ｂ７細胞由来の神経細胞について、神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。 図２６（ａ）は、実験例１４において、４１４Ｃ２細胞由来の神経細胞について、Ｔａｕタンパク質の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２６（ｂ）は、実験例１４において、４１４Ｃ２細胞由来の神経細胞について、神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。
［神経突起伸長促進用キット］
　１実施形態において、本発明は、γセクレターゼ阻害剤又はＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを含み、ニューロスフェアに作用させて前記ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導することにより、前記神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させるための、神経突起伸長促進用キットを提供する。本実施形態の神経突起伸長促進用キットは、γセクレターゼ阻害剤又はＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを含み、ニューロスフェアに作用させて前記ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導することにより、前記神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させるための、神経突起伸長促進剤であるということもできる。
　本明細書において、ニューロスフェアとは、神経幹細胞又は神経前駆細胞の浮遊増殖培養によって形成される球状の細胞凝集塊を意味する。神経幹細胞とは、自己複製能と神経前駆細胞への分化能を持つ細胞を意味する。また、神経前駆細胞とは、未分化ではあるが神経幹細胞から一段階分化した細胞であり、自身の自己増殖を行い、最終的には神経細胞に分化する細胞のことである。
　神経幹細胞又は神経前駆細胞は、多能性幹細胞から分化誘導して得られたものであることが好ましい。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等が挙げられる。多能性幹細胞はヒトの細胞であることが好ましい。
　多能性幹細胞を神経幹細胞又は神経前駆細胞に分化誘導する方法は、特に限定されず、通常行われる方法であってよい。例えば、多能性幹細胞をＢａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）及びＥｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）の少なくとも１種を含有する培地中で浮遊培養することによりニューロスフェアを得ることができる。また、得られたニューロスフェアを単一細胞に解離させて再びｂＦＧＦを含有する培地中で浮遊培養し、再びニューロスフェアを形成することを複数回繰り返してもよい。
　実施例において後述するように、ニューロスフェアにγセクレターゼ阻害剤を作用させ、神経細胞に分化誘導すると、神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させることができる。
　また、実施例において後述するように、ニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを導入し、ＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現させて神経細胞に分化誘導すると、神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させることができる。したがって、ニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを作用させるとは、ニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを導入することを意味する。発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよいし、プラスミドベクターであってもよいし、トランスポゾンベクターであってもよい。
　本実施形態において、対照としては、γセクレターゼ阻害剤を作用させていないニューロスフェアから分化誘導した神経細胞、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを導入していないニューロスフェアから分化誘導した神経細胞等が挙げられる。
　本明細書において、神経突起伸長が促進されているとは、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導した場合の神経細胞の神経突起の数が対照と比較して増加していること、及び／又は、神経突起の長さが対照と比較して長いことをいう。
　γセクレターゼ阻害剤としては、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４（ＣＡＳ番号：５６４４６２－３６－８）、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）等が挙げられる。なかでも、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４はＤＡＰＴよりも低濃度で神経突起伸長促進効果が得られる点で好ましい。
　本実施形態の神経突起伸長促進用キットは、リン酸化ｐ３８　ＭＡＰＫの脱リン酸化阻害剤を更に含むことが好ましい。
　実施例において後述するように、発明者らは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４又はＤＡＰＴをニューロスフェアに作用させるとＧＡＤＤ４５Ｇの発現量が上昇し、ｐ３８　ＭＡＰＫ（以下、「ｐ３８」という場合がある。）のリン酸化が亢進し、更にＣＤＣ２５Ｂのリン酸化が亢進することを明らかにした。発明者らは更に、リン酸化ｐ３８の脱リン酸化を阻害することにより、ｐ３８のリン酸化状態を維持し、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を有意に増加させ、神経突起伸長を有意に促進することができることを明らかにした。
　したがって、γセクレターゼ阻害剤とリン酸化ｐ３８の脱リン酸化阻害剤を併用することにより、神経細胞の神経突起伸長促進効果を更に向上させることができる。
　リン酸化ｐ３８の脱リン酸化阻害剤としては、ＲＫ－６８２（ＣＡＳ番号：１５０６２７－３７－５）が挙げられる。
　本実施形態の神経突起伸長促進用キットがγセクレターゼ阻害剤及びｐ３８の脱リン酸化阻害剤を含む場合、両者は別々の容器に収容されていてもよく、混合されて同一の容器に収容されていてもよい。γセクレターゼ阻害剤及びｐ３８の脱リン酸化阻害剤が混合されて組成物を形成している場合、本実施形態の神経突起伸長促進用キットは、γセクレターゼ阻害剤及びｐ３８の脱リン酸化阻害剤を含み、ニューロスフェアに作用させて前記ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導することにより、前記神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させるための、神経突起伸長促進用組成物であるということができる。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法］
　１実施形態において、本発明は、多能性幹細胞由来ニューロスフェアに、上述した神経突起伸長促進用キットを作用させる工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法を提供する。
　本実施形態の製造方法により、脊髄損傷治療用ニューロスフェアを製造することができる。本実施形態の製造方法において、多能性幹細胞、ニューロスフェア、神経突起伸長促進用キットについては上述したものと同様である。
　本実施形態の製造方法において、γセクレターゼ阻害剤は、ニューロスフェアの培地に添加した場合にニューロスフェアの細胞分裂を効果的に抑制し、ニューロスフェアに顕著な細胞毒性を示さず、また、培地中で沈殿を形成しない濃度で作用させることが好ましい。
　例えば、γセクレターゼ阻害剤としてＤＡＰＴを用いる場合、ニューロスフェアの培地中のＤＡＰＴの終濃度は、１０～１００μＭであることが好ましく、１０μＭ程度であることが更に好ましい。
　また、γセクレターゼ阻害剤としてＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４を用いる場合、ニューロスフェアの培地中のＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の終濃度は、１～１０μＭであることが好ましく、１μＭ程度であることが更に好ましい。
　ニューロスフェアにγセクレターゼ阻害剤を作用させる期間としては、８～７２時間であってもよく、１２～４８時間であってもよく、２０～２４時間であってもよい。
　また、リン酸化ｐ３８の脱リン酸化阻害剤としてＲＫ－６８２を用いる場合、ニューロスフェアの培地中のＲＫ－６８２の終濃度は、１０～２０μＭであることが好ましく、１０μＭ程度であることが更に好ましい。
