DE1442195A1 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsaeure - Google Patents

Description

Patentanwalt Dipl.-Phys. GERHARD LIEDL. MüneheT22, Steinsdortstr. ll

trefoil 29 3U2 FnrmchrGiber 05/22 208

A 1652

Dr.

ASAHI KASEI KOGYO KABUSHIKIKAISHA No. 25-1, 1-ohome, Ikgima-hamadori, Kita-ku, ■ OSAKA CITY /JAPAN

Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von !-Glutaminsäure.

Insbesondere hat es die Erfindung mit einem besonderen Züohtmedium zu tun, das oberflächenaktive Mittel enthält} die Fermentation oder Vergärung wird mit Hübenmelasse als Hauptkohlenstoff quelle durchgeführt, wobei L-Glutaminsäure-produzie-

rende Mikroorganismen verwendet werden, die für ihr Wachstum Biotin "benötigen.

Im Verlauf von Untersuchungen über die industrielle Erzeugung von !-Glutaminsäure durch Gärprozesse wurde neuerdings'die Entwioklung billiger Kohlehydratmaterialien in Angriff genommen und die Verwendung verschiedener Arten von Melassen in Betracht gezogen. Die untersuchten Kohlehydratmaterialien schließen Rohrmelassen, aufbereitete oder raffinierte Melassen, hochwertige Qualitätsmelassen, Rübenmelassen, etc. ein. Diese Materialien enthalten jedoch eine große Menge an Biotin, so daß es bei der L-Glutaminsäure-Fermentation erforderlich ist, die Menge des Biotins genau zu überwachen. Bei der Verwendung dieser Kohlehydrate als Vergärungsmaterialien treten zahlreiche Probleme auf. So enthält insbesondere Rohrmelasse einen auffälligen Überschuß an Biotin und weiterhin ein Übermaß an Verunreinigungen, die den Filtriervorgang verlangsamen oder Störungen bei demselben verursachen. In Rübenmelassen sind hingegen der Biotingehalt und die Menge an Substanzen, die den Filtriervorgang beeinträchtigen können, gering, so daß Rübenmelaesen ale Rohmaterial hervorragend geeignet sind. Im Verlauf einer Untersuchung hinsichtlich der besten Melassen wurden, die im nachstehenden erläuterten Ergebnisse gefunden.

Wenn die Biotinmenge unter Verwendung von Lactobacillus arabinoBUS als Probebakterium abgeschätzt wurde, betrug der Biotin-

AhQA19/069* ~

gehalt, wie in Tabelle 1 dargestellt, etwa 1,5 - 5,0 jug/100 g, waa in einem Züohtmedium, das so eingestellt war, daß die Geeamtkohlehydratkonzentration etwa 5$ betrug, einem Wert von 1»5 - 5»0 p.g/1 entsprach. Dies ist der geeignetste Bereich der Kohlehydratkonzentration für das Wachstum von L-Glutaminaäure-produzierenden Bakterien, wie auch für die Bildung von L-Glutaminsäure. Es wurde jedoch in der Hauptzüohtung die Bildung von L-Ölutaminsäure überhaupt nicht beobachtet. Diese Tatsache maohte es klar, daß im lalle einer mikrobialen (microbial) Probe unter Verwendung von lactobacillus arabinosus aktives Material für das Waohstum wie auch Biotin und dessen Verwandte vorliegen können, so daß bei Verwendung von Rübenmelasse es gänzlich unmöglioh ist, die Züohtbedingungen dadurch zu steuern, daß der Biotingehalt mit konventionellen Methoden abgeschätzt wird.

Tabelle 1
Zusammensetzung von Rübenmelaesen

Arten	A	B	σ	D	S	P
Gesamtkohlehydra-t (£)	55.52	58.26	57.93	48.98	48.56	46.57
direkt reduzierender Zucker (#)	0.62	0.90	0.82	0.93	1.03	0.92
Gesamtetiokatoff (<jL)	1.05	1.29	1.14	1.64	1.85	.. -1.39k
Biotin jttg/100 g	1.60	1.61	1/74	3.84	4.12	4.49

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Ea wurden Anstrengungen, unternommen» um dieses besondere Problem zu lösen mit dem Ziel, eine L-G-lutaminsäure-Vergärung in vorteilhafter Weise auszuführen. Als Ergebnis der Untersuchungen wurde gefunden, daß in diesem Falle L-Glutaminsäure dann mit sehr hoher Ausbeute gebildet und angesammelt werden kann, wenn ein besonderes Züohtmedium hergestellt wird, das besondere Zusatzstoffe als Züohtzusammensetzung enthält, und wenn mit diesen Medien die Züohtung durchgeführt wird. Insbesondere erwiesen sich die folgenden Stoffe als geeignet: ester-ätherartige niohtionisohe oberflächenaktive Stoffe, esterartige niohtionisohe oberflächenaktive Stoffe, polyoxyäthylenalkylaminartige kationische oberflächenaktive Stoffe, betainartige amphotere oberflächenaktive Stoffe, usw.

