DE1940551A1 - Virusbekaempfende Verbindungen - Google Patents

Description

Virusbekämpfende Verbindungen Priorität : 8.8. I968 - Australien

Die Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen« die eine AntIvirusaktIvItat« AntitümoräktiVität und ImmunosuppressIve Aktivität aufweisen« auf Verfahren.zur Herstellung solcher Verbindungen und auf pharmazeutische und Veterinäre Zusammensetzungen idle dieselben enthalten. Öle Erfindung bezieht sich auch auf Verfahren zur Behandlung von Tieren durch Verabreichung der erfindungsgemäflen Verbindungen oder von Zusammensetzungen« die solche Verbindungen enthalten^..

Die neuen Erfindungen besitzen die allgemeine Formel I

00982S/2054

worin X eine Methylengruppe (-CH₂-), eine a-Hyäroxyinethylen-

gruppe ( ^C ), eine ß-Hydroxyraethylengruape ( AC oder eine Carboxylgruppe, ( -C- ) darstellt und R eine

methy!gruppe (-CHq OH) oder eine Porniy!gruppe (-CH-Q) darstellt

Es wird darauf hingewiesen, daß die allgemeine Klasse« zu der die Verbindungen der allgemeine Formel I gehöhren, als 6,7-Di» hydro-5H-pyrrollzine bezeichnet werden können.

Bevorzugte erfindungsgeraäße Verbindungen sind solche der obigen Formel I, worin RHydroxy methyl und X Methylen, a-liydroxymethylen oderß-Hydroxymethylen darstellt.

Besondere erflndungsgem&Be Verbindungen« die «Ine wertvolle Antivirusaktivität, AntitumoralctivitMt und suppress 1 ve Aktivität aufwtieen, sind die folgenden Verbindungen ι ■"■-..-■■-■■ "-■ ' ··-.. '..:■- : - ■.-: ;: " - .-,; -. .,■■

(Dehydroheliotrldln oder l-

dihydro-(5H)-pyrroli»in). _r

. ö^-Dihydro-T-a-hydroxy-l-hydrcxymethyl-SH-pyrrolimln. (Dehydroretroneoin öder 1-Hydroxyeethy 1-7-ß-hydroxy-

dlhydro-(5H)-pyrroli*in)t -

6,7-Dihydro-l-hydroxymethyl-5H-pyrroli*ln. (Dehydroeupinidin oder 1-Hydroxymethy1-dihydro-(5H)-pyrrolizin)

Die in Klammern angegebenen Namen sind alternative Nasen für die aufgeführten Verbindungen. ^r

Wie bereits erwähnt, wurde gefunden, daß die Verbindungen Dehydroheliotrldln/ Dehydroretroneoin und Dehydroeupinldln eine wertvolle Antivirusaktivität, Antituaoraktlvität «id lnmunosuppreasive AIc^IvItKt aufweisen. Insbesondere norde gefunden« daflDehydroheliotrldln eine Reproduktion des infektiösen Rindtrrhinotracheitiavirus (IBR) inhibiert,

wenn es einerRindernlerenzellenkultür-zugesetzt wird, bevor diese mit einem Virus geimpft wird. Eine Inhibierung tritt auch auf, wenn der Virus, vor oder nach der Impfung der Nlerenzelien mit dem Virus,der Verbindung ausgesetzt wird. Dies ist ein Anzeichen für eine direkte Wirkung von Dehydroheliotridin auf den vorgeformten Virus. Andererseits zeigen Versuche mit den RNA-Viren der Parainfluenza (PI,), der Newcast le-Krankhelt (NDV) und der Mucosalkrankheit sowie mit Bacteriophage T₂, daß sich die inhibierende Wirkung offensichtlich auch auf die DNA-Viren erstreckt. Weiterhin wurde gefunden, daß Dehydroheliotridin gegen Ehrlich-Ascltee (EA) (intraperitoneal bei Mäusen), Walker-Carclnosarcom 256 (subcutan bei Mäusen) Lymphoidleukämie L-1210 (LE) (Intraperitoneal bei Mäusen) und lymphocytische Leukämie P->88 (PA) (intraperltoneal bei Mäusen) -Tumorsystemen aktiv und gegen menschliches Epidermoidcarcinom des Nasopharynx (KB) CSellenkultur) -Systems schwach aktiv ist. Weiterhin 1st Dehydroheliotridin .ein aktives immunosuppresaives Mittel, wenn es bei Mäusen getestet wird und wenn es vor der Injektion eines Antigens verabreicht wird.

