DE1518109B1 - Verfahren zur Herstellung des neuen Nonapeptid-Derivats N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophan-hydrazid - Google Patents

Description

Die aus Polypeptiden aufgebauten Hormone spielen bekanntlich sehr wichtige Rollen in den biologischen Prozessen der lebendigen Organismen; die aus Naturstoffen isolierten derartigen Hormone finden auch in der Therapie verbreitete Anwendung. Da die aus Naturstoffen herstellbaren derartigen Produkte in ziemlich beschränkten Mengen zugänglich sind, werden die verschiedenen präparativen Methoden der sich in der letzten Zeit rasch entwickelnden Peptidchemie in steigendem Maße zur Totalsynthese solcher Hormone angewendet. Die synthetischen Produkte sind auch deshalb vorteilhafter, weil sie zufolge ihrer größeren Reinheit in minderem Maß ungewünschte Nebenwirkungen zeigen.

Beim synthetischen Aufbau der solche Hormonwirkungen zeigenden Polypeptide sind vor allem diejenigen, etwa aus 7 bis 12 Aminosäureeinheiten aufgebauten Peptide von Bedeutung, welche als Bausteine zur weiteren Ausbildung der den Naturprodukten entsprechenden, aus 25 bis 30 Einheiten aufgebauten, komplizierten und synthetisch nur sehr schwierig erhältlichen Polypeptidprodukte verwendet werden können und gegebenenfalls auch selbst gewisse

ίο Hormonwirkungen ausüben können.

Besonders vorteilhafte Eigenschaften kommen aus diesen Gesichtspunkten dem neuen, in der Literatur bisher nicht beschriebenen Nonapeptid der nachstehenden schematischen Formel (I) zu:

Z — Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His — Phe — Arg — Try — NHNH₂

In der obigen Formel sowie in der weiteren Folge dieser Beschreibung werden die in der Peptidchemie üblichen Abkürzungen und Bezeichnungen verwendet :

Ser = L-Serinrest
Tyr = L-Tyrosinrest Met = L-Metioninrest GIu = L-Glutaminsäurerest His = L-Histidinrest Phe = L-Phenylalaninrest Arg = L-Argininrest Try = L-Trypsinrest

Z = Carbobenzyloxygruppe CiH₅ · CHs · COO —

OBz = Benzyloxygruppe GiH₅ · CH- · O —

OMe = Methoxygruppe CH_;iO OR = Alkoxygruppe

15

40

45

55

Die obige Verbindung der Formel (I), das N-Carbobenzyloxy -l - seryl -L- tyrosyl - L - seryl - L - methionyl - a -1. - glutamyl - l - histidyl -L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophan-hydrazid, ist ein Nonapeptid, in welchem die Reihenfolge der Aminosäureeinheiten dieselbe ist wie bei den Corticotropinen (ACTH-Polypeptiden) sowie bei den Aminosäuren 1 bis 9 des a-melanophor-slimulierenden Hormons (>5 der Schweine; die Sequenz der Aminosäuren 4 bis 9 des neuen Nonapeptids ist dabei identisch mit jener der Aminosäuren 7 bis 12 des /i-melanophor-stimulierenden Hormons der Rinder. Das erfindungsgemäße neue Polypeptid enthält ferner Strukturteile, die mit solchen der natürlichen Polypeptide mit CRF-Wirkung (Corticotropine Releasing Factor) gleichartig aufgebaut sind. Auf Grund dieser Eigenschaften kann das neue Nonapeptid der Formel (I) eine Schlüsselrolle bei der Totalsynthese von biologisch hochaktiven Polypeptiden spielen, und zwar um so mehr, als die Hydrazid-Endgruppe des neuen Polypeptids leicht in eine Azidgruppe übergeführt werden kann, welche dann zu weiteren Kupplungen fähig ist, während die Amino-Endgruppe schon von vornherein gegen unerwünschte weitere Reaktionen geschützt ist, gewünschtenfalls kann aber die schützende Gruppe leicht entfernt werden.

