DE112020002327T5

DE112020002327T5 - Chemisches verkappen für matrizenwechsel

Info

Publication number: DE112020002327T5
Application number: DE112020002327.3T
Authority: DE
Inventors: Ivan R. Correa; Madalee Gassaway Wulf; Nan Dai; Sean Maguire; Shengxi Guan
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2019-05-10
Filing date: 2020-05-06
Publication date: 2022-07-14
Also published as: WO2020231697A1; GB2597423A; GB202116544D0; US20220195424A1

Abstract

Hierin wird ein Verfahren zur chemischen Kappung von Polynukleotiden mit einem 5'-Monophosphat bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen kann das Verfahren Folgendes umfassen: Kombinieren eines aktivierten 5'-Nukleosidmono- oder -polyphosphats mit einer Polynukleotidpopulation, die Polynukleotide mit einem 5'-Monophosphat umfasst, um eine Reaktionsmischung herzustellen; und Inkubieren der Reaktionsmischung, um Reaktionsprodukte herzustellen, die ein Polynukleotid und eine 5'-Nukleosidkappe umfassen, die durch eine 5'-5'-Polyphosphatbindung verbunden sind. Die hier beschriebene chemische Verkappungsmethode kann in eine Vielzahl von cDNA-Synthesemethoden integriert werden.

Description

HINTERGRUND
Matrizenwechsel-Ereignisse (engl. „Template-Switching“ für Matrizenwechsel, kurz TS) werden in einer homologieabhängigen Weise erzeugt. Insbesondere löst sich der wachsende komplementäre DNA-Strang (cDNA), der von einer reversen Transkriptase (RT) synthetisiert wird, von seiner ursprünglichen Matrize (engl. „template“) und verbindet sich erneut mit einer anderen Matrize am 3'-Ende der cDNA.
TS wurde verwendet, um eine cDNA zu erzeugen, die eine Sequenz enthält, die komplementär zu einem Oligonukleotid mit bekannter Sequenz ist, das auch als Matrizenwechsel-Oligonukleotid (engl. „Template-Switching-Oligonukleotid“, kurz TSO) bekannt ist, und eine Ziel-RNA als Schritt zur Erzeugung einer Sequenzierungsbibliothek. In-vitro-Methoden des TS haben die natürlich vorkommende ⁷m-Gppp-Kappe (engl. „cap“ für Kappe) am 5'-Ende der eukaryotischen Boten-RNA (mRNA) genutzt, um cDNA-Bibliotheken von mRNA herzustellen. Die meisten RNAs, einschließlich prokaryotischer mRNAs, sind von Natur aus unverkappt (engl. „uncapped“). Das Vaccinia Capping Enzyme (New England Biolabs, Ipswich, MA) kann jedoch RNAs mit einem Diphosphat oder Triphosphat verkappen, um cDNA-Bibliotheken aus diesen RNAs zu erstellen. Leider haben viele wichtige regulatorische RNAs, wie z. B. microRNAs, und Fragmente von mRNA, die die terminalen verkappten Nukleotide verloren haben, kein Diphosphat oder Triphosphat am 5'-Ende und können daher nicht enzymatisch verkappt werden.
Ein weiteres Problem, das mit TS verbunden ist, ist das der Verzerrung. Die RTs, die für TS verwendet werden, scheinen zwischen RNAs mit unterschiedlichen terminalen Nukleotiden am 5'-Ende der RNA zu unterscheiden, was zu einer Verzerrung bei der Darstellung der Eingangs-RNA-Häufigkeit auf der Grundlage der Sequenzlesehäufigkeiten führt.
Es wäre wünschenswert, TS für jede RNA in einer Gesamt-RNA-Population verwenden zu können. Dies würde voraussetzen, dass der Zugang zu den RNAs mit einem einzigen Phosphat oder ohne Phosphat am 5'-Ende mit einem Minimum an Verzerrung erfolgt, unabhängig von der Identität des 5'-terminalen Nukleotids der RNA.
Es wäre auch wünschenswert, TS für DNAs verwenden zu können, insbesondere für die Analyse von abgebauter und/oder fragmentierter DNA mit einem hohen Einzelstranggehalt, wie z. B. alte DNA, Umwelt-DNA, forensische DNA, zirkulierende DNA (z. B. Exosomen), denaturierte DNA und virale DNA. Mehrere dieser DNAs können als Biomarker und in der medizinischen Diagnostik verwendet werden.
ZUSAMMENFASSUNG
Hierin wird ein Verfahren zur chemischen Verkappung (engl. „chemically capping“) einer Population von Polynukleotiden mit einem 5'-Monophosphat bereitgestellt. Das Verfahren kann umfassen: (a) Kombinieren eines aktivierten Nukleosid-5'-Mono- oder -Polyphosphats mit einer Population von Polynukleotiden, die Polynukleotide mit einem 5'-Monophosphat umfasst, um eine Reaktionsmischung herzustellen; und (b) Inkubieren der Reaktionsmischung, um Reaktionsprodukte herzustellen, die jeweils ein Polynukleotid umfassen, das durch eine 5'-zu-5'-Polyphosphat-Bindung an eine 5'-Nukleosid-Kappe gebunden ist.
Die Population der Polynukleotide kann aus RNAs bestehen. Beispielsweise kann die RNA-Population eine oder mehrere RNA-Arten umfassen, die aus kleinen RNAs, microRNAs (miRNAs), Transfer-RNAs (tRNAs), langen nichtcodierenden RNAs (IncRNAs) und fragmentierten mRNAs ausgewählt sind. Bei den Polynukleotiden in der Population kann es sich um einzelsträngige oder teilweise einzelsträngige DNAs (ssDNAs) handeln. Bei der Polynukleotidpopulation kann es sich um eine Polynukleotidpopulation aus einer Flüssigbiopsie, eine Polynukleotidpopulation aus einer Zelle, eine Polynukleotidpopulation aus einem Virus, eine Polynukleotidpopulation aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe oder eine Polynukleotidpopulation aus einer anderen hierin beschriebenen Quelle handeln.
Die oben beschriebenen Polynukleotide mit einem 5'-Monophosphat können das Produkt einer enzymatischen Addition eines einzelnen Phosphats an das 5'-Ende eines Polynukleotids ohne terminales Phosphat sein. Dies kann mit Hilfe einer Polynukleotidkinase erreicht werden.
Die Polynukleotide mit einem 5'-Monophosphat können die Produkte einer Entkapp-Reaktion von 5'verkappten RNAs sein. In diesen Ausführungsformen kann das Entkappen (engl. „decapping“) unter Verwendung eines Enzyms erfolgen, das aus einer Deadenylase, einer Apyrase, einer 5'-RNA-Polyphosphatase (RppH), einer Nudix-Phosphohydrolase, einer Tabaksäurepolyphosphatase, einem Mitglied der Histidin-Triad (HIT)-Superfamilie von Pyrophosphatasen, einer DcpS, einem Dcp1-Dcp2-Komplex, einer NudC oder einem Aprataxin (APTX) ausgewählt ist.
In jeder Ausführungsform kann die Reaktionsmischung einen pH-Wert im Bereich von pH 5 bis pH 6,5 aufweisen.
Im Hinblick auf die Verkappungsreaktion kann das aktivierte 5'-Mono- oder -Polyphosphat eine Imidazoleinheit enthalten, wobei eine nukleophile Substitutionsreaktion das Imidazol verdrängt. In einigen Ausführungsformen kann das aktivierte 5'-Mono- oder -Polyphosphat beispielsweise ein Phosphorimidazol-NMP, -NDP oder -NTP sein, und das Verfahren kann die Inkubation der Reaktionsmischung für weniger als 10 Stunden bei einer Temperatur von 30 °C-60 °C bei einem sauren pH-Wert, beispielsweise bei 50°C für 5 Stunden, 37°C für 4 Stunden oder Raumtemperatur für 4 Stunden bei einem pH-Wert im Bereich von pH 5 - pH 6,5 umfassen, um das Imidazol zu verdrängen und die 5'-verkappten Polynukleotide zu bilden.
Die 5'-Nukleosidkappe kann die Formel (I) haben:
worin X eine stickstoffhaltige Base ist; R1 und/oder R2 = O-Alkyl, Halogen, ein Linker, Wasserstoff oder ein Hydroxyl; n eine beliebige ganze Zahl von 1-9 ist; und die Polynukleotidkappe ein einzelnes Stereoisomer oder eine Vielzahl von Stereoisomeren einer oder mehrerer der durch Formel (I) beschriebenen Verbindungen oder ein Salz oder Salze davon ist.
In jeder Ausführungsform kann die stickstoffhaltige Base der 5'-Nukleosidkappe aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Guanin, Adenin, Cytosin, Uracil und Hypoxanthin sowie Analoga von Guanin, Adenin, Cytosin, Uracil und Hypoxanthin oder Modifikationen davon besteht. Beispielsweise kann eine modifizierte stickstoffhaltige Base der 5'-Nukleosidkappe eine modifizierte Base umfassen, die ausgewählt ist aus N6-Methyladenin, N 1-Methyladenin, N6-2'-O-Dimethyladenosin, Pseudouridin, N 1-Methylpseudouridin, 5-Iodouridin, 4-Thiouridin, 2-Thiouridin, 5-Methyluridin, Pseudoisocytosin, 5-Methoxycytosin, 2-Thiocytosin, 5-Hydroxycytosin, N4-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, Hypoxanthin, N1-Methylguanin, O6-Methylguanin, 1-Methyl-guanosin, N2-Methyl-guanosin, N7-Methyl-guanosin, N2,N2-Dimethyl-guanosin, 2-Methyl-2'-O-methyl-guanosin, N2,N2-Dimethyl-2'-O-methyl-guanosin, 1-Methyl-2'-O-methyl-guanosin, N2,N7-Dimethyl-2'-O-methyl-guanosin, oder Isoguanin. In diesen Ausführungsformen kann die stickstoffhaltige Base der 5'-Nukleosidkappe beispielsweise an einen Zucker gebunden sein, der aus einer Ribose oder einer modifizierten Ribose ausgewählt ist, die aus 2'- oder 3'-O-Alkylribose, Alkoxyribose, O-Alkoxyalkylribose, Fluoribose, Azidoribose, Allylribose, Desoxyribose, einer Arabinose oder einer modifizierten Arabinose, einer Thioribose, einem 1,5-Anhydrohexitol oder einer Threofuranose ausgewählt ist. Dementsprechend können die ein oder mehreren Phosphate der 5'-Nukleosidkappe aus einem Phosphorothioat, einem Phosphorodithioat, einem Alkylphosphonat, einem Arylphosphonat, einem N-Phosphoramidat, einem Boranophosphat oder einem Phosphonoacetat bestehen. In Beispielen schließt die 5'-Nukleosidkappe Guanosin ein.
Das hier beschriebene Verfahren kann ferner die reverse Transkription der Reaktionsprodukte umfassen, wobei die Polynukleotide einen 3'-Adapter und eine RT-Priming-Stelle enthalten, um die reverse Transkription einzuleiten und cDNA zu bilden. Die cDNA kann eine Sequenz am 3'-Ende enthalten, die komplementär zu einem TSO ist. Der 3'-Adapter kann (i) einen polyA-Schwanz einer RNA mit einem komplementären polyT zum Priming der cDNA-Synthese oder (ii) einen ligierten 3'-Adapter mit der RT-Priming-Sequenz umfassen. Der 3'-Adapter und das Polynukleotid, an das er gebunden ist, können in Gegenwart eines TSO revers transkribiert werden, um cDNA zu erzeugen, die das Komplement des TSO am 3'-Ende enthält.
Das Verfahren kann ferner den Schritt der Amplifikation der cDNA zur Herstellung eines Amplifikationsprodukts umfassen. Das Verfahren kann ferner die Sequenzierung der cDNA oder ihres Amplifikationsprodukts umfassen.
In einem Beispiel ist die 5'-Nukleosidkappe ein Guanosintriphosphat, wobei die cDNA-Produkte, die einer Population von Polynukleotiden entsprechen, für die ursprüngliche Population von Polynukleotiden repräsentativ sind, ohne eine wesentliche Verzerrung zugunsten eines oder mehrerer der folgenden Punkte: (i) diejenigen Polynukleotide, die ein spezifisches Nukleotid der vier Nukleotide A, G, C, U oder T in der ersten oder zweiten Position am 5'-Ende gegenüber jedem anderen Nukleotid aufweisen; oder (ii) eine Kappe, die Guanosin und ein, zwei, drei oder vier Phosphate zwischen der Guanosin-Kappe und dem ersten Nukleotid am 5'-Ende umfasst.
Handelt es sich bei der 5'-Nukleosidkappe um Guanosintriphosphat, so ist die Effizienz des Matrizenwechsels im Vergleich zu 5'-kappigen Polynukleotiden, die kein unmethyliertes Guanosin enthalten, um mindestens das Zweifache erhöht.
Ein Verfahren zur Synthese einer DNA, die komplementär zu einer einzelsträngigen Zielnukleinsäure ist, wird ebenfalls bereitgestellt. Das Verfahren kann Folgendes umfassen: (a) Kombinieren eines aktivierten Nukleosid-5'-Mono- oder -Polyphosphats mit einer Population von Polynukleotiden mit einem 5'-Monophosphat, um eine Reaktionsmischung herzustellen; (b) Inkubieren der Reaktionsmischung, um Reaktionsprodukte herzustellen, die jeweils ein Polynukleotid und eine 5'-Nukleosidkappe umfassen, die durch eine 5'-5'-Polyphosphatbindung verbunden sind und (c) Reverse Transkription der Produkte aus Schritt (b) in Gegenwart eines Matrizenwechsel-Oligonukleotids (TSO) zur Herstellung von cDNA, die das Komplement des TSO am 3'-Ende umfasst.
Das Verfahren kann ferner Folgendes umfassen: (i) Ligieren eines 3'-Adapters an die DNA vor Schritt (a) oder (ii) Ligieren eines 3'-Adapters an die Reaktionsprodukte von (b), wobei der Adapter gegebenenfalls eine cDNA-Primingstelle enthält und wobei die reverse Transkription unter Verwendung eines cDNA-Syntheseprimers durchgeführt wird, der an den Adapter hybridisiert. In jeder dieser Ausführungsformen kann die 5'-Nukleosidkappe ein Guanosintriphosphat sein. Das Verfahren kann ferner die Sequenzierung der cDNA umfassen.
Die resultierende cDNA kann für die Ausgangs-DNA-Population repräsentativ und annähernd äquivalent sein, unabhängig davon, ob das erste 5'-Nukleotid A, T, G oder C ist. Die Ausbeute an cDNA, die Sequenzen umfasst, die zur DNA-Population komplementär sind und 5'- und 3'-Adaptersequenzen aufweisen, kann bei Molekülen, die mit 5'-Guanosintriphosphat verkappt sind, im Vergleich zu verkappten DNAs, die kein 5'-Verkappungsguanosintriphosphat aufweisen, um mindestens das Zweifache erhöht sein.
Die Ausbeute an cDNA mit 5'- und 3'-Adaptersequenzen, die das Produkt der reversen Transkription der DNA-Population mit einem 5'-Cap-Guanosintriphosphat ist, kann im Vergleich zur Ausbeute des cDNA-Produkts aus einer DNA-Population, die nicht mit einem 5'-Cap-Guanosintriphosphat verkappt ist, um mindestens das Zweifache erhöht werden.
Außerdem wird hierin ein Kit bereitgestellt. Ein Kit kann ein Nukleosid 5'-Phosphorimidazolid, einen Kappungspuffer (engl. „capping buffer“) pH 5-pH 6,5, einen RT und gegebenenfalls einen TSO in einem oder mehreren verschiedenen Lagerbehältern enthalten. Der Kit kann eine Vielzahl von Modulen umfassen, wobei sich jedes Modul in einem oder mehreren Behältern befindet, wobei ein erstes Modul ein Kapp-Modul (engl. „capping module“) ist, das Reagenzien zum chemischen Verkappen (engl. „chemical capping“) einer Polynukleotidpopulation umfasst, und ein zweites Modul ein cDNA-Synthese- und Amplifikationsmodul umfasst, wobei das zweite Modul optional (i) einen TSO und/oder einen 3'-Splint-Adapter umfasst.
Ferner wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die Folgendes umfasst: ein aktiviertes 5'-Nukleosidmono- oder -polyphosphat in einem Puffer mit saurem pH-Wert.
Figurenliste
Der Fachmann wird verstehen, dass die nachstehend beschriebenen Zeichnungen nur zur Veranschaulichung dienen. Die Zeichnungen sind nicht dazu gedacht, den Umfang der vorliegenden Lehre in irgendeiner Weise zu begrenzen.