Die Erfindung wird anhand nachstehender Vtrsuchebeispiele weiter erläutertι

Yeriuohsbeispiel 1

Zusammensetzung des Keiaaüohtmediums;

Mai«-Quell-Flüseigktit 4.0* A»i*ittureflu«eigkeit KH₂PO₄ MgSO₄.7H₂O

0.1*

Zusammensetzung dee Hauptzüohtmediums{

RübtnmtlaMt

(al« G*Bamtkohl*hydrat KH₂PO₄ Harnstoff

0.2* 1.2*

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* Sie Hestflüssigkeit, wie sie von L-G-lutaminsäure aus aoid-hydrolisiertem Weizengluten duroh übliche Verfahren rüokgewonnen wird.

** Die Zusammensetzung des Züohtmediums ist in Gewiohts-pro-Volumen-^ dargestellt, ausgenommen Maisquellflüssigkeit und Aminosäureflüssigkeit, welche in Volumen~pro-Volumen-# angegeben sind.

Sie Züchtung wurde unter aerobischen Bedingungen in Eorm einer Sohütttlsüohtung während 28 Stunden bei 30⁰O ausgeführt, naohdea 3 asse Mikrobaoterium ammoniaphiIum eingeimpft waren (diese Art wurde in der deutsohen Patentanmeldung Nr. A 40 764 I7a/6b beschrieben). Es wurde während 24 Stunden bei 30⁰O auf einem eohräg liegenden Nähfagar in einem Erlenmeyerkolben vorgezüohtet. Der Brlenae/arkolben war mit 150 ml des Keimzüohtmediums besohiokt. 2" ml desselben wurden in das HauptZüchtmedium zur fermentation eingeimpft. Sas Hauptjsüohtmedium hatte eine Grund-Äueammeneetzung wie voranstehend und enthielt die in Tabelle 2 in ihren jeweiligen Konzentrationen angegebenen Stoffe* Sas Waohstum bei der Hauptzüohtung wurde während 48 Stunden ausgeführt. Sie in der Gärbrüht angesammelte Menge an L-Glutamin-■äure ist in Tabelle 2 angegeben. Wie aus Tabelle 2 dee Ver- »uohabeiapielea 1 hervorgeht, 1st die vorliegende Methode dadurch gekennetlohnet, dafl tin besonderte Züohtmedium verwendet das in «einer Züohtungezuiaamenietaung oberflächenaktive

Stoffe enthält. Dies ist von derjenigen Methode grundsätzlich verschieden, bei der ein Wachatumsverzögerungsmittel zugegeben wird, naohdem das Waohatum der Mikroorganismen begönnen hat, wie dies z.B. bei der Methode von Merok & Co., Inc. patent (französisches Patent Nr. 1 266 757) der Fall ist, da öine genaue Überwaohung des Bakterienwaohsturns aufrecht erhalten wird. Die Wirkung von Zusatzstoffen im Züohtmedium zur Erzeugung von !-Glutaminsäure unter Verwendung von Melassen als Kohlehydratmaterial spielt eine wichtige Rolle bei der Bildung von Enzymsystemen und dem anfänglichen Waohstum der Bakterien wie auch bei den Grundkomponenten des Züohtmediums (beispielsweise KH₂PO^,-MgSO^·7Η₂Ο, Biotin) für die Fermentation. Daher sind die genannten Stoffe als Zusatzstoffe für das erfindungsgemäße L-Glutaminsäurefermentationsverfahren wesentlich. Als besondere geeignete Stoffe kommen in Eraget Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat, Polyoxyäthylenglykolmonostearat, PoIyoxyäthylenphenyläther, Sorbitanmonolaurat, Sorbitanmonostearat, Polyoxyäthylenalkylamin, ein oberflächenaktiver Stoff TX1177» * der duroh Betainisierung von Polyoxyäthylenstearylamin mit 010H₂OOOH erhalten wird, wobei die genannten Stoffe zu den eeter-äther-ähnliohen niohtionisohen oberflächenaktiven Stoffen^ ätherähnliohen nichtionisohen oberflächenaktiven Stoffen, esterähnliohen nichtionisohen oberflächenaktiven Stoffen, Polyoxyäthylenen, alkylaminähnliohen kationisch©^! oberflächenaktiven Stoffen₍ betainähnliohen speziellen amphotertn oberfläohenaktivtn Stoffen, höheren lllcylalkoholtn und fettsäureamlAsulfonat-

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ähnlichen anionischen oberflächenaktiven Stoffen gehören können.