Das neue Nonapeptidderivat N-Carbobenzyloxy-L - seryl - L - tyrosyl - L - seryl - L - methionyl - L - glutamyl - L - histidyl - l - phenylalanyl - L - arginyl - l - tryptophan-hydrazid wird erfmdungsgemäß derart hergestellt, daß man N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid in Anwesenheit von Dimethylformamid als Lösungsmittel in an sich bekannter Weise in das entsprechende Azid überführt, die erhaltene Reaktionslösung, ohne das darin enthaltene Wasser durch Trocknen zu entfernen, unmittelbar mit einem L-Glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin-alkylester umsetzt, danach den erhaltenen N-geschützten Heptapeptidester in an sich bekannter Weise in das entsprechende Hydrazid und dieses in an sich bekannter Weise in Gegenwart von Dimethylformamid als Lösungsmittel in das entsprechende N - Carbobenzyloxy - L - seryl - L - tyrosyl - L - seryl-L - methionyl - L - glutamyl - L - histidyl - L - phenylalanin - azid überführt, die enthaltene Reaktionslösung, ohne das darin enthaltene Wasser durch Trocknen zu entfernen, unmittelbar mit einem L-Arginyl-L-tryptophan-alkylester umsetzt und den erhaltenen N-Carbobenzylaoxy-nonapeptid-alkylester in an sich bekannter Weise in das entsprechende Hydrazid überführt.

Es wurde schon ein Verfahren zur Herstellung von ähnlichen Peptiden durch Kupplung eines in Dimethylformamid hergestellten Azids in demselben Reaktionsgemisch mit einem aktiven Ester der

anderen Komponente beschrieben (HeIv. Chim. Acta, 41, S. 1866 [1958]). Nach dieser Methode wjrd die Kupplung eines Azids mit einem Ester (welche zwar von den Reaktionskomponenten gemäß Erfindung verschieden sind, doch ist die Reaktion analog) zwar ebenfalls in Dimethylformamid und ohne Zwischenisolierung des Azids durchgeführt, jedoch der Wassergehalt der Azidlösung vor Zugabe der Base mit wasserfreiem Natriumsulfat entfernt und somit die Reaktion in wasserfreiem Medium durchgeführt. Nach dem Verfahren gemäß Erfindung wird dagegen das in Form von 6 η-Salzsäure dem Reaktionsgemisch zugesetzte Wasser nicht entfernt und infolgedessen die Reaktion in einem aus wäßrigem Dimethylformamid bestehenden Medium durchgeführt. Dieser Verfahrensunterschied bringt wesentliche Vorteile mit sich, was die in den vorliegenden Beispielen angegebenen hohen Ausbeuten (66 bis 76¹Vo) deutlich macht.

Beispiel 1 (Spalte9): 73%,.
Beispiel 3 (Spalte9): 66%,
Beispiel 11, a) (SpalteO): 76%,
Beispiel 11, c) (Spalte 13): 76%.

Diese Überlegenheit wird noch deutlicher, wenn man in Betracht zieht, daß das Verfahren gemäß Erfindung schon an sich ein reines Produkt liefert, das z. B. nicht mehr getrocknet werden muß, so daß die beim Trocknen des wärmeempfindlichen Azids ίο sonst unumgänglichen Verluste vermieden werden, wodurch ebenfalls eine höhere Ausbeute und eine erhebliche Material- und Zeitersparnis erzielt werden. Die Totalsynthese des in den Endgruppen geschützten neuen Nonapeptids der Formel (1) erfolgt in den nachstehend schematisch dargestellten Schritten, die sowohl die hier nicht beanspruchte Herstellung der Ausgangsmaterialien A, B und C als auch deren anschließende Kondensation nach dem Verfahren der Erfindung veranschaulichen:

Ser Tyr-Ser Met-

GIu —
His —
Phe —

Arg 1

Try '

Ser — Tyr — Ser — Met — GIu — His — Phe - Arg — Try

. Aus dieser schematischen Darstellung des Synthesegangs ist es ersichtlich, daß das Prinzip des Aufbaus dieser neuen Verbindung weitgehend von der Aufbauweise der aus der Literatur bekannten, ähnliche Aminosäuresequenzen enthaltenden höheren Polypeptiden abweicht (vgl. R. A. Boissonnas,. St. Guttmann, Waller, P. A. JTaquenoud: Experientia, 12, S. 446 [1956]; C. H. L i, J. Me L-enhofer, E. Schnabel, D.Chung, T. L o, J. Ram a-Chandra-n: J, Am. Chem. Soc 82, S. 5760 [I960]; R. Schwyzer, W. Rittel, H. Kappeier, B, I s e 1 i η : Angew. Chem., 72, S. 915 [1960]; K. H ο fm a η η , M. E. W ο ο 1 η e r, H.-Yajirna, G. Spühler, T. A. Thompson, E. T. Schwartz: J. Am. Chem. Soc, 80, S. 6458 [1958]).