1A-1B zeigt Beispiele für Aktivierungsverfahren zum Anhängen eines gewünschten Nukleosid-5'-Phosphats an den 5'-Phosphat-Terminus einer RNA oder DNA.
1A zeigt sieben Beispiele für aktivierte Nukleosid-5'-Phosphate (in 1A engl. „examples of activated nuceloside 5'-phosphates). In diesen Beispielen werden die Nucleosid-5'-Phosphate durch Phosphordichloridat, Phosphoramidat, Phosphodiester, Phophotriester, gemischtes P(III)-P(V)-Anhydrid, Phospittriester und 5'-H-Phosphonat (in 1A engl. „phosphorodichloridate, phosphoramidate, phosphodiester, phophotriester P(III)-P(V) mixed anhydride, phospite triester and 5'-H-phosphonate“) aktiviert.
1B zeigt vier Beispiele für Nukleosidphosphat-Analoga (in 1B engl. „examples of nucleoside phosphate analogues“). Zu den Analoga gehören Ribonukleoside, Desoxyribonukleoside, carbocyclische Analoga und acyclische Analoga (in 1B engl. „ribonucleosides, deoxyribonucleosides, carbocyclic analogs and acyclic analogs“).
Die zeigen schematisch Verkappungsreaktionen, bei denen aktivierte Nucleosid-5'-Phosphate (z. B. Phosphorimidazolid-Vorläufer) (in 2A-2E) engl. „activated nucleoside 5'-phosphate“) verwendet werden, um Produkte herzustellen, die eine 5'-Nucleosidverkappung aufweisen, die durch eine 5'-5'-Polyphosphatbindung verbunden ist (engl. ,,5' nucleoside cap, linked by a 5' to 5' polyphosphate linkage‟).
2A zeigt eine Reaktion zwischen einem Nukleosidmonophosphat-Imidazolid und einem Polynukleotid mit einem einzelnen 5'-Phosphat zur Bildung eines Nukleosiddiphosphat-Polynukleotids.
2B zeigt eine Reaktion zwischen einem Nukleosiddiphosphat-Imidazolid und einem Polynukleotid mit einem einzigen 5'-Phosphat zur Bildung eines Nukleosidtriphosphat-Polynukleotids
2C zeigt eine Reaktion zwischen einem Nukleosidtriphosphat-Imidazolid und einem Polynukleotid mit einem einzelnen 5'-Phosphat zur Bildung eines Nukleosid-Tetraphosphat-Polynukleotids.
2D zeigt eine Reaktion zwischen einem Nukleosidmonophosphat-Imidazolid und einem Polynukleotid mit einem 5'-Diphosphat zur Bildung eines Nukleosidtriphosphat-Polynukleotids.
2E zeigt eine Reaktion zwischen einem Nukleosidmonophosphat-Imidazolid und einem Polynukleotid mit einem 5'-Triphosphat zur Bildung eines Nukleosid-Tetraphosphat-Polynukleotids
2F zeigt Beispiele für Imidazolid-Nukleosid-5'-Phosphate (engl. „examples of nucleoside 5'-phosphoroimidazolides“), die für die chemische Verkappung verwendet werden können. Die Imidazolid-Aktivierung ermöglicht die Bindung praktisch aller Nukleoside, einschließlich solcher mit Basen- und Ribose-Modifikationen, an eine 5'-phosphorylierte Nukleinsäure. Beispiele werden für die Nukleotide Guanosin, Adenosin, Cytidin, Thymidin und Inosin gezeigt. Diese Strategie ermöglicht auch die Bildung von verkappten Strukturen mit einer Polyphosphatbrücke variabler Länge sowie die Einführung von Phosphatmodifikationen (wie Phosphothioester).
3A-3E zeigt die Optimierung der Bedingungen für das chemische Verkappen einer synthetischen 25mer-RNA.
3A zeigt, wie eine Reaktion zwischen einem durch Phosphorimidazolid aktivierten Guanosin-5'diphosphat und einem RNA-Oligonukleotid, das ein 5'-Monophosphat (engl. „5'-monophosphate RNA“) aufweist, zur Bildung von Produkten führt, die eine 5'- bis 5'-Triphosphat-Bindung aufweisen.
3B zeigt, dass eine bei pH 6 durchgeführte Verkappungsreaktion optimal war. Ein pH 6-Puffer führte zu einem Anstieg der Ausbeute von 31 % auf 63 % im Vergleich zu einem pH 7-Puffer.
3C zeigt die Verkappungsreaktion, die mit unterschiedlichen Konzentrationen des Guanosin-5'-phosphorimidazolids imGDP durchgeführt wurde. Die Erhöhung des molaren Überschusses an imGDP von 10x auf 1000x (bezogen auf das RNA-Oligonukleotid 5'-Monophosphat) führte zu einer Steigerung der Ausbeute von 12% auf 73%.
3D zeigt den zeitlichen Verlauf der Kappungsreaktion bei 37 °C. Die Verkappungsreaktion wurde in einem pH-6-Puffer und 1000x imGDP durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine Ausbeute von etwa 85 % in 4 Stunden bzw. 91 % in 6 Stunden bei 37 °C.
3E zeigt den zeitlichen Verlauf der Verkappungsreaktion bei 50 °C. Die Verkappungsreaktion wurde in pH 6-Puffer und 1000x imGDP durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen eine Ausbeute von etwa 62 % in 1 Stunde bzw. 68 % in 2 Stunden bei 50 °C.
4A-4D zeigen vier Arbeitsabläufe für die Synthese eines cDNA-Erststrangs aus einer Ziel-RNA oder -DNA in einer Polynukleotidpopulation, wie sie in einem Zelllysat vorkommt. In jedem Arbeitsablauf wurde eine andere Strategie angewandt, um einen Oligonukleotid-Adapter an das 5'-Ende der cDNA einzubauen. In allen vier Arbeitsabläufen ist die Hinzufügung eines Oligonukleotid-Adapters am 3'-Ende der cDNA gleich und beinhaltet einen Schritt der chemischen Kappung des 5'-Endes der Ziel-RNA, um TS durch die RT zu ermöglichen. Auf das TS-Produkt kann eine Amplifikation und anschließend eine Sequenzierung folgen.
4A zeigt einen Arbeitsablauf unter Verwendung eines Primers („DNA-Primer“), der einen Teil hat, der entweder eine randomisierte Sequenz ist oder mit einem Segment des 3'-Endes der Ziel-RNA übereinstimmt, und einen anderen Teil, der eine definierte Sequenz (Primer) hat, unter Verwendung einer von Zhu et al. (2001) Biotechniques 30: 892-7 beschriebenen Methode.
4B zeigt einen Arbeitsablauf, der das Hinzufügen eines PolyA-Schwanzes unter Verwendung einer Poly(A)-Polymerase zur chemisch verkappten 5'-RNA und die Synthese der cDNA unter Verwendung eines DNA-Primers, der ein Poly(dT)-Segment enthält, um die reverse Transkriptionsreaktion unter Verwendung eines von Zhu et al. (2001) Biotechniques 30: 892-7 beschriebenen Verfahrens einzuleiten, umfasst.
4C zeigt einen Arbeitsablauf, bei dem ein 3'-Adapter an das 3'-Ende der Ziel-RNA für die Synthese eines cDNA-Erststrangs ligiert wird, der das Hinzufügen eines DNA-Primers beinhaltet, der mit der ligierten Sequenz unter Verwendung einer von Fuchs et al. (2015) PLoS ONE 10: e0126049 beschriebenen Methode hybridisiert.
4D zeigt einen Arbeitsablauf, bei dem ein 3'-Splint-Adapter (d. h. eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem 3'-Erweiterungssegment, das randomisierte Nukleotide enthält) an das 3'-Ende der Ziel-RNA ligiert werden kann.)
5A-5B zeigt, dass die größten Verbesserungen in Bezug auf Effizienz/Ausbeute und Verringerung der Verzerrung von TS zu beobachten sind, wenn eine unmethylierte Guanosin-Kappe (d. h. eine Kappe, die Guanosin und nicht 7-Methyl-Guanosin enthält) am 5'-Ende der RNA-Matrize vorhanden ist.
5A ist eine Zusammenstellung von Daten, die aus der Kapillarelektrophorese für jedes 5'-Ende einer RNA-Matrize erhalten wurden (HO-N, p-N, m ⁷GpppN und GpppN), wobei N das 5'-terminale Nukleotid (A, C, G oder U) in der ursprünglichen 25mer-RNA-Matrizensequenz darstellt. Guanosin-5'-verkappte RNAs (GpppN) zeigen unter den in Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen eine größere TS-Effizienz (in 5A engl. „Template Switching Efficiency“) als 7-Methylguanosin-5'-verkappte RNAs (m⁷GpppN) oder beliebige nicht verkappte RNAs (HO-N oder p-N). Zu Vergleichszwecken wurde die TS-Effizienz von GpppN willkürlich auf 100 % festgelegt. Insgesamt werden verkappte RNAs (m ⁷GpppN und GpppN) 2- bis 5-mal effizienter als unverkappte RNAs (5'-HO-N und 5'-p-N) matrizengewechselt (engl. „template switched“).
5B zeigt die normalisierte Verteilung der TS-Effizienz (in 5B engl. „normalized Template Switching Efficiency“) für jede der in der Zusammenstellung von 5A verwendeten RNA-Matrizen. Die normalisierte TS-Effizienz (%) für unmethylierte Guanosin-RNAs mit 5'-Kappe (GpppN) ist annähernd gleich, unabhängig davon, ob das erste Nukleotid in der Ziel-RNA A, C, G oder U ist, und zeigt somit eine geringere Verzerrung als bei anderen 5'-Termini auf der RNA-Matrize (HO-N, p-N oder m ⁷GpppN) beobachtet.
6 zeigt, dass die relativen TS-Effizienzen (in 6 engl. „Template Switching Efficiency“) innerhalb einer gegebenen RNA-Matrize bei verschiedenen RTs vom MMLV-Typ ähnlich sind. Die 25mer-RNA Matrizensequenz wird durch das Nukleotid A, C, G oder U an der ersten Position nach der Kappe dargestellt.
7 zeigt, dass ein Überschuss an dCTP und/oder die Abreicherung von dATP in der RT-Reaktion die TS-Effizienz für alle RNA-Matrizen unabhängig von der Identität des Ausgangsnukleotids (N = A, C, G oder U) der 25mer-RNA im Vergleich zu äquimolaren Konzentrationen aller Nukleotide erhöht. Ein 10-facher Überschuss an dCTP (10X dCTP) erhöhte die TS-Effizienz um das 1,5- bis 5-fache, wie durch Kapillarelektrophorese bestimmt. Die Daten wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und stellen Mittelwerte ± SD von n=2 unabhängigen Experimenten dar.
8A-8D bestätigt, dass bei der Verwendung von Sequenzierungs-Lesungen (in 8A-8D engl. „reads“) RNA-Matrizen, die chemisch mit einem unmethylierten Guanosin (Gppp) verkappt sind, die einheitlichsten (unverzerrten) TS aufweisen, unabhängig von den 5'-Nukleotiden an Position 1 und 2 der 25mer-RNA-Matrize und unter Verwendung des gleichen TSO (rGrGrG 3').
8A zeigt, dass alle Sequenzierungs-Lesungen, die aus einer cDNA-Bibliothek stammen, die aus Guanosin-5'-verkappten RNAs hergestellt wurde, innerhalb des 2-fachen des erwarteten Wertes liegen. Die Sequenz-ID (x-Achse) stellt die ersten beiden variablen Nukleotide am 5'-Ende der RNA-Matrizensequenz dar.
8B zeigt, dass die direkte reverse TS-Transkription des nicht verkappten Pools, der aus 5'-Monophosphat-RNAs (5'-p-NN) besteht, zu einer starken Verzerrung gegenüber Sequenzen führt, die mit Uridin oder Adenosin beginnen (RNA-Matrizen, die mit AA, AC, UG und UU beginnen, waren in den Sequenzierungs-Lesungen (engl. „reads“) unterrepräsentiert).
8C zeigt, dass die RNA-Matrizen in einer cDNA-Bibliothek, die mit herkömmlichen 3'- und 5'-Ligationsmethoden hergestellt wurde, stark unterrepräsentiert sind. RNA-Matrizen, die mit AG, GG, GU und UG beginnen, waren unterrepräsentiert, während GA in den Sequenzierungs-Lesungen überrepräsentiert war.
8D zeigt Daten aus 8A-8C, die in einem Streudiagrammformat dargestellt sind, in dem die genaueste Verteilung der Sequenzierungslesevorgänge für die cDNA-Bibliothek aus Guanosin-5'-verkappten RNA-Matrizen (offene Kreise) erhalten wurde. Für alle RNA-Matrizen wurde ein normalisierter Lese-Wert von 1 erwartet (durchgezogene Linie). Das Intervall der 2-fachen Abweichung vom erwarteten Wert (entspricht einer 2-fachen Über- oder Unterrepräsentation) ist mit gestrichelten Linien dargestellt. Die Daten stellen den Mittelwert von n=4 unabhängigen Experimenten dar.
9 zeigt in einem Streudiagramm der Sequenzierungs-Lesungen, dass relativ einheitliche Lesungen unter Verwendung von 16 diskreten RNA-Matrizen erhalten wurden, die sich durch die Anzahl der Phosphate zwischen dem G und dem ersten Nukleotid auf der Matrize und durch den Ersatz von G durch Inosin (I) in der Kappe unterschieden.