　ニューロスフェアにリン酸化ｐ３８の脱リン酸化阻害剤を作用させる期間としては、１０～１００時間が好ましく、２０～２４時間がより好ましい。
　γセクレターゼ阻害剤とリン酸化ｐ３８の脱リン酸化阻害剤は、同時にニューロスフェアに作用させてもよいし、γセクレターゼ阻害剤をニューロスフェアに作用させた後にリン酸化ｐ３８の脱リン酸化阻害剤を作用させてもよい。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェア］
　１実施形態において、本発明は、対照と比較して、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が増加している、脊髄損傷治療用ニューロスフェアを提供する。ここで、対照としては、γセクレターゼ阻害剤を作用させていないニューロスフェアが挙げられる。
　実施例において後述するように、発明者らは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４又はＤＡＰＴで処理したニューロスフェアは、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４又はＤＡＰＴで処理していないニューロスフェアと比較して、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量が有意に増加しており、リン酸化ｐ３８の存在量が有意に増加しており、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が有意に増加していることを明らかにした。したがって、本実施形態のニューロスフェアは、神経細胞に分化誘導した場合の神経突起伸長が促進されている。
　発明者らはまた、ＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアは、リン酸化ｐ３８の存在量が有意に増加しており、神経細胞に分化誘導した場合の神経突起伸長が有意に促進されることを明らかにした。
　したがって、本実施形態のニューロスフェアを慢性期脊髄損傷患者の脊髄損傷部位に移植することにより、脊髄損傷を効果的に治療することができる。
　ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量は、ｍＲＮＡレベルで測定してもよいし、タンパク質レベルで測定してもよい。ＧＡＤＤ４５ＧのｍＲＮＡの発現量は、定量的ＲＴ－ＰＣＲ等により測定することができる。ＧＡＤＤ４５Ｇタンパク質の発現量は、細胞の免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。また、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量は、細胞の免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。
　本実施形態のニューロスフェアは、上述した脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法により製造されたものであることが好ましい。
［脊髄損傷治療用ニューロスフェアの選別方法］
　１実施形態において、本発明は、ニューロスフェアにおけるＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を測定する工程を含み、測定された前記ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が、対照と比較して増加していることが、前記ニューロスフェアが脊髄損傷治療に適していることを示す、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの選別方法を提供する。ここで、対照としては、γセクレターゼ阻害剤を作用させていないニューロスフェアが挙げられる。
　本実施形態の選別方法により、脊髄損傷治療に適していることが示されたニューロスフェアを、慢性期脊髄損傷患者の脊髄損傷部位に移植することにより、脊髄損傷を効果的に治療することができる。ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量の測定方法、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量の測定方法については上述したものと同様である。
［神経突起伸長促進剤のスクリーニング方法］
　１実施形態において、本発明は、ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、前記ニューロスフェアの、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を測定する工程と、を含み、前記ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が、前記被験物質の非存在下と比較して上昇したことが、前記被験物質が神経突起伸長促進剤であることを示す、神経突起伸長促進剤のスクリーニング方法を提供する。
　実施例において後述するように、発明者らは、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が増加したニューロスフェアを神経細胞に分化誘導すると、神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させることができることを明らかにした。ここで、対照としては、γセクレターゼ阻害剤を作用させていないニューロスフェアから分化誘導した神経細胞が挙げられる。
　したがって、ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養した場合に、ニューロスフェアにおけるＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を増加させる被験物質は、神経突起伸長促進剤であるということができる。
　ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量の測定方法、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量の測定方法については上述したものと同様である。
　被験物質としては特に制限されず、例えば、天然化合物ライブラリ、合成化合物ライブラリ、既存薬ライブラリ、代謝物ライブラリ等が挙げられる。
　被験物質は、ニューロスフェアに作用させてもよいし、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程の少なくとも一部で作用さてもよいし、ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導する工程の全部で作用させてもよい。被験物質は、例えば、２０～２４時間作用させるとよい。
　次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実験例１］
（γセクレターゼ阻害剤による神経突起伸長促進効果の検討）
　ヒトｉＰＳ細胞由来ニューロスフェアに様々なγセクレターゼ阻害剤を作用させた。続いて、各ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導し、神経突起伸長を検討した。γセクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号：２０８２５５－８０－５）、Ｃｏｍｏｕｎｄ　３４（ＣＡＳ番号：５６４４６２－３６－８）、Ｌ－６８５，４５８（ＣＡＳ番号：２９２６３２－９８－５）、ＬＹ４１１５７５（ＣＡＳ番号：２０９９８４－５７－６）、Ｓｕｌｉｎｄａｃ（ＣＡＳ番号：３８１９４－５０－２、抗炎症薬でもある。）、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ（ＣＡＳ番号：２０９９８６－１７－４）を使用した。
　まず、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞をニューロスフェアに分化させた。２０１Ｂ７細胞の培地に、３μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ社、カタログ番号「３０１８３６－４１－９」）及び１５０ｎＭ　ＬＤＮ１９３１８９（ＳｔｅｍＲＤ社、カタログ番号「１０６２３６８－２４－４」）を添加し、６日間処理した。
　続いて、細胞を解離させ、神経誘導培地中、１×１０５個／ｍＬの細胞密度で細胞培養ディッシュ（製品名「ｕｌｔｒａｌｏｗ－ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓｈ」、コーニング社）に播種し、低酸素及び湿潤環境下（４％Ｏ２、５％ＣＯ２）で６日間培養し、ニューロスフェアに分化させた。