Es sind also zur erfindungsgemäßen Totalsynthese des neuen Nonapeptid^Derivats der Formel (I) die folgenden Operationen erforderlich, wobei die Stufen a) bis c) die hier nicht beanspruchte Herstellung der Ausgangsstoffe, die Stufen d) und e) das Verfahren der Erfindung erläutern: :

a) Herstellung eines die Aminosäuren 1 bis 4 enthaltenden, an der freien Aminogruppe geschützten Tetrapeptid-hydrazids;

b) Herstellung eines die Aminosäuren 5 bis 7 enthaltenden Tripeptidesters;

c) Herstellung eines die Aminosäuren 8 und 9 enthaltenden Dipeptidesters;

d) Kondensation des geschützten Tetrapeptidhydrazids 1 bis 4 mit dem Tripeptidester 5 bis 7 und

überführung des entstandenen geschützten Heptapeptidesters 1 bis 7 in das Hydrazid;

e) Kondensation des geschützten Heptapeptidhydrazids mit dem Dipeptidester 8 und 9 und überführung des entstandenen geschützten Nonapeptidesters 1 bis 9 in das Hydrazid.

55

Der Gang dieser Synthesenschritte wird schematisch durch die nachstehende Tabelle veranschaulicht; die waagerechte Verbindungslinie zwischen den angegebenen jeweiligen Endgruppen vertritt den Rest diejeniger Aminosäure bzw. der Kette von denjenigen Aminosäuren, welche über den diese waagerechte Verbindungslinie kreuzenden senkrechten Lifts rtien stehen. '.

Das Verfahren der Erfindung beginnt mit dem Schritt von I nach J, während die Stufen A bis I erläutern, wie die Ausgangsstoffe zugänglich sind.

CD

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I

Die einzelnen Schritte der obigen Synthesefolge können in folgender Weise durchgeführt werden (die nach den Struktursymbolen der einzelnen Peptide stehenden Buchstaben und Ziffern weisen auf die entsprechenden Zeilen bzw. Kolonnen der obigen Tabelle hin):

a) Herstellung des geschützten Tetrapeptid-

hydrazids Z — Ser — Tyr — Ser — Met — NHNH₂

(I 1-4) (Ausgangsmaterial)

Das durch eine Carbobenzoxygruppe geschützte L-Serin-hydrazid (D 1) (vgl.. J. S. F r u t ο η , J. Biol. Chem., 146, S. 463 [1942]) wird in das entsprechende Azid übergeführt, und mit diesem Azid wird ein L-Tyrosin-alkylester (C 2) acyliert, welcher unmittelbar vor dieser Reaktion aus einem Estersalz freigesetzt wurde. Der auf diese Weise erhaltene Dipeptidester Z — Ser — Tyr — OR (E 1-2) wird dann in das Hydrazid (F 1-2) übergeführt.

In ähnlicher Weise wird der Dipeptidester H — Ser — Met — OR (G 3-4) hergestellt, durch Umsetzen des aus dem Hydrazid Z— Ser — NHNH₂ (D 3) hergestelltenAzids mit dem Ester H—Met—OR (C 2) und nachfolgendes Entfernen der Gruppe Z.

Die Dipeptidderivate Z —Ser —Tyr —NHNHo (F 1-2) und H — Ser — Met — OR (G 3-4) werden dann mit Hilfe der Azidmethpde kondensiert, und der erhaltene Tetrapeptidester

Z — Ser — Tyr — Ser — Met — OR

(H 1-4) wird zuletzt in das entsprechende Hydrazid (I 1-4) übergeführt.

b) Herstellung des Tripeptidesters
H — GIu — His — Phe — OR

'—OH

(I 5-7) (Ausgangsmaterial)

Das Hydrazid Ζ — His — NHNH₂ (D 6) wird in das Azid übergeführt, mit diesem wird dann ein Phenyl-alanin-alkylester (C 7) acyliert, und vom erhaltenen geschützten Ester Z — His — Phe — OR (E 6-7) wird die Acyl-Schutzgruppe der terminalen Aminogruppe entfernt.

