JP2003509036A - 定差圧限外濾過による配列決定反応物の浄化方法 - Google Patents
定差圧限外濾過による配列決定反応物の浄化方法Info
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Abstract
(57)【要約】
汚染物を配列決定反応物から除去するために適合された配列決定反応物浄化方法であって、規定量の配列決定反応生成物を用意し;少なくとも一の表面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し;懸濁させた配列決定反応生成物をこの限外濾過膜の表面に移し;そして第一の定差圧をこの限外濾過膜に、汚染物を実質的に含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力で適用するステップを含む当該浄化方法。
Description
【０００１】発明の分野
この発明は、限外濾過方法に関するものである。一層詳細には、この発明は、
配列決定反応物を精製する方法に関するものである。
配列決定反応物を精製する方法に関するものである。
【０００２】発明の背景
小型の装置を用いる限外濾過は、ＤＮＡ及びタンパク質研究において用いられ
る標準的手順となりつつあり、必要とする物質は、着実に、ますます少量となっ
ている。限外濾過方法は、過去においては、遠心力に依存して、液体成分を限外
濾過膜を通して濾過した。しかしながら、必要とされる物質の量がだんだん少量
になるにつれて、遠心分離法は、特に、自動化に貢献しないので、もはや現在の
需要に適合しない。
る標準的手順となりつつあり、必要とする物質は、着実に、ますます少量となっ
ている。限外濾過方法は、過去においては、遠心力に依存して、液体成分を限外
濾過膜を通して濾過した。しかしながら、必要とされる物質の量がだんだん少量
になるにつれて、遠心分離法は、特に、自動化に貢献しないので、もはや現在の
需要に適合しない。
【０００３】
特に、例えば、ＤＮＡ配列決定反応物は、配列決定装置例えばPE Biosystems
のモデルＡＢＩ３７７及びＡＢＩ３７００、Amersham Pharmacia BiotechのＭｅ
ｇａＢＡＣＥ１０００及びBeckmanのＣＥＱ２０００上で行う自動化蛍光シーケ
ンシング(ＡＦＳ)による分析の前に精製しなければならない。後者の３つの高ス
ループットキャピラリー電気泳動用装置の導入は、試料純度と操作要件に新たな
要求をもたらした。
のモデルＡＢＩ３７７及びＡＢＩ３７００、Amersham Pharmacia BiotechのＭｅ
ｇａＢＡＣＥ１０００及びBeckmanのＣＥＱ２０００上で行う自動化蛍光シーケ
ンシング(ＡＦＳ)による分析の前に精製しなければならない。後者の３つの高ス
ループットキャピラリー電気泳動用装置の導入は、試料純度と操作要件に新たな
要求をもたらした。
【０００４】
精製は、電気泳動分離中に配列決定用生成物の分離を邪魔する汚染物質がＤＮ
Ａ配列の全部又は幾らかの決定を妨害するので必要とされる。これらの邪魔する
汚染物質の正体は、部分的に、配列決定用生成物を蛍光検出のために標識するの
に用いられる配列決定用化学(例えば、染料プライマー又は染料ターミネーター
化学)、及び標識された配列決定用生成物の電気泳動的分離に用いられるＤＮＡ
配列決定用装置の型(例えば、スラブ型ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキ
ャピラリー電気泳動)によって決まる。
Ａ配列の全部又は幾らかの決定を妨害するので必要とされる。これらの邪魔する
汚染物質の正体は、部分的に、配列決定用生成物を蛍光検出のために標識するの
に用いられる配列決定用化学(例えば、染料プライマー又は染料ターミネーター
化学)、及び標識された配列決定用生成物の電気泳動的分離に用いられるＤＮＡ
配列決定用装置の型(例えば、スラブ型ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はキ
ャピラリー電気泳動)によって決まる。
【０００５】
染料ターミネーターは、一度塩基特異的な仕方で取り込まれたならば配列決定
用生成物の更なる重合を阻止する蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド三リン
酸(ｄｄＮＴＰ)である。プライマー、テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰ緩衝液、塩及び染料ターミネーターは、約１０〜１２００ヌクレオチド長に
及ぶ配列決定用生成物の生成を与えるのに十分な濃度で配列決定用反応に添加す
る。染料ターミネーターは、ＤＮＡポリメラーゼの天然の基質ではないので、そ
れらの重合中の配列決定用生成物中への取り込みを確実にするには、天然のｄＮ
ＴＰ基質に比べて高濃度を与えなければならない。この効率の悪い取り込みの結
果は、反応が完結した後において、多量の取り込まれない染料ターミネーターが
以前として存在することである。取り込まれない染料ターミネーターは、電気泳
動中、短い配列決定用生成物と共に移動して、配列分析を邪魔する様々なアーテ
ィファクトを生じる。
用生成物の更なる重合を阻止する蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド三リン
酸(ｄｄＮＴＰ)である。プライマー、テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰ緩衝液、塩及び染料ターミネーターは、約１０〜１２００ヌクレオチド長に
及ぶ配列決定用生成物の生成を与えるのに十分な濃度で配列決定用反応に添加す
る。染料ターミネーターは、ＤＮＡポリメラーゼの天然の基質ではないので、そ
れらの重合中の配列決定用生成物中への取り込みを確実にするには、天然のｄＮ
ＴＰ基質に比べて高濃度を与えなければならない。この効率の悪い取り込みの結
果は、反応が完結した後において、多量の取り込まれない染料ターミネーターが
以前として存在することである。取り込まれない染料ターミネーターは、電気泳
動中、短い配列決定用生成物と共に移動して、配列分析を邪魔する様々なアーテ
ィファクトを生じる。
【０００６】
取り込まれなかった染料ターミネーターを電気泳動前に配列決定用反応物から
除去する最も一般的な方法は、アルコール沈殿(典型的には、エタノールを使用)
及びゲル濾過である。しかしながら、塩は、キャピラリー配列決定用装置上への
動電学的注入について、配列決定用生成物と競争し、やはり除去しなければなら
ない。配列決定用生成物の動電学的注入の効率は、塩濃度と反比例するので、エ
タノール沈殿は、キャピラリー電気泳動前に試料を調製するための方法としての
その有用性を減じる乏しい塩除去能力を有する。それ故、これらの塩を除去する
目的のために、アルコール沈殿は、試料調製のための不十分で変化しやすい方法
である。ゲル濾過は、塩を除去するためのアルコール沈殿より適した方法である
が、ゲル濾過とアルコール沈殿の両者は、遠心分離に基づく方法であり、記した
ように、これは自動化するのが困難である。遠心分離法は、しばしば、旧式のス
ラブゲル配列決定用装置で実施する低スループットのＤＮＡ配列決定には十分な
ものであるが、ゲノム産業は、ＤＮＡ配列決定を、遠心分離による試料調製法が
もはや実際的でなく又は十分に強力でない点にまで大規模化しつつある。猛烈な
競争と新規な高スループットのキャピラリーＤＮＡ配列決定装置にあおられて、
ゲノム産業は、新しい試料純度、自動化許容性及び高スループットを求めている
。しかしながら、かかる自動化可能な方法(塩及び染料ターミネーターを除去す
ることのできるもの)は、現在、利用可能でない。
除去する最も一般的な方法は、アルコール沈殿(典型的には、エタノールを使用)
及びゲル濾過である。しかしながら、塩は、キャピラリー配列決定用装置上への
動電学的注入について、配列決定用生成物と競争し、やはり除去しなければなら
ない。配列決定用生成物の動電学的注入の効率は、塩濃度と反比例するので、エ
タノール沈殿は、キャピラリー電気泳動前に試料を調製するための方法としての
その有用性を減じる乏しい塩除去能力を有する。それ故、これらの塩を除去する
目的のために、アルコール沈殿は、試料調製のための不十分で変化しやすい方法
である。ゲル濾過は、塩を除去するためのアルコール沈殿より適した方法である
が、ゲル濾過とアルコール沈殿の両者は、遠心分離に基づく方法であり、記した
ように、これは自動化するのが困難である。遠心分離法は、しばしば、旧式のス
ラブゲル配列決定用装置で実施する低スループットのＤＮＡ配列決定には十分な
ものであるが、ゲノム産業は、ＤＮＡ配列決定を、遠心分離による試料調製法が
もはや実際的でなく又は十分に強力でない点にまで大規模化しつつある。猛烈な
競争と新規な高スループットのキャピラリーＤＮＡ配列決定装置にあおられて、
ゲノム産業は、新しい試料純度、自動化許容性及び高スループットを求めている
。しかしながら、かかる自動化可能な方法(塩及び染料ターミネーターを除去す
ることのできるもの)は、現在、利用可能でない。
【０００７】
同様に、精製プライマー伸長生成物も又、ゲル分析(例えば、キャピラリー電
気泳動)により又は質量分析により分析することができる。例えば、単一ヌクレ
オチド多形(ＳＮＰ)は、集団内の個体を遺伝的に区別し、それ故、同義遺伝子の
相互作用により引き起こされる病気のマーカーとして機能しうる単一塩基の差異
である。プライマー伸長反応の差次的停止は、ＳＮＰ検出のための一般的に用い
られる方法であり、それにより、ジデオキシヌクレオチド類似体が配列変異部位
に取り込まれる。プライマー伸長反応物は、中間の長さのジデオキシ停止された
配列決定用ラダーを生成するために用いられる配列決定反応と同じ多くの成分を
含む。それ故、同じ汚染物質を同様に分析前に除去しなければならない。これら
の汚染物質は、塩及びジデオキシターミネーターを含みうる(これらの両者は、
限外濾過膜を通過するが、プライマー伸長生成物は通過しない)。
気泳動)により又は質量分析により分析することができる。例えば、単一ヌクレ
オチド多形(ＳＮＰ)は、集団内の個体を遺伝的に区別し、それ故、同義遺伝子の
相互作用により引き起こされる病気のマーカーとして機能しうる単一塩基の差異