　神経誘導培地としては、下記表１に組成を示すＭＨＭ培地に、２％Ｂ２７サプリメント（ビタミンＡ不含、サーモフィッシャーサイエンティフィック社、カタログ番号「１７５０４－０４４」）、２０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２（ペプロテック社）、１０μＭ　Ｙ２７６３２（シグマ－アルドリッチ社、カタログ番号「１４６９８６－５０－７」）、１μＭレチノイン酸（ＲＡ、シグマ社、カタログ番号「Ｒ２６２５－１Ｇ」）、３μＭ　ＣＨＩＲ　９９０２１（リプロセル社、カタログ番号「０４－０００４」）及び１０μＭ　ＳＢ４３１５４２（カルビオケム社、カタログ番号「３０１８３６－４１－９」）を添加した培地を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　続いて、形成されたニューロスフェアを単一細胞に解離させて、改変した神経誘導培地中で継代し、低酸素環境下（４％Ｏ２）で６日間培養した。改変した神経誘導培地としては、上記表１に組成を示すＭＨＭ培地に、２％Ｂ２７サプリメント（ビタミンＡ不含、カタログ番号「１７５０４－０４４」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）、２０ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ２（ペプロテック社）、１０μＭ　Ｙ２７６３２（カタログ番号「１４６９８６－５０－７」、シグマ－アルドリッチ社）及び１μＭレチノイン酸（ＲＡ、カタログ番号「Ｒ２６２５－１Ｇ」、シグマ社）を添加した培地を使用した。
　続いて、ニューロスフェアを各γセクレターゼ阻害剤の存在下で２４時間培養した。ＤＡＰＴは１０μＭ、Ｃｏｍｏｕｎｄ　３４は１μＭ、Ｌ－６８５，４５８は１０μＭ、ＬＹ４１１５７５は１０μＭ、Ｓｕｌｉｎｄａｃは１０μＭ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅは５μＭの終濃度となるようにニューロスフェアの培地に添加した。また、γセクレターゼ阻害剤の非存在下で培養した対照群も用意した。
　続いて、各ニューロスフェアをポリ－Ｌ－オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（イワキ社）に播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。
　続いて、得られた各神経細胞を０．１Ｍ　ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チュブリン、及び、軸索に多く分布するＴａｕタンパク質をそれぞれ免疫染色し、神経突起の長さを測定した。
　図１（ａ）～（ｇ）は、βＩＩＩ－チュブリンを免疫染色した各神経細胞の代表的な蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図１（ａ）は対照の神経細胞の写真であり、図１（ｂ）はＤＡＰＴ処理したニューロスフェアを分化誘導した神経細胞の写真であり、図１（ｃ）はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理したニューロスフェアを分化誘導した神経細胞の写真であり、図１（ｄ）はＬ－６８５，４５８処理したニューロスフェアを分化誘導した神経細胞の写真であり、図１（ｅ）はＬＹ４１１５７５処理したニューロスフェアを分化誘導した神経細胞の写真であり、図１（ｆ）はＳｕｌｉｎｄａｃ処理したニューロスフェアを分化誘導した神経細胞の写真であり、図１（ｇ）はＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ処理したニューロスフェアを分化誘導した神経細胞の写真である。
　図２は、図１（ａ）～（ｇ）の結果を定量化したグラフである。図２中、「Ｃｔｌ」は対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ処理した結果であることを示し、「Ｃ．３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した結果であることを示し、「Ｌ－６８５」はＬ－６８５，４５８処理した結果であることを示し、「ＬＹ」はＬＹ４１１５７５処理した結果であることを示し、「Ｓｕｌｉ」はＳｕｌｉｎｄａｃ処理した結果であることを示し、「Ｃｏｍ．Ｅ」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ処理した結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「ＮＳ」は有意差が存在しないことを示す。
　その結果、γセクレターゼ阻害剤のなかでもＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した群で特に神経突起伸長が促進されたことが明らかとなった。
　Ｔａｕタンパク質の免疫染色においても、βＩＩＩ－チュブリンの免疫染色と同様の結果が得られ、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した群で特に神経突起伸長が促進されたことが明らかとなった。
［実験例２］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検討１）
《ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量の検討》
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。
　また、次の方法により、ヒトｉＰＳ細胞株である４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアを作製した。まず、４１４Ｃ２細胞を、マウス胎児由来線維芽細胞と共に１２日間接着培養した。続いて、３０日間浮遊培養して胚葉体を形成させた。続いて、凝集した細胞を解離させ、上記表１に組成を示すＭＨＭ培地に２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ２（ペプロテック社）を添加した培地中で培養し、ニューロスフェアに分化させた。
　続いて、各ｉＰＳ細胞由来のニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４でそれぞれ処理した。続いて、各群のニューロスフェアから、直径約１００μｍのニューロスフェア１個ずつを選択し、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。
　図３は、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアをＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４でそれぞれ処理してＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行い、トランスクリプトームデータに基づいてＧＡＤＤ４５Ｇの発現量を定量した結果を示すグラフである。図３中、「Ｃｔｌ」は対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ処理した結果であることを示し、「Ｃ．３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した結果であることを示す。また、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＤＡＰＴ処理、及び、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理のいずれにおいてもＧＡＤＤ４５Ｇの発現が有意に上昇したことが明らかとなった。４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについても同様の結果が得られた。
［実験例３］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検討２）
《リン酸化ｐ３８の検討》
　実験例１と同様にして、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを様々なγセクレターゼ阻害剤で処理した。γセクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ、Ｃｏｍｏｕｎｄ　３４、Ｌ－６８５，４５８、ＬＹ４１１５７５、Ｓｕｌｉｎｄａｃ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅを、実験例１と同濃度で使用した。続いて、各ニューロスフェアをパラホルムアルデヒドで固定し、リン酸化ｐ３８を免疫染色した。
　図４（ａ）～（ｃ）は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図４（ａ）は対照の結果であり、図４（ｂ）はＤＡＰＴ処理した結果であり、図４（ｃ）はＣｏｍｏｕｎｄ　３４処理した結果である。図４（ａ）～（ｃ）中、「Ｐ－ｐ３８」はリン酸化ｐ３８を示す。また、スケールバーは１００μｍである。