Andere, Verbindungen der allgemeinen Formel I als die drei im vorhergehenden Absatz erwähnten Verbindungen besitzen höchstens eine sohwache Antivirusaktivität, Antitumoraktivität oder iramunosuppressive Aktivität. Jedoch sind sie wertvolle Zwischenprodukte bei der Herstellung der aktiveren Verbindungen der Erfindung.

Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Herstellung der obigen Verbindungen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel I werden dadurch hergestellt, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

BAD ORIGINAL

009825/2064

worin X eine Methylengruppe (-CHg-), a-Hydroxymethylengruppe

( C' ) oder ß-Hydroxymethylengruppe ( ""C^ ) darstellt

und R eine Hydroxymethylgruppe («CHgOH) darstellt, oxydiert, und wenn es erwUnscht Ist, eine Verbindung der allgemeinen Formel I hersustellen. In der X α- oder ß-Hydroxymethylen und/oder R Hy droxymethyl darstellt, das Oxydationaprodukt reduziert.

Ee wurde auch gefunden, daß höhere Ausbeuten in Qxydafcionspro« dukt erhalten werden lcönnen, wenn das M-Oxyd einer Verbindung der aUgemeinen Formel II oben als Auegangsmaterlal verwendet wird.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel II umfassen die bekannten Verbindungen Hellotrldln (worin X a-Hydroxymethylen darstellt)j Retronecln (worin X (3-IfydroxyiBethylen darstellt) und Suplnldln (worin X Methylen darstellt). Diese Ausgangsmaterialien' sind bekannte Alkaloldderivate* Hellotridln wird durch Hydrolyse des Alkaloids Hellotrin oder Laaiocarpin (von Hellotropium europaeura) erhalten. Retrcneoin wurd durch Hydrolyse von Monocrotalin (von Crotalarlaretusa oder Crotalarla sfjfictabilla) oder Speotabllln (von Crotalarla speotablila) erhalten. Supindln wird duroh Hydrolyse von Suplnln (von Hellotroplum auplnum) erhalten.

Die Oxydation der Verbindungen der allgemeinen Formel II kann durch Sfcandardverfahren ausgeführt werden* beispielsweise unter Verwendung eines bekannten Dehydrlerungakatalyeatore wie des Adam¹sehen PlatInoxydkataIysstora oder durch Oxydation unter milden Bedingungen unter Verwendung eines Oxydationsmittels wie Mangandioxyd, Kallutnpermenganat, Silberoxyd, ChIoranil, Ninhydrin oder Quecksilber(II)-8cetat. Bevorzugt wird das Oxydationsmittel Chloranil verwendet. In älinlIcher Welse kann die Reduktion des Oxydatlonsprodulcts unter Verwendung von Standardverfahren ausgeführt werden. Insbesondere können A Ika Urne ta 1 !borhydride (vorzugsweise Natrlumborhydrld) verwendot werden. Gewöhnlich werden sowohl di« Oxydatlons- als auch- -

QG9S35S72QS4 " bad original

1'9A 0.5

- - 5 - . ■ . - - ■■■■;■ ; die Reduktionsstufe bei Raumtemperatur ausgeführt»