である。プライマー伸長反応の差次的停止は、ＳＮＰ検出のための一般的に用い
られる方法であり、それにより、ジデオキシヌクレオチド類似体が配列変異部位
に取り込まれる。プライマー伸長反応物は、中間の長さのジデオキシ停止された
配列決定用ラダーを生成するために用いられる配列決定反応と同じ多くの成分を
含む。それ故、同じ汚染物質を同様に分析前に除去しなければならない。これら
の汚染物質は、塩及びジデオキシターミネーターを含みうる(これらの両者は、
限外濾過膜を通過するが、プライマー伸長生成物は通過しない)。
【０００８】
発明の要約
それ故、ＤＮＡ配列決定反応物を精製する方法及び自動化可能なＳＮＰアッセ
イを提供することは、この発明の第一の目的である。
イを提供することは、この発明の第一の目的である。
【０００９】
塩及び染料ターミネーターを除去することのできる限外濾過の自動化方法を提
供することは、この発明の更なる目的である。
供することは、この発明の更なる目的である。
【００１０】
一層大きな試料純度及び回収率を生じうる限外濾過方法を提供することは、こ
の発明の更なる目的である。
の発明の更なる目的である。
【００１１】
高スループットの限外濾過方法を提供することは、この発明の更なる目的であ
る。
る。
【００１２】
高スループットの塩及び染料ターミネーターをＤＮＡ配列決定反応物から除去
する自動化方法を提供することは、この発明の更なる目的である。
する自動化方法を提供することは、この発明の更なる目的である。
【００１３】
アルコール沈殿よりも一層効率的で徹底的な、塩をＤＮＡ配列決定反応物から
除去する方法を提供することは、この発明の更なる目的である。
除去する方法を提供することは、この発明の更なる目的である。
【００１４】
この発明の方法は、自動化可能で高スループットの限外濾過ベースの配列決定
反応物の浄化方法を開発する努力の結果である。塩及び染料ターミネーターなど
の不純物の分離は、一般的な実験室の装置を用いて真空によって駆動することが
でき、従って、自動化しやすい。歴史的には、遠心分離装置中の限外濾過膜を用
いて、低分子量の汚染物が一層高分子量の溶質から除去されたが、分画は、時間
を浪費して非効率的でありうる。記したように、ＤＮＡ配列決定反応物の浄化は
、要求の厳しい分離であり、有用なデータを生じるために、組み込まれなかった
蛍光標識及び塩を、ポリメラーゼ伸長生成物から除去しなければならない。十分
な純度を生じ得ない遠心分離式の限外濾過と異なり、この発明の方法では、定差
圧限外濾過を用いて、この臨界的分離を達成する。定差圧限外濾過は、膜及び操
作条件を注意深く制御すれば、高度に純粋な結果を与える。限外濾過膜を用いて
、配列決定用生成物を保持し、組み込まれなかった蛍光標識及び塩類は、定差圧
限外濾過中に該膜を通過する。
反応物の浄化方法を開発する努力の結果である。塩及び染料ターミネーターなど
の不純物の分離は、一般的な実験室の装置を用いて真空によって駆動することが
でき、従って、自動化しやすい。歴史的には、遠心分離装置中の限外濾過膜を用
いて、低分子量の汚染物が一層高分子量の溶質から除去されたが、分画は、時間
を浪費して非効率的でありうる。記したように、ＤＮＡ配列決定反応物の浄化は
、要求の厳しい分離であり、有用なデータを生じるために、組み込まれなかった
蛍光標識及び塩を、ポリメラーゼ伸長生成物から除去しなければならない。十分
な純度を生じ得ない遠心分離式の限外濾過と異なり、この発明の方法では、定差
圧限外濾過を用いて、この臨界的分離を達成する。定差圧限外濾過は、膜及び操
作条件を注意深く制御すれば、高度に純粋な結果を与える。限外濾過膜を用いて
、配列決定用生成物を保持し、組み込まれなかった蛍光標識及び塩類は、定差圧
限外濾過中に該膜を通過する。
【００１５】
記したように、定差圧限外濾過は、優れた塩類除去、蛍光標識除去及び配列決
定反応生成物の回収率を容易に自動化される形式で与える。この方法で用いる真
空ベースの又は陽圧ベースのマニホールドは、遠心分離式の限外濾過よりも自動
化するのが一層容易である。やはり、精製された配列決定反応物への完全なトッ
プアクセス(濾液収集能力は必要ない)も、限外濾過膜表面からの直接的な動電学
的注入を可能にし、それにより、試料の処理を単純化して他の消耗品の必要性を
減じる。この配列決定反応物を処理するための新規なプロトコールの開発は又、
ＤＮＡ配列で得たの分析を邪魔するアーティファクトをも排除する。
定反応生成物の回収率を容易に自動化される形式で与える。この方法で用いる真
空ベースの又は陽圧ベースのマニホールドは、遠心分離式の限外濾過よりも自動
化するのが一層容易である。やはり、精製された配列決定反応物への完全なトッ
プアクセス(濾液収集能力は必要ない)も、限外濾過膜表面からの直接的な動電学
的注入を可能にし、それにより、試料の処理を単純化して他の消耗品の必要性を
減じる。この配列決定反応物を処理するための新規なプロトコールの開発は又、
ＤＮＡ配列で得たの分析を邪魔するアーティファクトをも排除する。
【００１６】
汚染物を配列決定反応物から除去するために適合されたこの発明の配列決定反
応物の浄化のための好適な方法は、配列決定反応生成物の規定量を用意し;少な
くとも一つの面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し;配列決定反応生成
物を限外濾過膜表面に移し；そして第一の定差圧を限外濾過膜に、実質的に汚染
物を含まない配列決定反応物を生成しうる力で加えるステップを含む。この方法
の目的のために、用語「生成物」は、粗試料から部分精製された試料までの変化
する純度の試料を含んでよく、液体及び／又は固体を含んでよい。やはり、用語
「配列決定反応」も又、ジデオキシヌクレオチド又は修飾されたジデオキシヌク
レオチドで終端した核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含むことがで
きる。例えば、用語「配列決定反応」は、プライマー伸長反応を含むことができ
る。この発明の方法は、配列決定反応物の濃縮及び精製の過程の任意の時点で(
例えば、テンプレートを含む粗試料を用いる開始時点で、又は精製プロセスの終
わりに向けて、最終精製ステップとして)用いることができる。この限外濾過膜
は、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量を有してよく、好ましくは、約
３，０００〜１５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する。除去すべき汚
染物が塩及び／又は染料ターミネーターを含む場合には、第一の定差圧を限外濾
過膜に加えるステップは、好ましくは、実質的に塩類及び／又は染料ターミネー
ターを含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を加えることを含
む。
応物の浄化のための好適な方法は、配列決定反応生成物の規定量を用意し;少な
くとも一つの面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し;配列決定反応生成
物を限外濾過膜表面に移し；そして第一の定差圧を限外濾過膜に、実質的に汚染
物を含まない配列決定反応物を生成しうる力で加えるステップを含む。この方法
の目的のために、用語「生成物」は、粗試料から部分精製された試料までの変化
する純度の試料を含んでよく、液体及び／又は固体を含んでよい。やはり、用語
「配列決定反応」も又、ジデオキシヌクレオチド又は修飾されたジデオキシヌク
レオチドで終端した核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含むことがで
きる。例えば、用語「配列決定反応」は、プライマー伸長反応を含むことができ
る。この発明の方法は、配列決定反応物の濃縮及び精製の過程の任意の時点で(
例えば、テンプレートを含む粗試料を用いる開始時点で、又は精製プロセスの終
わりに向けて、最終精製ステップとして)用いることができる。この限外濾過膜
は、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量を有してよく、好ましくは、約
３，０００〜１５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する。除去すべき汚
染物が塩及び／又は染料ターミネーターを含む場合には、第一の定差圧を限外濾
過膜に加えるステップは、好ましくは、実質的に塩類及び／又は染料ターミネー
ターを含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を加えることを含
む。
【００１７】
この方法は、更に、ある量の配列決定反応生成物を規定容量の第一の溶剤中に
懸濁させるステップを含むことができる。ある量の配列決定反応生成物を規定容
積の溶剤に懸濁させるステップは、１０〜１５％のホルムアミド、０．５ｍＭ以
下のＥＤＴＡ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含む(但し、これらに限らない)少なくとも
一種の溶剤を配列決定反応物に加えることを含んでよい。更に、定差圧を限外濾
過膜に加えるステップは、約５〜２８インチ水銀の真空を適用することを含んで
よく、その場合、この方法は、更に、この汚染物を実質的に含まない配列決定反
応生成物を第２の溶剤で洗浄して；第２の定差圧を限外濾過膜に適用するステッ
プを含むことができ、ここに、第２の定差圧も約５〜２８インチ水銀の力で加え
ることができる。この第２の溶剤は、好ましくは、ホルムアミド、蒸留水及び／
又はＥＤＴＡを含む。
懸濁させるステップを含むことができる。ある量の配列決定反応生成物を規定容
積の溶剤に懸濁させるステップは、１０〜１５％のホルムアミド、０．５ｍＭ以
下のＥＤＴＡ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含む(但し、これらに限らない)少なくとも
一種の溶剤を配列決定反応物に加えることを含んでよい。更に、定差圧を限外濾
過膜に加えるステップは、約５〜２８インチ水銀の真空を適用することを含んで
よく、その場合、この方法は、更に、この汚染物を実質的に含まない配列決定反