　図５は、各γセクレターゼ阻害剤で処理したニューロスフェアにおける、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図５中、「Ｃｔｌ」は対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ処理した結果であることを示し、「Ｃ．３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した結果であることを示し、「Ｌ－６８５」はＬ－６８５，４５８処理した結果であることを示し、「ＬＹ」はＬＹ４１１５７５処理した結果であることを示し、「Ｓｕｌｉ」はＳｕｌｉｎｄａｃ処理した結果であることを示し、「Ｃｏｍ．Ｅ」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ処理した結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＮＳ」は有意差が存在しないことを示す。
　図６は、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアをＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４でそれぞれ処理してＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行い、トランスクリプトームデータに基づいてｐ３８の発現量を定量した結果を示すグラフである。図６中、「Ｃｔｌ」は対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ処理した結果であることを示し、「Ｃ．３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した結果であることを示す。また、「ＮＳ」は有意差が存在しないことを示す。
　その結果、ＤＡＰＴ処理又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理により、ニューロスフェアにおけるリン酸化ｐ３８の存在量が有意に増加しており、かつ、ｐ３８の発現量は増加しないことが明らかとなった。
［実験例４］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検討３）
《リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの検討》
　実験例１と同様にして、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを、様々なγセクレターゼ阻害剤で処理した。γセクレターゼ阻害剤としては、ＤＡＰＴ、Ｃｏｍｏｕｎｄ　３４、Ｌ－６８５，４５８、ＬＹ４１１５７５、Ｓｕｌｉｎｄａｃ、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅを、実験例１と同濃度で使用した。続いて、各ニューロスフェアをパラホルムアルデヒドで固定し、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂを免疫染色した。
　図７（ａ）～（ｃ）は、ＤＡＰＴ処理及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図７（ａ）は対照の結果であり、図７（ｂ）はＤＡＰＴ処理の結果であり、図７（ｃ）はＣｏｍｏｕｎｄ　３４処理の結果である。図７（ａ）～（ｃ）中、「Ｐ－ＣＤＣ２５Ｂ」はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂを示す。また、スケールバーは１００μｍである。
　図８は、各γセクレターゼ阻害剤で処理したニューロスフェアにおける、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を定量化した結果を示すグラフである。図８中、「Ｃｔｌ」は対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ処理した結果であることを示し、「Ｃ．３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した結果であることを示し、「Ｌ－６８５」はＬ－６８５，４５８処理した結果であることを示し、「ＬＹ」はＬＹ４１１５７５処理した結果であることを示し、「Ｓｕｌｉ」はＳｕｌｉｎｄａｃ処理した結果であることを示し、「Ｃｏｍ．Ｅ」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　Ｅ処理した結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示し、「ＮＳ」は有意差が存在しないことを示す。
　図９は、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアをＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４でそれぞれ処理してＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行い、トランスクリプトームデータに基づいてＣＤＣ２５Ｂの発現量を定量した結果を示すグラフである。図９中、「Ｃｔｌ」は対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴ処理した結果であることを示し、「Ｃ．３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理した結果であることを示す。また、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＤＡＰＴ処理又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理により、ニューロスフェアにおけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が有意に増加したことが明らかとなった。また、ＣＤＣ２５Ｂの発現量も若干増加したことが明らかとなった。
　以上の結果から、発明者らは、図１０に示すシグナルカスケードが神経突起伸長に関わっていると仮説を立てた。
［実験例５］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証１）
《ＧＡＤＤ４５Ｇのノックダウン》
　図１０に示すシグナルカスケードが、実際に神経突起伸長に関わっているか否かを検証した。まず、実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇに対するｓｉＲＮＡ（カタログ番号「４３９２４２０」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を導入した。ｓｉＲＮＡの導入には、市販のキット（製品名「ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ」、カタログ番号「３０１７０５」、キアゲン社）を使用した。また、対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（カタログ番号「４３９０８４４」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を導入した群も用意した。
　続いて、各ニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の存在下でそれぞれ２４時間培養した。ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４は、実験例１と同濃度で使用した。
　続いて、各ニューロスフェアをパラホルムアルデヒドで固定し、リン酸化ｐ３８を免疫染色した。図１１（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１１（ａ）はコントロールｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であり、図１１（ｂ）はＧＡＤＤ４５Ｇに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。図１１（ａ）及び（ｂ）中、「Ｐ－ｐ３８」はリン酸化ｐ３８を示す。
　図１１（ｃ）は、各群のリン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図１１（ｃ）中、「ＤＡＰＴ」はコントロールｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ＋ｓｉＲＮＡ（ＧＡＤＤ４５Ｇ）」はＧＡＤＤ４５Ｇに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＧＡＤＤ４５Ｇに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行うと、ニューロスフェアにおけるリン酸化ｐ３８の存在量の増加が有意に抑制されたことが明らかとなった。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４を用いた場合においてもＤＡＰＴを用いた場合と同様の結果が得られた。すなわち、ＧＡＤＤ４５Ｇに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理を行うと、ニューロスフェアにおけるリン酸化ｐ３８の存在量の増加が有意に抑制されたことが明らかとなった。
［実験例６］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証２）
《ＳＢ２０３５８０の添加がＣＤＣ２５Ｂのリン酸化に及ぼす影響の検討》