Die Mengen an Oxydationsmittel und Reduktionsmittel hängen von der Natur des Oxydationsmittels oder Reduktionsmittels und von der Natur des Ausgangsmaterials ab„ Das Oxydationsmittel kann in Mengen von äquimolar zum Ausgangsmaterial bis zu einem großen molaren Überschuß verwendet werdenο Chloranll wird vorzugsweise in einer äquimolaren Menge verwendet, während Mangandioxyd vorzugsweise in einem großen molaren Überschuß von 20 Mol oder mehr verwendet wird» In ähnlicher Weise kann das Reduktionsmittel in verschiedenen Mengen verwendet werden. Es wird bevorzugt, 2 molare oder größere Mengen Natrium Borhydrid zu verwenden«

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die eine Antivirusaktivität Antltumoraktivltät oder immunosuppressive Aktivität aufweisen, können in der Human- oder Veterinärmedizin entweder aI¹XeIne oder in Form von pharmazeutischen oder Veterinären Zusammensetzungen verwendet werden. Bei der Herstellung solcher Zusammensetzungen kann die Verbindung mit ein oder mehreren bekannten physiologisch unbedenklichen organischen oder anorganischen Hilfsmitteln oder Trägern verwendet werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung von VirusInfektionen, zur Suppression oder Kontrolle von Immunreäktlonen oder Tumoren oder zur Behandlung von anderen Krankheiten, die eine Antivirus-, Antitumor- oder immunosuppresive Therapie erfordern. Dieses Verfahren wird dadurch ausgeführt,, daß die Verbindungen der Erfindung entweder alleine oder In Form von pharmazeutischen oder Veterinären Zusammensetzungen verabreicht werden.

Bei der Behandlung von VirusInfektionen können die erfindungsgemäßen Verbindungen örtlich in einem geeigneten Medium aufgebracht oder durch Injektion als Lösung oder Suspension der Verbindung In einem Isotonischen Medium verabreicht werden.

00 9 825/2054

Bel der Beeinflussung von Immunreaktionen oder bei der Beeinflussung des Wachstums von Tumoren können die erfindungsgemäöen Verbindungen durch Injektion einer Lösung oder Suspension der Verbindung In einem isotonischen Medium, entweder intravenös, subkutan oder direkt in einen Tumor verabreicht Herden» -

Die Herstellungsverfahren und die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindungen sind in den folgenden Beispielen angegeben. Die Beispiele sind nicht in einschränkendem Sinne aufzufassen«

Beispiel 1 , Herstellung von DehvdroheIlotrldin

Bine Lösung von 930 mg Heliotridln in Chlorofona Wurde mit einer Lösung von 1,47 g ChI or anil in 350 al Chloroform behandelt, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei Rauattnperatur stehen gelassen. 40 ml einer gesättigten wässrigen Kaiiuaoarbonatlösung wurden dann unter RUhren zugegeben» worauf sich der Zusatz von 10 g festem Bleicarbonat anschloß. Nach einem 45 Minuten dauernden RUhren wurden die grüne gelatinöse Ausfällung und das unlösliche Bleicarbonat durch Filtration durch Gelite abfiltriert und mit 50 ml frischem Chloroform gewaschen, Die wässrige Schicht des PiItrats wurde abgetrennt und welter mit 4 χ 50 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigte Chloroformlösung wurde dann mit wässrigem Natriumborhydrid (1 g in 50 ml) behandelt und heftig 1 Stunde gerührt. Di· farblose Chloroformsohloht wurde abgetrennt und dia wässrige Phas« wurde mit Kaliumcarbonat gesättigt und mit 4 χ 50 η 1 frischem Chloroform extrahiert. Der vereinigte Chloroformextrakt wurde Über Na₂SOjI gttrooknet und ergab beim Eindampfen ein öl, welches aLoh Ieloht verfestigte. Sublimation (70°cA 0,001 mn) und Kristallisation aus Benzol ergaben 310 mg Dehydroheliotrldin als farblose Platten; Pp 91 - 92°C, α ^ * 27,65° (Äthanol)aOefunden: C, 62,7 %; H, 7*3 %l N, 9,2 $. Der theoretische Wert für CqH₁₁NO₂ ist % C, 62,7 %; H, 7,2 % j H, 9,1 $.