Tabelle 2

[Arten der Reagenzien	Handelsname der Stoffe	zugefügte Menge	Menge der gebil deten L-Grlutamin- säure
•aterartiges nioht- ionisohes oberflächen aktives Reagenz	Span 20 Span 60	0.15# 0.20	21·0 mg/ml 18.0
fettsäureamidsulfonat- artiges anionischeβ ober flächenaktive β Reagenz	Diapon T	0.05	22.0
Böherer Alkylalkohol	Stearyl aloohol	0.10	24.1
eeter-ätherartiges nioht- ionisohes oberflächen aktives Reagenz	Cween 40	0.05	25·6
eeterartigeβ niohtioni- Boh.ee oberflächen aktives Reagenz	Emanon 3115	0.10	25.2
titherartigee niohtioni- Behe· oberfläohen- jaktives Reagenz	tJewpoul PE64	0.10	24.1
polyoxyäthylenalkylamin- Etrtlges kkt ionische β öbea> ifläohenäktives Reagenz	Iminon 295	0.02	21.2
!spezielles amphoteres .oBisohee oioerfläehen- jaktivee Reagent	CX-1177	0.10	22.2 *
ihn· Zugase			1.8

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-β-

Es ist evident, daß diese Stoffe von den bloßen Wachstumsverzögerungsmitteln verschieden sind, wie sie in der erwähnten französiohen Patentschrift Hr. 1 266 757 beschrieben sind,, Als nächstes gibt die untenstehende Tabelle 3 die Yersuohsergebnisse wieder, aus denen hervorgeht, daß die Produktion von !-Glutaminsäure geringer ist, wenn diese Stoffe in entsprechender Zeit nach der Einleitung der Züchtung zugegeben werden.

Versuchsbeispiel 2

Eine Züchtung wurde ausgeführt nach-dem "Vorgehen des Versuchsbeispieles 1. Die Stoffe wurden getrennt von den anderen Züohtmediumkomponenten sterilisiert und innerhalb 6-8 Stunden naoh Beginn der Züchtung zugegeben, was offensichtlich die Optimalzeit für die Zugabe von Reagenzien ist. Die Ergebnisse und die während 48 Stunden Züchtung angesammelte L-Glutaminsäuremenge Bind in Tabelle 3 aufgeführt·

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Tabelle 3

Menge der erzeugten L-GIutaminsäure (jig/ml)

Stoff	polyoxyäthylen- glykolmonostearat 0.1 #	8 Stun den spä ter	Polyoxyäthylen- sorbitanmono- palmitat 0·05#	3 Stun den spä ter	Polyoxyäthylen alkylamin 0»02yo	8 Stun den spä ter
Zeitpunkt der Stoff zugabe	Bei Her stellung des Züoht- mediums	14.6 14.8 13.2	Bei Her stellung des Züoht- mediums	9o3 8.7 8,4	Bei Her stellung des Zucht- nediums	12.0 11.0 10.3
Versuch No. 1 Ho. 2 No» 3	22.5 20.9 21.8	22.0 21.3 21.8	25.1 25.2 24.8

Aus dem Obigen geht klar hervor, daß, wenn die genannten Bakterien verwendet werden, ein Kennzeichen der erfindungsgemäß verwendeten Stoffe darin liegt, daß sie notwendigerweise als Züchtmediumkomponenten in demjenigen Zeitpunkt zugegeben werden müssen, zu dem das Züohtmedium hergestellt wird. Daneben besteht der große Vorteil, daß» falls Rübenmelasse als Kohlehydratquelle verwendet wird, sioh eine hervorragende Ausbeute ergibt.

- 10 -

Rübenmelasse enthält selbstverständlich. Pyrrolidoncarboxylsaure; selbst wenn die Menge dieses Stoffes in Betracht gezogen wird, ist die Ausbeute an L-Glutaminsäure im Verhältnis zur Menge des verwendeten Zuckers, wie aus Versuchsbeispiel 3 ersichtlich, günstig im Vergleich zu demjenigen Fall, in dem G-lukose als Kohlehydratquelle verwendet wird. Die Ausbeute kann bei etwa 10$ liegen.