Die chemische Verkappung wurde vor TS durchgeführt, um 5'-Xpm, pNN RNA-Oligonukleotide zu erzeugen, wobei die Sequenz-ID „NN“ die ersten beiden variablen Nukleotide am 5'-Ende der 25mer-Sequenz darstellt; X ist Inosin (I) oder Guanosin (G); und m = 1, 2 oder 3 ist die Anzahl der Phosphate, die durch die chemische Verkappungsreaktion hinzugefügt wurden.
Ein Streupunktdiagramm der Verteilung der Sequenzierungslesezeichen von cDNA-Bibliotheken bestätigte, dass eine unmethylierte Guanosinkappe, die eine 5'-5'-Triphosphatbindung mit der RNA-Matrize (5'-GpppNN) bildet, die gleichmäßigste und genaueste Verteilung der Sequenzierungslesezeichen ergab (offene Kreise). Für alle RNA-Matrizen wurde ein normalisierter Read-Wert von 1 erwartet (durchgezogene Linie). Das Intervall der 2-fachen Abweichung vom erwarteten Wert (entspricht einer 2-fachen Über- oder Unterrepräsentation) ist mit gestrichelten Linien dargestellt. Die Daten stellen den Mittelwert von n=4 unabhängigen Experimenten dar.
10A-10B zeigt, dass ein kommerziell erhältlicher äquimolarer Pool von 962 einzigartigen miRNAs (miRXplore, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland), der am 5'-Ende (5'-Gppp) für TS verkappt wurde und einen 3'-Adapter mit bekannter Sequenz durch Splint-Ligation (3'-Splint-Adapter) aufwies, eine viel weniger verzerrte Darstellung der cDNA-Sequenzen lieferte als die, die mit einem kommerziell erhältlichen Kit (Illumina TruSeq® Small RNA Kit (Illumina, San Diego, CA)) beobachtet wurde.
10A zeigt die Verteilung der Sequenzen der cDNA-Bibliotheken, die durch TS von Guanosin 5'verkappten (5'-Gppp) miRNAs und verschiedene 3'-Adapter-Ligationsstrategien hergestellt wurden.
10B zeigt 10 zufällig ausgewählte Sequenzen aus der miRXplore cDNA-Bibliothek in 10A. Eine große Anzahl von miRNAs ist mit dem Illumina TruSeq Small RNA Library Prep Kit unterrepräsentiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Sequenzierungs-Lesungen, die von Guanosin-5'-verkappten miRNAs stammen, weniger verzerrt sind (45 %-78 % der Sequenzierungs-Lesungen lagen innerhalb eines Intervalls von 2-fach vom erwarteten Wert) als diejenigen, die von einer herkömmlichen Methode zur Vorbereitung von Small-RNA-Bibliotheken erhalten wurden (nur 22 % der Sequenzierungs-Lesungen lagen innerhalb des 2-fachen Intervalls mit dem Illumina TruSeq Small RNA Library Prep Kit).
11 zeigt, dass die chemische Verkappung von RNA mit einem einzelnen Phosphat am 5'-Terminus vor der Verkappung in Kombination mit der Verwendung von TS zum Hinzufügen eines 5'-TSO und Ligation zum Hinzufügen eines 3'-Adapters eine genaue Quantifizierung einzelner RNA-Matrizen ermöglicht. Hier wurde die Gesamt-RNA des menschlichen Gehirns mit unterschiedlichen Mengen von 12 microRNAs angereichert. Die Sequenzierungsergebnisse zeigen, dass die relative Repräsentation jeder der 12 microRNAs, die aus der Gesamt-RNA-Mischung identifiziert wurden, mit den Eingabeverhältnissen übereinstimmte.
12A-12C zeigt, dass natürlich vorkommende miRNAs durch Deep Sequencing in komplexen Proben identifiziert werden können, die aus Gesamt-RNA bestehen, die aus verschiedenen Zelltypen nach chemischer Kappung und TS extrahiert wurde, um cDNAs zu erzeugen.
12A zeigt cDNA, die einer miRNA in der Gesamt-RNA des menschlichen Gehirns entspricht.
12B zeigt cDNA, die einer miRNA in der Gesamt-RNA des menschlichen Herzens entspricht.
12C zeigt cDNA, die der miRNA in der in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gesamt-RNA der menschlichen Leber entspricht.
cDNA-Bibliotheken wurden durch TS von Guanosin-5'-verkappten (5'-Gppp) miRNAs und verschiedene 3'-Adapter-Ligationsstrategien hergestellt. Die Daten stellen Mittelwerte von n=2 unabhängigen Experimenten dar.
13A-13C zeigt, dass chemisch verkappte ssDNA (5'-Gppp) mit TS effizient und mit geringerer Verzerrung nachgewiesen werden kann als nicht verkappte ssDNA.
13A zeigt die Ergebnisse der Kapillarelektrophorese für Guanosin-5'-verkappte ssDNA-Matrizen, aus denen cDNA-Bibliotheken mit durch TS eingeführten Adapteren am 5'-Ende erzeugt wurden. TS ist bei 5'verkappten ssDNA-Matrizen effizienter als bei nicht verkappten DNA-Matrizen.
13B zeigt eine Streupunktdiagramm-Verteilung der Sequenzierungs-Lesungen, die aus cDNA-Bibliotheken stammen, die aus einem Pool von 16 diskreten ssDNA-Matrizen hergestellt wurden (Sequenzen sind im Einschub gezeigt, wobei d für Desoxyribonukleotid steht). ssDNA-Matrizen, die am 5'-Ende (5'-Gppp) für TS verkappt waren und einen 3'-Adapter mit bekannter Sequenz durch Splint-Ligation (3'-Splint-Adapter) aufwiesen, lieferten eine weniger verzerrte Darstellung der DNA-Sequenzen (Daten dargestellt durch gefüllte Kreise) als bei nicht verkappten (5'-p) DNA-Matrizen (Daten dargestellt durch offene Quadrate) beobachtet. Bei allen DNA-Matrizen wurde ein normalisierter Lesewert von 1 erwartet (durchgezogene Linie). Das Intervall der 2-fachen Abweichung vom erwarteten Wert (entspricht einer 2-fachen Über- oder Unterrepräsentation) ist mit gestrichelten Linien dargestellt. Die Daten stellen den Mittelwert von n=2 unabhängigen Experimenten dar.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Hierin werden Verfahren und Zusammensetzungen zur chemischen Verkappung von Polynukleotiden beschrieben.
Aspekte der vorliegenden Offenbarung können im Lichte der Ausführungsformen, der Abschnittsüberschriften, der Figuren, der Beschreibungen und der Beispiele weiter verstanden werden, von denen keines so ausgelegt werden sollte, dass es den gesamten Umfang der vorliegenden Offenbarung in irgendeiner Weise einschränkt. Dementsprechend sollten die nachstehend aufgeführten Ansprüche im Hinblick auf die gesamte Breite und den Geist der Offenbarung ausgelegt werden.
Jede der hier beschriebenen und dargestellten Ausführungsformen weist einzelne Komponenten und Merkmale auf, die ohne weiteres von den Merkmalen einer der anderen Ausführungsformen getrennt oder mit ihnen kombiniert werden können, ohne dass dies vom Anwendungsbereich oder Geist der vorliegenden Lehre abweicht. Jedes beschriebene Verfahren kann in der angegebenen Reihenfolge oder in jeder anderen logisch möglichen Reihenfolge durchgeführt werden.
Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, gemeinhin verstanden wird. Dennoch werden bestimmte Begriffe hier in Bezug auf Ausführungsformen der Offenbarung und im Interesse der Klarheit und Einfachheit der Bezugnahme definiert.
Quellen für allgemein verständliche Begriffe und Symbole können sein: Standardwerke und Texte wie Kornberg und Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan und Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999); Eckstein, Herausgeber, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991); Gait, Herausgeber, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984); Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d ed., John Wiley and Sons, New York (1994), und Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991), vermitteln einem Fachmann die allgemeine Bedeutung vieler der hier verwendeten Begriffe.
Alle hier angeführten Referenzen sind durch Verweis einbezogen.
Wie hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendet, schließt die Singularformen „ein“ (engl. „a“ oder „an“) den Plural ein, es sei denn, aus dem Kontext geht eindeutig etwas anderes hervor. So bezieht sich beispielsweise der Begriff „ein Protein“ auf ein oder mehrere Proteine, d. h. auf ein einzelnes Protein und mehrere Proteine. Es wird ferner darauf hingewiesen, dass die Ansprüche so formuliert werden können, dass jedes optionale Element ausgeschlossen wird. Daher soll diese Erklärung als Grundlage für die Verwendung ausschließender Begriffe wie „ausschließlich“, „nur“ und dergleichen in Verbindung mit der Aufzählung von Anspruchselementen oder der Verwendung einer „negativen“ Einschränkung dienen.
Numerische Bereiche umfassen die Zahlen, die den Bereich definieren. Alle Zahlen sind so zu verstehen, dass sie den Mittelpunkt der Ganzzahl über und unter der Ganzzahl umfassen, d. h. die Zahl 2 umfasst 1,5-2,5. Die Zahl 2,5 umfasst 2,45-2,55 usw. Wenn numerische Beispielwerte angegeben werden, kann jeder für sich einen Zwischenwert in einem Wertebereich darstellen und zusammen die Extremwerte eines Bereichs repräsentieren, sofern nicht anders angegeben.
Es werden Zusammensetzungen und Verfahren für die Vorbereitung von cDNA-Bibliotheken für die Sequenzierung, einschließlich der Erstellung von Genexpressionsprofilen, und andere Verwendungen bereitgestellt. Die Sequenzierung, einschließlich der Sequenzierung der nächsten Generation (Next Generation Sequencing, NGS), ist ein leistungsfähiges Instrument für die Analyse von cDNA-Bibliotheken, die von Polynukleotiden abgeleitet sind, da sie den Nachweis von Unterschieden zwischen einzelnen Basen zwischen Molekülen, die Entdeckung unbekannter Moleküle und die Bestimmung der Unterschiede in der Zusammensetzung oder Expression zwischen verschiedenen Proben ermöglicht. Zu den Polynukleotidbibliotheken gehören auch RNA-Bibliotheken. RNA-Bibliotheken werden in der Regel durch Ligation hergestellt, wie zum Beispiel in Hafner et al. (2008) Methods 44: 3-12 beschrieben. Es ist jedoch bekannt, dass diese Bibliotheken durch die terminalen RNA-Sequenzen verzerrt werden, die offenbar die Ligationseffizienz bestimmen (Jackson, et al. (2014) BMC Genomics 15: 569; Hafner, et al. (2011) RNA 17: 1697-1712; Coenen-Stass, et al. (2018) RNA Biol. 15: 1133-1145). Eine andere Methode zum Aufbau von RNA-Bibliotheken verwendet TS, aber veröffentlichte Methoden haben auch Probleme der Verzerrung (Coenen-Stass, et al. (2018) RNA Biology 15: 1133-1145).
„Verzerrung“ (engl. „bias“) bezieht sich hier auf die Bevorzugung oder Benachteiligung einer Polynukleotidsequenz oder einer Art von Polynukleotidmolekülen in einer gemischten Population von Molekülen. Eine Verzerrung wird beispielsweise beobachtet, wenn die Abundanz der eingegebenen RNA falsch dargestellt wird, wie durch die Analyse der Sequenzlesehäufigkeiten bestimmt werden kann.
Der hier verwendete Begriff „Effizienz“ (engl. „efficiency“) bezeichnet ein Maß für den Erfolg der Umwandlung eines Moleküls von einer Form in eine andere, z. B. den Erfolg der Umwandlung einer nicht verkappten RNA in eine verkappte RNA und/oder den Erfolg der Umwandlung eines RNA-Moleküls in ein cDNA-Molekül und/oder den Erfolg der Umwandlung eines revers transkribierten Polynukleotids in ein Polynukleotid mit einem durch TS angehängten Adapter.
Der hier verwendete Begriff „Polynukleotidpopulation“ bzw. „Population von Polynukleotiden“ bezieht sich auf mehrere unterschiedliche, vorzugsweise natürlich vorkommende Polynukleotide, die sich durch ihre Länge, die 5'-terminalen Nukleotide und/oder das Fehlen eines 5'-Phosphats oder eines oder zweier 5'-Phosphate unterscheiden können. Die Population der Polynukleotide kann ferner verschiedene Klassen von Polynukleotiden umfassen, wie ssDNA, teilweise ssDNA, RNAs verschiedener Typen und Fragmente von RNA oder DNA. Die Polynukleotidpopulation kann unterschiedliche Mengen repräsentativer Polynukleotidtypen enthalten, wobei einige Typen in sehr geringen Konzentrationen und andere in größeren Mengen vorkommen können. In jeder Ausführungsform kann eine Population von Polynukleotiden natürlich vorkommen, d. h. aus einer Zelle gewonnen werden. In diesen Ausführungsformen kann die Polynukleotidpopulation beispielsweise mRNA, miRNA, fragmentierte RNA, RNA, die für eine oder mehrere Spezies angereichert wurde, oder RNA, die für eine oder mehrere Spezies abgereichert wurde, umfassen. Die in dem Verfahren verwendete RNA kann aus einer beliebigen Quelle stammen, z. B. einem Prokaryoten (z. B. einem Bakterium) oder einem Eukaryoten (z. B. einer Pflanze oder einem Tier wie einem Säugetier oder einem Menschen).
Die Begriffe „5'-Kappen-Vorläufer‟ (engl. „5' cap precursor‟), „aktiviertes 5'-Nukleosidmono- oder - polyphosphat“ und „aktiviertes Nukleosid-5'-phosphat“ werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf denselben Molekültyp. Solche Moleküle bestehen aus drei Komponenten: einem Nukleosid, einer phosphatreaktiven Abgangsgruppe und einem oder mehreren Phosphaten (in der Regel ein, zwei oder drei Phosphate), wobei das eine oder die mehreren Phosphate das Nukleosid mit der Abgangsgruppe verbinden, wie in 1A-1B und 2A-2F dargestellt. Einzelheiten und Beispiele für die Bestandteile dieser Moleküle werden nachstehend ausführlicher beschrieben.
Der Begriff „chemische Verkappung“ (engl. „chemical capping“) bezieht sich auf eine Reaktion, die nicht enzymatisch katalysiert wird, d. h. nicht mit Hilfe eines Verkappungsenzyms (engl. „capping enzyme“) erfolgt. Chemisches Verkappen beinhaltet eine nukleophile Substitutionsreaktion, bei der die Abgangsgruppe eines aktivierten 5'-Mono- oder -Polyphosphats des Nukleosids mit dem 5'-Phosphat des Polynukleotids reagiert, wodurch die Abgangsgruppe freigesetzt und das 5'-Mono- oder -Polyphosphat des Nukleosids an das Polynukleotid über eine 5'-5'-Polyphosphat-Bindung gekoppelt wird, die z. B. 2, 3 oder 4 Phosphate umfasst.
Der Begriff „Inkubation“ bezieht sich auf die Aufrechterhaltung einer Reaktion unter Bedingungen, die für die Herstellung eines gewünschten Produkts geeignet sind. Im vorliegenden Fall bezieht sich der Begriff „Inkubation“ auf eine Reaktion, die mindestens 30 Minuten lang (z. B. 1 Stunde bis 10 Stunden oder 1-6 Stunden) bei einer Temperatur von mindestens Raumtemperatur (z. B. Raumtemperatur bis etwa 60 °C) stattfindet.
Der Begriff „Matrizenwechsel-Reaktion“ (engl. „Template-Switching reaction“, kurz TS für „Template Switching“) bezieht sich auf die Matrizen-abhängige (engl. „template-dependent“) Addition des Komplements eines Oligonukleotids (als Matrizenwechsel-Oligonukleotid oder TSO bezeichnet) an das 3'-Ende einer cDNA während der cDNA-Synthese. Es wird angenommen, dass TS dadurch verursacht wird, dass eine RT während der cDNA-Synthese die Matrize von einem Molekül (einer RNA) auf ein anderes (das TSO) umschaltet. TS und TSOs werden z. B. in Luo et al. (J. Virol., 1990 64: 4321-4328) und Zhu et al. (Biotechniques 2001 30: 892-897) beschrieben. In TS wird die reverse Transkription in Gegenwart des TSO durchgeführt.
Der Begriff „reverse Transkription“ (engl. „reverse transcribing“) bezieht sich auf eine templatabhängige Reaktion, bei der eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (eine RT) RNA in DNA (d. h. cDNA) kopiert. Wie in 4A-4D dargestellt, kann RNA unter Verwendung eines oder mehrerer genspezifischer Primer, zufälliger Primer oder eines Oligo-dT-Primers in cDNA kopiert werden (in diesem Fall muss das 3'-Ende der RNA vor der reversen Transkription nicht modifiziert werden). Die RNA kann auch unter Verwendung eines Universalprimers in cDNA kopiert werden (in diesem Fall kann zuvor ein Adapter, der eine Bindungsstelle für den Universalprimer bereitstellt, an das 3'-Ende der RNA angefügt werden). In einigen Ausführungsformen kann die RNA unter Verwendung einer PolyA-Polymerase mit einem PolyA-Schwanz versehen werden, und die mit einem PolyA-Schwanz versehene RNA kann unter Verwendung eines Oligo-dT-Primers in cDNA kopiert werden. Obwohl der Begriff „reverse Transkription“ im Allgemeinen so verstanden wird, dass RNA in cDNA kopiert wird, wird derselbe Begriff hier im weiteren Sinne verwendet und bezieht sich auf jedes Polynukleotid (einschließlich RNA, DNA oder Hybride davon), das in cDNA kopiert wird.
Eine Lösung für das Problem der Verzerrung und der Effizienz bei der Bibliotheksvorbereitung wird hier durch die chemische Verkappung von DNA- oder RNA-Molekülen in einer Population von Polynukleotiden und die Matrizenwechsel-reverse Transkription (engl. „template switching reverse transcription“) angeboten. Ein 5'-Kappe-Vorläufer wird an das 5'-Ende eines Polynukleotidmoleküls mit einem 5'-Phosphat in einer Population von Polynukleotiden angefügt, um 5'-verkappten (engl. „5'-capped‟) Polynukleotide durch eine kovalente 5'-zu-5'-Polyphosphat-Bindung zu bilden. Eine RT erzeugt dann eine cDNA und fügt anschließend eine Adaptersequenz hinzu, die komplementär zu einem TSO ist.
Zu den Vorteilen dieses Ansatzes im Vergleich zu anderen Methoden der cDNA-Generierung gehören einer oder mehrere der folgenden Punkte:

a) Verbesserung der Kappungseffizienz: Verkappte Polynukleotide fördern die TS effizienter als unverkappte Polynukleotide, einschließlich DNA und RNA (siehe z. B. 5A-5B, 8A-8D und 13A-13C);
b) Höhere Ausbeute und geringere Verzerrung in Sequenzierbibliotheken: Guanosin (G) Kappe (engl. „cap“) zeigte eine höhere Ausbeute und weniger Verzerrungen als 7-Methylguanosin (m ⁷G) Kappe, (siehe zum Beispiel 5A-5B); und
c) Höhere Effizienz und geringere Verzerrungen bei cDNA aus beschädigter RNA, nicht verkappter RNA und ssDNA: Die chemische Kappung bzw. Verkappung verbessert die Effizienz und verringert die Sequenzierungsverzerrungen von beschädigter RNA (siehe z. B. 12C), nicht verkappter RNA (siehe z. B. kleine RNAs; wie in 10A-10B, 11 und 12A-12C gezeigt) und ssDNA (siehe z. B. 13A-13C).

