DE1928428C

DE1928428C - Verfahren zur Herstellung eines Arzneipräparates mit inhibierender Wirkung gegenüber der Abnahme der DNP-ATPase und der Schwellung von Gehirnzellen

Info

Publication number: DE1928428C
Authority: DE
Inventors: Shpzo Prof. Tokio Ishii
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication date: 1971-11-25

Description

IO

Bei der Untersuchung der Schwellung von Gehirnzellen wurde festgestellt, daß der Adenosintriphosphatase-Spiegel von Gehirnmitochondrien rasch parallel zu der Funktion verletzter Gehirnzellen abnimmt, wobei Schwellung der Gehirnmitochondrien und des Gehirngewebes auftritt (vgl. Head Injury, Conference Proceedings, herausgegeben von W. F. Cayeness und A. E. Walker, Verlag I, B. Lippincott Company, Philadelphia und Toronto, 1966).

Die Beziehung zwischen der Funktion der Gehirnmitochondrien und der Schwellung von Gehirnzellen wurde untersucht, und es ergab sich, daß ein Extrakt aus Mitochondrien von frischen, tierischen Gehirnzellen spezifisch die Abnahme der dinitrophenol-ab- |₅ hängigen Adenosintriphosphatase-Aktivität (im folgenden kurz als DNP-ATPase bezeichnet) und die Schwellung der Mitochondrien hemmt. Die Erfindung beruht auf diesem Befund.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneipräparates mit inhibierender Wirkung gegenüber der Abnahme der DNP-ATPase und der Schwellung von Gehirnzellen, das dadurch gekennzeichnet ist. daß man

a) eine frische, homogenisierte, tierische Gehirnsuspension 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert (überstand A und Gehirnivste),

b) den mitochondrienhaltigen überstand (A) IO Minuten bei 20000 g zentrifugiert (überstand [B] und Mitochondrien),

c) die erhalten-η Mitochondrien in einem Suspensionsmedium suspendiert, die Suspension zur Zerstörung der Mitochondücn einfriert und auftaut und die Suspension de zerstörten Mitochondrien zur Entfernung der Milochondrienreste I Stunde bei 50000 g zentrifugiert (überstand [C] und Mitochondricnreste),

d) den überstand (B) 2 Stunden bei 50000 g zentrifugiert (Überstand [D]).

e) die erhaltenen überstände (C) und (D) vereinigl, mit wenig Albumin versetzt und die erhaltene Lösung 24 Stunden bei 0 bis 4 C gegen 0,25 M Mannit 0,5 mM Phosphatpufferlösung pH 7,4 dialysiert und das Diffusat in bekannter Weise lyophilisiert und konfektioniert.

Verabreicht man einem Tier. z. B. einer Katze, mil: experimentell erzeugtem zerebralem ödem das erfindungsgemäß hergestellte Präparat intravenös in die Arteria comunis, so kehren die wegen des Ödems vor·

45 wiegend auf der komprimierten Seile auftretenden abnorm hohen und langsamen EEG-Frequenzen auf normale Werte zurück. Vorher war das Tier benommen oder lag im Halbkoma, und es zeigte entweder keine oder nur eine verzögerte Reaktion auf Schmerzreiz. Etwa 15 Minuten nach der injektion bewegte sich das Tier spontan und zeigte eine rasche Reaktion auf Schmerzreize oder Lnutreize. Einige Tiere konnten einige Meter laufen, während sie vor der Injektion nicht stehen konnten. Diese Tatsache zeigt, daß das Präparat eine erheblich bessernde Wirkung bei Störungen von Gehirnschwellungen hat.

Im folgenden wird das bevorzugte Verfahren zur Gewinnung des Präparats der Erfindung beschrieben.

Vorzugsweise wird das Gehirn, z. B. von Ratten, Katzen, Hunden, Schafen oder Rindern, dem Tier sofort nach dem Töten rasch entnommen. Nach einem bekannten Verfahren werden die Mitochondrien daiaus gewonnen. Zum Beispiel wird das Gehirn innerhalb von 10 bis 15 Sekunden in eine Lösung von Mannit und Äthylendiamintetraessigsäure, im folgenden Mannit-EDTA-Lösung genannt, gebracht, deren pH-Wert mit Kaliumhydroxydlösung auf 7,4 eingestellt wurde. Bei wesentlich längeren Zeiten erhält man schlechte Ergebnisse, da sich dadurch nicht nur der aktive Faktor zersetzt, sondern auch viel Fettsäure gebildet wird, die die DNP-ATPase-Aktivität hemmt.