応生成物を第２の溶剤で洗浄して；第２の定差圧を限外濾過膜に適用するステッ
プを含むことができ、ここに、第２の定差圧も約５〜２８インチ水銀の力で加え
ることができる。この第２の溶剤は、好ましくは、ホルムアミド、蒸留水及び／
又はＥＤＴＡを含む。
【００１８】
この方法は、更に、この実質的に汚染物を含まない配列決定反応生成物を第３
の溶剤で洗浄し；第３の定差圧を限外濾過膜に適用するステップを含むこともで
き、ここに、この第３の溶剤は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、ホルムアミド又はＥＤＴＡ
を含むことができる。この第３の定差圧真空は、好ましくは、約５〜２８インチ
水銀の力で加える。
の溶剤で洗浄し；第３の定差圧を限外濾過膜に適用するステップを含むこともで
き、ここに、この第３の溶剤は、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、ホルムアミド又はＥＤＴＡ
を含むことができる。この第３の定差圧真空は、好ましくは、約５〜２８インチ
水銀の力で加える。
【００１９】
この発明の方法は、更に、膜の表面からピペットで吸い取ることにより、汚染
物を実質的に含まない配列決定反応生成物を回収するステップを含むことができ
る。加えて、限外濾過膜は、一般に、上流及び下流面を有し、懸濁された配列決
定反応生成物が上流面に移されて、そこから回収される。この配列決定反応生成
物は、実質的に汚染物を含まず、この膜の保持物表面から、ピペット操作、拡散
、攪拌及び動電学的輸送を含む(これらに限られない)幾つかの方法によって回収
することができる。約５インチ水銀の真空力を、回収ステップ中に加えて、膜下
部構造からの汚染物の保持された物質への逆行を防止することができる。
物を実質的に含まない配列決定反応生成物を回収するステップを含むことができ
る。加えて、限外濾過膜は、一般に、上流及び下流面を有し、懸濁された配列決
定反応生成物が上流面に移されて、そこから回収される。この配列決定反応生成
物は、実質的に汚染物を含まず、この膜の保持物表面から、ピペット操作、拡散
、攪拌及び動電学的輸送を含む(これらに限られない)幾つかの方法によって回収
することができる。約５インチ水銀の真空力を、回収ステップ中に加えて、膜下
部構造からの汚染物の保持された物質への逆行を防止することができる。
【００２０】
生成物を質量分析によって分析するか電気泳動によって分析するかによって、
この方法は、次のステップの少なくとも一つを含むこともできる：該配列決定反
応生成物を、該生成物由来の任意のナトリウムイオンを置換することのできる少
なくとも一種の塩で洗い;該汚染物の少なくとも一種を実質的に含まない該配列
決定反応生成物を結晶化可能なマトリクス中に再懸濁し；該汚染物の少なくとも
一種を実質的に含まない該配列決定反応生成物を、キャピラリー電気泳動による
分析のために、水、ＥＤＴＡ又はホルムアミド中に再懸濁し；又は、該汚染物の
少なくとも一種を実質的に含まない該配列決定反応生成物を、質量分析による分
析のために、少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させる。
この方法は、次のステップの少なくとも一つを含むこともできる：該配列決定反
応生成物を、該生成物由来の任意のナトリウムイオンを置換することのできる少
なくとも一種の塩で洗い;該汚染物の少なくとも一種を実質的に含まない該配列
決定反応生成物を結晶化可能なマトリクス中に再懸濁し；該汚染物の少なくとも
一種を実質的に含まない該配列決定反応生成物を、キャピラリー電気泳動による
分析のために、水、ＥＤＴＡ又はホルムアミド中に再懸濁し；又は、該汚染物の
少なくとも一種を実質的に含まない該配列決定反応生成物を、質量分析による分
析のために、少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させる。
【００２１】
記したように、配列決定反応生成物は、少なくとも一の単一ヌクレオチド多型
を含む(それらに限定されない)ジデオキシヌクレオチド又は修飾ジデオキシヌク
レオチドで終端している核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含むこと
ができる。
を含む(それらに限定されない)ジデオキシヌクレオチド又は修飾ジデオキシヌク
レオチドで終端している核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含むこと
ができる。
【００２２】
配列決定反応物から汚染物を除去するために適合された、配列決定反応物の浄
化のための、この発明の他の好適な方法は、ある量の配列決定反応生成物を用意
し;該量の配列決定反応生成物をホルムアミド、ＥＤＴＡ及び／又はＭｉｌｌｉ
−Ｑ水を含む少なくとも一種の溶剤に懸濁させ；少なくとも一の表面を有する少
なくとも一の限外濾過膜を用意し;該懸濁させた配列決定反応生成物を該限外濾
過膜の該表面に移し;そして第一の定差圧を該限外濾過膜に約５〜２８インチ水
銀の力で加えて該汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成するス
テップを含む。
化のための、この発明の他の好適な方法は、ある量の配列決定反応生成物を用意
し;該量の配列決定反応生成物をホルムアミド、ＥＤＴＡ及び／又はＭｉｌｌｉ
−Ｑ水を含む少なくとも一種の溶剤に懸濁させ；少なくとも一の表面を有する少
なくとも一の限外濾過膜を用意し;該懸濁させた配列決定反応生成物を該限外濾
過膜の該表面に移し;そして第一の定差圧を該限外濾過膜に約５〜２８インチ水
銀の力で加えて該汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成するス
テップを含む。
【００２３】
この方法は、更に、該汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を第２
の溶剤で洗い;そして、第２の定差圧を、該限外濾過膜に、約５〜２８インチ水
銀の力で加えるステップを含むことができ；該第２の溶剤は、好ましくは、ホル
ムアミド、ＥＤＴＡ及び／又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含む。尚更に、この方法は、
該汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を第三の溶剤で洗い;そして
、第三の定差圧を、該限外濾過膜に加えるステップを含むことができ；該汚染物
は、少なくとも一種の塩及び少なくとも一種の染料ターミネーターを含むことが
でき、該第一の定差圧を該限外濾過膜に加えるステップは、該塩及び該染料ター
ミネーターを実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成することのできる力
を加えることを含む。
の溶剤で洗い;そして、第２の定差圧を、該限外濾過膜に、約５〜２８インチ水
銀の力で加えるステップを含むことができ；該第２の溶剤は、好ましくは、ホル
ムアミド、ＥＤＴＡ及び／又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水を含む。尚更に、この方法は、
該汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を第三の溶剤で洗い;そして
、第三の定差圧を、該限外濾過膜に加えるステップを含むことができ；該汚染物
は、少なくとも一種の塩及び少なくとも一種の染料ターミネーターを含むことが
でき、該第一の定差圧を該限外濾過膜に加えるステップは、該塩及び該染料ター
ミネーターを実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成することのできる力
を加えることを含む。
【００２４】
配列決定反応物から汚染物が実質的に浄化された後に、その生成物を、結晶化
可能なマトリクス中に、水、ホルムアミド、ＥＤＴＡ中で又は少なくとも一種の
揮発性溶剤中で再懸濁させることができる。
可能なマトリクス中に、水、ホルムアミド、ＥＤＴＡ中で又は少なくとも一種の
揮発性溶剤中で再懸濁させることができる。
【００２５】
好適な方法の詳細な説明
この発明の方法を配列決定反応物の浄化に適合させ、それにより、汚染物例え
ば塩類及び／又は染料ターミネーターを最終配列決定反応生成物から除去して、
自動化蛍光配列決定装置例えばPerkin Elmer社、Amersham Pharmacia Biotech社
及びBeckman社の高スループットのキャピラリー電気泳動装置を用いて分析する
ことのできる精製されたＤＮＡ配列決定用生成物を生成する。図１は、ここに開
示した約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を用いる
この発明の方法により精製した配列決定用反応生成物試料の、かかるキャピラリ
ー電気泳動装置に由来する電気泳動図の例である。
ば塩類及び／又は染料ターミネーターを最終配列決定反応生成物から除去して、
自動化蛍光配列決定装置例えばPerkin Elmer社、Amersham Pharmacia Biotech社
及びBeckman社の高スループットのキャピラリー電気泳動装置を用いて分析する
ことのできる精製されたＤＮＡ配列決定用生成物を生成する。図１は、ここに開
示した約１０，０００ダルトンの分子量カットオフを有する限外濾過膜を用いる
この発明の方法により精製した配列決定用反応生成物試料の、かかるキャピラリ
ー電気泳動装置に由来する電気泳動図の例である。
【００２６】
この発明の方法は、定差圧を濾過工程の駆動力として利用する。高流量を、こ
の方法の利用に適した殆どの適用について十分な期間にわたって維持することが
できる。この方法は、低容量の出発材料を、遠心分離よりかなり短い時間内に分
離することを可能にする。加えて、定差圧に駆動される限外濾過は、非極性溶質
につき経時的に起きる、遠心分離式の限外濾過に関連した流束減衰を受けない。
故に、定差圧駆動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりもずっと高い濃縮
係数を達成することを可能にする。加えて、たとえ濃縮タンパク質などの非極性