Versuchsbeispiel· 3 '

Mikrobaoterium ammoniaphilum, das in einem Bouillon-Schrägagar bei 30 0 während 24 Stunden vorgezüchtet war, wurde während 28 Stunden bei 30⁰C, wie in Versuchsbeispiel 1 schüttelgezüchtet, und zwar unter Verwendung des Keimzüohtmediums, wie es im Versuchsbeispiel angeführt ist« 500 ml wurden in ein 20 1 Fermentiergefäß eingeimpft, das mit 10 1 Züchtmedium der nachstehenden Zusammensetzung beschickt war» Die Züchtmedien ent- . hielten als Kohlehydratquellen Glukose bzw» Rübenmelasse. Das Züchtmedium wurde unter aerobischen und untergetauchten Verhältnissen bei 30⁰G durchgeschüttelt, wobei der pH-Wert mit Ammoniaklösung während der Vergärung auf 8 eingestellt wurde. 40 Stunden später ergab sich eine Ausbeute und ein Ausbeuteverhältnis von L-Glutaminsäure, wie in Tabelle 4 dargestellte

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U42195

Zusammensetzung des Hauptkulturmediums:

(A) Kohlehydratquelle} Glukose

Glukose 1296

MnSO₄HH₂O MgSO₄-7H₂O

PeSO₄*7H₂O Oo001$

Biotin 2 jig/lit.

(B) Kohlehydratquelle; Rübenmelasse

Sübenmelasse (als Gesamtkohlehydrat)

Emanon 3115

(polyoxyäthylenglykol-

monostearat)

Als Hübenmelasse wurde die in Tabelle 1 unter A aufgeführte Art verwendete

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	Tabelle 4	mg/ml	Ausbeute in i» der Zuk- kerverwendg·	Kohlehydratquelle\ Rübenmelasse	Ausbeute in i» der Zuk- kerverwendg·
Versuohe u. Ergebnisββ	Kohlehydratquelle; Glukose		44.0	Menge der ge bildeten L- glutamin-SÄre	53.2
	Menge an gebil deter I-gluta- min-Säure		44.1	. 63.8 mg/ml	54.6
Versuch. No. 1	52.8		45.8	65.5	57.1
No· 2	52„9	42.7 *	68.5	55.3 i
No. 3	55.0		66.3
No· 4	51.2

Im Verlauf dtr Erfindung wurden auoh Versuohe angestellt» die den Einfluß der zuyor erwähnten Zusatzstoffe auf die folgenden Mikroorganismen ergaben. Die Ergebnisse unterschieden sich nur geringfügig von denjenigen, wie sie mit Mikrobaoteriumammoniaphilum erhalten wurden»

Miorobaoterium flaTum yar. glutamiοum

lfliorocooeui glutamiou· « η

ΑϊΟΟ 13693 ATOO 13032 AIOO 13Ο5Θ AfOO 13009 ATOO 15060

Breribftettrium divaricatu» NRRL Β-2311 OorynibaeteriuBi Kor. Sp* Ke».1fl9t»

(Dieit· Äakterium liegt der japanischen Pattntanntl-

dung Nr. fifi 431/1959 Eugrundt).

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Beispiel 1

Zusammensetzung dee Keimzüohtmediumst

Maisciuellflüssigkeit Ami no säure flüssigkeit

MgSO₄ · 7H₂O 0.196

Zusammensetzung des Hauptzüohtmediums!

Eübenmelaese (als Gesamt- 1 kohlehydrat)

0.2$

Harnstoff 1·

laanon 3115 (Polyoxyäthylen-

glyko!mono s t e arat)

3 aze Berribaoterium divarloatum NRRL B-2311, während 24 Stunden "bei 30⁰O in Nährbouillon-Sohrägagar vorgezüohtet, wurden in einen Erlenmeyerkolben eingeimpft, der mit 150 ml der erwähnten Keimaüohtlösung beschickt war. Es wurde mit Sohüttelzüchtung unter aerobisohen Bedingungen während 28 Stunden bei 30⁰C geiüohtetf 2 ml der Lösung wurden in einen 500 ml Sohüttelkolben

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eingeimpft, der 100 ml des erwähnten Hauptzüchtmediums enthielt» Während des Fermentationsverlaufes wurde die¹ Schüttelzüchtung bei 3O⁰O fortgeführt, wobei der pH-Wert auf etwa 7,5 mit Harnst off lösung eingestellt wurde. Die Menge an L-G-lutaminsäure, die sioh naoh 48 Stunden Züchtung ansammelte, betrug 36,5 mg/ml.