Durch eine erhöhte Ausbeute an cDNA, verringerte Verzerrungen durch unterschiedliche Sequenzen von Polynukleotiden in der Population und eine verbesserte Genauigkeit von cDNA-Bibliotheken, die die unterschiedlichen Polynukleotide aus der Probe repräsentieren, ermöglicht die Methode die Analyse kleiner Mengen von Polynukleotiden in einer Population, in der die Population von Polynukleotiden aus der Probe sowohl nicht verkappte RNAs als auch abgebaute und/oder fragmentierte RNAs und DNAs enthalten kann.
CHEMISCHE VERKAPPUNG
Die im Folgenden beschriebenen Zusammensetzungen und Methoden zeigen eine hohe Effizienz und eine relativ schnelle Produktion von verkappten Polynukleotiden. Die Effizienz der Verkappung stieg im Vergleich zu früher beschriebenen Verkappungen um mehr als das 1,5-fache innerhalb eines Zeitraums von weniger als 10 Stunden, insbesondere weniger als 6 Stunden, insbesondere 5 Stunden oder weniger (siehe z. B. 3B-3E).
Die obigen Ergebnisse zeigen eine deutliche Verbesserung gegenüber der nicht-enzymatischen Verkappung von 5'-Monophosphat-Oligonukleotiden mit 7-methyliertem Guanosin, die von Sawai et al. in J. Org. Chem. 64, 5836-5840 (1999), die von geringen bis mäßigen Ausbeuten der Verkappungsreaktion (35%-49%) mit Inkubationszeiten von 4 bis 10 Tagen berichteten, was die Praktikabilität dieser Verkappungsmethode einschränkte. Diese Verbesserungen ermöglichen erstmals das Verkappen von Polynukleotidmolekülen aus komplexen Proben wie Zellextrakten oder formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe.
Das hier beschriebene chemische Verkappen wurde verwendet, um eine synthetische 5'-Kappe-Struktur (einschließlich Guanosin-, Adenosin-, Cytidin-, Inosin- und Uridin-Kappen sowie Di-, Tri- und Tetraphosphat-Brücken) an nicht verkappte Nukleinsäuren anzuhängen, um Polynukleotid-Sequenzierungsbibliotheken zu erzeugen. Als bevorzugte Kappen wurden unmethylierte Guanosin-Kappen gefunden, die in stabilen RNAs in der Natur nicht vorkommen. Eine unmethylierte 5'-Guanosin-Kappe führte zu einem effizienteren und weniger sequenzverzerrten (engl. „sequence biased“) Matrizenwechsel (engl. „template switch“) als m ⁷G-Kappen, die in der Natur auf intakten mRNAs zu finden sind.
Die chemische Verkappung wurde in Gegenwart von aktivierten 5'-Nukleotidvorläufern durchgeführt. Die Synthese aktivierter 5'-Nukleotide basiert auf der nukleophilen Substitution eines Nukleosids oder Nukleosid-5'-Phosphats, wie z. B. eines Nukleosid-5'-Monophosphats (NMP), eines Nukleosid-5'-Diphosphats (NDP) und eines Nukleosid-5'-Triphosphats (NTP). Nucleoside und Nucleosid-5'-phosphate können als Phosphordichloridat, Phosphoramidat, Phosphodiester, Phosphotriester, 5'-H-Phosphonat, P(III)-P(V)-Mischanhydrid oder Phosphittriester aktiviert werden (1A). P(III)- und P(V)-Aktivierungschemikalien (besprochen von Roy, et al. Chem. Rev., 116, 7854-7897 (2016)) können auf eine große Anzahl von Nukleosid-5'-Phosphat-Analoga angewendet werden, einschließlich Ribonukleoside oder Desoxyribonukleoside, basen- oder zuckermodifizierte Nukleoside sowie carbocyclische und acyclische Analoga (1B).
Die Chemie für die Synthese von Nukleosid-5'-Phosphat-Vorläufern wird im Folgenden näher beschrieben.
P(III)- und P(V)-Aktivierungschemikalien können zur Herstellung von Analoga verwendet werden, die Phosphatmodifikationen enthalten, wie Thiophosphate, Boranophosphate und Selenophosphate. 5'-Phosphat-Nukleoside sowie ihre carbocyclischen und acyclischen Analoga, die mit einem der oben beschriebenen Reagenzien aktiviert werden, können in Kupplungsreaktionen mit einem 5'-Phosphat-Oligonukleotid (z. B. einem 5'-Monophosphat-, 5'-Diphosphat- oder 5'-Triphosphat-Oligonukleotid) verwendet werden, um Produkte zu bilden, die 5'-5'-Polyphosphat-Bindungen enthalten. Die Kupplungsreaktion mit einem Oligonukleotid-5'-phosphat kann in einem wässrigen Lösungsmittel, einem organischen Lösungsmittel oder einer Kombination davon durchgeführt werden; sie kann ein anorganisches Metallsalz als Katalysator und weitere Zusatzstoffe wie Polyethylenglykole (PEG) und PEG-Derivate enthalten. Phosphordichloridate können zum Beispiel durch die Reaktion von Nukleosiden mit Phosphorylchlorid in Trimethylphosphat hergestellt werden.
Nucleosid-5'-Phosphodiester können beispielsweise durch die Reaktion von 2',3'-geschützten Nucleosiden mit 2-Cyanoethylphosphat in Gegenwart von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erzeugt werden, gefolgt von der in situ-Entfernung der Cyanoethylgruppe. Ein weiteres Beispiel für ein Phosphorylierungsreagenz ist das 2-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)ethylsulfonylethan-2'-yl-phosphat, das in Gegenwart eines entsprechend geschützten Nukleosids und Triisopropylbenzolsulfonyltetrazolid (TPSTAZ) ein Phosphodiester-Intermediat bildet.
Nucleosid-5'-Phosphotriester können beispielsweise durch eine Kupplungsreaktion vom Mitsunobu-Typ zwischen einem Nucleosid und einem Dibenzylphosphat in Gegenwart von Triphenylphosphin und Diethylazodicarboxylat hergestellt werden; durch anschließende Debenzylierung entsteht das Phosphotriester-Zwischenprodukt. Ein weiterer Ansatz zur Herstellung eines Phosphotriesters besteht in der Umsetzung von entsprechend geschützten Nukleosiden zunächst mit Di-tert-butyloxy-N,N-diethylphosphoramidit in Gegenwart von IH-Tetrazol und anschließender Oxidation mit meta-Chlorperoxybenzoesäure (m-CPBA); durch anschließende Entfernung der tert-Butyl- und Acetonidgruppen entsteht das Phosphotriester-Zwischenprodukt. Ein weiterer Ansatz für einen Phosphotriester ist die Verwendung von Salicylalkoholen zur Maskierung der Phosphatgruppe (CycloSalphosphat). CycloSal-Phosphotriester können über die P(III)- und P(V)-Chemie synthetisiert werden. Ein Ansatz zur Herstellung von CycloSalphosphotriestern über P(III) basiert auf der Kopplung eines Nukleosids mit Saligenylchlorophosphit, gefolgt von einer in situ-Oxidation. Ein zweiter Ansatz für CycloSal-Phosphotriester über P(III) beinhaltet die Reaktion eines Nukleosids mit einem Phosphoramidit und die anschließende Oxidation des Phosphit-Trimesters. Ein dritter Ansatz zur Herstellung von CycloSalphosphotriestern über P(III) beinhaltet die Reaktion eines Nukleosids mit einem Cyclosaligenylphosphorochloridat. Ein vierter Ansatz zur Herstellung von CycloSalphosphotriestern über P(III) beinhaltet die vorherige Synthese von Nucleosidphosphorodichloridat, das dann mit Salicylalkohol behandelt wird.
Nucleosid-5'-H-Phosphonate können beispielsweise durch Umesterung von Diphenyl-H-Phosphonat mit entsprechend geschützten Nucleosiden in Pyridin hergestellt werden, um Phenyl-H-Phosphonat-Diester zu erzeugen; die anschließende Behandlung mit wässrigem Triethylamin ergibt das H-Phosphonat-Monoester-Zwischenprodukt. H-Phosphonatmonoester können in dreiwertige Silylphosphite umgewandelt werden, zum Beispiel durch Behandlung mit N,O-Bis(trimethylsilyl)acetamid (BSA), um die weitere Oxidation zu den entsprechenden Phosphaten zu erleichtern.
Nucleoside, die P(III)-P(V)-Mischanhydride enthalten, können beispielsweise durch Phosphitylierung von Nucleosid-5'-Monophosphaten in Form ihrer Tetra-N-butyl- oder Tris-N-hexylammoniumsalze mit einem Phosphoramidit-Reagenz (z. B. Salicylchlorophosphit oder Bis-diisopropylamino-chlorophosphin) und anschließender Oxidation mit einer wässrigen Pyridinlösung von Iod hergestellt werden. Zur Vermeidung von Nebenreaktionen können bei diesem Ansatz entsprechend geschützte Nukleoside erforderlich sein; die Verwendung von sperrigen Phosphitylierungsreagenzien ermöglicht jedoch auch die Reaktion mit ungeschützten Nukleosiden. P(III)-P(V)-Mischanhydride können zur Herstellung von Analoga verwendet werden, die Modifikationen am α-Phosphat enthalten, wie z. B. 5'-(α-P-Thiophosphate), 5'-(α-P-Boranophosphate) und 5'-(α-P-Selenophosphate).
Nucleosid-5'-phosphosulfonyl-Reagenzien können beispielsweise durch Umsetzung von Tetra-n-butylammonium-Salzen von Nucleosid-5-phosphaten mit einem Sulfonylimidazolium-Salz in Gegenwart von N-Methylimidazol (NMI) oder N,N'-Diisopropylethylamin (DIPEA) als Base hergestellt werden. Das Sulfonylimidazoliumsalz kann durch Umsetzung von Phenylsulfonylimidazolid mit Methyltriflat in Ether hergestellt werden.
Nukleosid-5'-Phosphoramidate sind einige der nützlichsten Vorstufen für die Synthese von Phosphat-Phosphat-Bindungen. Beispiele für Phosphoramidate sind Phosphoroimidazolide, Phosphoromorpholidate, Phosphoropiperidate, Pyrrolidiniumphosphoramidate und Pyridiniumphosphoramidate.
Nucleosid-5'-Phosphoropiperidate können z. B. durch Phosphitylierung von Carboxybenzyl-geschützten Nucleosiden mit Benzyl-N,N-diisopropylchlorophosphoramidit in Gegenwart von IH-Tetrazol und anschließende oxidative Kopplung mit CCl₄/Et₃N/Piperidin hergestellt werden; die anschließende Entschützung (engl. „deprotection“) der Carboxybenzyl- und Benzylester der Nukleosid- und Phosphoramidateinheiten durch milde katalytische Hydrierung ergibt das Phosphoropiperidat. Die Kopplung von 5'-Phosphoropiperidaten mit phosphathaltigen Verbindungen zur Bildung von Phosphat-Phosphat-Bindungen kann durch 4,5-Dicyanoimidazol (DCI) gefördert werden.
Nucleosid-5'-phosphoromorpholidate können beispielsweise durch Umsetzung eines Nucleosids oder eines Nucleosid-5'-phosphats mit 2,2,2-Tribromethylphosphoromorpholinochloridat und anschließender in situ-Entfernung der 2,2,2-Tribromethyl-Schutzgruppe mit Cu-Zn hergestellt werden. Ein weiterer Ansatz für 5'-Phosphoromorpholidate ist die Kopplung eines 5'-Nukleosidphosphats mit Morpholin in Gegenwart von DCC.
Nucleosid-5'-Pyrrolidiniumphosphoramidate können beispielsweise durch Umlagerung von Nucleosidphosphoramidat-Diestern aus N-(3-Chlorbutyl)-N-methylamin erzeugt werden, was zur Bildung von Pyrrolidiniumphosphoramidaten führt.
Nucleosid-5'-Pyridiniumphosphoramidate können aus Nucleosid-5'-H-Phosphonatmonoestern hergestellt werden, die entweder aus Salicylchlorophosphit oder Phosphortrichlorid gewonnen werden. Die Silylierung der H-Phosphonatmonoester mit TMSC1 in Pyridin und die anschließende Oxidation mit Iod führen zu den entsprechenden Pyridiniumphosphoramiditen. Nukleosid-5'-Phosphorimidazolide sind bevorzugte Reagenzien, da sie reaktiver sind als die entsprechenden Phosphoromorpholidate und mehr Spielraum bei der Wahl des Lösungsmittels bieten. Phosphorimidazolide werden manchmal auch als Phosphorimidazolate, Phosphorimidazolidate, Phosphorimidazole, Phosphorimidazolidate, Phosphorimidazolate, Phosphorimidazolide und Phosphorimidazole bezeichnet.
Nucleosid-5'-phosphorimidazolide können beispielsweise durch Behandlung von Nucleosid-5'-phosphaten (einschließlich Nucleosid-5'-monophosphaten, NMPs; Nucleosid-5'-diphosphaten, NDPs; Nucleosid-5'-triphosphaten, NTPs; Nucleosid-5'-Tetraphosphate, Nucleosid-5'-Pentaphosphate, Nucleosid-5'-Hexaphosphate usw.) mit 1,1'-Carbonyldiimidazol (CDI), gefolgt von der Entfernung der 2',3'-Carbonat-Schutzgruppe unter basischen Bedingungen. Eine andere Strategie zur Herstellung von Phosphorimidazoliden besteht in der Behandlung von Nukleosid-5'-Phosphaten mit Imidazol in Gegenwart von Triphenylphosphin und 2,2'-Dithiodipyridin. Die letztgenannte Strategie kann auch mit Imidazolderivaten wie N-Methylimidazol, 2-Methylimidazol, 4-Methylimidazol, 2-Aminoimidazol, 2-Isopropylimidazol, 2-Phenylimidazol, Benzimidazol, 2-Methylbenzimidazol, 2-Chlorimidazol oder 2-Methylaminoimidazol durchgeführt werden. Eine weitere Strategie zur Herstellung von Phosphorimidazoliden ist die In-situ-Aktivierung von Nukleosid-5'-Phosphaten mit Trifluoressigsäureanhydrid (TFAA) in Gegenwart eines tertiären Amins in Acetonitril, gefolgt von der Entfernung des überschüssigen TFAA unter Vakuum und der Behandlung der resultierenden gemischten Anhydride mit N-Methylimidazol zur Herstellung der entsprechenden Phosphormethylimidazolide.
Die Phosphorimidazolid-Aktivierungschemie kann auf eine große Zahl von Nucleosid-5'-Phosphat-Analoga angewandt werden, darunter Ribonucleoside oder Desoxyribonucleoside, basen- oder zuckermodifizierte Nucleoside sowie carbocyclische und acyclische Analoga. Die resultierenden Nucleosid-5'-Phosphorimidazolide können durch Fällung isoliert werden, beispielsweise durch Behandlung mit Natrium- oder Lithiumperchlorat in Aceton und anschließende Filtration.
Das Nukleosid 5'-Phosphorimidazolid kann von einem Guanosinphosphat, einem Adenosinphosphat, einem Cytidinphosphat oder einem Inosinphosphat abgeleitet werden, wobei das Phosphat ein Monophosphat, Diphosphat, Triphosphat oder Tetraphosphat sein kann, das nach chemischer Verkappung zu einem Polynukleotid mit einer 5'-5'-di-, -tri-, -tetra- oder -penta-phosphatverknüpften Nukleosidkappe führt (siehe zum Beispiel 2A-2F, 9 und Beispiel 3).
Die 2'-Position des Nucleosid-5'-phosphats kann ein SH, NH₂, ein Niederalkyl (z.B. Methyl), ein Niederalkoxy (z.B. Methoxy), ein Niederacyloxy (z.B. Acetoxy), ein Niederalkylamin (z.B. Methylamin), ein Niederacylamin (z.B. Acetamid), Halogen, Allyl, Propargyl oder N sein, Methylamin), ein niederes Acylamin (z.B. Acetamid), Halogenyl, Allyl, Propargyl oder N₃. In einigen Ausführungsformen ist die 3'-Position des Nucleosid-5'-phosphats SH, NH₂, ein niederes Alkyl (z.B. Methyl), ein niederes Alkoxy (z.B, Methyl), ein niederes Alkoxy (z.B. Methoxy), ein niederes Acyloxy (z.B. Acetoxy), ein niederes Alkylamin (z.B. Methylamin), ein niederes Acylamin (z.B. Acetamid), Halogenyl, Allyl, Propargyl oder N₃. In einigen Ausführungsformen sind sowohl die 2'- als auch die 3'-Position des Nucleosid-5'-phosphats mit den gleichen oder verschiedenen oben genannten Gruppen modifiziert. In einigen Ausführungsformen umfasst das Nucleosid-5'-phosphat außerdem eine oder mehrere Fluoreszenz-, Quencher- oder Affinitätsgruppen, die entweder an die Nucleobase oder an die 2'- oder 3'-Position gebunden sind.
Jede der oben beschriebenen chemischen Verfahren kann zur Synthese einer großen Anzahl von Nukleosid-5'-Phosphat-Analoga eingesetzt werden, einschließlich Ribonukleosiden oder Desoxyribonukleosiden, basen- oder zuckermodifizierten Nukleosiden sowie carbocyclischen und acyclischen Analoga. Beispiele für Basenmodifikationen sind unter anderem 2-Aminopurin, 2,6-Diaminopurin, 5-Joduracil, 5-Bromuracil, 5-Fluoruracil, 5-Hydroxyuracil, 5-Hydroxymethyluracil, 5-Formyluracil, 5-Proprinyluracil, 5-Methylcytosin, 5-Hydromethylcytosin, 5-Formylcytosin, 5-Carboxycytosin, 5-Jodocytosin, 5-Bromocytosin, 5-Fluorocytosin, 5-Proprynylcytosin, 4-Ethylcytosin, 5-Methylisocytosin, 5-Hydroxycytosin, 4-Methylthymin, Thymin-Glykol, Ferrocen-Thymin, Pyrrolo-Cytosin, Inosin, 1-Methyl-Inosin, 2-Methylinosin, 5-Hydroxybutynl-2'-desoxyuracil (Super T), 8-aza-7-deazaguanin (Super G), 5-Nitroindol, Formylindol, Isothymin, Isoguanin, Isocytosin, Pseudouracil, 1-Methylpseudouracil, 5,6-Dihydrouracil, 5,6-Dihydrothymin, 7-Methylguanin, 2-Methylguanin, 2,2-Dimethylguanin, 2,2,7-Trimethylguanin, 1-Methylguanin, Hypoxanthin, Xanthin, 2-Amino-6-(2-Thienyl)purin, Pyrrol-2-Carbaldehyd, 4-Thiouracil, 4-Thiothymin, 2-Thiothymin, 5-(3-Aminoallyl)-Uracil, 5-(Carboxy)vinyl-Uracil, 5-(1-Pyrenylethinyl)-Uracil, 5-Fluor-4-O-TMP-Uracil, 5-(C2-EDTA)-Uracil, C4-(1,2,4-Triazol-1-yl)-Uracil, 1-Methyladenin, 6-Methyladenin, 6-Thioguanin, Thienoguanin, Thienouracil, Thienocytosin, 7-Deaza-Guanin oder -Adenin, 8-Amino-Guanin oder -Adenin, 8-Oxo-Guanin oder -Adenin, 8-Bromo-Guanin oder -Adenin, Ethenoadenin, 6-Methylguanin, 6-Phenylguanin, Nebularin, Pyrrolidin und Puromycin. Beispiele für Zuckermodifikationen sind u. a. die in Dideoxynukleotiden (z. B. ddGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP), 2'- oder 3'-O-Alkyl-Nukleotiden (z. B, 2'-O-Methyl-Nukleotide und 3'-O-Methyl-Nukleotide), 2'- oder 3'-O-Methoxyethyl-Nukleotide (MOE), 2'- oder 3'-Fluor-Nukleotide, 2'- oder 3'-O-Allyl-Nukleotide, 2'- oder 3'-O-Propargyl-Nukleotide, 2'- oder 3'-Amin-Nukleotide (z.B., 3'-Desoxy-3'-amin-Nukleotide), 2'- oder 3'-O-Alkylamin-Nukleotide (z.B., 2'-O-Ethylamin-Nukleotide), 2'- oder 3'-O-Cyanoethyl-Nukleotide, 2'- oder 3'-O-Acetalester-Nukleotide, 4'-C-Aminomethyl-2'-O-Methyl-Nukleotide und 2'- oder 3'-Azido-Nukleotide (z. B. 3'-Desoxy-3'-azid-Nukleotide). Weitere Beispiele für Zuckermodifikationen sind solche, die in den Monomeren vorkommen, die das Rückgrat synthetischer Nukleinsäuren bilden, wie 2'-O,4'-C-Methylen-[3-D-Ribonukleinsäuren oder Locked Nucleic Acids (LNAs), Methylen-cLNA, 2',4'-(N-Methoxy)aminomethylen-verbrückte Nukleinsäuren (N-MeO-Amino-BNA), 2',4'-Aminooxymethylen-verbrückte Nukleinsäuren (N-Me-Aminooxy-BNA), 2'-O,4'-C-Aminomethylen-verbrückte Nukleinsäuren (2',4'-BNA(NC)), 2'4'-C-(N-Methylaminomethylen) verbrückte Nukleinsäuren (2',4'-BNA(NC)[NMe]), Peptid-Nukleinsäuren (PNA), Triazol-Nukleinsäuren, Morpholin-Nukleinsäuren, Amid-verknüpfte Nukleinsäuren, 1,5-Anhydrohexitol-Nukleinsäuren (HNA), Cyclohexenyl-Nukleinsäuren (CeNA), Arabinose-Nukleinsäuren (ANA), 2'-Fluor-Arabinose-Nukleinsäuren (FANA), α-L-Threofuranosyl-Nukleinsäuren (TNA), 4'-Thioribose-Nukleinsäuren (4'S-RNA), 2'-Fluor-4'-thioarabinose-Nukleinsäuren (4'S-FANA), 4'-Selenoribose-Nukleinsäuren (4'Se-RNA), Oxepan-Nukleinsäuren (ONA) und Methanocarba-Nukleinsäuren (MC).
Nukleosid-5'-Phosphorimidazolide können zur Bildung von 5'-verkappten Polynukleotiden mit Phosphatmodifikationen verwendet werden, wie z. B. Phosphorothioate (Ersatz eines nicht verbrückenden Sauerstoffatoms der Phosphatgruppe durch ein Schwefelatom), Phosphorodithioate (beide nicht verbrückenden Sauerstoffatome der Phosphatgruppe werden durch Schwefel ersetzt), Alkyphosphonate (ein nicht verbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe wurde durch eine Alkylgruppe ersetzt, z. B. Methyl), Arylphosphonate (ein nicht verbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe wurde durch eine Arylgruppe ersetzt, z. B. Phenyl), N-Phosphoramidate (ein Sauerstoffatom ist entweder am 3'- oder am 5'-Sauerstoff durch eine Aminogruppe ersetzt), Boranophosphate (ein nicht verbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe ist durch BH3 ersetzt), Phosphonoacetate (PACE, ein nicht verbrückendes Sauerstoffatom der Phosphatgruppe ist durch eine Acetatgruppe ersetzt) und 2',5'-Phosphodiester-Bindungen.
Nukleosid-5'-Phosphorimidazolide können zur Bildung von 5'-verkappten Polynukleotiden mit einer oder mehreren Fluoreszenz- oder Quencher-Gruppen, Affinitätsgruppen (z. B. Biotin, Desthiobiotin, Digoxigenin, Glutathion, Heparin, Maltose, Coenzym A, Polyhistidin und andere), Haptene für einen Antikörper (z. B. HA-Tag, c-myc-Tag, FLAG-Tag, S-Tag und viele andere), Mono- oder Oligosaccharidliganden für ein Lektin, Hormone, Zytokine, Toxine und Vitamine. Beispiele für spezifische Bindungspartner zu den oben genannten Affinitätsgruppen sind, ohne darauf beschränkt zu sein, Avidin, Streptavidin, Neutravidin, Maltose-bindendes Protein, Glutathion-S-Transferase (GST), Antikörper, Lektine, Nickel, Kobalt, Zink und Polyhistidin. Weitere Beispiele sind Gruppen, die eine irreversible Bindung mit einem Protein-Tag eingehen, wie Benzylguanin oder Benzylchoropyrimidin (SNAP-tag® (New England Biolabs, Ipswich, MA)); Benzylcytosin (CLIP-tag™ (New England Biolabs, Ipswich, MA)); Haloalkan (Halo Tag® (Promega, Madison, WI)); CoA-Analoga (MCP-Tag und ACP-Tag); Trimpethoprim oder Methotrexat (TMP-Tag); FlAsH oder ReAsH (Tetracystein-Tag); ein Substrat der Biotin-Ligase; ein Substrat der Phosphopanthelin-Transferase; und ein Substrat der Liponsäure-Ligase. Eine Affinitätsgruppe wird zur selektiven Anreicherung von Proben mit Hilfe von Affinitätsreinigungsverfahren verwendet, bei denen der Affinitätsbindungspartner in einer Säule (engl. „column“), einem Tropfen (engl. „bead“), einer Mikrotiterplatte, einer Membran oder einem anderen festen Träger immobilisiert ist. In einigen Ausführungsformen umfasst das Nukleosid-5-Phosphat einen spaltbaren Linker zwischen der Affinitätsgruppe und der Bindungsstelle an das Nukleosid-5-Phosphat. Diese Strategie ermöglicht eine spezifische Elution des Ziels von Interesse. Der abspaltbare Linker kann beispielsweise durch eine chemische, thermische oder photochemische Reaktion abspaltbar sein. Zu den chemisch spaltbaren Linkern gehören Disulfidbrücken und Azoverbindungen (gespalten durch Reduktionsmittel wie Dithiothreitol (DTT), β-Mercaptoethanol oder Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP)); Hydrazone und Acylhydrazone (gespalten durch Transiminierung in einem schwach sauren Medium); Levulinoylester (gespalten durch Aminolyse, z. B. durch Hydroxylamin oder Hydrazin); Thioester, Thiophenylester und Vinylsulfide (gespalten durch Thiol-Nukleophile wie Cystein); Orthoester, Ketale, Acetale, Vinylether, Phosphoramidate und β-Thiropropionate (gespalten durch saure Bedingungen); vicinale Diole (gespalten durch Oxidationsmittel wie Natriumperiodat); und Allylester, 8-Hydroxychinolinester und Picolinatester (gespalten durch metallorganische und metallische Katalysatoren). Weitere Beispiele sind säure- oder basenlabile Gruppen, u. a. Diarylmethyl- oder Trimethylarylmethylgruppen, Silylether, Carbamate, Oxyester, Thiester, Thionoester und α-fluorierte Amide und Ester. Beispiele für photospaltbare Linker sind o-Nitrophenylgruppen, Diazobenzol, Phenacyl, Alkoxybenzoin, Benzylthioether und Pivaloylglykolderivate.