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の存在下でそれぞれ２４時間培養した。ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４は、実験例１と同濃度で使用した。また、この時に、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（ＣＡＳ番号：１５２１２１－４７－６）を終濃度２０μＭで培地に添加した。また、対照としてＳＢ２０３５８０を添加しない群も用意した。続いて、各ニューロスフェアをパラホルムアルデヒドで固定し、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂを免疫染色した。
　図１２（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１２（ａ）はＳＢ２０３５８０の非存在下でＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であり、図１２（ｂ）はＳＢ２０３５８０の存在下でＤＡＰＴ処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。図１２（ａ）及び（ｂ）中、「Ｐ－ＣＤＣ２５Ｂ」はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂを示す。
　図１２（ｃ）は、各群のリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を定量化した結果を示すグラフである。図１２（ｃ）中、「ＤＡＰＴ」はＳＢ２０３５８０の非存在下でＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ＋ＳＢ２０３５８０」はＳＢ２０３５８０の存在下でＤＡＰＴ処理を行った結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＳＢ２０３５８０の存在下でＤＡＰＴ処理を行うと、ニューロスフェアにおけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量の増加が有意に抑制されたことが明らかとなった。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４を用いた場合においてもＤＡＰＴを用いた場合と同様の結果が得られた。すなわち、ＳＢ２０３５８０の存在下Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理を行うと、ニューロスフェアにおけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量の増加が有意に抑制されたことが明らかとなった。
［実験例７］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証３）
《ＳＢ２０３５８０の添加が神経突起伸長に及ぼす影響の検討》
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の存在下でそれぞれ２４時間培養した。ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４は、実験例１と同濃度で使用した。また、この時に、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０（ＣＡＳ番号：１５２１２１－４７－６）を終濃度２０μＭで培地に添加した。また、対照としてＳＢ２０３５８０を添加しない群も用意した。
　続いて、各ニューロスフェアをポリ－Ｌ－オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（イワキ社）に播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。
　続いて、得られた各神経細胞を０．１Ｍ　ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チュブリン、及び、軸索に多く分布するＴａｕタンパク質をそれぞれ免疫染色し、神経突起の長さを測定した。
　図１３（ａ）及び（ｂ）は、βＩＩＩ－チュブリンの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１３（ａ）はＳＢ２０３５８０の非存在下でＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であり、図１３（ｂ）はＳＢ２０３５８０の存在下でＤＡＰＴ処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。
　図１３（ｃ）は、各群の神経細胞の神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。図１３（ｃ）中、「ＤＡＰＴ」はＳＢ２０３５８０の非存在下でＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ＋ＳＢ２０３５８０」はＳＢ２０３５８０の存在下でＤＡＰＴ処理を行った結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＳＢ２０３５８０の存在下でＤＡＰＴ処理を行うと、神経突起伸長が有意に抑制されたことが明らかとなった。また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４を用いた場合においてもＤＡＰＴを用いた場合と同様の結果が得られた。すなわち、ＳＢ２０３５８０の存在下でＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理を行うと、神経突起伸長が有意に抑制されたことが明らかとなった。
［実験例８］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証４）
《ＣＤＣ２５Ｂのノックダウン》
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアにＣＤＣ２５Ｂに対するｓｉＲＮＡ（カタログ番号「４３９０８２４」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を導入した。ｓｉＲＮＡの導入には、市販のキット（製品名「ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ」、カタログ番号「３０１７０５」、キアゲン社）を使用した。また、対照としてコントロールｓｉＲＮＡ（カタログ番号「４３９０８４４」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を導入した群も用意した。
　続いて、各ニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の存在下でそれぞれ２４時間培養した。ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４は、実験例１と同濃度で使用した。
　続いて、各ニューロスフェアをポリ－Ｌ－オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（イワキ社）に播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。
　続いて、得られた各神経細胞を、４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チュブリン、及び、軸索に多く分布するＴａｕタンパク質をそれぞれ免疫染色し、神経突起の長さを測定した。
　図１４（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１４（ａ）はコントロールｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であり、図１４（ｂ）はＣＤＣ２５Ｂに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。
　図１４（ｃ）は、各群の神経細胞の神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。図１４（ｃ）中、「ＤＡＰＴ＋ｓｉＲＮＡ（ｃｏｎｔｒｏｌ）」はコントロールｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ＋ｓｉＲＮＡ（ＣＤＣ２５Ｂ）」はＣＤＣ２５Ｂに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行った結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＣＤＣ２５Ｂに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行うと、神経突起伸長が有意に抑制されたことが明らかとなった。また、Ｔａｕタンパク質の免疫染色においても、βＩＩＩ－チュブリンの免疫染色と同様の結果が得られ、ＣＤＣ２５Ｂに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＤＡＰＴ処理を行うと、神経突起伸長が有意に抑制されたことが明らかとなった。