溶質について定差圧駆動式の限外濾過を用いて流束減衰が観察できても、定差圧
駆動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりも殆どの状況において一層速い
。定差圧駆動式限外濾過の工程は、低分子量汚染物を除去するのに遠心分離を用
いた場合にしばしば必要となる時間浪費的な反復希釈及び濾過の必要性を減じ又
は排除する。
の方法の利用に適した殆どの適用について十分な期間にわたって維持することが
できる。この方法は、低容量の出発材料を、遠心分離よりかなり短い時間内に分
離することを可能にする。加えて、定差圧に駆動される限外濾過は、非極性溶質
につき経時的に起きる、遠心分離式の限外濾過に関連した流束減衰を受けない。
故に、定差圧駆動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりもずっと高い濃縮
係数を達成することを可能にする。加えて、たとえ濃縮タンパク質などの非極性
溶質について定差圧駆動式の限外濾過を用いて流束減衰が観察できても、定差圧
駆動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりも殆どの状況において一層速い
。定差圧駆動式限外濾過の工程は、低分子量汚染物を除去するのに遠心分離を用
いた場合にしばしば必要となる時間浪費的な反復希釈及び濾過の必要性を減じ又
は排除する。
【００２７】
「定差圧」とは、陽圧又は陰圧(又は真空)を意味する。常に液体のヘッド高さ
の低下のために経時的に圧力が減少する遠心分離法と異なり、定差圧法において
は、液体に作用する圧力は、濾過サイクル中一定に維持されうる。加えて、圧力
は、それが作用する液体のヘッド高さに依存しないので、濾過プロセスを完了さ
せるために経時的に増加させることさえできる。所望であれば、経時的に減圧す
ることも、この定義内にある。しかしながら、遠心分離と異なって、定差圧は、
かかる減圧を、液体のヘッド高さに無関係に制御することを可能にし、従って、
流束減衰を減じ又は排除する。
の低下のために経時的に圧力が減少する遠心分離法と異なり、定差圧法において
は、液体に作用する圧力は、濾過サイクル中一定に維持されうる。加えて、圧力
は、それが作用する液体のヘッド高さに依存しないので、濾過プロセスを完了さ
せるために経時的に増加させることさえできる。所望であれば、経時的に減圧す
ることも、この定義内にある。しかしながら、遠心分離と異なって、定差圧は、
かかる減圧を、液体のヘッド高さに無関係に制御することを可能にし、従って、
流束減衰を減じ又は排除する。
【００２８】
限外濾過膜は、典型的には、平均細孔寸法よりも、それらの名目分子量カッ
トオフ(即ち、特定の膜を通過することのできる最大寸法の分子)によって評価さ
れる(精密濾過膜と同様)。本発明の方法においては、分子量カットオフは、この
方法を用いる精製プロセス中の時点によって、約１００ダルトン(１００Ｄａ)か
ら５００キロダルトン(５００ｋＤ)に及びうる。限外濾過膜は、ポリアミド、ポ
リスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、セルロース誘導体
、再生セルロース及びポリビニリデンフルオリドを含む(これらに限らない)様々
な材料から作ることができる。それらは、非対照的デザインが好ましいが、対照
的であっても非対照的であってもよい。
トオフ(即ち、特定の膜を通過することのできる最大寸法の分子)によって評価さ
れる(精密濾過膜と同様)。本発明の方法においては、分子量カットオフは、この
方法を用いる精製プロセス中の時点によって、約１００ダルトン(１００Ｄａ)か
ら５００キロダルトン(５００ｋＤ)に及びうる。限外濾過膜は、ポリアミド、ポ
リスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、セルロース誘導体
、再生セルロース及びポリビニリデンフルオリドを含む(これらに限らない)様々
な材料から作ることができる。それらは、非対照的デザインが好ましいが、対照
的であっても非対照的であってもよい。
【００２９】
この発明の方法を用いて、核酸、タンパク質及び他の材料などの典型的に限外
濾過を用いて濾過された生物学的材料を効果的に精製することができる。この方
法は、一般に、完了した配列決定反応生成物をホルムアミド、水及び／又はＥＤ
ＴＡ中に懸濁させ；その懸濁液を、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量
カットオフを有する限外濾過プレートに移し；そしてそのプレートを、最初、約
２５インチ水銀の真空で定差圧にかける。この発明の目的につき、用語「配列決
定反応」は、ジデオキシヌクレオチド又は修飾ジデオキシヌクレオチドで終端し
ている核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含む。かかる修飾ジデオキ
シヌクレオチドの例には、放射性同位元素、蛍光部分又はマスタグ、又は伸長停
止させるジデオキシヌクレオチドの同定及び／又は検出を助成する任意の他の修
飾により修飾されたものが含まれる。特に、例えば、用語「配列決定反応」は、
決定力のない長さのジデオキシ停止された「シーケンシングラダー」を生成する
ために利用されるサンガー型のＤＮＡ配列決定反応、及び遺伝子型別プライマー
の一塩基乃至数塩基下流の位置で意図的にジデオキシ停止されるポリメラーゼ伸
長を包含する。もし単一ヌクレオチド多形(ＳＮＰ)をアッセイするために後者の
方法を用いたならば、４種類のデオキシヌクレオチド(天然のポリメラーゼの基
質)の少なくとも一種が、配列反応から省かれる。これは、決定力のある長さと
予想可能な分子量の配列決定用生成物を生成して、質量(ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質
量分析)又は電気泳動移動度(電気泳動)の重複する断片の生成を伴わない遺伝子
型別プライマーの多重化を可能にするように働く。
濾過を用いて濾過された生物学的材料を効果的に精製することができる。この方
法は、一般に、完了した配列決定反応生成物をホルムアミド、水及び／又はＥＤ
ＴＡ中に懸濁させ；その懸濁液を、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量
カットオフを有する限外濾過プレートに移し；そしてそのプレートを、最初、約
２５インチ水銀の真空で定差圧にかける。この発明の目的につき、用語「配列決
定反応」は、ジデオキシヌクレオチド又は修飾ジデオキシヌクレオチドで終端し
ている核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含む。かかる修飾ジデオキ
シヌクレオチドの例には、放射性同位元素、蛍光部分又はマスタグ、又は伸長停
止させるジデオキシヌクレオチドの同定及び／又は検出を助成する任意の他の修
飾により修飾されたものが含まれる。特に、例えば、用語「配列決定反応」は、
決定力のない長さのジデオキシ停止された「シーケンシングラダー」を生成する
ために利用されるサンガー型のＤＮＡ配列決定反応、及び遺伝子型別プライマー
の一塩基乃至数塩基下流の位置で意図的にジデオキシ停止されるポリメラーゼ伸
長を包含する。もし単一ヌクレオチド多形(ＳＮＰ)をアッセイするために後者の
方法を用いたならば、４種類のデオキシヌクレオチド(天然のポリメラーゼの基
質)の少なくとも一種が、配列反応から省かれる。これは、決定力のある長さと
予想可能な分子量の配列決定用生成物を生成して、質量(ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質
量分析)又は電気泳動移動度(電気泳動)の重複する断片の生成を伴わない遺伝子
型別プライマーの多重化を可能にするように働く。
【００３０】
質量分析を用いて濾過した生成物を分析するならば、適当な塩例えばクエン酸
アンモニウムを用いて、配列決定反応生成物に由来するナトリウムイオンを、質
量分析の前に、洗い又は置換することができる。この配列決定反応生成物は、好
ましくは、質量分析前に、幾つかの別の手段を用いて再懸濁させる(この生成物
を直接結晶化に適したマトリクスに再懸濁させること；限外濾過膜からの生成物
をＭＡＬＤＩターゲット上にスポットする前に水中に再懸濁させ、そのスポット
を乾燥させ、そしてそのスポットを適当なマトリクスと重ねること；又は限外濾
過膜からの生成物をＭＡＬＤＩターゲット上にスポットする前に揮発性溶剤に再
懸濁させることが含まれるが、これらに限らない)。
アンモニウムを用いて、配列決定反応生成物に由来するナトリウムイオンを、質
量分析の前に、洗い又は置換することができる。この配列決定反応生成物は、好
ましくは、質量分析前に、幾つかの別の手段を用いて再懸濁させる(この生成物
を直接結晶化に適したマトリクスに再懸濁させること；限外濾過膜からの生成物
をＭＡＬＤＩターゲット上にスポットする前に水中に再懸濁させ、そのスポット
を乾燥させ、そしてそのスポットを適当なマトリクスと重ねること；又は限外濾
過膜からの生成物をＭＡＬＤＩターゲット上にスポットする前に揮発性溶剤に再
懸濁させることが含まれるが、これらに限らない)。
【００３１】
この方法は、定差圧力を、保持物質に、比較的短時間にわたって、汚染物を、
膜を通して、実質的に一定で且つ効率的な速度で濾過するのに十分な力で適用す
る。適用される力のレベルは、濾過すべき物質の量、膜の分子量カットオフ、膜
の活性な濾過領域、所望の濾過速度及び物質の分極のレベルを含む幾つかの因子
に依存する。配列決定反応生成物について、下記の膜パラメーター及び操作条件
が最高純度を達成し且つ自動化しうるということが見出されている。
膜を通して、実質的に一定で且つ効率的な速度で濾過するのに十分な力で適用す
る。適用される力のレベルは、濾過すべき物質の量、膜の分子量カットオフ、膜
の活性な濾過領域、所望の濾過速度及び物質の分極のレベルを含む幾つかの因子
に依存する。配列決定反応生成物について、下記の膜パラメーター及び操作条件
が最高純度を達成し且つ自動化しうるということが見出されている。
【００３２】
一度配列決定反応生成物を単離したら、サーマルサイクリングプレート内で、