009325/2014

Dehydroheliotrldin zeigt ein Mutterion ra/e 153 im Massenspektrometer und besitzt die folgende NMR-Absorptlon : ein 2-H-Singulett, δ 4,5 (CH₂OH), ein 1-H-MuItiplett, δ 5,10 (CHOH) und zwei 1-H-Dubletten, δ 6,15, 6,50 (J 3 ο/β) (Pyrrolprotonen)*

Beispiel 2

Herstellung von a^-Dlhydro^-a-hydroxy-l-fornorl-SH-pyrrollzln und

pyrrollzln (Pehydroheliotrldln)»

(a) ö^-Dihydro^a-hydroxy-l-fornjyl-SH-pyrroiizln.

Eine Lösung von 0,536 g Heliotrldln in 20 ml Chloroform wurde mit 6 g Mangandioxyd behandelt und das Gemisch wurde ungefähr 6 Stunden, oder bis eine Dünnsöhlohtchrofliatographie (TLG) die Abwesenheit von Ausgangsnaterial anseigfce, gerührt« Dob Reaktionsgemisch wurde dann durch Kieselgu£ filtriert und das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft* Es wurden 0,419 g blasßgelbes öl erhalten, das haupteSohlioh aus 6,7-Diliydro-7a-hydroxy-l-formyl-5H-pyrroliein bestand #b«r tuch kleine Mengen Dehydrohellotridin, den Keto&ldehyd (Ι,Χ-CO, R«CHO) und ringgeöffnete Verbindungen enthielt. Des rohe Produkt kann durch Chromatographie auf einer kurzen neutralen Alutnlniumoxydkoionne gereinigt werden« Die Kolonnentrennung wird durch Portsetzung der Mangandioxydoxydation, hin dir Ketoaldehyd die einzige Ha*uptverunre in igung let, erleichtert, 6,7-Dihydrö-7α-hydroxyl-l-foππyl-5H-pyΓroilIiln ergibt Im Massenspektrometer ein Mutterion ra/e 151 und hat die folgende NMR-Abeorptlon t ein i-H-Slngulett, 6 9,2 (CBO)f ein 1-K-Multiplett, δ 5*4 (CHOH)f und ein 2-H-MuItlpWtt, δ 6,6 (Pyrrolproton«i).

(b) 6,7-Dlhydro-7a-hydroxyl-l-hydroxymethyl-5H-p]rrrollsin (Dehydroheliotrldln)

2,039 g rohee: 6,7-Dlhydro-7a-hydro3cy-l-forne'l-5H-PTrrolisin

00 9 8 26/2&S4

(oben) wurden in ca, 5 ml Wasser suspendiert und ein großer Überschuß Natriuraborhydrld wurde in kleinen Mengen zugegeben. Das Reduktionsgemisch wurde ungefähr 2 Stunden bei Raumtemperatur gehalten, wobei gelegentlich gerührt wurde. Das gelbe öl löste sich langsam auf. Nachdem TLC eine vollständige Reduktion angezeigt hatte, wurde die wässrige Lösung mit Kaliumcarbonat gesättigt und mit Chloroform extrahiert. Der getrocknete (Na₂SO₂.) Extrakt wurde dann zur Trocknet eingedampft und ergab ein nahezu farbloses öl (1,97^ g),welches sich aus DehydroheUotridin (70 #) und einer ringgeöffneten Verbindung (30 #) zusammensetzte- Reiben mit Aceton ergab Dehydroheliotridin in Form eines farblosen Peststoffs (371 mg) mit einem Fp von 89 - 91⁰C. Das im Aceton verbliebene Dehydroheliotridin konnte durch Chromatographie auf alkalischem Aluminiuraoxyd von den Verunreinigungen abgetrennt werden, obwohl dies einem beträchtlichen Verlust mit sich brachte. Die Verunreinigung durch die ringgeöffnete Verbindung konnte verringert werden, wenn" die anfängliche Oxydation mit Heliotridin-N-oxyd. In Methanol ausgeführt 1 wurde, wobei das endgültige rohe Dehydroheliotridin nur 5 bis 10 % Verunreinigungen enthielt. Eine Behandlung des rohen 6,7-Dihydro-7a-hydroxyl-l-formyl-5H-pyrrollzins mit konzentriertem wässrigen Kaliumcarbonat ergab eine Abtrennung der ringgeöffneten Verbindung.