　また、βＩＩＩ－チュブリン及びＴａｕタンパク質の免疫染色の結果から、ＣＤＣ２５Ｂをノックダウンすると、神経細胞への分化は阻害されていないが、神経突起伸長が阻害されていることが明らかとなった。
　また、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４を用いた場合においてもＤＡＰＴを用いた場合と同様の結果が得られた。すなわち、ＣＤＣ２５Ｂに対するｓｉＲＮＡを導入したうえでＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理を行うと、神経突起伸長が有意に抑制されたことが明らかとなった。
　また、ＤＡＰＴを用いた場合においても、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４を用いた場合においても、ＣＤＣ２５Ｂのノックダウンにより神経突起伸長が約７５％抑制された。この結果は、ＣＤＣ２５Ｂが神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの最下流のエフェクターであることが考えられた。
［実験例９］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証５）
《ＲＫ－６８２がｐ３８及びＣＤＣ２５Ｂのリン酸化に及ぼす影響の検討》
　ｐ３８のリン酸化を維持、促進することでＣＤＣ２５Ｂのリン酸化が上方制御されるか否かを検討した。ＲＫ－６８２（ＣＡＳ番号：１５０６２７－３７－５）はストレプトマイセス属細菌から単離されたチロシンリン酸化の脱リン酸化阻害剤である。ＲＫ－６８２は、リン酸化ｐ３８の脱リン酸化を抑制することにより、ｐ３８を活性化された状態に維持する作用を有する。また、ＲＫ－６８２にはＣＤＣ２５Ｂの脱リン酸化阻害効果はないとされている。
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアを、終濃度２０μＭのＲＫ－６８２の存在下で２４時間培養した。また、対照としてＲＫ－６８２を添加しない群も用意した。続いて、各ニューロスフェアをパラホルムアルデヒドで固定し、リン酸化ｐ３８及びリン酸化ＣＤＣ２５Ｂをそれぞれ免疫染色した。
　図１５（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ｐ３８の免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１５（ａ）は対照の結果であり、図１５（ｂ）はＲＫ－６８２処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。図１５（ａ）及び（ｂ）中、「Ｐ－ｐ３８」はリン酸化ｐ３８を示す。
　図１５（ｃ）は、各群のリン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図１５（ｃ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＫ－６８２処理を行っていない対照の結果であることを示し、「ＲＫ－６８２」はＲＫ－６８２処理を行った結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＲＫ－６８２処理を行うと、ニューロスフェアにおけるリン酸化ｐ３８の存在量が有意に増加したことが明らかとなった。
　また、図１６（ａ）及び（ｂ）は、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６（ａ）は対照の結果であり、図１６（ｂ）はＲＫ－６８２処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。図１６（ａ）及び（ｂ）中、「Ｐ－ＣＤＣ２５Ｂ」はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂを示す。
　図１６（ｃ）は、各群のリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を定量化した結果を示すグラフである。図１６（ｃ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＫ－６８２処理を行っていない対照の結果であることを示し、「ＲＫ－６８２」はＲＫ－６８２処理を行った結果であることを示す。また、「＊」はｐ＜０．０５で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＲＫ－６８２処理を行うと、ニューロスフェアにおけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が有意に増加したことが明らかとなった。
［実験例１０］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証６）
《ＲＫ－６８２が神経突起伸長に及ぼす影響の検討》
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアを、終濃度２０μＭのＲＫ－６８２の存在下で２４時間培養した。また、対照としてＲＫ－６８２を添加しない群も用意した。
　続いて、各ニューロスフェアをポリ－Ｌ－オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（イワキ社）に播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。
　続いて、得られた各神経細胞を０．１Ｍ　ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チュブリン、及び、軸索に多く分布するＴａｕタンパク質をそれぞれ免疫染色し、神経突起の長さを測定した。
　図１７（ａ）及び（ｂ）は、βＩＩＩ－チュブリンの免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図１７（ａ）は対照の結果であり、図１７（ｂ）はＲＫ－６８２処理を行った結果である。スケールバーは１００μｍである。
　図１７（ｃ）は、各群の神経細胞の神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。図１７（ｃ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＲＫ－６８２処理を行っていない対照の結果であることを示し、「ＲＫ－６８２」はＲＫ－６８２処理を行った結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す。
　その結果、ＲＫ－６８２処理を行うと、神経突起伸長が有意に促進されたことが明らかとなった。また、Ｔａｕタンパク質の免疫染色においても、βＩＩＩ－チュブリンの免疫染色と同様の結果が得られ、神経突起伸長が有意に促進されたことが明らかとなった。
　実験例５～９の結果から、図１０に示す神経突起伸長に関わるシグナルカスケードが正しいことが実証された。また、ＲＫ－６８２は図１０に示すシグナルカスケードを利用して神経突起伸長を促進する化合物であることが示された。
［実験例１１］
（遺伝子発現パターンの解析）
　上述したように、発明者らは、ＤＡＰＴ又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４をニューロスフェアに作用させ、神経細胞に分化誘導した場合の神経突起伸長促進に関わるシグナルカスケードを実証した。
　そこで、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の両化合物間で、ニューロスフェアに作用させた場合の網羅的な遺伝子の転写レベルの変動を、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により検討した。
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア、及び、ヒトｉＰＳ細胞株である４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアをそれぞれ作製した。続いて、各ｉＰＳ細胞由来のニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４でそれぞれ処理した。続いて、各群のニューロスフェアから、直径約１００μｍのニューロスフェア１個ずつを選択し、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。
　図１８は、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られた、変動した全遺伝子のクラスター解析図である。図１８中、「Ｂ７」は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアの結果であることを示し、「４１４Ｃ２」は４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアの結果であることを示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＤＡＰＴもＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４も作用させていない対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴを作用させた結果であることを示し、「Ｃ３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４を作用させた結果であることを示す。