Der aus einem Salz frisch freigesetzte Dipeptidester H — His — Phe — OR (G 6-7) wird mit Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-y-benzylester (G 5) acyliert, vom erhaltenen geschützten Tripeptidester

Z — GIu — His — Phe — Or

j 5 (H 5-7) werden die Schutzgruppen Z und Bz entfernt, und auf diese Weise wird der zur weiteren Kondensation geeignete Tripeptidester

H — GIu — His — Phe — OR

OH

(I 5-7) gewonnen.

3°

35

c) Herstellung des Dipeptidesters
H—Arg —Try —OR (H 8-9) (Ausgangsmaterial)

N-a-Carbobenzyloxy-L-arginin (B 8) wird mit einem Trypsin-alkylester H — Try — OR (C 9) kondensiert, vom erhaltenen Dipeptidester

Z —Arg —Try —OR

(D 8-9) wird die Alkylestergruppe durch alkalisches Verseifen entfernt, dann wird auch die Carbobenzyloxygruppe abgespalten und derart das freie Dipeptid H — Arg — Try — OH (F 8-9) erhalten. Dieses wird dann in das entsprechende Alkylestersalz übergeführt und die freie H — Arg — Try — OR-(H 8-9)-Base freigesetzt.

d) Herstellung des geschützten Heptapeptid-Hydrazids Z — Scr — Tyr — Ser — Met — GIu — His — Phe — NHNH₂

1—OH (K 1-7) (Verfahren der Erfindung)

Das unter a) -erhaltene Hydrazid -Z — Ser — Tyr — Ser —Met—NHNH₂ (I 1-4) wird in das Amid übergeführt und mit dem unter b) erhaltenen Tripeptidester

H — GIu — His — Phe — OR

(I 5-7) umgesetzt. Der erhaltene Heptapeptidester (J 1-7) wird in das entsprechende Heptapeptid-hydrazid (K 1-7) übergeführt.

e) Herstellung, des Nonapeptid-hydrazids Z — Ser — Tyr — Scr — Met — GIu — His — Phe — Arg — Try — NHNH₂

(M 1-9) (Verfahren der Erfindung)

Das unter d) erhaltene Heptapeptid-hydrazid (K 1-7) wird in das entsprechende Azid übergeführt und mit dem Dipeptidester H — Arg — Try —OR (H 8-9) kondensiert, dann wird der erhaltene rohe Nonapeptidester (L 1-9) unmittelbar in das entsprechende Hydrazid (M 1-9) übergeführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachfolgenden Beispiele näher veranschaulicht. Die in den Beispielen angegebenen Schmelzpunkte wurden durch die Kapillarmethode bestimmt, die angegebenen Werte sind unkorrigiert. Die R_t-Werte wurden an Whatman-Nr. 1-Papier durch aufsteigende

909 546/92

10

Chromatographie bestimmt. Die dabei angewendeten Lösungsmittelsysteme sind durch in Klammern gesetzte Ziffern angegeben: (1) n-Butanol—Eisessig— Wasser 4:1:1; (2) Methyläthylketon—Pyridin— Wasser 65 : 15 : 20. Es wurden stets frisch bereitete Lösungsmittelgemische verwendet.

Die Beispiele 1 bis 10 erläutern die Herstellung der für das Verfahren der Erfindung erforderlichen Ausgangsstoffe.

B e i s pie 1 1

N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-methioninmethylester (E 3-4)

7,6 g Carbobenzyloxy-L-serin-hydrazid werden in 50 ml Dimethylformamid unter Rühren und Kühlen mit gesalzenem Eis und unter Zusatz von 15 ml 6n-Salzsäure gelöst. Die erhaltene klare Lösung wird mit 2,1 g Natriumnitrit versetzt und noch 10 Minuten weitergerührt. _t