Beispiel 3

Herstellung von 6,7-Dlhydro-l-fomiyl-5H-P!yrrollgln und e^-Dlhydro-l-hydroxymethyl-SH-OTrrollzln (Dehydrosuplnidln)

(a)■ 6,7-Dihydro-l-formyl-5H-pyrrolizin

Eine Suspension von 0,05 g des Adam⁵sohen hydratiaierten Platinoxydkatalysators in 2 ml Wasser wurden reduziert, das Wasser wurde unter Vakuum eingedampft-und der getrocknete Katalysator wurde 30 see der Luft ausgesetzt. Eine Lösung von 1,00 g Supinidin in 10 ml Wasser wurde dem Katalysator zugesetzt,und der Reaktionslcolben wurde augenblicklich evakuiert, mechanisch mehrere Stunderv geschiittelfe und dann 4 Tage stehen

gelassen. Der Katalysator wurde dann abfiltriert und das FiI-trat wurde durch verdünnte Schwefelsäure neutralisiert und mit Chloroform extrahiert, wobei 0,21 g des rohen Aldehyds erhalten wurden. Der Aldehyd wurde gereinigt, indem er durch eine neutrale Aluminiumoxydkolonne hindurehgefUhrt und mit Benzol elulert wurde. Die Benzolfraktion wurde nach dem Eindampfen zur Trockne mit leichtem Petroläther (Kp 40-60°C) extrahiert, die Lösung wurde konzentriert, und der Aldehyd wurde kristallisieren gelassen» Nach weiteren Umkristallisatlonen aus leichtem Petroläther wurden weiße Kristalle mit einem Pp von 59 bis 6O⁰C erhalten. Gefunden : C, 70,71 %l H, 6,83 #j N, 10,27 %... Der theoretische ; Wert fllr CgH₉NO ist·. C, 71,11 ^j H, 6,67 £i N, 10,37 #. 6,7~Dihydro»l-formyl-5H-.pyrrolizidin zeigte im Massenspektrum eine Mutterspitze bei m/e 135· Die Qrundspltze trat bei m/e 134 auf. Eine starke Spitze wurde bei m/e I06 gefunden, entsprechend einem Verlust von CO aus dem m/e 134 Fragmente Das NMR°Spektrura in Deuterochlorofora zeigte ein 1-H-Singulett bei δ 9,76 (Aldehydproton) und ein 2-H-Slngulett bei δ 6,58 (Pyrrolproton), Das Deuterobenzol-HMR-Spketrum zeigte ein 1-H-Singulett bei δ 9,97 (Aldehydproton) und Dubletten bei δ 6,10, 6,65 (J 3 eps) (PyrrolprOtonen).

(b) 6,7-Dihydro-l-hydroxymethyl-5H-pyrrolizin (Dehydroeupinidiß)

Eine wässrige Äthanollösung des wie oben erhaltenen Aldehyds (87.ng, 0,00064 Mol) wurde zu einer wässrigen Lösung von Natriumborhydrid (48 mg, 0,00128 Mol) zugegeben. Die Lösung wurde mechanisch 1 Stunde lang gerührt und dann Über Naoht stehen gelassen. 3 g Kaliumcarbonat wurden dann sugegeben und die Lösung wurde In einem Seheidetrichter mit Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft, wobei der offensichtlich reine Alkohol (76 mg) erhalten wurde» 6,7-Dihydro-l-hydroxy-methyl-5H-pyrrolizin zeigte in seinem Massenspektrum keine Mutter« spitze. Das NMR~Sp@ktrum in Deuterochloroform zeigte ein 1-H-Singulett, welches bei DgO-Austausch verschwand, bei δ 1,59 (Hydroxy!proton) ein 2-H-Singulett bei δ 4,45

00982572β«4

(9-Methylen) und Dubletten bei δ 6,17» 6,51 (J 2,4 ops) (Pyrrolprotonen).