Parallel hiermit wurde eine zweite HauptZüchtung in genau derselben Weise wie oben im selben Züchtmedium wie oben ausgeführt, mit der Ausnahme jedoch, daß Emanon 3115 (das esterähnliohe niohtionische .oberflächenaktive Beagenz von Polyoxyäthylenglykolmonostearat) ausgeschlossen wurde· Die Menge an L-Glutaminsäure, die sich im Verlaufe von 48 Stunden ansammelte, ergab sioh zu lediglich 12,8 mg/ml. Die L-Glutaminsäure wurde durch die manometrische Warburg-Methode mit L-Glutaminsäuredecarboxyiase der Irooknungszelle der E-Ooli-Art bestimmt · Die bakteriellen Zellen wurden aus der Züohtbrühe naoh Abschluß der Züchtung entfernt. Naohdem die Brühe erhitzt' und konzentriert war, konnten naoh Abkühlung, wobei der pH-Wert mit konzentrierter HOl auf 3,2 eingestellt wurde, Kristalle von L-Glutaminsäure leicht abgesohieden werden. Nach Zentrifugalabsoheidung und Trocknung konnten hiervon Ii-Glutaminsäure-Kristalle erhalten werden_e

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Im 'übrigen hatte die Im Hauptzüchtmedium verwendete Rübenmelasse die folgende Zusammensetzung und kam so zur Anwendung, daß die Gesamtzuokerkonzentration 12?4 betrugt

Ge samtkohlehydrat	57	.939&
direkt reduzierender Zuoker	0	♦82$
Q-esamtstiokstoff	1	.1496
Biotin	1	• 74 Jig/100 g

Die Rübenmelasse der obigen Zusammensetzung wurde auoh in den nachstehenden Beispielen verwendet·

Beispiel 2

Unter Verwendung von Miorooooous glutamious ATGO 13058 wurde die Fermentation in einem 500 ml SohUttelkolben in genau der gleichen Welse wie la Beispiel 1 ausgeführt· DasKelmeüohtmedium war ein Nährmedium, das hauptsächlich aus MaisquellflUselgkelt und Aainosiursfliissigksit wie In Beispiel 1 BusammengesetEt war ι die Eusamaeneetsung des Hauptzüohtmediums war die folgendet

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!ween 40 0.05$

(Polyoxyäthylensorbitan-

monopalmitat)

Harnstoff 1 .

.Während der Hauptzüohtung wurde der pH-Wert mit Harnstoff lösung auf etwa 7»5 eingestellt. Naoh 48 Stunden Züohtung wurden 58 mg/ml an L-Grlutaminsäure festgestellt»

Beispiel 3

Es kam Mioroooccus glutamioua ATOO 15059 aur Anwendung; die Fermentation wurde in einem SohUttelkolben in genau der gleiohen Weiee wie in Beispiel 2 durohgeführt( in diesem Falle wurde jedoch, ein Haupteüchtmedium der untenstehenden Zusammensetiung verwendet!

Zusammensetzung des HauptzUohtmediun·!

. Rttbenmelaset (Gaeamtkohlehydrat) KH₂PO₄

3113 0*1 $ft

(Polyoxyäthylenglyool- .

tt)

fitrnitoff

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Während der Vergärung wurde der pH-Wert mit Harnstofflösung auf etwa 7»5 eingeateuert. Die angesammelte Menge an L-G-lutaminsäure, wie sie naoh 48 Stunden im ZUchtmedium vorlag, betrug 45,6 mg/ml.

Beispiel 4

Die Hauptfermentation wurde in einem Sohüttelkolloen in genau der gleiohen Weise wie in Beispiel 1 unter Verwendung von Oor_yne-!Pyp Bakterium Nr« 129 G ausgeführt; dieses Bakterium liegt der japanisohen Patentanmeldung Nr. 29431/1959 zugrunde. 48 Stunden später waren 48,5 mg/ml an L-Grlutaminsäure im Züohtmedium angesammelt. Das Hauptzüohtmedium hatte die nachstehende Zusammensetzung:

Rübenmelasse (0· es amtkohl ehydrät) 12^6

KH₂PO₄ 0*194

MgSO₄*7H₂O ' 0.05# (HH₄)₂S0₄ O.I96

Aminen 295 0.05#

(Polyoxyäthylenalkylamin)