6,0 g L-Methionin-methylester-hydrochlorid werden in 50 ml Dimethylformamid unter Kühlen mit gesalzenem Eis und Rühren gelöst und mit 12 g Triäthylamin versetzt, dann wird dem Gemisch die auf die oben beschriebene Weise hergestellte Azidlösung tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, dann wird das Lösungsmittel in Vakuum verdampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst, die Lösung mit Natriumhydrogencarbonatlösung. und mit verdünnter Salzsäure gewaschen, getrocknet und zur Trockene verdampft. Es werden 8,4 g kristallines Produkt (73°/o der Theorie) erhalten, Schmp. 101' C. Äthylacetat gelöst und die Lösung mit Wasser, dann mit 10%iger Salzsäure und zuletzt mit gesättigter wäßriger Natriumhydrogenkarbonatlösung gewaschen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels werden 3,8 g (66% der Theorie) Tripeptidester als fester Rückstand erhalten, welcher unmittelbar ohne weitere Reinigung zur Herstellung des Azids verwendet werden kann. Schmp. nach Umkristallisieren aus wäßrigem Äthanol 160 bis 170 C (Zersetzung).

"Bei spiel-2

L-SerylTL-methionin-methylester-hydrochlorid (F 3-4)

3,84 g N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-methionin-methylester werden in 100 ml absolutem Methanol gelöst, die Lösung wird mit 2,0 ml 6 η-Salzsäure versetzt und in der Gegenwart von 2,0 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator bei Atmosphärendruck hydriert. Nach Beendigung der Wasserstoffaufnahme wird der Katalysator durch Filtrieren entfernt und die Lösung in Vakuum zur Trockene verdampft. Der Rückstand wird in 30 ml Methanol gelöst, die Lösung mit Salzsäuregas gesättigt und dann in Vakuum wieder zur Trockene verdampft. Es werden 2,6 g (88% der Theorie) harziges Peptidesterhydrochlorid erhalten. Die Reinheit des Produktes ist genügend zur weiteren Synthese, Rr (1) = 0,48. Analyse: CohHshOioNiS; Molgewicht 634,7. Berechnet ... C 54,88%, H 6,04%, N 8,80%; gefunden ... C 55,14%, H 6,40%, N 9,00%.

B e i s ρ i e 1 4

N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-hydrazid (I 1-4)

3,8 g des nach Beispiel 3 hergestellten Carbobenzyloxy-tripeptidesters werden in 50 ml heißem Methanol gelöst, die Lösung wird mit 1,78 ml 70¹Vo Hydrazinhydratlösung versetzt und 30 Minuten langsam gekocht. Bis zum Ende des Kochens bildet sich ein reichlicher Niederschlag, dieser wird abfiltriert und getrocknet; es werden 3,2 g (84% der Theorie) Tetrapeptid-hydrazid erhalten. Schmp. nach Umkristallisieren aus wäßrigem Dioxan: 237 C (Zersetzung [«]. = —15 (i¹ = 3,3 in Eisessig).

Analyse: CohHjhOoNoS; Molgewicht'634,7. Berechnet ... C 52,98%, H 6,04%, N 13,23%; gefunden ... C 58,58%, H 6,35¹¹Ai, N 12,77%.

Beispiel 5

L-Histidyl-phenylalanin-methylester-dihydrochlorid (F 6-7)

19,3 g Carbobenzyloxy-L-histidyl-L-phenylalaninmethylester werden in 350 ml absolutem Methanol gelöst, die Lösung wird mit 14,0 ml 6 n-Salzsäure versetzt und in der Gegenwart von 2 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator bei Atmosphärendruck hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung in Vakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand in 100 ml absolutem Methanol gelöst, die Lösung unter Kühlen mit Salzsäuregas gesättigt und in Vakuum wieder zur Trockene verdampft. Es werden 14,9 g trockenes Dipeptidesterhydrochlorid (91% der Theorie) erhalten; R_r (2) = 0,6.

B e i s ρ i e 1 6

Carbobenzyloxy-H-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin-methylester-y-benzylester (H 5-7)

Beispiels

N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester (H 1-4)

3,8 g N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosin-hydrochlorid werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst und unter Rühren und Kühlen mit 4,5 ml 6 n-Salzsäure und 625 mg Natriumnitrit versetzt.