Beispiel 4

Herstellung von 6j7-Dlhydro-7ß-lxvdroxy-l°liYdro:xymethyl-5H-jyrrollzln (Dehydroretronecln)

Die Anwendung des selben Verfahrens wie In Beispiel 1 oben auf 930 . mg Retronecin ergab 600 rag gereinigtes Dehydroretroneolnj Pp 91*5 - 93,5°Cj [a] ²° - 28,4° (Äthanol). Das- NMR-Spektrum und Massenspektruia war mit demjenigen fUr Dehydroheliotridin Identisch. '

Beispiel 5 Tests auf AntlvluraaktivltKt

Als Viren wurden ein DNA-Virus *VI55-Stamra des infektiösen Rinderrhlnotracheitlsvirus (IBR) der sur Herpeiigruppe gehurt, und ein RNA-Viriia, naralloh PZL-Stamm von Ityxovirus paraln fluenza Typ 3 (PZL* Ή*) verwendet. Die beiden Viren wachsen und erzeugen einen eytophatischen Effekt bei Mndernierenzellen (BK) in einer Gewebekultur. "Verdünnungen des Pyrrols wurden mit 10 BK-Rönronen inkubiert. 24 Stunden später wurden 100 TCIDe₀ zugesetzt (aewebekulturlnfektlvdosis 50 % (d.h. 100 rael die Menge Virus, die 50 % einer Anzahl von Oeweberöhröhen infiziert)). De» VI55-Vlrus wurde in 4 Röhrchen eingebracht. PZL wurde in 4 Röhrohen eingebracht, und zwei wurden alsToxizitSbskontrollen zurückgehalten. Nachdem der Virus 6 Tage wachsen gelassen wurde, wurden Repiikatruhrbhen angesetzt, 10-faoh Verdünnungen wurden vorgenonnen um die Ausbeute an lnfektlven Virus zu titrieren. Bei diesem Verfahren 1st das Titrationsergebnis genau dasjenige des Ruhrohens alt des) höchsten Titer.

009825/20S4

Prüfergebnisse Verbindung

Dehydroheliotrldin Dehydroretroneoin Dehydrosuplnidin

Konzentration Verringerung	ausbeute(log	der Virus
(^g/ml)	IBR	TCID )
	6,5	PI3
100	4,5	1,0
50	4,0	1,0
25	1.5	0,5
12,5	1,5	0
6,25	5.25	0
100	2,75	0,6
33.3	1,0	0,1
11,1	" 0,25	0
3,7	0	-0,15
1.2		0,1
ο	(gegenüber Zellen
100	• toxisch)
	6,0
50	kein Ergebnis	5,0
25	5,0	4,25
12,5	0,4	1,5
6,25	-0,1

(Ähnliche Resultate wurden mit Dehydroheliotridln erhalten, wenn die Verbindung gleichzeitig mit dem Virus oder 2k Stunden nach dem Virus zugesetzt wurde. Die Zugabe von Dehydroheliotridin 72 Stunden nach dem Virus ergab eine Verringerung

der Ausbeute des IBR-Virue von 3.5 logjn ^TCID5o* ^w°8^egen die Ausbeute an PI,-Vlrue nloht beeinflußt wurde).

Bei einem anderen Versuch wurde gezeigt, daß Dehydroheliotridln den IBR-Virus inaktiviert wenn.er mit dem Virus in Abwesenheit von Gastzellen bei einer Konzentration von 84 |ig/nl bei 37°C inkubiert wurde» dies war jedoch bei 4°C ηloht der Pail.