Harnstoff 1

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Beispiel 5

Es wurde mikrobacterium flavum var. glutamicum ATCO. 13693 verwendet; die Züchtung wurde in einem 500 ml Schüttolkolben in genau derselben Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt»

Zusammensetzung des Hauptzüchtmediumst

Rübenmelasse (Gesamtkohlehydrat 12$ ₄ · · 0o1#

. 7H₂O 0,05#

Fewpoul PE 64 O₉

(Polyoxyäthylenphenyläther)

Oberflächenaktives Reagenz ΪΧ-1177, hergestellt durch Betainisierung von Polyoxyäthylenstearylamin mit 010H₂OOOE

Die im Züohtmedium nach 40 Stunden angesammelte Menge an L-Glutaminsäure betrug 48,0 mg/ml.

Beispiel 6

3 aze Miorobaoterium flavum var. Slutamioum ATOC 13693» während 24 Stunden bei 30⁰O mit Hährbouillon-Sohrägagar gezüohtet, wurden in einen 500 ml Erlenmeyerkolben eingeimpft.»

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dor seinerseits mit 150 ml Keimzüohtmedium ähnlich wie in Beispiel 1 beschickt war; die Züchtung wurde unter Sohüttelung bei aerobisohen Bedingungen während 28 Stunden bei 30⁰O durchgeführt ι 500 ml hiervon wurden in ein 20 Liter Fermentiergefäß eingeimpft, das mit 10 mil. des untenstehenden HauptzUohtmedlums beschickt war; während der Vergärung wurde die Züchtung unter aerobisohen Bedingungen mit konstanter Sohüttelung bei 30⁰O ausgeführt, wobei der pH-Wert mit Ammoniaklösung auf 7 eingesteuert wurde·

Zusammensetzung des Hauptzüohtmediumst Rübenmelaeae (G-esamtkohlehydrat) 12?C

MgSO₄/7H₂O 0.05#

Stwpoul PE 64 0.19t

(Polyoxyäthyltnphenyläthir)

Swetn 40 Ο·Ο39(

(Polyoxyäthyltnsorbitan-

monopalmitat)

Naoh 40 Stunden Vergärung hatten sioh 48,0 mg/ml an L-CJluta mineäure la Züohtmedium angeeammelt.

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Beispiel 7

Eine Keimkultur von Miorobaoterium ammoniaphilum wurde in derselben Weise wie in Beispiel 6 hergestellt ι 500 ml hiervon wurden in ein 20 Liter Fermentiergefäß eingeimpft, das mit 10 1 der unten angegebenen Hauptkultur besohiokt war; während der Fermentation wurde die Züchtung unter aerobisohen Bedingungen unter konstanter Umrührung bei 30⁰C auegeführt, wobei der pH-Wert mit Ammoniaklösung auf 8 eingestellt wurde; nach 40 Stunden Züchtung hatten eioh 65,8 mg/ml an L-Q-lutaminsäure angesammelt ι die Ausbeute betrug bezogen auf den verwendeten Zucker 54,8?S.

Zusammensetzung des Hauptzuchtmediumsi Rübenmelaeee (G-eaamtkohlehydrat) 12ji

kminon 295 0.02*

(Polyoiyäthylenalkylamin)

Ei wurA· Miorobftoterium ammoniaphilua verwendet ι die Züchtung wurdt mit «inern 20 Liter Ftrmtntiirgtifefl in genau der gleichen Wtiee wie iß Bflbpitl 7 aufgeführt, Di« rerwtndete Keinrüohtlöeung war die gltiohe wie in Beispiel 1, wobei jtdooh im Haupt-

ORIGINAL

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züohtmedium 0,01-Tween 40 (Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat) anstelle von Aminon 295 verwendet wurde und 0,05$ Emanon 3115 (Polyoxyäthylenglykölmonostearat). Nach 40 Stunden hatten sich 67,2 mg/ml an L-Glutaminsäure angesammelt} die Ausbeute betrug, bezogen auf den verwendeten Zucker, 56,ι

Beispiel 9

Unter Benutzung von Miorobaoterium ammonlaphilum wurde ein· Sohütteizüohtung unter Verwendung desselben Keimzüohtmediums wie in Beispiel 1 ausgeführt, 750 ml hiervon wurden in einen 100 Liter Züchttank eingeimpft, der mit 40 Litern Züohtmedium beschickt war, das seinerseits dieselbe Zusammensetzung wie die zweite Stufe aufwies, um hierin die Züohtung unter aerobisohen Bedingungen bei konstanter Umrührung auszuführen? 25 Liter

■x

hiervon wurden in einen m Züohttank eingeimpft, der mit 500 Litern des nachstehend aufgeführten Hauptzüohtmediums beschiokt war; unter Einsteuerung des pH^Wertes mit Ammoniakgas auf 8 wurde eine VergärungsZüchtung während 40 Stunden unter aerobisohen Bedingungen und Umrührung durchgeführt.