2,6 g L-Seryi-L-methionin-methylester (hergestellt nach Beispiel 1) werden in 25 ml Dimethylformamid gelöst, die Lösung wird mit 5,2 ml Triäthylamin versetzt, dann wird die auf obige Weise hergestellte kalte Azidlösung unter Rühren und Kühlen zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, das Lösungsmittel in Vakuum verdampft, der Rückstand in 9,6 g Carbobenzyloxy-L-glutaminsäure-7-benzyI-ester werden in 150 ml absolutem Dioxan gelöst, die Lösung wird auf +5 C gekühlt, und das teilweise erstarrte Gemisch wird mit 3,8 ml absolutem Triäthylamin, dann tropfenweise mit 2,6 ml Chlorkohlensäure-äthylester versetzt. Nach 20 Minuten Rühren ^f'° wird das Gemisch mit gesalzenem Eis bis zum völligen Erstarren abgekühlt.

10,0 g des nach Beispiel 5 erhaltenen rohen Dipeptidester-hydrochlorids .werden: in 50 ml kaltem Wasser gelöst, die Lösung wird tropfenweise "mit ^f>5 6,7 ml Triäthylamin versetzt, und das erhaltene Gemisch wird zur eingefrorenen Lösung des obigen gemischten Anhydrids zugesetzt. Das Gemisch wird zuerst unter Kühlen, später bei Zimmertemperatur ge-

rührt, dann mit Eisessig bis pH = 6 neutralisiert und in Vakuum verdampft. Der ölige Rückstand wird mit Wasser verrieben, bis das Produkt erstarrt und zu einem Pulver zerfällt. Nach Filtrieren und Trocknen im Exsikkator werden 14,0 g des gewünschten Produktes (80°/o der Theorie) erhalten; Schmp. 170 bis 173'C,

Analyse: Gib
Berechnet
gefunden

Molgewicht 669,7.

C 64,56%, H 5,88⁰O. N 10,46" ₀; C 64,65%, H 6,00%, N .9,89%.

Beispiel 7

«-L-Glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin-methylester (I 5-7)

5,1 g des nach Beispiel 6 hergestellten geschützten Tripeptidesters werden in einem Gemisch von 150 ml Methanol, 20 ml Wasser und 3 ml Eisessig gelöst und in der Gegenwart von 1,0 g 10%igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator 2 Stunden bei Atmosphärendruck hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung zur Trockene verdampft, der Rückstand in 10 ml Dimethylformamid gelöst und mit 50 ml absolutem Äthylacetat versetzt. Der entstandene Niederschlag wird durch Dekantieren getrennt und in ähnlicher Weise noch einmal umgefällt, dann filtriert und an der Luft getrocknet. Es werden 2,65 g des gewünschten Produkts (78% der Theorie) erhalten; Schmp. 110bis 120 C(Zersetzung). R₁-(I) = 0,42. [,/]"- = -10.8 (c = 6,6 in Wasser). entfernt. Die Lösung wird 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann wird das Methanol in Vakuum abdestilliert. Die obere wäßrige Phase des flüssigen Rückstandes wird vom unteren gelbliehen öl dekantiert, mit Aktivkohle aufgekocht, dann heiß filtriert und abgekühlt. Nach mehrstündiger Eiskühlung wird die abgeschiedene Kristallmasse abfiltriert und an der Luft getrocknet. Es werden 2,9 g des gewünschten Produkts erhalten, Schmp. 116 ίο bis 117 C; [«]- = -15 (c = 2 in Eisessig) bzw. +2 (ί· = 2,5 in Dimethylformamid.)

Analyse: C₂₅HwQoHi · H₂O · HCl; Molgewicht 549.0.

Berechnet:

_IS C 54,7%, H 6,1%. N 15.3»». Cl 6.45" ₍>:
gefunden:
C55.0»,,, H6,2»_;l). N 15.0%, Cl 6.66» _u.