　その結果、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア及び４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアのいずれにおいても、ＤＡＰＴ処理後の遺伝子発現変動パターンと、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理後の遺伝子発現変動パターンは、クラスターとして相同な関係であることが明らかとなった。
　図１９（ａ）及び（ｂ）は、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、神経幹細胞及び神経前駆細胞のマーカー遺伝子である、ＮＥＳＴＩＮ、ＭＵＳＡＳＨＩ１、ＨＥＳ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、ＰＡＸ６、ＦＡＢＰ７及びＩＤ１の発現パターンを解析した結果を示す図である。図１９中、「Ｂ７」は２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアの結果であることを示し、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」はＤＡＰＴもＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４も作用させていない対照の結果であることを示し、「ＤＡＰＴ」はＤＡＰＴを作用させた結果であることを示し、「Ｃ３４」はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４を作用させた結果であることを示す。
　その結果、上記遺伝子について、ＤＡＰＴ処理後の遺伝子発現変動パターンと、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理後の遺伝子発現変動パターンは、クラスターとして相同な関係であることが明らかとなった。また、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについても同様の結果が得られた。
［実験例１２］
（神経細胞におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの発現の検討）
　ニューロスフェアをＤＡＰＴ又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４で処理し、神経細胞に分化誘導した後におけるリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を検討した。
　実験例１と同様にして、ヒトｉＰＳ細胞株である２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアを作製した。続いて、ニューロスフェアを、ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４の存在下でそれぞれ２４時間培養した。ＤＡＰＴ及びＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４は、実験例１と同濃度で使用した。
　続いて、各ニューロスフェアをポリ－Ｌ－オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（イワキ社）に播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。
　続いて、得られた各神経細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーであるβＩＩＩ－チュブリン、及び、リン酸化ＣＤＣ２５Ｂをそれぞれ免疫染色した。
　図２０（ａ）～（ｆ）は、免疫染色の代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２０（ａ）及び（ｂ）はＤＡＰＴ処理もＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理も行っていない対照の結果であり、図２０（ｃ）及び（ｄ）はＤＡＰＴ処理を行った結果であり、図２０（ｅ）及び（ｆ）はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４処理を行った結果である。また、図２０（ａ）、（ｃ）、（ｅ）はβＩＩＩ－チュブリンの免疫染色の結果であり、図２０（ｂ）、（ｄ）、（ｆ）はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの免疫染色の結果である。
　その結果、ニューロスフェアをＤＡＰＴ又はＣｏｍｐｏｕｎｄ　３４で処理すると、非処理の場合と比較して、神経細胞に分化誘導した後においてもリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が上昇したことが明らかとなった。
［実験例１３］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証７）
《ＧＡＤＤ４５Ｇの過剰発現がｐ３８のリン酸化に及ぼす影響の検討》
　レンチウイルスベクターを用いて、ヒトｉＰＳ細胞株である、２０１Ｂ７細胞及び４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現させ、ｐ３８のリン酸化に及ぼす影響を検討した。
　まず、実験例１と同様にして、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア、及び、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアをそれぞれ作製した。続いて、レンチウイルスベクターを用いて、各群のニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇ発現用コンストラクトを導入し、ＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現させた。また、対照として空のレンチウイルスベクターを導入した群も用意した。続いて、各ニューロスフェアをパラホルムアルデヒドで固定し、リン酸化ｐ３８及びｐ３８を免疫染色した。
　図２１（ａ）は、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２１（ａ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示し、「Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８」はリン酸化ｐ３８を検出した結果であることを示す。「Ｖｅｎｕｓ」を空のレンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。また、「ＥＧＦＰ」をＧＡＤＤ４５Ｇ発現用レンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。
　図２１（ｂ）は、各群の２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図２１（ｂ）中、「Ｃｔｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示す。また、「＊＊＊」はｐ＜０．００１で有意差が存在することを示す（ｎ＝３）。
　図２２（ａ）は、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２２（ａ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示し、「ｐ３８」はｐ３８を検出した結果であることを示す。「Ｖｅｎｕｓ」を空のレンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。また、「ＥＧＦＰ」をＧＡＤＤ４５Ｇ発現用レンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。
　図２２（ｂ）は、各群の２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図２２（ｂ）中、「Ｃｔｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示す。また、「ＮＳ」は有意差がないことを示す（ｎ＝３）。
　図２３（ａ）は、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２３（ａ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示し、「Ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８」はリン酸化ｐ３８を検出した結果であることを示す。「Ｖｅｎｕｓ」を空のレンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。また、「ＥＧＦＰ」をＧＡＤＤ４５Ｇ発現用レンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。