Das Tiergehirii wird in das 5- bis lOfache Volumen einer Mannit-EDTA-Lösung gebracht, die Suspension wird homogenisiert und 10 Minuten bei 2000 g zentrifugiert. Nach der Entfernung des Niederschlags wird der überstand (A) noch einmal bei 20000 g zentrifugiert, wodurch man die ausgefällten Mitochondrien und den überstand (B) erhält.

Die so erhaltenen Mitochondrien werden in einem geeigneten Medium suspendiert, eingefroren und aufgetaut. Dann wird die Suspension 1 Stunde bei 50(XK) g zentrifugiert und man erhält den überstand (C).

Der überstand (B) wird 2 Stunden bei 50000 g zentrifugiert, wodurch man den überstand (D) erhält.

Die überstände (C) und (D) werden vereinigt und mit wäßriger Albuminlösung bis zu einer Konzentration von z. B. I % versetzt. Dann wird die Lösung in Dialysierschläuche abgefüllt und gegen einen 5millimolaren PhosphatpufTer. der O,25molar an Mannit ist. vom pH-Wert 7,4 24 Stunden bei 0 bis 4 C dialysiert. Der aktive Faktor befindet sich im Diffusat. Die einzelnen Stufen sind im folgenden schematisch wiedergegeben.

Gehirn

I
Homogenat

Zentrifugation in einem Suspensionsmedium. 2000 g, 10 M'nuten

Niederschlag

[überstand (A)]

Zentfifogation, 20000 g, 10 Minuten

Niederschlag (Milochondrien)

Obentand (B)

Fortsetzung

Einfrieren, Auftauen, Zentrifugat;on in einem Suspensionsmedium, 50000g, !Stunde

Niederschlag

Zentrifugsition, 50000 g, 2 Stunden

überstand (C)

Niederschlag

überstand (D)

Dialyse

Diffusat

Die Aktivität wird höher, wenn man die überstünde (C) und (D) vereinigt. Man erhält ein besseres rrii parat durch Zugabe von Albumii. zu den überstanden, da dadurch ein Vermischen Jer im Verlauf des Verfahrens in geringen Mengen gebildeten Fettsäuren, die die DNP-ATPase hemmen, mit dem gewünschten Präparat verhindert wird.

Das erhaltene Diffusat (Außenflüssigkeit) mit dem aktiven Faktor wird zur Haltbarmachung des Präparates lyophilisiert. Das iyophilisierte Präparat wird zur Injektion mit Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Sofort nach dem Abtrennen des Kopfes einer Ratte wurde die Hirnhälfte entnommen und in das 5fachc Volum η einer kalten Mannit-EDTA-Lösung((),3molar Mannit und Ü.Olmi'llimolar Äthylendiamintetraessigsäure. pH-Wert 7,4) gebracht. Der Vorgang dauerte etwa K) Sekunden. Dann wurde das Gehirn mit einem Potter-Elvenhjcm-Homogenisator mäßig homogenisiert. Das Homogcnisat wurde zunächst 10 Minuten nei 2000 g zentrifugiert und anschließend der überstand weitere 10 Minuten bei 20(XX) g zentrifugiert, wodurch man einen überstand und die Mitochondrien als Niederschlag erhielt. Die Mitochondrien wurden gleichmäßig in 10 ml kalter Mannit-EDTA-Lösung suspendiert, und die Suspension wurde in einer Tiefkühltruhe bei -20 C eingefroren. Nach dem Auftauen bei Raumtemperatur wurde die Suspension 1 Stunde unter Kühlen bei 5000(1 g zentrifugiert. Hierbei erhielt man den überstand (C).

Der Überstand (B) wurde 2 Stunden bei 50000 g zentrifugiert. Man erhielt den überstand (D).

Die vereinigten überstände (C) und (D) wurden mit 1% Albumin versetzt. Das Gemisch wurde gegen einen Smillimolaren Phosphatpuffer, der 0,25molar an Mannit war, 24 Stunden dialystert. In 90 ml Dialysebad war die Substanz mit der bessernden und vor* beugenden Wirkung bei Störung der Gehirnfunktion enthalten.