9825/2054

Konzentration μg/ml Verringerung des Vlrustlters

57° 40

	333	6,3	(EA)	1,1
	166	6,3	0,6
	84	6,3	0,6
	42	2,8'	0,6
	0	O	0
		Beispiel 6
Tösts	auf Antituraoraktivltät
(O	Ehrlich ascites

(a) Eine Gruppe von 6 5-Wochen alten Mäusen wurde Ip.mit

1 ml einer Lösung injiziert, die 1000 oder 10000 EA-Zellen und 100 (ig Testverbindung enthielt. Die Vergleichstiere enthielten EA=ZeIlen ohne die Verbindung. Nach 2, 4 und 8 Wochen nach der Impfung wurden Beobachtungen gemacht, um die Tumorentwieklung zu bestimmen ο Bei den Vergleichstieren waren nach 2 Wochen Tumore vorhandene

Verbindung Intervall zwischen dem Mäuse mit

Mischen der EA-ZeIlen Tümorentw; V

mit der Verbindung und wicklung der Impfung (st)

Dehydroheliotridln 0 5/6

1 2/6

3 0/6

Dehydroretronecin -2 0/4

Dehydrosupinidin 3 0/6

(b) Eine Gruppe von 6 5-Wochen alten Mäusen wurde 1.ρ. mit 1 ml eines Mediums injiziert, das 1000 EA-ZeIlon enthielt ο Nach 24 Stunden wurde den Mäusen 72 rag/kg Dehydroheliotridin verabreicht, worauf sich während der nächsten drei Tage weitere Dosen von 57 rag/kg anschlössen. Vergleichstieren, denen eine Kochsalzlösung verabreicht wurde, entwickelten bei 5 aus 6 innerhalb eines Monats Tumore. Bei den behandelten Mäusen entwickelten sich keine Tumore.

00982S/20S4

- 13 -

(ο) Ih einem weiteren Versuch wurde eine einzige Dosis von Dehydroheliotridin (100 mg/kg» < 1/2 1^)₅₀) ^fin Gruppen von 6 5-Wochen alten Mäusen in verschiedenen Zeitabständen naoh der Verabreichung der Tumorzellen (10000 Zellen ) verabreicht.

Tage nach d. Verabreichung Mäuse mit Tumorent>-von Tumorzellen wicklung nach 1 Monat

0 - _ 0/6

3 0/6

6 0/6

• (Vergleich) 5/6

(ü) Lympholdleukämie L-1210I lymphocytiaone Lftufeifesle P-388 und KB-Zellenkultur

Diese Resultate wurden nach den Angaben und gaaäS dem Protokoll von*The Cancer- Chemotherapy National Service Center« Bethesda, Maryland, USA" (Cancer Chemotherapy Reports 1962, Nr. 25) gemessen.

PUr die Leukämie L-1210 und P-388 ist die Aktivität als Erhöhung der Überlebenszelt ausgedrückt. Eine Testverbindung ist aktiv, wenn die prozentuale Uberlebenszelt } 125 ist·

Verbindung Dosis prozentuale Überlebenszeit

(mg/kg) L-1210 P-388

Dehydroheliotridin 200 75 - .

100 121 . 85

50 153 133

25 143 U7

Die KB-Zellenkulturresultate sind als SDe₀ ausgedruckte, ist die Konzentration, bei der das Zellenwaehstuai gegenüber den Vergleiohsproben um 50 Jf verringert ist. Sine nennenswerte Aktivität liagt vor, wenn ED₅₀ < 1 ist.

003625/2054

EDg₀ (pg/ml)

Dehydroheliotridin 19

Dehydrosupinidin 1#9

6,7-Dihydro-7-hydroxy-5H-pyrrolizin 22

6,7-Dlhydro-l-foriqyl-5H-pyrrolizin > 100 (inaktiv)

Dehydroretronecin (nicht getestet)

Beispiel 7 Tests auf Immunosuppresslve Aktivität

Das in diesem Beispiel verwendete Verfahren war eine Abwandlung der Jerne Plaque Assay (Cunningham, A.J. und Pzenberg, Ä., Immunologie 1968, 14, 599)* wobei rote Sohafezeilen als Antigen verwendet wurden. 100 mg/kg Dehydroheliotridin wurden vor, gleichzeitig und nach dem Antigen verabreicht. Zählungen der Plaque Forming Ceils (FFC) (geometrisches MIttel aus 6 Mäusen)wurd· 5 Tage nach der Antigenverabreichung gemacht. .