Beispiels

N-M-Carbobenzyloxy-L-arginyl-L-tryptophanmethylester (D 8-9)

35

5,15 g N-ii-Carbobenzyloxy-L-arginin und 4,65 g L-Tryptophan-methylester-hydrochlorid werden in 20 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird unter Rühren mit 5,2 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die weitergerührte Lösung erwärmt sich langsam bis 40 C, und N,N'-Dicyclohexylcarbamid scheidet sich ab. Nach Stehen über Nacht wird filtriert, und das Filtrat wird in Vakuum verdampft. Der harzige Rückstand wird zur Entfernung des überschüssigen Ν,Ν'-Dicyclohexyl-carbodiimids mit Äther extrahiert, dann in Chloroform gelöst und die Lösung mit Wasser, dann mit verdünnter Salzsäure und endlich mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen. Nach Verdampfen der organischen Lösung wird als trockener Rückstand die freie Dipeptidbase erhalten, die aber noch mit Ν,Ν'-Dicyclohexyl-carbamid verunreinigt ist. Das erhaltene 9 g rohe Produkt kann ohne Reinigen zur Verseifung (Beispiel 9) verwendet werden.

Beispiel 9

N-M-Carbobenzyloxy-L-arginyl-L-tryptophanhydrochlorid (E 8-9)

60

6,0 g des nach Beispiel 8 hergestellten rohen, geschützten Dipeptidesters werden in 60 ml Methanol gelöst,, und die Lösung wird mit 22 ml η-Natriumhydroxydlösung versetzt. Das als Verunreinigung anwesende N.N'-Dicyclohexyl-carbamid scheidet sich in kristalliner Form ab und wird durch Filtrieren

Beispiel 10

L-Arginyl-L-tryptophan-methylester-dihydrochlorid (G 8-9)

1,65 g des nach Beispiel 9 hergestellten Carbobenzyloxy-dipeptidester-hydrochlorids werden in einem Gemisch von 45 ml Methanol. 2 ml Wasser und 1.5 ml Eisessig in der Gegenwart von 0,2 g 10" »igem Palladium-Aktivkohle-Katalysator bei Atmosphärendruck hydriert. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird die Lösung zur Trockene verdampft, der Rückstand in 30 ml absolutem Methanol gelöst und die Lösung mit Salzsäuregas gesättigt. Dann wird das Lösungsmittel abdestilliert und die obige Operation wiederholt. Als Rückstand werden 1.16 g des sehr gut löslichen Dihydrochlorids (76" η der Theorie) erhalten, R₁- (1) = 0,36.

Das Beispiel 11 erläutert das Verfahren der Erfindung.

Beispiel II

a) N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-i.-seryl-

L-methionyl-ri-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin-

methylester (J 1-7)

951 mg des nach Beispiel 4 hergestellten Tetrapeptid-hydrazids (I 1-4) werden in 10 ml Dimethylformamid und Zugabe von 0.75 ml 6 η-Salzsäure gelöst, und die Lösung wird unter starkem Kühlen und stetigem Rühren mit 104 mg Natriumnitrit versetzt. Nach 10 Minuten weiterem Rühren wird die erhaltene Azidlösung der ebenfalls abgekühlten Lösung von 735 mg Tripeptidester (I 5-7) in 10 ml Dimethylformamid und 0,85 ml Triäthylamin zugesetzt, und das Gemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der nach Abdestillieren des Lösungsmittels erhaltene ölige Rückstand wird mit 20 ml Wasser versetzt, und das dadurch zum Erstarren gebrachte Produkt wird zum Pulver verrieben, filtriert, mit Wasser gründlich gewaschen und an der Luft getrocknet. Es werden 1,19 g (76% der Theorie) des gewünschten Heptapeptids (J 1-7) erhalten; Schmp. nach Umkristallisieren aus wäßrigem Methanol 167 bis 173C.

Analyse: CiitHßiOiöNoS; Molgewicht 1 048,1.
Berechnet:

C 56,15%, H 5,9%, N 12,0%, S 3,1%;
gefunden:
C 55,7%, H 6,15%, N 11,7%, S-3,4%.

b) N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-i.-seryl-L-methionyl-ii-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanin-

hydrazid (K 1-7)

12.2 g des nach Beispiel 11. a) hergestellten Heptapeptidesters (J 1-7) werden in 12 ml Methanol unter Erwärmen gelöst, und die Lösung wird mit 0.42 ml ■70" (liger Hydrazinhydratlösung versetzt und 2 Stunden gekocht. Dann wird das Gemisch abgekühlt. 24 Stunden stehengelassen, das abgeschiedene Heptapeptid-hydrazid wird filtriert, mit 6 ml Methanol aufgeschlämmt, scharf abgenutscht und im Exsikkator über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet. Es werden 0.82 g Hydrazid (73% der Theorie) erhalten: Schmp. nach Umkristallisieren aus Wasser 214 bis 215 C. [«]: = -15 (c = 5.15 in Eisessig).