Nukleosid-5'-Phosphorimidazolide können zur Bildung von 5'-verkappten Polynukleotiden mit einer oder mehreren reaktiven Gruppen verwendet werden. In einigen Ausführungsformen umfasst das Analogon eine reaktive Gruppe, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Carbonyl, einem Carboxyl, einem aktiven Ester, z. B. einem Succinimidylester; einem Maleimid; einem Amin; einem Thiol; einem Alkin; einem Azid; einem Alkylhalogenid; einem Isocyanat; einem Isothiocyanat; einem Iodacetamid; einem 2-Thiopyridin; einem ein 3-Arylproprionitril; ein Diazoniumsalz; ein Alkoxyamin; ein Hydrazin; ein Hydrazid; ein Phosphin; ein Alken; ein Semicarbazon; ein Epoxid; ein Phosphonat; und ein Tetrazin. Beispiele für chemoselektive Reaktionen sind: zwischen einer reaktiven Amingruppe und einem Elektrophil wie einem Alkylhalogenid oder einem N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester); zwischen einer reaktiven Thiolgruppe und einem Iodacetamid oder einem Maleimid; zwischen einem Azid und einem Alkin (Azid-Alkin-Cycloaddition oder „Click Chemistry“). Beispiele und Anwendungen chemoselektiver Reaktionen in biologischen Systemen werden in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben, wie z. B. in Sletten, E. M. und Bertozzi, C. R. „Bioorthogonal Chemistry: Fishing for Selectivity in a Sea of Functionality“ Angewandte Chemie International Edition English 2009, 48(38): 6974-98.
VERKAPPUNGSREAKTION
Ein 5'-Phosphorimidazolid kann in einer Verkappungsreaktion mit einem 5'-Polynukleotidphosphat (z. B. einem 5'-Monophosphat, 5'-Diphosphat, 5'-Triphosphat, 5'-Tetraphosphat usw.) verwendet werden, um 5'-5'-Polyphosphat-Bindungen zu bilden (siehe beispielsweise 2A-2E). Das Nukleosid 5'-Phosphorimidazolid kann in einer Verkappungsreaktion in einem molaren Überschuss von 2 bis 1000000-fach relativ zum Polynukleotid 5'-Phosphat verwendet werden, wobei das 1000-fache (1000x) am bevorzugtesten ist.
Die Kupplungsreaktion zwischen einem Nukleosid-5'-Phosphorimidazolid und einem Polynukleotid-5'-phosphat kann in einem wässrigen Puffer, einem organischen Lösungsmittel oder einer Kombination davon mit einem pH-Wert im Bereich von 4 bis 7, vorzugsweise 5 bis 6, durchgeführt werden. Ein Beispiel für einen wässrigen Puffer ist ein nicht-nukleophiler, phosphatfreier Puffer, wie ADA (N-(2-Acetamido)-2-iminodiessigsäure), BES (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure), BICINE (N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycin), DIPSO (3-(N,N-Bis[2-hydroxyethyl]amino)-2-hydroxypropansulfonsäure), EPPS (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-propansulfonsäure), HEPBS (N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N'-(4-butansulfonsäure)), 4-Ethylmorpholin, MOBS (4-(N-Morpholino)butansulfonsäure), MOPS (3-(N-Morpholino)propansulfonsäure), MOPSO (3-(N-Morpholinyl)-2-hydroxypropansulfonsäure), PIPES (1,4-Piperazindiethansulfonsäure), POPSO (Piperazin-N,N'-bis(2-Hydroxypropansulfonsäure)), TEA (Triethylammoniak), BIS-TRIS (2,2-Bis(hydroxymethyl)-2,2',2"-nitrilotriethanol), BIS-TRIS propan (1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan) oder eine Kombination davon. Beispiele für organische Lösungsmittel sind: Alkohole, wie Ethanol, 1-Propanol, 2-Propanol, 1-Butanol, 2-Butanol, t-Butylalkohol; oder Nitrile, wie Acetonitril oder Propionitril; Amide, wie N,N-Dimethylformamid (DMF), N,N-Dimethylacetamid (DMA), N-Methyl-2-pyrrolidon; Sulfoxide wie Dimethylsulfoxid (DMSO); Ether wie Diethylether, Diisopropylether, Methyl-t-butylether, Tetrahydrofuran, 1 ,4-Dioxan, 2-Methoxyethanol, Anisol; oder beliebige Mischungen aus einem oder mehreren dieser Lösungsmittel. Ein bevorzugter Puffer für die Kupplungsreaktion enthält 10 % bis 40 % organisches Lösungsmittel in wässriger Pufferlösung, vorzugsweise 20 %.
Die Kupplungsreaktion zwischen einem Nukleosid-5'-Phosphorimidazolid und einem Polynukleotid-5'-phosphat kann ein anorganisches Metallsalz als Katalysator enthalten. Beispiele hierfür sind Halogenid-, Sulfat-, Nitrat-, Phosphat-, Hydrogenphosphat- oder Hydrogensulfatsalze, wobei das anorganische Metall Magnesium, Mangan, Zink oder Kobalt ist. Vorzugsweise ist das anorganische Metallsalz MgCl₂, MnCl₂, ZnCl₂ oder CoCl₂.
Die Kupplungsreaktion zwischen einem 5'-Phosphorimidazolid und einem 5'-Phosphat-Polynukleotid kann außerdem Additive wie Polyethylenglykole (PEG) und PEG-Derivate wie PEG-Ether (z. B., Laureths, Ceteths, Ceteareths und Oleths), PEG-Fettsäuren (z. B. PEG-Laurate, -Dilaurate, -Stearate und -Distearate), PEG-Aminether (z. B. PEG-Cocamine), PEG-Propylenglykole oder andere Derivate. Bevorzugt werden PEGs mit einem Molekulargewicht (MW) von 1.000 bis 20.000 Da. PEGs können Mischungen verschiedener Oligomergrößen umfassen.
Die Kupplungsreaktion zwischen einem Nukleosid-5'-Phosphorimidazolid und einem Polynukleotid-5'-phosphat kann außerdem ein oder mehrere Tenside enthalten. Beispiele für Tenside sind Polyoxyethanyl-alpha-Tocopherylsebacat (PTS), DL-alpha-Tocopherolmethoxypolyethylenglykolsuccinat (TPGS-750-M), beta-Sitosterolmethoxyethylenglykolsuccinat (SPGS-550-M), Bis(4-((2-(Methoxycarbonyl)phenyl)amino)-4-oxobutansäure)polyethylenglykol 1000 und Kombinationen davon.
Die Kupplungsreaktion zwischen einem 5'-Phosphorimidazolid und einem 5'-Phosphat-Polynukleotid kann in einem Bereich von 20 °C bis 70 °C durchgeführt werden. Die Reaktionszeiten liegen typischerweise im Bereich von weniger als einer Stunde bis zu 24 Stunden. Bei Verwendung von 5'-Phosphorimidazoliden, die von Nukleosid-5'-Monophosphaten (imNMPs) abgeleitet sind, können die Temperatur und die Dauer der Kupplungsreaktion beispielsweise 50 °C und 5 Stunden betragen; 37 °C und 4 Stunden bei Verwendung von 5'-Phosphorimidazoliden, die von Nukleosid-5'-diphosphaten (imNDPs) abgeleitet sind; oder Raumtemperatur und 4 Stunden bei Verwendung von 5'-Phosphorimidazoliden, die von Nukleosid-5'-triphosphaten (imNTPs) abgeleitet sind.
Ein geeignetes Nucleosid-5'-Phosphorimidazolid- und/oder Polynucleotid-5'-phosphatsalz kann mit einem geeigneten Kation gebildet werden, das ausgewählt ist aus, aber nicht beschränkt ist auf: anorganische Kationen, wie Na⁺, Li⁺, K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Co²⁺ und Al⁺³, Ammoniumionen (d. h. NH₄ ⁺) und substituierte Ammoniumionen (z. B., NH₃R⁺, NH₂R₂ ⁺, NHR₃ ⁺ und NR₄ ⁺), wobei sich die substituierten Ammoniumionen von Alkyl- und Arylaminen wie Ethylamin, Diethylamin, Dicyclohexylamin, Triethylamin, Butylamin, Hexylamin, Ethylendiamin, Ethanolamin, Diethanolamin, Piperazin, Pyridin, Benzylamin und beliebigen Kombinationen davon ableiten.
Das Polynukleotid-5'-Phosphat kann aus DNA, RNA oder einem chimären Polynukleotid (Chimäre) bestehen, das sich aus RNA- und DNA-Basen zusammensetzt. Das 5'-Polynukleotid-Phosphat kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein oder aus einer Chimäre aus teilweise einzelsträngigen und doppelsträngigen Segmenten bestehen. Das Polynukleotid-5'-Phosphat kann auch ein doppelsträngiges Segment mit Nukleotidverlängerungen am 3'- oder 5'-Ende sein. Das 5'-Phosphat-Polynukleotid kann eine oder mehrere RNA-Spezies umfassen, die ausgewählt sind aus kleinen RNAs, kleinen nuklearen RNAs (snRNAs), kleinen nukleolaren RNAs (snoRNAs), miRNAs, Piwi-interagierenden RNAs (piRNAs), IncRNAs; tRNAs; ribosomale RNAs (rRNAs); mRNAs; nicht-kodierende RNAs (ncRNAs); intergene RNAs; Silencing-RNAs (siRNAs); kleine regulatorische RNAs (srRNAs); oder beliebige Kombinationen davon. Das Polynukleotid-5'-Phosphat kann Proben fragmentierter und/oder abgebauter RNAs umfassen, insbesondere fragmentierter und/oder abgebauter mRNAs und langer nichtcodierender RNAs. Das Polynukleotid-5'-Phosphat kann fragmentierte und/oder degradierte DNA umfassen, wie z. B. alte DNA, Umwelt-DNA, forensische DNA, zirkulierende DNA (z. B. Exosomen), denaturierte DNA und virale DNA. Mehrere dieser DNAs und RNAs können als Biomarker und in der medizinischen Diagnostik verwendet werden. Diese DNAs und RNAs können aus einem Zell- oder Gewebeextrakt, aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe (FFPE) oder aus einer Körperflüssigkeit wie Speichel, Blut, Menstruationsblut, Zervikovaginalflüssigkeit und Sperma gewonnen werden.
Die Polynukleotidpopulation kann Polynukleotid-5'-Phosphate mit einem oder mehreren Polynukleotiden mit unterschiedlichen 5'-Termini enthalten. Das 5'-Phosphat des Polynukleotids wird durch die Reaktion mit einem 5'-Phosphorimidazolid selektiv verkappt, während die anderen Polynukleotide in der Population unreaktiv bleiben. In anderen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, Polynukleotide ohne terminales Phosphat am 5'-Ende zu verkappen; in solchen Fällen können diese Polynukleotide mit einer Polynukleotidkinase vorbehandelt werden, um ein terminales 5'-Phosphat in die Polynukleotide einzubauen, denen ein 5'-Phosphat fehlt. In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, das 3'-Ende eines Polynukleotids zu reparieren, d. h. ein terminales 3'-Phosphat oder ein 2',3'-zyklisches Phosphat zu entfernen, um die unerwünschte Bildung einer 3'-5'-Polyphosphatbindung durch Reaktion mit einem Nukleosid-5'-Phosphorimidazolid zu vermeiden; in solchen Fällen können diese Polynukleotide mit einer Polynukleotidkinase (z. B., T4 PNK) oder einem verwandten Enzym (z. B. einer Phosphatase) vorbehandelt werden, das in der Lage ist, ein 3'-terminales Nukleotid oder 2',3'cyclisches Phosphat zu dephosphorylieren, um einen 3'-OH-Terminus zu erzeugen (Zhelkovsky, (2014) J Biol Chem 289: 33608-16).
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, in einem Polynukleotid eine bestehende 5'-Kappe-Struktur zu ersetzen, wie z. B. die N7-Methylguanosin-Kappe in eukaryotischer mRNA; oder eine Trimethylguanosin-Kappe in kleinen Kern-RNAs (snRNAs); oder eine γ-Methylphosphat-Kappe in snRNAs wie U6 und 7SK; oder Kappen-ähnliche Strukturen wie Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD⁺), 3'-Desphospho-Coenzym A (dpCoA) und andere Einheiten, die durch eine Oligophosphatbrücke an das 5'-Ende der RNA gebunden sind [Warminski, et al. (2017) Top Curr Chem 375: 16]. In solchen Fällen wird die vorhandene Kappe-Struktur durch einen Prozess des Entkappens des 5'-Endes ersetzt, so dass die Polynukleotide in der Population ein endständiges Phosphat am 5'-Ende aufweisen (z. B. ein 5'-Monophosphat, ein 5'-Diphosphat und/oder ein 5'-Triphosphat), und dieses endständige 5'-Phosphat wird dann durch chemisches Verkappen neu verkappt, (siehe auch US 2018/0195061 ). Die Entkappungsreaktion kann durch ein Enzym oder durch chemische Hydrolyse vermittelt werden (es können geeignete saure oder basische Bedingungen gewählt werden). Wenn die Entkappungs-Reaktion enzymatisch durchgeführt wird, kann das Enzym ausgewählt werden aus einer Deadenylase, einer Apyrase, einer 5'RppH, einer Nudix-Phosphohydrolase, einer Tabaksäurepolyphosphatase, einem Mitglied der HIT-Superfamilie von Pyrophosphatasen, einem DcpS, einem Dcp1-Dcp2-Komplex, einem NudC, einem APTX, einem Mitglied der DXO-Proteinfamilie, einer APAH-ähnlichen Phosphatase, einem Cap-Clip-Reagenz (CELLSCRIPT, Madison, WI) oder einer Kombination davon. Beispiele und Verwendungen von Entkappungs-Enzymen sind in Kramer, et al. (2019) Wiley Interdiscip Rev RNA, 10: e1511 beschrieben.
Die oben beschriebene chemische Kappungsmethode kann in eine Vielzahl von cDNA-Synthesemethoden integriert werden. Zum Beispiel kann die RNA chemisch verkappt, in cDNA kopiert und dann sequenziert werden. In einigen Ausführungsformen kann die cDNA-Synthese in Gegenwart eines TSO durchgeführt werden, wodurch cDNAs entstehen, die das Komplement des TSO am 3'-Ende enthalten. Dementsprechend kann es sich bei der RNA um zelluläre RNA handeln, die aus Zellen, z. B. direkt aus Säugetierzellen, extrahiert wurde. Eine solche Probe kann eine Population verschiedener natürlich vorkommender RNA-Moleküle oder Fragmente davon enthalten, wobei sie mehr als 1.000, mehr als 10.000, mehr als 50.000 oder mehr als 100.000 bis zu 1 Mio. oder mehr verschiedene RNA-Spezies, d. h. RNA-Moleküle mit unterschiedlicher Sequenz, enthalten kann. Die RNA kann mRNA-Moleküle enthalten, die typischerweise mindestens 100 nt lang sind (z. B. 200 nt bis 10kb) und eine mittlere Länge im Bereich von 500-5.000 nt haben. Eine RNA-Probe kann zusätzlich eine Vielzahl kleiner nicht-kodierender regulatorischer RNAs enthalten, die hier allgemein als „kleine RNAs“ bezeichnet werden, z. B. kurze interferierende RNAs, microRNAs, winzige nicht-kodierende RNAs, Piwiinteragierende kleine RNAs (piRNAs), snoRNAs und kleine modulierende RNAs. Kleine RNAs sind in der Regel weniger als 100 nt lang und haben eine mittlere Länge im Bereich von 18 nt bis 40 nt. Eine RNA-Probe kann zusätzlich rRNA-Moleküle, tRNA-Moleküle, pre-miRNA-Moleküle, snRNAs und lange nicht-kodierende RNA-Moleküle (IncRNA) wie große intergene RNA-Moleküle (lincRNA) enthalten.
Die hier beschriebene Methode kann zur Analyse von Polynukleotidproben von praktisch jedem Organismus und/oder Probentyp eingesetzt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Pflanzen, Tiere (z. B. Reptilien, Säugetiere, Insekten, Würmer, Fische usw.), Viren, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten, Leichengewebe, archäologische/antike Proben usw. In bestimmten Ausführungsformen kann die in der Methode verwendete Polynukleotidprobe von einem Säugetier stammen, wobei in bestimmten Ausführungsformen das Säugetier ein Mensch ist. In beispielhaften Ausführungsformen kann die Polynukleotidprobe RNA und/oder DNA aus einer Säugetierzelle enthalten, z. B. aus einer Zelle von Mensch, Maus, Ratte oder Affe. Die Probe kann aus einer Gewebebiopsie oder einer Flüssigbiopsie oder aus kultivierten Zellen, fixierten Zellen oder Zellen einer klinischen Probe, z. B. einer Gewebebiopsie, einem Gewebeschnitt oder einer Lavage oder Zellen einer forensischen Probe (d. h. Zellen einer an einem Tatort gesammelten Probe) stammen. Die Probe kann Exosomen enthalten oder darauf abzielen. Die Probe kann eine Blutprobe von einer schwangeren Frau enthalten, um fötale Polynukleotide zu analysieren. In besonderen Ausführungsformen kann die RNA- und/oder DNA-Probe aus einer biologischen Probe wie Zellen, Gewebe, Körperflüssigkeiten und Stuhl gewonnen werden. Zu den Körperflüssigkeiten, die von Interesse sind, gehören unter anderem Blut, Serum, Plasma, Speichel, Schleim, Schleimhaut, Hirn- und Rückenmarksflüssigkeit, Pleuraflüssigkeit, Tränen, Milchgangflüssigkeit, Lymphe, Sputum, Liquor, Synovialflüssigkeit, Urin, Fruchtwasser und Sperma. In bestimmten Ausführungsformen kann eine Probe von einem Subjekt, z. B. einem Menschen, gewonnen werden. Der hier beschriebene Matrizenwechsel unter Verwendung von chemischem Verkappen kann bei diagnostischen Tests für Krebs, genetische Erkrankungen, chronische Krankheiten, Autoimmunerkrankungen, Infektionserreger (z. B. E. coli, Influenza und SARS-CoV-2 u. a.), Umweltkontamination durch biologisches Material, das Mikrobiom oder andere Bakterienpopulationen, die Auswirkungen von therapeutischen Wirkstoffen oder Arzneimitteln auf die Genexpression oder die Auswirkungen externer Stimuli oder entwicklungsbedingter Auswirkungen auf die Genexpression in einem Organismus usw. verwendet werden. Zu den Amplifikationsschritten, die in den hier beschriebenen Verfahren und Verwendungen verwendet werden, können alle in der Fachwelt bekannten Amplifikationsverfahren gehören, wie z. B. Temperaturzyklusverfahren wie PCR, isothermische Amplifikation wie LAMP, HDA oder ligaseabhängige Amplifikationsverfahren.
Zur Erleichterung des Arbeitsablaufs kann jedes der Reagenzien immobilisiert werden. So können z. B. die Schritte des Matrizenwechsels, der reversen Transkription und/oder der Adapter-Ligation durch immobilisierte Enzyme wie immobilisierte RTs und DNA-Polymerasen bzw. immobilisierte Ligasen und Poly(A)-Polymerasen durchgeführt werden. Die Enzyme können in einer festen Oberfläche durch Fusion mit einem Protein-Tag, z. B. SNAP-Tag oder CLIP-Tag, immobilisiert werden, gefolgt von einer Reaktion mit einer entsprechend funktionalisierten festen Oberfläche, wie z. B. Magnetkügelchen, die mit einer reaktiven O6-Benzylguanin (BG)-Funktionsgruppe des SNAP-Tags oder einer reaktiven O2-Benzylcytosin (BC)-Funktionsgruppe des CLIP-Tags modifiziert sind (siehe Immobilisierung von Enzymen auf magnetischen Mikrokügelchen unter Verwendung des SNAP-Tags, siehe z. B. Li, et al (2018) Bioconjugate Chemistry, 29: 2316-2324).
Die chemische Kopplung einer Kappenstruktur an ein Polynukleotid durch eine 5'-5'-Polyphosphatbindung verbessert den Einbau von 3'-SequenzierungsAdapteren in cDNA durch TS. Die Sequenzierungsergebnisse zeigen, dass die Ausführungsformen Sensitivität und Spezifität (siehe z.B. 8A bis 13C) für den Nachweis und die Quantifizierung von RNA- oder DNA-Polynukleotiden bieten. Die TS-Effizienz stieg bei verkappten RNAs im Vergleich zu unverkappten RNAs um mehr als das 1,5-fache oder das 2-bis 5-fache (siehe z. B. 5A-5B). Die TS-Effizienz von chemisch verkappten Polynukleotiden lag bei über 30 % Effizienz. Darüber hinaus lagen die Sequenzen von mindestens 40 % der verkappten Moleküle und sogar 75 % oder mehr der verkappten Moleküle innerhalb der 2-fachen erwarteten Variation, unabhängig von der Identität der beiden terminalen Nukleotide hinter der Kappe (siehe z. B. 9 und Beispiel 10).
In einigen Fällen kann das chemisch 5'-verkappte Polynukleotid für die direkte Sequenzierung ohne cDNA-Synthese verwendet werden. Die Umgehung der cDNA-Synthese ist wünschenswert, um eine Amplifikation zu vermeiden und somit PCR- oder RT-Verzerrungen auszuschließen. Darüber hinaus ist die typische direkte RNA- oder DNA-Sequenzierung mit sehr langen Leseabschnitten kompatibel, die z. B. bei der Untersuchung von Transkriptionsinitiationsstellen (TSS) und Spleißvarianten besonders nützlich sind.
Die Sequenzierung der chemisch 5'-verkappten RNA oder DNA kann als Beispiel für die direkte Sequenzierung durch eine Nanoporenvorrichtung durchgeführt werden. In einigen Fällen kann die 5'-Cap-Struktur bzw. 5'-Kappe-Struktur außerdem eine Adapter-Sequenz umfassen (z. B. ein Oligonukleotid, das an der 2'- oder 3'-Position des Nukleosids oder an einer beliebigen Position der Nukleobase gebunden ist), wobei das gebundene Adapter-Oligonukleotid das Lesen der Sequenzen am und um das 5'-Ende der Ziel-RNA erleichtert. In anderen Fällen kann die 5'-Kappe-Struktur außerdem eine reaktive Gruppe (z. B. ein Alkin oder Azid) enthalten, die die Bindung eines Adapter-Oligonukleotids an die Ziel-RNA nach der Verkappungs-Reaktion ermöglicht.
Jede auf dem Gebiet der Sequenzierung bekannte Plattform kann ohne Einschränkung verwendet werden. Neben der Oxford-Nanopore-Sequenzierung sind weitere Beispiele die Illumina-Sequenzierung, die Sequenzierung mit einem Pacific Biosciences-Sequenzer oder einem Sequenzer des Beijing Genome Institute.
Das chemisch 5'-verkappte Polynukleotid kann durch Kopplung eines aktivierten Nukleosids 5'-(Mono-, Di- oder Tri)phosphat mit einem Polynukleotid 5'-(Mono-, Di- oder Tri)phosphat gebildet werden, wobei das Polynukleotid 5'-(Mono-, Di- oder Tri)phosphat (i) natürlich in eukaryotischer RNA, prokaryotischer RNA oder einer Mischung davon vorhanden ist; (ii) aus der Entkappung von natürlich verkappten mRNA-Molekülen in der Probe gewonnen wird, um die 5'-diphosphorylierten oder 5'-monophsophorylierten RNA-Moleküle zu erzeugen; oder (iii) aus der 5'-Phosphorylierung von 5'-unphosphorylierten RNA-Molekülen in der Probe gewonnen wird, unabhängig davon, ob diese natürlich vorkommt oder durch Fragmentierung oder Abbau der Probe entsteht.