完了した配列決定反応生成物に１０〜１５％ ホルムアミド、≦０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加える。しかし、この発明の方法は、溶剤としては
必ずしもホルムアミド、水又はＥＤＴＡには限られないということに注意された
い。同様の正の効果を有する、当業者に公知の、他の適当な溶剤を利用すること
ができる。
完了した配列決定反応生成物に１０〜１５％ ホルムアミド、≦０．５ｍＭ ＥＤ
ＴＡ及びＭｉｌｌｉ−Ｑ水を加える。しかし、この発明の方法は、溶剤としては
必ずしもホルムアミド、水又はＥＤＴＡには限られないということに注意された
い。同様の正の効果を有する、当業者に公知の、他の適当な溶剤を利用すること
ができる。
【００３３】
懸濁させた反応物質を、次いで、約１〜３０ｋＤの分子量カットオフ(ＭＷＣ
Ｏ)を有する３８４ウェル限外濾過プレートに移す。この限外濾過膜は、好まし
くは、約３〜３０ｋＤの、一層好ましくは約３〜１５ｋＤのＭＷＣＯを有する。
この３８４限外濾過プレートを、次いで、市販の真空マニホールド上に置く。真
空を、約５〜２８インチ水銀で、約２〜５分間にわたって又はこれらのウェルが
空になるまで適用する。
Ｏ)を有する３８４ウェル限外濾過プレートに移す。この限外濾過膜は、好まし
くは、約３〜３０ｋＤの、一層好ましくは約３〜１５ｋＤのＭＷＣＯを有する。
この３８４限外濾過プレートを、次いで、市販の真空マニホールド上に置く。真
空を、約５〜２８インチ水銀で、約２〜５分間にわたって又はこれらのウェルが
空になるまで適用する。
【００３４】
次いで、この保持物を、約１０〜２５μｌの１０〜２５％ ホルムアミド、≦
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び／又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水(Millipore社より市販)を含む
溶剤で２回洗い、真空を、約５〜２８インチ水銀で、同じ時間にわたって、定差
圧力を用いて、２回適用する。この保持物を約１０μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水又は
蒸留水を含む溶剤でもう一度洗い、真空を、約５〜２８インチ水銀で適用する。
次いで、精製された配列決定生成物を、この膜の表面での、約１０μｌのＭｉｌ
ｌｉ−Ｑ水、ホルムアミド又はＥＤＴＡを用いる１〜２０回のピペッティングに
より回収する。約５インチ水銀の弱真空をこの回収ステップにおいて適用するこ
とができる。その生成物を、同様に、少なくとも一の拡散、攪拌及び／又は動電
学的方法を用いて回収することができる。
０．５ｍＭ ＥＤＴＡ及び／又はＭｉｌｌｉ−Ｑ水(Millipore社より市販)を含む
溶剤で２回洗い、真空を、約５〜２８インチ水銀で、同じ時間にわたって、定差
圧力を用いて、２回適用する。この保持物を約１０μｌのＭｉｌｌｉ−Ｑ水又は
蒸留水を含む溶剤でもう一度洗い、真空を、約５〜２８インチ水銀で適用する。
次いで、精製された配列決定生成物を、この膜の表面での、約１０μｌのＭｉｌ
ｌｉ−Ｑ水、ホルムアミド又はＥＤＴＡを用いる１〜２０回のピペッティングに
より回収する。約５インチ水銀の弱真空をこの回収ステップにおいて適用するこ
とができる。その生成物を、同様に、少なくとも一の拡散、攪拌及び／又は動電
学的方法を用いて回収することができる。
【００３５】
当業者は、上記の方法の変法を行って、任意特定の変数を最適化して、所望の
速度、純度、回収率及び自動化のバランスを達成することができる。例えば、こ
の方法の間中の一定の真空を用いて、完全な分離を行うことができよう。テンプ
レートＤＮＡなどの一層高分子量の汚染物を涸渇させる試料予備処理ステップを
考えることもできよう。後者の場合、１００〜５００ｋＤの範囲の分子量カット
オフを有する限外濾過膜を、試料特性(例えば、分子量)、速度、テンプレート除
去効率及び配列決定反応生成物の回収要件の間のバランスに応じて利用するであ
ろう。かかる変法その他(この発明の方法の目的と一致するもの)は、当業者の心
に思い浮かぶものであろうが、以下の請求の範囲内に入るものである。
速度、純度、回収率及び自動化のバランスを達成することができる。例えば、こ
の方法の間中の一定の真空を用いて、完全な分離を行うことができよう。テンプ
レートＤＮＡなどの一層高分子量の汚染物を涸渇させる試料予備処理ステップを
考えることもできよう。後者の場合、１００〜５００ｋＤの範囲の分子量カット
オフを有する限外濾過膜を、試料特性(例えば、分子量)、速度、テンプレート除
去効率及び配列決定反応生成物の回収要件の間のバランスに応じて利用するであ
ろう。かかる変法その他(この発明の方法の目的と一致するもの)は、当業者の心
に思い浮かぶものであろうが、以下の請求の範囲内に入るものである。
【図１】
この発明の方法により精製した配列決定反応生成物試料の電気泳動図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年６月３日（２００２．６．３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項３】 前記の量の配列決定反応生成物を第一の溶剤に懸濁させるス
テップを更に含む、請求項１に記載の方法。
テップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】 前記の定差圧を前記の限外濾過膜に適用するステップが、約
５〜２８インチ水銀の力を適用することを含む、請求項１に記載の方法。
５〜２８インチ水銀の力を適用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】 下記のステップを更に含む、請求項４に記載の方法：
前記の実質的に前記の汚染物を含まない配列決定反応生成物を第二の溶剤で洗
い；そして 第二の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。
い；そして 第二の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。
【請求項６】 下記のステップを更に含む、請求項５に記載の方法、
前記の実質的に前記の汚染物を含まない配列決定反応生成物を第三の溶剤で洗
い；そして 第三の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。
い；そして 第三の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。
【請求項７】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成物
を、前記の膜の前記の表面をピペットで吸うことにより回収するステップを更に
含む、請求項１に記載の方法。
を、前記の膜の前記の表面をピペットで吸うことにより回収するステップを更に
含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】 前記の膜の前記の表面をピペットで吸いながら、約５インチ
水銀の真空を適用する、請求項７に記載の方法。
水銀の真空を適用する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】 前記の汚染物が塩を含み且つ前記の第一の定差圧を前記の限
外濾過膜に適用するステップが、前記の塩を実質的に含まない配列決定反応生成
物を生成することのできる力を適用することを含む、請求項１に記載の方法。
外濾過膜に適用するステップが、前記の塩を実質的に含まない配列決定反応生成
物を生成することのできる力を適用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】 前記の汚染物が染料ターミネーターを含み且つ前記の定差
圧を前記の限外濾過膜に適用するステップが、前記の染料ターミネーターを実質
的に含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を適用することを含
む、請求項１に記載の方法。
圧を前記の限外濾過膜に適用するステップが、前記の染料ターミネーターを実質
的に含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を適用することを含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】 前記の限外濾過膜が上流面及び下流面を有し且つ、前記の
懸濁させた配列決定反応生成物を該上流面に移す、請求項１に記載の方法。
懸濁させた配列決定反応生成物を該上流面に移す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を、前記の膜の前記の上流面をピペットで吸うことにより回収するステップを
更に含む、請求項１１に記載の方法。
物を、前記の膜の前記の上流面をピペットで吸うことにより回収するステップを
更に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を、ピペッティング、拡散、攪拌及び動電学的輸送よりなる群から選択する少
なくとも一のステップによって回収するステップを更に含む、請求項１に記載の
方法。
物を、ピペッティング、拡散、攪拌及び動電学的輸送よりなる群から選択する少
なくとも一のステップによって回収するステップを更に含む、請求項１に記載の
方法。
【請求項１４】 前記の配列決定反応生成物、該生成物からの如何なるナト
リウムイオンをも置換することのできる少なくとも一種の塩で洗うステップを更
に含む、請求項１に記載の方法。
リウムイオンをも置換することのできる少なくとも一種の塩で洗うステップを更
に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】 少なくとも一種の前記の汚染物を実質的に含まない前記の
配列決定反応生成物を、結晶化可能なマトリクスに再懸濁させるステップを更に
含む、請求項１に記載の方法。
配列決定反応生成物を、結晶化可能なマトリクスに再懸濁させるステップを更に