Die nach Beendigung der Züchtung anwesende Menge an L-Glutaminsäure betrug 66,4 mg/ml$ die Ausbeute, bezogen auf den verwendeten Zucker, betrug 53,196·

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Zusammensetzung des Hauptzuchtmediums:

Rübenmelasse (als Gesamtkohlehydrat) 12.5$ PO₄ O

Iween 40 O

(Polyoxyäthylensorbitan-

monopalmitat),

Beispiel 10

Es wurde Miorobacterium ammoniaphilum verwendet; eine Sohüttelzüchtung wurde unter Benutzung desselben Keimzüchtmediums wie in Beispiel 1 ausgeführt} 500 ml hiervon wurden in einen Züchttank eingeimpft, der 7 Liter Keimzüchtmedium mit derselben Zusammensetzung wie in der zweiten Stufe enthielt} die Züchtung wurde unter aerobisohen und Umrührungs-Bedingungen ausgeführt; die gesamte Menge hiervon wurde in einen Züchttank eingeimpft, der 350 Liter Keimzüchtmedium mit der nämlichen Zusammensetzung enthielt} hierauf wurde eine Keimzüchtung unter aerobischen Bedingungen mit Umrührung ausgeführt.

Für die HauptZüchtung wurde ein 10 m Züohttank verwendet, der 7000 Liter ZÜohtmedium mit der nachstehenden Zusammensetzung enthielt. Die gesamte Menge der Züohtflüssigkeit wurde nach Beendigung der Keimzüohtung eingeimpft; die Züchtung wurde

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hierauf unter aerobisohen und Umrührungs-Verhältnissen bei 3O⁰O ausgeführt.

Während der Vergärung wurde eine Züchtung ausgeführt, wobei der pH-Wert mit Ammoniakgas auf 8 eingestellt wurde· TJm die Zuokerkoneentration im Züohtmedium auf etwa 1$ zu halten, wurde von der 16. Stunde an eine Lösung mit einer Gesamtzuokerkoneentration von 45?G kontinuierlich zusätzlich eingeführt. Auf diese Weise wurden 45 Stunden später eine Ansammlung von 73»6 mg/ml L-Glutaminsäure im Züohtmedium festgestellt. Die Ausbeute, bezogen auf den verwendeten Zucker, betrug 54,

Zusammensetzung des Hauptzüchtmediumst Rübenmelaase (als Gesamtkohlehydrat) 5·0#

Emanon 3115 0«2fi

(PolyoXyäthvlenglykol-

xaonostearat)

Beidpi·! 11

Unter Terwendung von Miorobaoterium anmoniaphilua wurde dlt Züohtung in tints 20 Littr ?tratntitrgtfä0 wit in Btitpitl 7 •ungeführt» Da· Ktiaeüohteedium wurdt to tingtittllt, 4afl ti die gleloh· Zuiaeatnetteung wit in Btitpiel 1 hmtt·,

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während die Züchtung mit den Reagenzien ausgeführt wurde, wie sie für die Hauptzüchtung verwendet wurden. Diese Reagenzien waren ähnlich. Es wurden jedoch 0,075$ Polyoxyäthylenstearylamin, anstelle von Aminon 295» betainisiert als oberflächenaktives Reagenz ΪΧ-1177» zugegeben. 40 Stunden später wurde eine Ansammlung von 65,6 mg/ml an L-Glutaminsäure im Züchtmedium beobachtet; die Ausbeute,bezogen auf den verwendeten Zucker, betrug 54,4$.

