DE1218076T1 - Verfahren zur reinigung von sequentiellen reaktionsprodukten durch ultrafiltration bei konstantem differentialdruck - Google Patents
Verfahren zur reinigung von sequentiellen reaktionsprodukten durch ultrafiltration bei konstantem differentialdruckInfo
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Claims (33)
1. Verfahren zur Aufreinigung eines Sequenzierungsreaktionsgemischs,
das zur Entfernung von kontaminierenden Stoffen aus einem Sequenzierungsreaktionsgemisch geeignet
ist, mit den folgenden Stufen:
Bereitstellen einer Menge des Sequenzierungsreaktionsprodukts;
Bereitstellen von mindestens einer Ultrafiltrationsmembran
mit mindestens einer Oberfläche; Übertragen des suspendierten Sequenzierungsreaktionsprodukts
auf die Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran ; und
Anlegen einer ersten konstanten Druckdifferenz an die
Ultrafiltrationsmembran mit einer Kraft, durch die ein im wesentlichen von den kontaminierenden Stoffen freies
Sequenzierungsreaktionsprodukt produziert werden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ultrafiltrationsmembran
einen Molekulargewichtscutoff zwischen etwa 1000 und 30000 Dalton aufweist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Ultrafiltrationsmembran
einen Molekulargewichtscutoff zwischen etwa 3000 und 15000 Dalton aufweist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe des
Suspendierens der Menge des Sequenzierungsreaktionsprodukts in einem ersten Lösemittel umfasst.
5 5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Stufe des Suspen-
dierens der Menge des Sequenzierungsreaktionsprodukts in einem Lösemittel die Zugabe von einem oder mehreren
Lösemitteln, die aus einer Gruppe von Formamid, EDTA und Wasser ausgewählt sind, zum Sequenzierungsreaktionsgemisch
umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Stufe des Anlegens einer konstanten Druckdifferenz an die Ultrafiltrationsmembran
das Anlegen einer kraft zwischen etwa 5 und 28 Zoll Quecksilber umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, das ferner die Stufen Waschen des im wesentlichen von den kontaminierenden
Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts mit einem zweiten Lösemittel; und
Anlegen einer zweiten konstanten Druckdifferenz an die
Ultrafiltrationsmembran umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die zweite konstante Druckdifferenz mit einer Kraft zwischen etwa 5 und 28
Zoll Quecksilber angelegt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das zweite Lösemittel ein oder mehrere Lösemittel, die aus der Gruppe von
Formamid, Wasser und EDTA ausgewählt sind, umfasst.
10. Verfahren nach Anspruch 7, das ferner die Stufen Waschen des im wesentlichen von den kontaminierenden
Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts mit ei-0 nem dritten Lösemittel; und
Anlegen einer dritten konstanten Druckdifferenz an die
Ultrafiltrationsmembran umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das dritte Lösemittel
ein oder mehrere Lösemittel, die aus der Gruppe
DE/&Eacgr;&Rgr; T 218 076 T1
von Wasser, Formamid und EDTA ausgewählt sind, umfasst .
12. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die dritte konstante
Druckdifferenz mit einer Kraft zwischen etwa 5 und 28
Zoll Quecksilber angelegt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe der Gewinnung des im wesentlichen von den kontaminierenden
Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts durch Abpipettieren der Oberfläche der Membran umfasst.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei ein Vakuum von etwa
5 Zoll Quecksilber angelegt wird, während die Oberfläehe der Membran abpipettiert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kontaminierenden Stoffe Salze umfassen und wobei die Stufe des Anlegens
einer ersten konstanten Druckdifferenz an die Ultrafiltrationsmembran
das Anlegen einer Kraft, durch die ein im wesentlichen von Salzen freies Sequenzierungsreaktionsprodukt
produziert werden kann, umfasst.
16. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die kontaminierenden Stoffe Farbstoffterminatoren umfassen und wobei die
Stufe des Anlegens einer ersten konstanten Druckdifferenz an die Ultrafiltrationsmembran das Anlegen einer
Kraft, durch die ein im wesentlichen von Farbstoffterminatoren
freies Sequenzierungsreaktionsprodukt produ-0 ziert werden kann, umfasst.
17. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Ultrafiltrationsmembran
eine stromaufwärtige und stromabwärtige Oberfläche
aufweist und wobei das suspendierte Sequenzie-5 rungsreaktionsprodukt zur stromaufwärtigen Oberfläche
7-fj7-i;V DE/&Eacgr;&Rgr; t 218076 Tl
transportiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, das ferner die Stufe der Gewinnung des im wesentlichen von den kontaminierenden
Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts durch Abpipettieren der stromaufwärtigen Oberfläche der Membran
umfasst.
19. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe der
Gewinnung des im wesentlichen von den kontaminierenden Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts durch
eine oder mehrere Stufen, die aus der Gruppe von Pipettieren, Diffusion, Rühren und elektrokinetischem
Transport ausgewählt sind, umfasst.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei ein Vakuum von etwa 5 Zoll Quecksilber während der Gewinnungsstufe angelegt
wird.
21. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe des
Waschens des Sequenzierungsprodukts mit einem oder mehreren Salzen, die Natriumionen von dem Produkt verdrängen
können, umfasst.
22. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe des Resuspendierens des im wesentlichen von einem oder
mehreren der kontaminierenden Stoffe freien Sequenzierungsprodukts in einer zur Kristallisation fähigen Matrix
umfasst.
23. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe des Resuspendierens des im wesentlichen von einem oder
mehreren der kontaminierenden Stoffe freien Sequenzierungsprodukts in Wasser umfasst.
•;:\ü7.f!VDE/EPi218076T1
24. Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Stufe des Resuspendierens des im wesentlichen von einem oder
mehreren der kontaminierenden Stoffe freien Sequenzierungsprodukts in einem oder mehreren flüchtigen Lösemitteln
umfasst.
25. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Sequenzierungsreaktionsprodukt
eines oder mehrere Einzelnucleotidpolymorphismen umfasst.
26. Verfahren zur Aufreinigung eines Sequenzierungsreaktionsgemischs,
das zur Entfernung von kontaminierenden Stoffen aus einem Sequenzierungsreaktionsgemisch geeignet
ist, mit den Stufen:
Bereitstellen einer Menge des Sequenzierungsreaktionsprodukts;
Suspendieren der Menge des Sequenzierungsreaktionsprodukts
in einem oder mehreren Lösemitteln, die aus der Gruppe von Formamid, EDTA und Wasser ausgewählt sind;
Bereitstellen von mindestens einer Ultrafiltrationsmembran mit mindestens einer Oberfläche;
Übertragen des suspendierten Sequenzierungsreaktionsprodukts auf die Oberfläche der Ultrafiltrationsmembran
; und
Anlegen einer ersten konstanten Druckdifferenz an die
Ultrafiltrationsmembran mit einer Kraft zwischen etwa 5 und 28 Zoll Quecksilber zur Produktion eines im wesentlichen
von den kontaminierenden Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts.
27. Verfahren nach Anspruch 26, das ferner die Stufen Waschen des im wesentlichen von den kontaminierenden
Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts mit einem zweiten Lösemittel; und
5 Anlegen einer zweiten konstanten Druckdifferenz an die
DE/ EP 1218076T1
Ultrafiltrationsmembran mit einer Kraft zwischen etwa
5 und 28 Zoll Quecksilber umfasst.
28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das zweite Lösemittel
ein oder mehrere Lösemittel, die aus der Gruppe von Formamid, Wasser und EDTA ausgewählt sind, umfasst
.
29. Verfahren nach Anspruch 28, das ferner die Stufen
Waschen des im wesentlichen von den kontaminierenden Stoffen freien Sequenzierungsreaktionsprodukts mit einem
dritten Lösemittel; und
Anlegen einer dritten konstanten Druckdifferenz an die
Ultrafiltrationsmembran umfasst.
30. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die kontaminierenden Stoffe ein oder mehrere Salze und ein oder mehrere
Farbstoffterminatoren umfassen und wobei die Stufe des
Anlegens einer ersten konstanten Druckdifferenz an die Ultrafiltrationsmembran das Anlegen einer Kraft, durch
die das im wesentlichen von den Salzen und den Farbstoff terminatoren freie Sequenzierungsreaktionsprodukt
produziert werden kann, umfasst.
31. Verfahren nach Anspruch 26, das ferner die Stufe des Resuspendierens des im wesentlichen von einem oder
mehreren der kontaminierenden Stoffe freien Sec[uenzierungsprodukts
in einer zur Kristallisation fähigen Matrix umfasst.
32. Verfahren nach Anspruch 26, das ferner die Stufe des Resuspendierens des im wesentlichen von einem oder
mehreren der kontaminierenden Stoffe freien Sequenzierungsprodukts in einem oder mehreren flüchtigen Lösemitteln
umfasst.
33. Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Sequenzierungsreaktionsprodukt
eine oder mehrere Einzelnucleotidpolymorphismen umfasst.
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5
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