含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】 少なくとも一種の前記の汚染物を実質的に含まない前記の
配列決定反応生成物を、水に再懸濁させるステップを更に含む、請求項１に記載
の方法。
配列決定反応生成物を、水に再懸濁させるステップを更に含む、請求項１に記載
の方法。
【請求項１７】 少なくとも一種の前記の汚染物を実質的に含まない前記の
配列決定反応生成物を、少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させるステップを
更に含む、請求項１に記載の方法。
配列決定反応生成物を、少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させるステップを
更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】 前記の配列決定反応生成物が、少なくとも一の単一ヌクレ
オチド多形を含む、請求項１に記載の方法。
オチド多形を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】 配列決定反応物から汚染物を除去するために適合された配
列決定反応物の浄化方法であって、下記のステップを含む当該方法、 ある量の配列決定反応生成物を用意し; 該量の配列決定反応生成物を、ホルムアミド、ＥＤＴＡ及び水よりなる群から
選択する少なくとも一種の溶剤に懸濁させ； 少なくとも一の表面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し; 該懸濁させた配列決定反応生成物を該限外濾過膜の該表面に移し；そして 第一の定差圧を、該限外濾過膜に、約５〜２８インチ水銀の力で適用して、該
汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成する。
列決定反応物の浄化方法であって、下記のステップを含む当該方法、 ある量の配列決定反応生成物を用意し; 該量の配列決定反応生成物を、ホルムアミド、ＥＤＴＡ及び水よりなる群から
選択する少なくとも一種の溶剤に懸濁させ； 少なくとも一の表面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し; 該懸濁させた配列決定反応生成物を該限外濾過膜の該表面に移し；そして 第一の定差圧を、該限外濾過膜に、約５〜２８インチ水銀の力で適用して、該
汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成する。
【請求項２０】 下記のステップを更に含む、請求項１９に記載の方法、
前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成物を第二の溶剤で洗
い；そして 第二の定差圧を前記の限外濾過膜に約５〜２８インチ水銀の力で適用する。
い；そして 第二の定差圧を前記の限外濾過膜に約５〜２８インチ水銀の力で適用する。
【請求項２１】 下記のステップを更に含む、請求項２０に記載の方法、
前記の実質的に前記の汚染物を含まない配列決定反応生成物を第三の溶剤で洗
い；そして 第三の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。
い；そして 第三の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。
【請求項２２】 前記の汚染物が、少なくとも一種の塩及び少なくとも一種
の染料ターミネーターを含み、前記の第一の定差圧を前記の限外濾過膜に適用す
るステップが、該塩及び該染料ターミネーターを実質的に含まない配列決定反応
生成物を生成することのできる力を適用することを含む、請求項１９に記載の方
法。
の染料ターミネーターを含み、前記の第一の定差圧を前記の限外濾過膜に適用す
るステップが、該塩及び該染料ターミネーターを実質的に含まない配列決定反応
生成物を生成することのできる力を適用することを含む、請求項１９に記載の方
法。
【請求項２３】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を結晶化可能なマトリクスに再懸濁させるステップを更に含む、請求項１９に
記載の方法。
物を結晶化可能なマトリクスに再懸濁させるステップを更に含む、請求項１９に
記載の方法。
【請求項２４】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させるステップを更に含む、請求項１ ９ に記載の方法。
物を少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させるステップを更に含む、請求項１ ９ に記載の方法。
【請求項２５】 前記の配列決定反応生成物が、少なくとも一の単一ヌクレ
オチド多形を含む、請求項１９に記載の方法。
オチド多形を含む、請求項１９に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
染料ターミネーターは、一度塩基特異的な仕方で取り込まれたならば配列決定
用生成物の更なる重合を阻止する蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド三リン
酸(ｄｄＮＴＰ)である。プライマー、テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰ緩衝液、塩及び染料ターミネーターは、約１０〜１２００ヌクレオチド長に
及ぶ配列決定用生成物の生成を与えるのに十分な濃度で配列決定用反応に添加す
る。染料ターミネーターは、ＤＮＡポリメラーゼの天然の基質ではないので、そ
れらの重合中の配列決定用生成物中への取り込みを確実にするには、天然のｄＮ
ＴＰ基質に比べて高濃度を与えなければならない。この効率の悪い取り込みの結
果は、反応が完結した後において、多量の取り込まれなかった染料ターミネータ
ーが以前として存在することである。取り込まれなかった染料ターミネーターは
、電気泳動中、短い配列決定用生成物と共に移動して、配列分析を邪魔する様々
なアーティファクトを生じる。
用生成物の更なる重合を阻止する蛍光標識されたジデオキシヌクレオチド三リン
酸(ｄｄＮＴＰ)である。プライマー、テンプレート、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮ
ＴＰ緩衝液、塩及び染料ターミネーターは、約１０〜１２００ヌクレオチド長に
及ぶ配列決定用生成物の生成を与えるのに十分な濃度で配列決定用反応に添加す
る。染料ターミネーターは、ＤＮＡポリメラーゼの天然の基質ではないので、そ
れらの重合中の配列決定用生成物中への取り込みを確実にするには、天然のｄＮ
ＴＰ基質に比べて高濃度を与えなければならない。この効率の悪い取り込みの結
果は、反応が完結した後において、多量の取り込まれなかった染料ターミネータ
ーが以前として存在することである。取り込まれなかった染料ターミネーターは
、電気泳動中、短い配列決定用生成物と共に移動して、配列分析を邪魔する様々
なアーティファクトを生じる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
同様に、精製プライマー伸長生成物も又、ゲル分析(例えば、キャピラリー電
気泳動)により又は質量分析により分析することができる。例えば、単一ヌクレ
オチド多形(ＳＮＰ)は、集団内の個体を遺伝的に区別し、それ故、同義遺伝子の
相互作用により引き起こされる病気のマーカーとして機能しうる単一塩基の差異
である。プライマー伸長反応の差次的停止は、ＳＮＰ検出のための一般的に用い
られる方法であり、それにより、ジデオキシヌクレオチド類似体が配列変異部位
に取り込まれる。プライマー伸長反応物は、不確定の長さのジデオキシ停止され
た配列決定用ラダーを生成するために用いられる配列決定反応と同じ多くの成分
を含む。それ故、同じ汚染物質を同様に分析前に除去しなければならない。これ
らの汚染物質は、塩及びジデオキシターミネーターを含みうる(これらの両者は
、限外濾過膜を通過するが、プライマー伸長生成物は通過しない)。
気泳動)により又は質量分析により分析することができる。例えば、単一ヌクレ
オチド多形(ＳＮＰ)は、集団内の個体を遺伝的に区別し、それ故、同義遺伝子の
相互作用により引き起こされる病気のマーカーとして機能しうる単一塩基の差異
である。プライマー伸長反応の差次的停止は、ＳＮＰ検出のための一般的に用い
られる方法であり、それにより、ジデオキシヌクレオチド類似体が配列変異部位
に取り込まれる。プライマー伸長反応物は、不確定の長さのジデオキシ停止され
た配列決定用ラダーを生成するために用いられる配列決定反応と同じ多くの成分
を含む。それ故、同じ汚染物質を同様に分析前に除去しなければならない。これ
らの汚染物質は、塩及びジデオキシターミネーターを含みうる(これらの両者は
、限外濾過膜を通過するが、プライマー伸長生成物は通過しない)。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１０】
一層高い試料純度及び回収率を生じうる限外濾過方法を提供することは、この
発明の更なる目的である。
発明の更なる目的である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
記したように、定差圧限外濾過は、優れた塩類除去、蛍光標識除去及び配列決
定反応生成物の回収率を容易に自動化される形式で与える。この方法で用いる真
空ベースの又は陽圧ベースのマニホールドは、遠心分離式の限外濾過よりも自動
化するのが一層容易である。やはり、精製された配列決定反応物への完全なトッ
プアクセス(濾液収集能力は必要ない)も、限外濾過膜表面からの直接的な動電学
的注入を可能にし、それにより、試料の処理を単純化して他の消耗品の必要性を
減じる。この配列決定反応物を処理するための新規なプロトコールの開発は又、
ＤＮＡ配列データの分析を邪魔するアーティファクトをも排除する。
定反応生成物の回収率を容易に自動化される形式で与える。この方法で用いる真
空ベースの又は陽圧ベースのマニホールドは、遠心分離式の限外濾過よりも自動
化するのが一層容易である。やはり、精製された配列決定反応物への完全なトッ
プアクセス(濾液収集能力は必要ない)も、限外濾過膜表面からの直接的な動電学