　図２３（ｂ）は、各群の４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、リン酸化ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図２３（ｂ）中、「Ｃｔｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す（ｎ＝３）。
　図２４（ａ）は、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２４（ａ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示し、「ｐ３８」はｐ３８を検出した結果であることを示す。「Ｖｅｎｕｓ」を空のレンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。また、「ＥＧＦＰ」をＧＡＤＤ４５Ｇ発現用レンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。
　図２４（ｂ）は、各群の４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアについて、ｐ３８の存在量を定量化した結果を示すグラフである。図２４（ｂ）中、「Ｃｔｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示す。また、「ＮＳ」は有意差がないことを示す（ｎ＝３）。
　その結果、ＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現により、ニューロスフェアにおけるリン酸化ｐ３８の存在量が有意に増加し、かつ、ｐ３８の発現量は増加しないことが明らかとなった。
［実験例１４］
（神経突起伸長に関わるシグナルカスケードの検証８）
《ＧＡＤＤ４５Ｇの過剰発現が神経突起伸長に及ぼす影響の検討》
　レンチウイルスベクターを用いて、ヒトｉＰＳ細胞株である、２０１Ｂ７細胞及び４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現させ、神経突起伸長に及ぼす影響を検討した。
　まず、実験例１と同様にして、２０１Ｂ７細胞由来のニューロスフェア、及び、４１４Ｃ２細胞由来のニューロスフェアをそれぞれ作製した。続いて、レンチウイルスベクターを用いて、各群のニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇ発現用コンストラクトを導入し、ＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現させた。また、対照として空のレンチウイルスベクターを導入した群も用意した。
　続いて、各ニューロスフェアをポリ－Ｌ－オルニチン／フィブロネクチンコートされた４８ウェルチャンバースライド（イワキ社）に播種し、増殖因子を含まない培地中で３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気環境下で１４日間培養し、神経細胞に分化させた。
　続いて、得られた各神経細胞を０．１Ｍ　ＰＢＳ中、４％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｔａｕタンパク質を免疫染色し、神経突起の長さを測定した。
　図２５（ａ）は、２０１Ｂ７細胞由来の神経細胞について、Ｔａｕタンパク質の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２５（ａ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示す。「Ｖｅｎｕｓ」を空のレンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。また、「ＥＧＦＰ」をＧＡＤＤ４５Ｇ発現用レンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。
　図２５（ｂ）は、各群の２０１Ｂ７細胞由来の神経細胞について、神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。図２５（ｂ）中、「Ｃｔｌ」は対照の神経細胞の結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現した神経細胞の結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す（ｎ＝３）。
　図２６（ａ）は、４１４Ｃ２細胞由来の神経細胞について、Ｔａｕタンパク質の免疫染色を行った代表的な結果を示す蛍光顕微鏡写真である。スケールバーは１００μｍである。図２６（ａ）中、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は対照のニューロスフェアの結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現したニューロスフェアの結果であることを示す。「Ｖｅｎｕｓ」を空のレンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。また、「ＥＧＦＰ」をＧＡＤＤ４５Ｇ発現用レンチウイルスベクターのレポーターとして使用した。
　図２６（ｂ）は、各群の４１４Ｃ２細胞由来の神経細胞について、神経突起長を定量化した結果を示すグラフである。図２６（ｂ）中、「Ｃｔｌ」は対照の神経細胞の結果であることを示し、「ＧＡＤＤ４５Ｇ　ＯＥ」はＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現した神経細胞の結果であることを示す。また、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差が存在することを示す（ｎ＝３）。
　その結果、ニューロスフェアにＧＡＤＤ４５Ｇを過剰発現させると、神経細胞に分化誘導した場合の神経突起伸長が有意に促進されたことが明らかとなった。
　実験例９及び１０において、ニューロスフェアにＲＫ－６８２を投与することにより、ｐ３８／ＣＤＣ２５Ｂのシグナルが増強され、神経突起伸長が促進されたことが確認された。本実験例により、より上流のＧＡＤＤ４５Ｇの発現をレンチウイルスで増加させても同様の結果が得られることが明らかとなった。
　以上の結果から、化合物投与によっても、遺伝子工学的にも、図１０に示すシグナルカスケードが正しいことが確認された。
　本発明によれば、多能性幹細胞由来神経細胞の神経突起伸長を促進する技術を提供することができる。

Claims (8)

  1. 　γセクレターゼ阻害剤又はＧＡＤＤ４５Ｇの発現ベクターを含み、ニューロスフェアに作用させて前記ニューロスフェアを神経細胞に分化誘導することにより、前記神経細胞の神経突起伸長を、対照と比較して促進させるための、神経突起伸長促進用キット。
  2. 　前記γセクレターゼ阻害剤が、Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　３４又はＤＡＰＴである、請求項１に記載の神経突起伸長促進用キット。
  3. 　リン酸化ｐ３８　ＭＡＰＫの脱リン酸化阻害剤を更に含む、請求項１に記載の神経突起伸長促進用キット。
  4. 　前記リン酸化ｐ３８　ＭＡＰＫの脱リン酸化阻害剤が、ＲＫ－６８２である、請求項３に記載の神経突起伸長促進用キット。
  5. 　多能性幹細胞由来ニューロスフェアに、請求項１～４のいずれか一項に記載の神経突起伸長促進用キットを作用させる工程を含む、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの製造方法。
  6. 　対照と比較して、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が増加している、脊髄損傷治療用ニューロスフェア。
  7. 　ニューロスフェアにおけるＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を測定する工程を含み、測定された前記ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が、対照と比較して増加していることが、前記ニューロスフェアが脊髄損傷治療に適していることを示す、脊髄損傷治療用ニューロスフェアの選別方法。
  8. 　ニューロスフェアを被験物質の存在下で培養する工程と、
    　前記ニューロスフェアの、ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量を測定する工程と、を含み、
    　前記ＧＡＤＤ４５Ｇの発現量又はリン酸化ＣＤＣ２５Ｂの存在量が、前記被験物質の非存在下と比較して上昇したことが、前記被験物質が神経突起伸長促進剤であることを示す、神経突起伸長促進剤のスクリーニング方法。
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