Zeit d. Verabreichung von PFC/Mllz PFC/10 Milszell«n Dehydroheliotridin ______

92

24 st vor d. Antigen	6,607
gleichzeitig mit dem
Antigen	19*720
24 st nach d. Antigen	548,300
Vergleich, keine
Behandlung	338,100

8588

PATBHTANSFRfJCHB

009825/2054

Claims (1)

1. PAT E NTA NSPR U CH E

   1. Verbindungen der allgemeinen Formel I

   worin X eine Methylengruppe C-CHg-)* eine a-Hydroxy-

   . . . H^ JOH methylengruppe ( -^v $» eine B-Hydroxymethylengruppe

   H_n ^H ft

   ( /<\ , ) oder eine Carboxylgruppe ( - C - ) darstellt

   und R eine Hydroxymethylgruppe (-CHgOH) öder «ine Foray I-gruppe C-CH-O) darstellt,

   2. Verbindungen der allgemeinen Formel X» dadurch gekennzeichnet, das X. ein® Methylengruppe («CSig-), eine

   H^ JDH

   a-Hydroxymethylengruppe ( €/" ) odtr «in« i-

   H 0H ^/

   H_% ^ methylengruppe ( ^C^ ) darstellt« m& äef R

   Hydroxymethy!gruppe f-CHgOH) darstellt, 3 · 6,7-Dibydro-

   5» e^

   6. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen naon einen der AnsprUohe 1 bis 5, dadurch gekennaelohnst, da· sea sins Verbindung der allgemeinen Formel II -

   00 9825/2064 " "

   BAD ORIGINAL

   1840551

   ιβ - ,;"■.■. ■ .. ■■■■■■"

   oder das N-Öxyd derselben, worin X eine Methylengruppe (-

   α-Hydroxymethylengruppe ( C" 5 oder S-Hydroxymethylen-

   gruppe ( ^C-) darstellt und R eine Hydroxynethy!gruppe C-CH OH) darstellt oxydiert und daß man, wenn es erwünscht 1st, eine Verbindung herzustellen, in der X α- oder ß-Hydroxy- »ethylen, darstellt und/oder R Hydroxy«ethyl darstellt, das oxydationsprodukt reduziert.

   7* Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dag die Oxydation mit einem Dehydrierungskatalysator oder Oxydationsmittel unter milden Bedingungen ausgeführt wird.

   8. Verfahren nach Anspruch 7* dadurch gekennzeichnet» das als Oxydationsmittel Mangandioxyd ,Kaliumpermanganat, Silberoxyd, ChIorani1, Ninhydrin oder Queokeilber(II)-acetat verwendet wird. ·

   9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, da β die Reduktion mit einem Alkalimetall» borohydrid ausgeführt wird.

   ΙΟ« Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Alkalimetallborhydrid Natriumborhydrid ist.

   11» Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Ansprefe 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel II

   II

   worinXeine Methylengruppe (-CH₂-), a-Hydroxymethylengruppe

   H. ^.0H H^ JQH

   C ^<y" ) oder B-^droxymethylen ( ^SC^ ) darstellt,

   und R eine Hydroxytisfehylgruppe (-CHgOH) darstellt, mit Chlora« Mangandioxyd oder Adärn^uschem Platinoxydkatalysator oxydiert

   00 98 2 5/2QSi __Α ■ ■ ·

   BAD ORIGINAL

   redu-

   @i©r
   8 da§ sie eins in I tola

   ent«

   Erfahren
   oder

   einem der

   vc»n Vipuaisif@!gtl«@B
   von Iwmmvmktlmm

   dl·« Wache« bis §

   Susasnen·

   -INQ.KMN« DJPL-INS-S-STAEGi*

   009ia§/IC|S4 BAD