的注入を可能にし、それにより、試料の処理を単純化して他の消耗品の必要性を
減じる。この配列決定反応物を処理するための新規なプロトコールの開発は又、
ＤＮＡ配列データの分析を邪魔するアーティファクトをも排除する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
汚染物を配列決定反応物から除去するために適合されたこの発明の配列決定反
応物の浄化のための好適な方法は、配列決定反応生成物の規定量を用意し;少な
くとも一つの面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し;配列決定反応生成
物を限外濾過膜表面に移し；そして第一の定差圧を限外濾過膜に、実質的に汚染
物を含まない配列決定反応物を生成しうる力で加えるステップを含む。この方法
の目的のために、用語「生成物」は、粗試料から部分精製された試料までの変化
する純度の試料を含んでよく、液体及び／又は固体を含んでよい。やはり、用語
「配列決定反応」も又、ジデオキシヌクレオチド又は修飾されたジデオキシヌク
レオチドで終端した核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含むことがで
きる。例えば、用語「配列決定反応」は、プライマー伸長反応を含むことができ
る。この発明の方法は、配列決定反応物の濃縮及び精製の過程の任意の時点で(
例えば、テンプレートを含む粗試料を用いる開始時点で、又は精製プロセスの終
わりに向けて、最終精製ステップとして)用いることができる。この限外濾過膜
は、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有してよく、好ま
しくは、約３，０００〜１５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する。除
去すべき汚染物が塩及び／又は染料ターミネーターを含む場合には、第一の定差
圧を限外濾過膜に加えるステップは、好ましくは、実質的に塩類及び／又は染料
ターミネーターを含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を加え
ることを含む。
応物の浄化のための好適な方法は、配列決定反応生成物の規定量を用意し;少な
くとも一つの面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し;配列決定反応生成
物を限外濾過膜表面に移し；そして第一の定差圧を限外濾過膜に、実質的に汚染
物を含まない配列決定反応物を生成しうる力で加えるステップを含む。この方法
の目的のために、用語「生成物」は、粗試料から部分精製された試料までの変化
する純度の試料を含んでよく、液体及び／又は固体を含んでよい。やはり、用語
「配列決定反応」も又、ジデオキシヌクレオチド又は修飾されたジデオキシヌク
レオチドで終端した核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含むことがで
きる。例えば、用語「配列決定反応」は、プライマー伸長反応を含むことができ
る。この発明の方法は、配列決定反応物の濃縮及び精製の過程の任意の時点で(
例えば、テンプレートを含む粗試料を用いる開始時点で、又は精製プロセスの終
わりに向けて、最終精製ステップとして)用いることができる。この限外濾過膜
は、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量カットオフを有してよく、好ま
しくは、約３，０００〜１５，０００ダルトンの分子量カットオフを有する。除
去すべき汚染物が塩及び／又は染料ターミネーターを含む場合には、第一の定差
圧を限外濾過膜に加えるステップは、好ましくは、実質的に塩類及び／又は染料
ターミネーターを含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を加え
ることを含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
この発明の方法は、定差圧を濾過工程の駆動力として利用する。高流量を、こ
の方法の利用に適した殆どの適用について十分な期間にわたって維持することが
できる。この方法は、低容量の出発材料を、遠心分離よりかなり短い時間内に分
離することを可能にする。加えて、定差圧に駆動される限外濾過は、非極性溶質
につき経時的に起きる、遠心分離式の限外濾過に関連した流束減衰を受けない。
故に、定差圧駆動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりもずっと高い濃縮
係数を達成することを可能にする。加えて、たとえ濃縮タンパク質などの極性溶
質について定差圧駆動式の限外濾過を用いて流束減衰が観察できても、定差圧駆
動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりも殆どの状況において一層速い。
定差圧駆動式限外濾過の工程は、低分子量汚染物を除去するのに遠心分離を用い
た場合にしばしば必要となる時間浪費的な反復希釈及び濾過の必要性を減じ又は
排除する。
の方法の利用に適した殆どの適用について十分な期間にわたって維持することが
できる。この方法は、低容量の出発材料を、遠心分離よりかなり短い時間内に分
離することを可能にする。加えて、定差圧に駆動される限外濾過は、非極性溶質
につき経時的に起きる、遠心分離式の限外濾過に関連した流束減衰を受けない。
故に、定差圧駆動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりもずっと高い濃縮
係数を達成することを可能にする。加えて、たとえ濃縮タンパク質などの極性溶
質について定差圧駆動式の限外濾過を用いて流束減衰が観察できても、定差圧駆
動式の限外濾過は、遠心分離式の限外濾過よりも殆どの状況において一層速い。
定差圧駆動式限外濾過の工程は、低分子量汚染物を除去するのに遠心分離を用い
た場合にしばしば必要となる時間浪費的な反復希釈及び濾過の必要性を減じ又は
排除する。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２９】
この発明の方法を用いて、核酸、タンパク質及び他の材料などの典型的に限外
濾過を用いて濾過された生物学的材料を効果的に精製することができる。この方
法は、一般に、完了した配列決定反応生成物をホルムアミド、水及び／又はＥＤ
ＴＡ中に懸濁させ；その懸濁液を、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量
カットオフを有する限外濾過プレートに移し；そしてそのプレートを、最初、約
２５インチ水銀の真空で定差圧にかける。この発明の目的につき、用語「配列決
定反応」は、ジデオキシヌクレオチド又は修飾ジデオキシヌクレオチドで終端し
ている核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含む。かかる修飾ジデオキ
シヌクレオチドの例には、放射性同位元素、蛍光部分又はマスタグ、又は伸長停
止させるジデオキシヌクレオチドの同定及び／又は検出を助成する任意の他の修
飾により修飾されたものが含まれる。特に、例えば、用語「配列決定反応」は、 不確定の 長さのジデオキシ停止された「シーケンシングラダー」を生成するため
に利用されるサンガー型のＤＮＡ配列決定反応、及びゲノタイピングプライマー
の一塩基乃至数塩基下流の位置で意図的にジデオキシ停止されるポリメラーゼ伸
長を包含する。もし単一ヌクレオチド多形(ＳＮＰ)をアッセイするために後者の
方法を用いるならば、４種類のデオキシヌクレオチド(天然のポリメラーゼの基
質)の少なくとも一種が、配列反応から省かれる。これは、確定した長さと予想
可能な分子量の配列決定用生成物を生成して、質量(ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分
析)又は電気泳動移動度(電気泳動)の重複する断片の生成を伴わないゲノタイピ
ングプライマーの多重化を可能にするように働く。
濾過を用いて濾過された生物学的材料を効果的に精製することができる。この方
法は、一般に、完了した配列決定反応生成物をホルムアミド、水及び／又はＥＤ
ＴＡ中に懸濁させ；その懸濁液を、約１０００〜３０，０００ダルトンの分子量
カットオフを有する限外濾過プレートに移し；そしてそのプレートを、最初、約
２５インチ水銀の真空で定差圧にかける。この発明の目的につき、用語「配列決
定反応」は、ジデオキシヌクレオチド又は修飾ジデオキシヌクレオチドで終端し
ている核酸を生成する任意のポリメラーゼ伸長反応を含む。かかる修飾ジデオキ
シヌクレオチドの例には、放射性同位元素、蛍光部分又はマスタグ、又は伸長停
止させるジデオキシヌクレオチドの同定及び／又は検出を助成する任意の他の修
飾により修飾されたものが含まれる。特に、例えば、用語「配列決定反応」は、 不確定の 長さのジデオキシ停止された「シーケンシングラダー」を生成するため
に利用されるサンガー型のＤＮＡ配列決定反応、及びゲノタイピングプライマー
の一塩基乃至数塩基下流の位置で意図的にジデオキシ停止されるポリメラーゼ伸
長を包含する。もし単一ヌクレオチド多形(ＳＮＰ)をアッセイするために後者の
方法を用いるならば、４種類のデオキシヌクレオチド(天然のポリメラーゼの基
質)の少なくとも一種が、配列反応から省かれる。これは、確定した長さと予想
可能な分子量の配列決定用生成物を生成して、質量(ＭＡＬＤＩ−Ｔｏｆ質量分
析)又は電気泳動移動度(電気泳動)の重複する断片の生成を伴わないゲノタイピ
ングプライマーの多重化を可能にするように働く。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
質量分析を用いて濾過した生成物を分析するならば、適当な塩例えばクエン酸
アンモニウムを用いて、配列決定反応生成物に由来するナトリウムイオンを、質
量分析の前に、洗い又は置換することができる。この配列決定反応生成物は、好
ましくは、質量分析前に、幾つかの別の手段を用いて再懸濁させる(この生成物
を直接結晶化に適したマトリクスに再懸濁させること；限外濾過膜からの生成物