Beispiel 12

Unter Verwendung von Microbacterium ammoniaphilum wurde die Züchtung in einem 20 Liter Vergärungsgefäß in genau der gleichen Weise wie in'Beispiel 7 ausgeführt. Hinsichtlich der verwendeten Reagenzien ging die Vergärung unter Verwendung der nachfolgenden Züchtmediumzusammensetzung unter Zusatz von PE 64 (Polyoxyäthylenphenylather) vonstatten. Haoh 40 Stunden wurden in der Zuchtlösung 50,8 mg/ml an L-Glutaminsäure festgestellt; die Ausbeute, bezogen auf den verwendeten Zucker, betrug 52,

Haupt züchtme dium:

Rübenmelasse (als Gesamtkohlehydrat) KH₂PO₄

Newpoul PE 64 0.1$

(Pdlyoxyäthylenphenyläther)

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Beispiel 13

Unter Verwendung von Miorobacterium ammoniaplailum wurde die Fermentation in einem Yergärungsgefäß in genau der gleichen Weise wie in Beispiel 7 ausgeführt j in diesem Falle kam jedoch die nachstehende Zusammensetzung des Hauptzüchtmediums zur Anwendung·

Zusammensetzung des Hauptzüohtmediums: Rübeiraelasse (als Gesamtkohlehydrat)

0.2<fo

₂ O.O596

(JSH₄)₂SO₄ 0.1$

Stearylaloohol 0·1

Während der Fermentation wurde der pH-Wert mit Ammoniaklösung auf 8 eingestellt, während die Züchtung unter aerobisohen Bedingungen und Umrührung "bei'30⁰O ausgeführt wurde. Nach 40 Stunden betrug die Ansammlung an L-GIutaminsäure 4-5,0 mg/ml; die Ausbeute ,bezogen auf den verwendeten Zucker, lag bei 45$.

Beispiel 14

Zusammensetzung des Hauptzüohtmediumsχ Hübenmelasse (als Gesamtkohlehydrat) 1O₁

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0.2$ MgSO₄«7H₂O 0.1$

Diapon T 0.

(Alkylamidnatriumaulfonat)

Die Züchtung wurde in einem 20 Liter Tergärungsgefäß unter Verwendung von Microbacterium ammoniaphilum in genau der gleichen Weise wie in Beispiel 7 ausgeführt. In diesem Pail kam die obenerwähnte Zusammensetzung 'des Hauptzüchtmediums zur Anwendung, dem als Reagenz Alkylamidnatriumsulfonat zugegeben war·

Nach 40 Stunden wurde die Bildung und Ansammlung von 51,0 mg/ml an !-Glutaminsäure beobachtet; die Ausbeute,bezogen auf den verwendeten Zucker, betrug 51 »<

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Claims (8)

Patentansprüche

1. ) Verfahren zur Herstellung von L-G-lutaminsäure, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlehydratmaterial Melassen (Rübennebenprodukte) verwendet werden, daß ein Ztichtmedium unter Zugabe einer oder mehrerer Arten von oberflächenaktiven Reagenzien oder höheren Alkoholen als Bestandteile des Züchtmediums hergestellt wird, und daß hierauf !-Glutaminsäure produzierende Mikroorganismen, welche für ihr Wachstum Biotin benötigen, eingeimpft und gezüchtet werden, so daß sioh schließlich L-Glutaminsäure im Züchtmedium ansammelt,

2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als oberflächenaktive Reagenzien kationische, anionische nichtionische und amphotere oberflächenaktive Stoffe verwendet werden.

3, Verfahren naoh Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die nachfolgenden oberflächenaktiven Reagenzien verwendet werdent

Polyoxyäthylensorbitanmonopalmitat;
Polyoxyäthyleneorbitanmonostearat;
Sorbitanmonolaurat;

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Sorbitanmonostearat;

Polyoxyäthylenglykolmonostearat 5

Poly oxy äthylenphenyläther;

Polyoxyäthylenalkylamin;

betainartige amphotere oberflächenaktive Stoffe und fettsäureamidsulfonatartige anionische oberflächenaktive Stoffe.

4· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß höhere Alkohole verwendet werden, insbesondere Alkylalkohole, deren Alkylradikal Stearyl-, Palmityl- und Lauryl- ist.

5. Verfahren nach einem der voranstellenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Liikr ο Organismus aus der Gruppe genus Mikrobaoterium, genus Micrococeus, genus Brevibacterium, genus Gorynebacterium verwendet wird«,

6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlehydratmat.erial Rübenmelasse oder Glukose (Dextrose) verwendet wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als Kohlehydratmaterial eine Mischung aus Eübenmelasse und Glukose verwendet wird.

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-29- 14Λ2195

8. Verfahren nach einem oder mehreren der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Gesamtkohlehydrat 5$ an Rübenmelasse eingegeben wird, und daß die Vergärung dadurch gesteuert wird, daß zusätzlich Zucker eingespeist wird, wenn nach Beginn der Züchtung die Zuckerkonzentration einen Wert von etwa λ°/ο erreidht hat.

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