Enthält das aktivierte Nukleosid-5'-Phosphat außerdem eine geeignete Affinitätsmarkierung (z. B. Biotin oder Desthiobiotin), ermöglicht dies die Anreicherung von chemisch 5'-verkappten Polynukleotiden in einer Population. In bestimmten Ausführungsformen kann die Affinitätsgruppe mit einem Adapter-Oligonukleotid in demselben Molekül kombiniert werden, um die Anreicherung und Sequenzierung des chemisch 5'-verkappten Zielpolynukleotids zu ermöglichen.
In einigen Ausführungsformen kann das chemisch 5'-verkappte Polynukleotid anschließend manipuliert werden. Zum Beispiel kann das chemisch 5'-verkappte Polynukleotid isoliert (eingefangen, gereinigt, angereichert) werden, beispielsweise durch Affinitätsbindung an eine geeignete Matrix (engl. „matrix“). Jede geeignete Matrix kann verwendet werden, wie z. B. und ohne Einschränkung eine feste, halbfeste oder poröse Matrix. Die Matrix kann in jeder geeigneten Form vorliegen, z. B. als Kügelchen, einschließlich magnetischer Kügelchen, Säule, Platte oder mikrofluidische Vorrichtung. Solche Matrizen können mit einem Bindungsreagenz, Liganden oder Markierungspartner behandelt, adsorbiert oder affinitätsbeschichtet werden, der spezifisch für die Bindung der Markierung an das Mononukleotid ist. Die Matrix kann aus jedem geeigneten Material bestehen, z. B. Metall, Polystyrol, Glas, Papier, Protein oder einem anderen biologischen oder chemischen Reagenz wie einem Polymer. Nach der Bindung an die Matrix kann das gebundene chemisch 5'-verkappte Polynukleotid gewaschen, eluiert oder auf andere Weise isoliert und gegebenenfalls aus dem Gemisch gereinigt werden, um es anschließend wie gewünscht zu analysieren. Die Anreicherung durch Immobilisierung auf einer Matrix kann bei Temperaturen im Bereich von 25 °C bis 80 °C, z. B. 25 °C bis 75 °C oder 30 °C bis 60 °C, durchgeführt werden.
In einigen Ausführungsformen kann das 5'-verkappte Polynukleotid gemäß den hier beschriebenen Verfahren vor oder nach der Verkappung fragmentiert werden. Durch eine solche Fragmentierung wird die Größe des Polynukleotids auf jede gewünschte Länge reduziert. Beispielsweise können die Polynukleotidfragmente eine Länge von etwa 10-10000 Nukleotiden oder dazwischen liegende Bereiche aufweisen, z. B. 100-1000 Nukleotide, 10-500 Nukleotide, 3000-5000 Nukleotide oder etwa 50, 100, 200, 250 Nukleotide. Die Fragmentierung kann mit Standardtechniken wie mechanischer Scherung, chemischer oder enzymatischer Verdauung und Beschallung erfolgen.
Eine Zusammensetzung oder ein Kit kann mindestens enthalten: a) ein aktiviertes Guanosin-5'-phosphat-Reagenz, wie oben beschrieben; und b) einen Kappungsreaktionspuffer im Bereich von pH 5 bis pH 6,5, wie oben beschrieben.
Die Zusammensetzung oder die Bestandteile des Kits können zu einem Substrat hinzugefügt werden, das ein natürlich vorkommendes Polynukleotid in einer Polynukleotidpopulation oder ein Polynukleotid umfasst, das wie oben beschrieben entkappt oder 5'-phosphoryliert wurde, um eine zweite Zusammensetzung zu bilden.
Die Zusammensetzung oder der Kit kann eine Vielzahl von Modulen umfassen, wobei sich jedes Modul in einem oder mehreren Röhrchen befindet, wobei ein erstes Modul ein Kappungs-Modul (engl. „capping module“) ist, das Reagenzien zum chemischen Verkappen einer Polynukleotidpopulation umfasst, und ein zweites Modul ein cDNA-Synthese- und Amplifikationsmodul umfasst, wobei das zweite Modul optional einen TSO und/oder ein 3'-Adapter-Oligonukleotid (wie einen 3'-Splint-Adapter oder einen 3'-Random-Adapter) umfasst. Eine Zusammensetzung oder ein Kit kann ferner eine Polynukleotidkinase und/oder eine Poly(A)-Polymerase enthalten.
Repräsentative Beispiele von Arbeitsabläufen für die Synthese eines cDNA-Erststrangs aus Ziel-DNA oder -RNAs in einer Polynukleotidpopulation, wie sie in einem Zelllysat vorkommt, sind in 4A-4D dargestellt. In jedem Arbeitsablauf wurde eine andere Strategie verwendet, um eine Adaptersequenz an das 5'-Ende der cDNA einzubauen. In allen Arbeitsabläufen ist die Hinzufügung einer Adaptersequenz am 3'-Ende der cDNA gleich und beinhaltet einen Schritt der chemischen Kappung des 5'-Endes der Ziel-DNA oder -RNA vor der TS durch eine RT. Das Produkt der TS ist ein cDNA-Erststrang mit 5'- und 3'-Adaptersequenzen. Nach der Synthese eines cDNA-Zweitstrangs kann ein PCR-Amplifikationsschritt folgen, um die cDNA für Deep-Sequencing-Plattformen vorzubereiten.
In manchen Fällen kann es wünschenswert sein, die PCR-Amplifikation wegzulassen, um die Einführung von Artefakten in die Sequenzierbibliotheken zu vermeiden. Dies ist besonders wichtig bei der Sequenzierung von Genomen oder Genomregionen mit stark verzerrter Basenzusammensetzung, wie z. B. bei den Genomen von Plasmodium falciparum mit einem hohen Adenin-Thymin-Gehalt (AT) und Mycobacterium tuberculosis mit einem hohen Guanin-Cytosin-Gehalt (GC).
Vor der Synthese der cDNA durch eine RT kann eine Art Adapter an das 3'-Ende des Polynukleotids angefügt werden, um eine Priming-Stelle für die RT zu schaffen. Es gibt mehrere Strategien zur Aufnahme einer Adaptersequenz, die auch eine Priming-Stelle für die RT bereitstellt, wie in 4A-4D dargestellt (siehe z. B. Zhuang, et al. (2012) Nucleic Acids Res. 2012, 40: e54).
4A zeigt einen Arbeitsablauf für das Hinzufügen einer Adaptersequenz (DNA-Primer), die einen Teil aufweist, der entweder eine randomisierte Sequenz ist oder mit einem Segment des 3'-Endes der Ziel-DNA oder -RNA übereinstimmt, um die reverse Transkriptionsreaktion einzuleiten. Diese Adaptersequenz umfasst auch einen Teil, der eine definierte Sequenz für die PCR-Amplifikation oder eine direkte Sequenz aufweist.
4B zeigt einen Arbeitsablauf zum Hinzufügen eines polyA-Schwanzes (z.B. SEQ ID NO: 1) mittels einer Poly(A)-Polymerase an das 3'-Ende der chemisch verkappten 5'-RNA und zur anschließenden Synthese der cDNA unter Verwendung eines DNA-Primers, der ein poly(dT)-Segment enthält, um die reverse Transkriptionsreaktion einzuleiten. Ein polyA-Schwanz kann natürlich auf einem Polynukleotid wie eukaryotischer mRNA vorhanden sein. Alternativ kann eine Nukleotid-Homopolymer-Sequenz mit Hilfe einer Poly(A)-Polymerase oder einer terminalen Desoxyribonukleotidyltransferase hinzugefügt werden. So kann beispielsweise ein polyG-, polyC- oder polyU-Schwanz durch die Verwendung von Poly(U)-Polymerase an die DNA- oder RNA-Matrize angefügt werden. In solchen Fällen kann ein polydC-, polydG- bzw. polydA-Primer für das RT-Priming verwendet werden.
4C zeigt einen Arbeitsablauf, bei dem ein 3'-Adapter an das 3'-Ende der Ziel-DNA oder -RNA für die Synthese eines cDNA-Erststrangs ligiert wird, wobei ein RT-Primer hinzugefügt wird, der an die ligierte Sequenz hybridisiert. Dieser 3'-Adapter kann aus einem oder mehreren randomisierten Nukleotiden bis zu 10 randomisierten Nukleotiden bestehen. Ein besonders bevorzugter 3'-Adapter umfasst 4 bis 6 randomisierte Nukleotide. Dieser 3'-Adapter kann auch einen Pool von zwei oder mehr 3'-Adapteren mit randomisierten Nukleotiden umfassen. Ein besonders bevorzugter Pool von 3'-Adapteren umfasst zwischen zwei und zwanzig 3'-Adapteren, wobei jede Adaptersequenz zwischen 4 und 6 randomisierte Nukleotide enthält. 4D zeigt einen Arbeitsablauf zur Ligierung einer 3'-Adaptersequenz an das Polynukleotid unter Verwendung eines geschienten Adapters (siehe z. B. U. S. Provisional Application No. 62/839,191 ). Ein Beispiel für einen 3'-Splint-Adapter zur Verwendung hierin umfasst eine DNA mit einem oberen Strang mit einem 5'-voradenylierten Ende (5'-App-) und einem 3'-blockierten Ende (z. B. 3'-Aminolinker, ein 3'-invertiertes Nukleotid oder ein 3'-Dideoxynukleotid) und einem unteren Strang mit einem 3'-blockierten Ende (z. B., 3'-Aminolinker, ein invertiertes 3'-Nukleotid oder ein 3'-Didesoxynukleotid), gefolgt von 4 bis 8 randomisierten Nukleotiden, vorzugsweise 6 randomisierten Nukleotiden, auf die dann ein Desoxyribouridin-Nukleotid und eine vordefinierte Sequenz folgen, die mit dem oberen Strang hybridisieren. Die randomisierten Nukleotide können dann durch Spaltung an der Desoxyribouridin-Stelle mit Hilfe des Enzyms USER® (New England Biolabs, Ipswich, MA) entfernt werden, um einen Primer für die reverse Transkription zu erzeugen. Der Oberstrang des 3'-Splint-Adapters kann ein 5'voradenyliertes Ende (5'-App-) wie oben beschrieben oder alternativ ein 5'-Monophosphat-Ende aufweisen. Ein 3'-Splint-Adapter mit einem 5'-Monophosphat-Ende am Oberstrang ist besonders nützlich für DNA-Matrizen, wenn er mit DNA-Ligasen (z. B. T4-DNA-Ligase) kombiniert wird. 4D zeigt einen Arbeitsablauf, bei dem ein 3'-Splint-Adapter, der eine doppelsträngige Nukleinsäure mit einem 3'-Verlängerungssegment ist, das randomisierte Nukleotide enthält, an das 3'-Ende der ZielMatrize ligiert wird. In anderen Ausführungsformen wird bei der Strategie der Ligierung einer 3'-Adaptersequenz an die RNA- oder DNA-Matrize eine gesplintete Adaptersequenz verwendet, wobei der Adapter aus einem einzelnen Oligonukleotid besteht, das in einer haarnadelförmigen Struktur gefaltet ist.
Die RT kann aus einer der vielen RT-Familien ausgewählt werden, darunter Retrovirus-RTs wie die RT des menschlichen Immunschwächevirus (HIV), die RT des Avian Myeloblastosis Virus (AMV), die RT des Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) und die RT des Jaagsiekte Schaf-Retrovirus (JSRV) ([Yu, et al. (1992) J Biol Chem 1992, 267: 10888-96; Gerard, et al. (1997) Mol Biotechnol 1997, 8: 61-77]; rekombinante endogene Retrovirus-RTs, wie das RT, das aus der Rekombination zwischen dem N-tropischen Provirus am genetischen Locus Emv-1 und einem B-tropischen endogenen murinen Leukämievirus in der Neuro-2a-Zelllinie stammt (Pothlichet, et al. (2006) Int. J. Cancer 119: 815-822); Telomerase-RTs; Retrotransposon-RTs (Beifort, et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108: 20304-10); Nicht-LTR-Retroelement-RTs; und Intron-RTs der Gruppe II (Nottingham, et al. (2016) RNA 2016, 22: 597-613). Weitere Beispiele für Retroviren, die als Quellen für RTs dienen können, sind das Rinderimmunschwächevirus (BIV), das Ziegenenzephalitis-Arthritis-Virus (CAEV), das Virus der infektiösen Anämie der Einhufer (EIAV), das Katzenimmunschwächevirus (FIV), das Ziegenleukoenzephalitis-Virus (GLV), das Jembrana-Virus (JDV), das Maedi/Visna-Virus (MVV) und das Virus der progressiven Pneumonie (PPV). Dazu gehören auch Viren wie das Hepatitis-B-Virus (HBV), die zwar technisch nicht als Retroviren eingestuft werden, aber dennoch eine RT verwenden. Mehrere dieser RTs sind im Handel erhältlich, darunter Transcriptor RT (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), AMV und AMV XL RTs, Protoscript® II (New England Biolabs, Ipswich, MA), Superscript® RTs (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA), SMARTScribe™ RT (Takara Bio, Mountain View, CA), Expand™ RT (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), TGIRT™-III Enzyme (InGex, St. Louis MO.) und andere. Besonders nützlich sind RNase H-defiziente und/oder thermostabile RT-Enzyme, die in der Lage sind, modifizierte Nukleotide und Sekundärstrukturen zu lesen, wie z. B. von kleinen RNAs gebildete Stammschleifen, die eine gleichmäßige reverse Transkription aller Mitglieder des Polynukleotidpools behindern können. Am besten sind RTs, die in der Lage sind, Inter-Strang-TS effizient durchzuführen. Beispiele für RTs sind in 6 dargestellt.
Die reverse Transkription kann auch durch eine DNA-Polymerase mit reverser Transkriptionsaktivität durchgeführt werden. Beispiele für solche Enzyme sind unter anderem Mitglieder der Familie A der DNA-Polymerasen wie: Bst, Taq, Tth, Klenow, KOD, Sco und Sli; Topoisomerasen wie Sco TopA und Sli TopA; Phi29-DNA-Polymerase; und Kombinationen davon. Die Aktivität der reversen Transkription in DNA-Polymerasen kann weiter verstärkt werden, indem Magnesiumionen im Reaktionspuffer durch Manganionen ersetzt werden. Beispiele für DNA-Polymerasen mit reverser Transkriptionsaktivität wurden von Myers, et al. (1991) Biochemistry 30: 7661-6; Grabko, et al. (1996) FEBS Lett 387: 189-92; und Bao, et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101: 14361-6 beschrieben. Am besten geeignet sind DNA-Polymerasen, die in der Lage sind, TS zwischen den Strängen effizient durchzuführen.
Die reverse Transkription kann auch durch eine Kombination aus einer RT mit TS-Aktivität und einer High-Fidelity-DNA-Polymerase durchgeführt werden, um die Synthese eines High-Fidelity-cDNA-Produkts aus der PolynukleotidMatrize zu ermöglichen. Dieser Ansatz eignet sich für die Bestimmung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNP) in der PolynukleotidMatrize.
Eine zum TSO komplementäre 3'-DNA-Adaptersequenz wird während der reversen TS-Transkription durch die RT in den ersten cDNA-Strang eingebaut. In einigen Ausführungsformen kann der TSO DNA, RNA oder ein chimäres Polynukleotid (Chimäre) sein, das aus RNA- und DNA-Basen besteht. Vorzugsweise ist der TSO ein hybrides Oligonukleotid, bei dem die Nukleotide am 5'-Ende aus DNA und die letzten 3 Nukleotide am 3'-Ende aus RNA bestehen. In anderen Ausführungsformen können die RNA-Nukleotide am 3'-Ende des TSO weiter modifiziert werden, um die Stärke der Hybridisierung zwischen dem TSO und dem cDNA-Strang zu erhöhen. Beispiele für solche Modifikationen sind u. a. 2'-Fluor-2'-Deoxy-Nukleotide und 2'-Methoxy-Nukleotide. Beispiele für TSO-3'-Enden sind rGrGrG; rUrUrG; rGrUrG; ^2'FrG ^2'FrG^2'F rG; rCrCrC; rUrUrU; rIrIrI;^2'OMe rG^2'OMerG2'^OMe rG; ^2'FrG ^2'FrU^2'F rG; ^2'FrG^2'F rG^2'FrA; ^2'FrG^2'F rG ^2'FrC; und ^2'FrG ^2'FrG ^2'FrU; wobei I Inosin ist, ^2'FN ein 2'-Fluor-2'-desoxy-Nukleotid ist und ^2'OMeN ein 2'-Methoxy-Nukleotid ist. Weitere Beispiele für TSO-3'-Enden sind dGdGdG^CLAMP, dGdG-Methylenblau und dGdTdG-Azid, wobei dG^cLAMP ein trizyklisches Aminoethyl-Phenoxazin-2'-Desoxycytidin-Analogon ist, das mit dem AP-dC-CE Phosphoramidit (Glen Research, Sterling, VA) synthetisiert wurde. Weitere Beispiele für Basen-, Zucker- und/oder Phosphatmodifikationen, einschließlich der Verwendung von carbocyclischen und acyclischen Analoga, wurden weiter oben in der Erfindung aufgeführt und gelten auch hier für TSO-Modifikationen am 3'-Ende.
In weiteren Ausführungsformen können TSO auch Modifikationen am 5'-Ende enthalten, wie z. B.: ein 5'rU, ein 5'-Biotin, ein 5'-Biotin-d^iso G, ein 5'-N₃ oder ein 5'-dA-(Int Spacer 9), wobei Int Spacer 9 ein Triethylenglykol-Spacer von Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) ist und i^soG ein Isoguanosin darstellt. Die Nukleotidmodifikationen am 5'-Ende des TSO sollen die TSO-Konkatemerisierung auf dem cDNA-Strang verringern.
Die cDNA-Synthese durch Matrizenwechsel-reverse Transkription kann in Gegenwart von äquimolaren oder nicht-äquimolaren dNTP-Mischungen durchgeführt werden, wie in 7 dargestellt. In einigen Ausführungsformen kann die dNTP-Mischung aus einem Überschuss an dATP, dCTP, dGTP oder dTTP bestehen, wobei die relative Zusammensetzung jedes dNTP vom 1,1- bis zum 100-fachen, vorzugsweise dem 10-fachen (10x), variieren kann. Die bevorzugte Bedingung ist ein 10-facher Überschuss an dCTP (10x dCTP) im Vergleich zu anderen dNTPs. In einigen Ausführungsformen kann die dNTP-Mischung auch eine Unterversorgung mit dATP, dCTP, dGTP oder dTTP enthalten, wobei die relative Zusammensetzung jedes dNTPs zwischen dem 0,1- und 0,001-fachen, vorzugsweise dem 0,1-fachen (0,1x oder 1/10) variieren kann. Die am meisten bevorzugte Bedingung ist eine 0,1-fache Unterversorgung mit dATP (0,1x dATP) im Verhältnis zu den anderen dNTPs. Jede Kombination von Über- und/oder Unterversorgung mit dNTPs kann in jeder der Ausführungsformen verwendet werden.
Verfahren zur Synthese einer cDNA aus einem Polynukleotid (z.B. einer DNA- oder RNA-Nukleinsäure) durch Matrizenwechsel-reverse Transkription, umfassend die Schritte: (a) Auswählen eines 5'-Kappe-Vorläufers, der ein Nukleotid oder Modifikationen davon, die mit einem Phosphat verknüpft sind, und gegebenenfalls eine Abgangsgruppe, wie ein Imidazol, umfasst; (b) chemisches Verknüpfen eines 5'-Kappe-Vorläufers mit dem 5'-Ende der Zielnukleinsäure durch eine 5'-zu-5'-Polyphosphatverknüpfung, um eine 5'-verkappte Nukleinsäure zu bilden; (c) gegebenenfalls Behandeln der 5'-verkappten Nukleinsäure mit einer 5'→3'-Exonuklease (z. B., XRN-1, Terminator, Rexo5, Exo T, TREX1 und verwandte Exonukleasen, die spezifisch 5'-Monophosphate von Polynukleotiden abbauen), um alle verbleibenden nicht verkappten Sequenzen in der Polynukleotidpopulation abzubauen; (d) Ligieren eines 3'-Adapters an die 5'-verkappte Nukleinsäure, wobei der Adapter gegebenenfalls eine cDNA-Primingstelle enthält; (e) Inkontaktbringen der 5'-verkappten Nukleinsäure aus (b) oder (c) oder (d) mit einem TSO und einer RT; und (e) Synthetisieren der zur Zielnukleinsäure komplementären DNA. Das Verfahren kann ferner die Größenselektion oder Anreicherung der Zielnukleinsäure vor dem Schritt (b) umfassen.
Das Produkt der Matrizenwechsel-reversen Transkription ist ein cDNA-Erststrang mit 5'- und 3'-Adaptersequenzen. Nach der Synthese eines cDNA-Zweitstrangs kann ein PCR-Amplifikationsschritt folgen, um die cDNA für Deep-Sequencing-Plattformen vorzubereiten. Die Amplikons können weiteren Bibliotheksvorbereitungsmethoden gemäß den Arbeitsabläufen und Anweisungen spezifischer Sequenzierungsplattformen unterzogen werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Illumina (San Diego, CA) (z. B. iSeq®, MiniSeq®, MiSeq®, HiSeq®, NovaSeq® und NextSeq®), ThermoFisher Scientific (Waltham, MA) (z. B., Proton™ I und PGM), Pacific Biosciences (Menlo Park, CA) (z. B. PacBio Sequel® und RSII), Roche 454, SOLiD und Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK) (z. B. MinION®, GridION®, PromethION® und Flongle®). Beispielsweise kann die cDNA amplifiziert und dann auf einem Substrat sequenziert werden, z. B. mit der reversiblen Farbstoffterminator-Methode von Illumina, die cDNA kann mit einer Einzelmolekülsequenzierungsmethode sequenziert werden.
KITS
Im Rahmen dieser Offenbarung werden auch Kits zur Durchführung des oben beschriebenen Verfahrens bereitgestellt. In einigen Ausführungsformen kann der Kit zusätzlich eine oder mehrere der oben aufgeführten Komponenten enthalten. Beispielsweise kann ein Kit ein aktiviertes Guanosin-5'-Mono- oder -Polyphosphat und einen Verkappungsreaktionspuffer (engl. „capping reaction buffer“) mit einem pH-Wert im Bereich von pH 5 bis pH 6,5, ein Nucleosid-5'-Phosphorimidazolid, einen Verkappungspuffer (engl. „capping buffer“) mit einem pH-Wert von 5 bis pH 6,5 und eine natürlich vorkommende Population von Polynucleotiden, ein Nucleosid-5'-Phosphorimidazolid, einen Verkappungspuffer mit einem pH-Wert von 5 bis pH 6,5, eine RT und gegebenenfalls einen TSO enthalten.5, eine RT und gegebenenfalls einen TSO; und oder eine Vielzahl von Modulen, wobei sich jedes Modul in einem oder mehreren Behältern befindet, wobei ein erstes Modul ein Verkappungsmodul ist, das Reagenzien zum chemischen Verkappen einer Polynukleotidpopulation umfasst, und ein zweites Modul ein cDNA-Synthese- und Amplifikationsmodul umfasst, wobei das zweite Modul gegebenenfalls (i) einen TSO und/oder einen 3'-Splint-Adapter enthält. Ein Kit kann auch einen oder mehrere Primer enthalten, z. B. einen Primer zur Herstellung von cDNA-Erststrang, RT usw. Die verschiedenen Bestandteile des Kits können in separaten Behältern vorhanden sein oder bestimmte kompatible Bestandteile können je nach Wunsch in einem einzigen Behälter vorkombiniert werden. Zusätzlich zu den oben genannten Bestandteilen können die Kits auch Anweisungen für die Verwendung der Bestandteile des Kits zur Durchführung der betreffenden Methoden, d. h. Anweisungen für die Probenanalyse, enthalten.
Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, sind hierin durch Bezugnahme in demselben Umfang enthalten, wie wenn jede einzelne Veröffentlichung, jedes einzelne Patent oder jede einzelne Patentanmeldung ausdrücklich und individuell als durch Bezugnahme enthalten angegeben wäre.
BEISPIELE
Obwohl die vorstehende Erfindung zum Zwecke der Klarheit des Verständnisses in einigen Details durch Illustration und Beispiele beschrieben wurde, ist es für Fachleute mit normaler Sachkenntnis im Lichte der Lehren dieser Erfindung leicht ersichtlich, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen daran vorgenommen werden können, ohne vom Geist oder Umfang der beigefügten Ansprüche abzuweichen. Zur Veranschaulichung der beanspruchten Erfindung wurden Figuren bereitgestellt und oben ausführlich beschrieben. Die darin gezeigten Ergebnisse können mit den nachstehend beschriebenen Verfahren erzielt werden.
Beispiel 1: Herstellung von RNA-Matrizen (eng. „RNA-Templates“), Matrizenwechsel-Oligonukleotiden (TSOs) und DNA-Primern