を水中に再懸濁させてからＭＡＬＤＩターゲット上にスポットし、そのスポット
を乾燥させ、そしてそのスポットを適当なマトリクスと重ねること；又は限外濾
過膜からの生成物をＭＡＬＤＩターゲット上にスポットする前に揮発性溶剤に再
懸濁させることが含まれるが、これらに限らない)。
アンモニウムを用いて、配列決定反応生成物に由来するナトリウムイオンを、質
量分析の前に、洗い又は置換することができる。この配列決定反応生成物は、好
ましくは、質量分析前に、幾つかの別の手段を用いて再懸濁させる(この生成物
を直接結晶化に適したマトリクスに再懸濁させること；限外濾過膜からの生成物
を水中に再懸濁させてからＭＡＬＤＩターゲット上にスポットし、そのスポット
を乾燥させ、そしてそのスポットを適当なマトリクスと重ねること；又は限外濾
過膜からの生成物をＭＡＬＤＩターゲット上にスポットする前に揮発性溶剤に再
懸濁させることが含まれるが、これらに限らない)。
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フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＮ，Ｊ
Ｐ，ＳＧ
(72)発明者 ジョーゼフ ゲイブリエルズ
アメリカ合衆国 02474 マサチューセッ
ツ、アーリントン、クリーブランド スト
リート 41
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 BA80 CA01 CA11
HA19
4B063 QA05 QA11 QA18 QQ41 QR41
QR50 QS12 QS20 QS39
Claims (33)
- 【請求項１】 配列決定反応物から汚染物を除去するために適合させた配列
決定反応物の浄化方法であって、下記のステップを含む当該方法、 ある量の配列決定反応生成物を用意し； 少なくとも一の面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し; 懸濁させた配列決定反応生成物を該限外濾過膜の該表面に移し;そして 第一の定差圧を該限外濾過膜に、該汚染物を実質的に含まない該配列決定反応
生成物を生成することのできる力で適用する。 - 【請求項２】 前記の限外濾過膜が、約１０００〜３０，０００ダルトンの
分子量カットオフを有する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記の限外濾過膜が、約３，０００〜１５，０００ダルトン
の分子量カットオフを有する、請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記の量の配列決定反応生成物を第一の溶剤に懸濁させるス
テップを更に含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記の量の配列決定反応生成物を溶剤に懸濁させるステップ
が、ホルムアミド、ＥＤＴＡ及び水よりなる群から選択する少なくとも一の溶剤
を該配列決定反応生成物に加えることを含む、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 前記の定差圧を前記の限外濾過膜に適用するステップが、約
５〜２８インチ水銀の力を適用することを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 下記のステップを更に含む、請求項６に記載の方法： 前記の実質的に前記の汚染物を含まない配列決定反応生成物を第二の溶剤で洗
い；そして 第二の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。 - 【請求項８】 前記の第二の定差圧を、約５〜２８インチ水銀の力で適用す
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記の第二の溶剤が、ホルムアミド、水及びＥＤＴＡよりな
る群から選択する少なくとも一の溶剤を含む、請求項７に記載の方法。 - 【請求項１０】 下記のステップを更に含む、請求項７に記載の方法、 前記の実質的に前記の汚染物を含まない配列決定反応生成物を第三の溶剤で洗
い；そして 第三の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。 - 【請求項１１】 前記の第三の溶剤が、水、ホルムアミド及びＥＤＴＡより
なる群から選択する少なくとも一の溶剤を含む、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記の第三の定差圧を、約５〜２８インチ水銀の力で適用
する、請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を、前記の膜の前記の表面をピペットで吸うことにより回収するステップを更
に含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 前記の膜の前記の表面をピペットで吸いながら、約５イン
チ水銀の真空を適用する、請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 前記の汚染物が塩を含み且つ前記の第一の定差圧を前記の
限外濾過膜に適用するステップが、前記の塩を実質的に含まない配列決定反応生
成物を生成することのできる力を適用することを含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１６】 前記の汚染物が染料ターミネーターを含み且つ前記の定差
圧を前記の限外濾過膜に適用するステップが、前記の染料ターミネーターを実質
的に含まない配列決定反応生成物を生成することのできる力を適用することを含
む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記の限外濾過膜が上流面及び下流面を有し且つ、前記の
懸濁させた配列決定反応生成物を該上流面に移す、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を、前記の膜の前記の上流面をピペットで吸うことにより回収するステップを
更に含む、請求項１７に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を、ピペッティング、拡散、攪拌及び動電学的輸送よりなる群から選択する少
なくとも一のステップによって回収するステップを更に含む、請求項１に記載の
方法。 - 【請求項２０】 前記の回収のステップにおいて、約５インチ水銀の真空を
適用する、請求項１９に記載の方法。 - 【請求項２１】 前記の配列決定反応生成物、該生成物からの如何なるナト
リウムイオンをも置換することのできる少なくとも一種の塩で洗うステップを更
に含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２２】 少なくとも一種の前記の汚染物を実質的に含まない前記の
配列決定反応生成物を、結晶化可能なマトリクスに再懸濁させるステップを更に
含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２３】 少なくとも一種の前記の汚染物を実質的に含まない前記の
配列決定反応生成物を、水に再懸濁させるステップを更に含む、請求項１に記載
の方法。 - 【請求項２４】 少なくとも一種の前記の汚染物を実質的に含まない前記の
配列決定反応生成物を、少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させるステップを
更に含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２５】 前記の配列決定反応生成物が、少なくとも一の単一ヌクレ
オチド多形を含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２６】 配列決定反応物から汚染物を除去するために適合された配
列決定反応物の浄化方法であって、下記のステップを含む当該方法、 ある量の配列決定反応生成物を用意し; 該量の配列決定反応生成物を、ホルムアミド、ＥＤＴＡ及び水よりなる群から
選択する少なくとも一種の溶剤に懸濁させ； 少なくとも一の表面を有する少なくとも一の限外濾過膜を用意し; 該懸濁させた配列決定反応生成物を該限外濾過膜の該表面に移し；そして 第一の定差圧を、該限外濾過膜に、約５〜２８インチ水銀の力で適用して、該
汚染物を実質的に含まない該配列決定反応生成物を生成する。 - 【請求項２７】 下記のステップを更に含む、請求項２６に記載の方法、 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成物を第二の溶剤で洗
い；そして 第二の定差圧を前記の限外濾過膜に約５〜２８インチ水銀の力で適用する。 - 【請求項２８】 前記の第二の溶剤が、ホルムアミド、水及びＥＤＴＡより
なる群から選択する少なくとも一の溶剤を含む、請求項２７に記載の方法。 - 【請求項２９】 下記のステップを更に含む、請求項２８に記載の方法、 前記の実質的に前記の汚染物を含まない配列決定反応生成物を第三の溶剤で洗
い；そして 第三の定差圧を前記の限外濾過膜に適用する。 - 【請求項３０】 前記の汚染物が、少なくとも一種の塩及び少なくとも一種
の染料ターミネーターを含み、前記の第一の定差圧を前記の限外濾過膜に適用す
るステップが、該塩及び該染料ターミネーターを実質的に含まない配列決定反応
生成物を生成することのできる力を適用することを含む、請求項２６に記載の方
法。 - 【請求項３１】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を結晶化可能なマトリクスに再懸濁させるステップを更に含む、請求項２６に
記載の方法。 - 【請求項３２】 前記の汚染物を実質的に含まない前記の配列決定反応生成
物を少なくとも一種の揮発性溶剤に再懸濁させるステップを更に含む、請求項２
６に記載の方法。 - 【請求項３３】 前記の配列決定反応生成物が、少なくとも一の単一ヌクレ
オチド多形を含む、請求項２６に記載の方法。
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