Beispiel 2

bessernder und vorbeugender Wirkung bei Gehirnfunktionsstörungen.

Experiment '

Eine Katze wurde mit Phenobarbital-Natrium flach nnästhetisiert, und der Kopf wurde rechts parietal trepanisiert. Ein kleiner, mit einem Polyäthylenschlauch verbundener Gummiballon wurde in den Epiduralraum gebracht, und an beiden Schläfen wurden EEG-Elektroden angebracht. Zur Aufzeichnung der Rindenströn-e auf beiden Seiten wurden unipolare Elektroden verwendet, und die indifferente Elektrode wurde an der Stirn angebracht. Der Polyäthylenschlauch und die Elektroden wurden mit Zahnzement befestigt.
Nach dem Abklingen der EEG-Abnormalitü'cn nach Beendigung der Anästhesie wurde der Ballon durch anteilsweisc Zugabe von 0,2 ml physiologischer Kochsalzlösung aufgebläht. Zum Zehpunkt der Kompression treten hochamplitudige langsame Wellen sowie spindelförmige Entladungen zuerst auf der komprimierten Seite auf. Sobald langsame Wellen auf der Gegenseite auftraten, wurde die Zufuhr der physiologischen Kochsalzlösung beendet und der Polyäthylenschlauch verschlossen. Der Druck auf das Gehirn wurde 24 Stunden lang aufrechterhalten.

Dann wurde die physiologische Kochsalzlösung und der Ballon entfernt und 3 Stunden lang weiter beobachtet. Wenn man feststellte, daß der Allgemeinzustand der Katze wieder normaler wurde, aber die Bewußtseinslage noch nicht wiederhergestellt war (sublethaler Zustand), wurden 2 ml des Präparates der Erfindung mit dem wirksamen Bestandteil aus 3 bis 7 g Gehirn intravenös injiziert, worauf die Elektroenzephalogramme 30 und 40 Minuten nach der Injektion aufgenommen wurden. 60 Minuten nach der ersten Injektion wird nochmals die gleiche Menge injizier., und 5, 10 und 20 Minuten nach dies:r Injektion werden die Elektroenzephalogramme aufgenommen.
In der Zeichnung sind die Elektroenzephalogramme

wiedergegeben. Die oberen Elektroenzephalogramme geben die Rindenströme der Seite wieder, an der das experimentelle ödem erzeugt wurde.

Ein Schaf wurde sofort nach dem Töten an der Schlafe trepaniert, und das Oehirngewebe wurde her· 6$ ausgesaugt. Das erhaltene Gewebe wurde auf die gleiche Weise wie im Beispiel I suspendiert und auf-Bearbeitet. Man erhielt ein inji/ierba-ies Präparat mit

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung eines Arzneipräpa* rates mit inhibierender Wirkung gegenüber der Abnahme der DNP-ATPase und der Schwellung

1 928 4128

on Gehirnzellen, dadurch gekenn/cichict. daß man

(a) eine frische« homogenisierte, tierische Gehirnsuspension IO Minuten bei 2000 g zentrifugiert (überstand A und Gehirnreste),

(b) den mitochondrienhaltigen überstand (A) 10 Minuten bei 20000 g zentrifugiert (Überstand [B] und Mitochondrien),

(C) die erhaltenen Mitoehondfien in einem Suspensionsmedium suspendiert, die Suspension zur Zerstörung der Mitochondrien einfriert und auftaut und die Suspension der zerstörten

Mitochondrien zur Entfernung der Mitochondrienresle I Stunde bei 50(KX) g zentrifugiert (überstand [C] und Mitoehondrienreste).

(d) den überstand (B) 2 Stunden bei 50000 g zentrifugiert (überstand [D]),

(e) die erhaltenen überstände (C) und (D) vereinigt, mit wenig Albumin versetzt und die erhaltene Lösung 24 Stunden bei 0 bis 4" C gegen 0,25 M Mannit—0,5 m M Phosphatpulterlösung pH 7,4 dialysiert und das DiITusat in bekannter Weise lyophylisieri und konfektioniert.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

1922