5'-Hydroxyl (5'-OH) und 5'-Monophosphat (5'-p) RNAs, TSOs, RT-DNA-Primer und Adapteren wurden von Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) synthetisiert. 5'-Triphosphat-RNAs wurden nach Goldeck, et al. (Angew. Chem. Int. Ed. 53, 4694-4698 (2014) synthetisiert. Die Sequenz der RT-Primer, TSOs und Adapteren ist in Tabelle 1 beschrieben. Tabelle 1: RT-Primer-, TSO- und Adapter-Sequenzen (zur Unterscheidung von DNA- und RNA-Nukleotiden wird in dieser Tabelle den RNA-Nukleotiden ein „r“ und den DNA-Nukleotiden ein „d“ vorangestellt; „dd“ steht für ein Didesoxynukleotid).

RT-Fibel	Sequenz
5'-FAM-DNA-Primer	5'-FAM-d(TTGAGCGTACTCGACGAAGT)-3' (SEQ ID NO:2)
i7-Fibel	5'-d(GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNTTGAGCGTACTCGACGAAG)-3' (SEQ ID NO:3)
Poly(dT)-Primer	5'-d(AGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTTTTTTTTVN)-3' (SEQ ID NO:4)
SR RT-Primer	5'-d(AGACGTGTGCTCTTCCGATCT)-3' (SEQ ID NO:5)
TSO	Sequenz
rGrGrG-3' TSO	5'-d(GCTAATCATTGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT)rGrGrG-3' (SEQ ID NO:6)
rUrUrG-3' TSO	5'-d(GCTAATCATTGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT)rUrUrG-3' (SEQ ID NO:7)
rGrUrG-3' TSO	5'-d(GCTAATCATTGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT)rGrUrG-3' (SEQ ID NO:8)
^2'FrG^2'F rG ^2'FrG-3' TSO	5'-d(GCTAATCATTGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT) ^2'FrG ^2'rG ^2'FrG-3' (SEQ IDNO:9)
i5-rGrGrG-3'TSO	5'-d(ACTAATCATTGCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)rGrGrG-3' (SEQ ID NO:10)
Adapter	Sequenz
3'-SR-Adapter	5'-rApp-d(AGATCGGAAGAGCACACGTCT)-NH₂-3' (SEQ ID NO:11)
3'-Random	5'-rApp-d(TCGTATGNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCT)-NH₂-3'(SEQ ID NO:12)
Adapter	5'-rApp-d(AGCATACNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCT)-NH₂-3' (SEQ ID NO:13)
(gleiche	5'-rApp-d(CTACGCANNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCT)-NH₂-3' (SEQ ID NO:14)
Mischung dieser vier Sequenzen)	5'-rApp-d(GATGCGTNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCT)-NH₂-3' (SEQ ID NO:15)
3'-Splint-Adapter	5'-rApp-d(AGATCGGAAGAGCACACGTCT)-ddC-3' (SEQ ID NO:16)
(für RNA-Matrizen)	3'-NH₂-d(NNNNNNUCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA)-5' (SEQ ID NO: 17)
3'-Splint-Adapter	5'-p-d(AGATCGGAAGAGCACACGTCT)-ddC-3' (SEQ ID NO:18)
(für DNA-Matrizen)	3'-NH ₂-d(NNNNNNUCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA)-5' (SEQ ID NO: 19)