Analyse: C₄₈H₁₁₁O₁₄N₁₁S 4H₂O: Molgewicht 1120,2. Berechnet... C 51.48"0. H 6.21%. N 13.75%: gefunden ... C 51.86%. H 6.56" „. N 13,57" „.

c) N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-lyrosyl-i.-seryl-L-methionyl-(i-L-gIutamyl-L-histidyl-L-phen\lalanyl- L-arginyl-L-tryptophan-methylester (L 1-9)

210mg des nach Beispiel ll.b) hergesteHten Heptapeptid-hydrazids (K 1-7) werden in 2 ml Dimethylformamid gelöst: die Lösung erstarrt beim Kühlen mit gesalzenem Eis gelartig, wird aber nach Versetzen mit 0.10 ml 6 η-Salzsäure wieder klar flüssig. Nach Zugabe von 18 mg Natriumnitrit wird das Gemisch 10 Minuten unter starkem Kühlen gerührt, dann wird die erhaltene Azidlösung einer gekühlten Lösung von 90 mg Arginyltryptophan-methylester-hydrochlorid (G 8-9) in 1 ml Dimethylformamid und 0.14 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, dann wird das Lösungsmittel abdeslilliert. und das als Rückstand erhaltene öl wird mit 3 ml Wasser verrieben. Das erstarrte und zum Pulver verriebene Produkt wird abfiltriert. mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Es werden 230 mg .(76% der Theorie) des gewünschten Esters (L 1-9) erhalten: Zerselzungspunkt um 150 C.

Analyse: C«iHssOirNisS: Molgewicht 1389.

Berechnet ... Nl 5.0%; gefunden ... Nl 5.2¹¹ n.

d) N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-

L-methionyl-a-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyli.-arginyl-L-tryplophan-hydrazid (M 1-9)

120 mg des nach Beispiel 11, c) erhaltenen Nonapeptidesters (L 1-9) werden in heißem Methanol gelöst, die Lösung wird mit 0,10 ml 70%igem Hydrazinhydrat versetzt und 4 Stunden gekocht. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen, dann wird das Produkt durch Zugabe von 15 ml absolutem Äther gefällt. Nach Filtrieren und Trocknen an der Luft werden 112 mg des gewünschten Nonapeptid-hydrazids (M 1-9) erhalten (93% der Theorie); Zersetzungspunkt um 190 C.

Analyse: Q₁₅H₈₃O₁₀N₁₇S: Molgewicht 1389.

Berechnet ... N 17,0%;
gefunden ... N 16.6° 0.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung des neuen Nonapeptid-DerivatsN-Carbobenzyloxy-L-seryl-t.-tyrosyl - L - seryl -L- methionyl -L- glutamyl -L- histidyl -L- phenylalanyl -L- arginyl - 1. - tryptophanhydrazid. dadurch gekennzeichnet, daß man N-Carbobenzyloxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-melhionin-hydrazid in Anwesenheit von Dimethylformamid als Lösungsmittel in an sich bekannter Weise in das entsprechende Azid überführt, die erhaltene Reaktionslösung, ohne das darin enthaltene Wasser durch Trocknen zu entfernen, unmittelbar mit einem L-Glutamyli.-histidyl-L-phenylalanin-alkylester umsetzt, danach den erhaltenen N-geschützten Heptapeptidester in an sich bekannter Weise in das entsprechende Hydrazid und dieses in an sich bekannter Weise in Gegenwart von Dimethylformamid als Lösungsmittel in das entsprechende N - Carbobenzyloxy -1. - seryl -1. - tyrosyl -1- - seryl - L - methionyl - L - glutamyl - L - histidyli.-phenylalanin-azid überführt, die erhaltene Reaktionslösung, ohne das darin enthaltene Wasser durch Trocknen zu entfernen, unmittelbar mit einem i.-Arginyl-i.-tryptophan-alkylester umsetzt und den erhaltenen N-Carbobenzyloxy-nonapeptidalkylester in an sich bekannter Weise in das entsprechende Hydrazid überführt.