Beispiel 2: Synthese von Nukleosid-5'-Phosphorimidazoliden

Ein Nukleosid-5'-phosphat (0,9 mmol), Imidazol (9 mmol), 2',2'-Dithiodipyridin (3,5 mmol) und Triphenylphosphin (3,5 mmol) wurden kombiniert. Wasserfreies DMF (7,0 mL) und Triethylamin (3,5 mmol) wurden zugegeben und die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Lithiumperchlorat (7 g) in Aceton (70 mL) wurde zugegeben. Die Suspension wurde auf 4°C gekühlt. Nach dem Zentrifugieren wurde der Überstand entfernt, der Niederschlag mit kaltem Aceton gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Tabelle 2 enthält die Ribonukleosid-5'-phosphate, die in die entsprechenden Imidazolide umgewandelt wurden, sowie die Ausbeute und Reinheit nach der Isolierung für jedes Phosphorimidazolid. Die Abkürzungen lauten wie folgt: AMP, Adenosin-5'-monophosphat; ADP, Adenosin-5'-diphosphat; ATP, Adenosin-5'-triphosphat; CMP, Cytidin-5'-monophosphat; CDP, Cytidin-5'-diphosphat; CTP, Cytidin-5'-triphosphat; GMP, Guanosin-5'monophosphat; GDP, Guanosin-5'-diphosphat; GTP, Guanosin-5'-triphosphat; UMP, Uridin-5'-monophosphat; UDP, Uridin-5'-diphosphat; UTP, Uridin-5'-triphosphat; IDP, Inosin-5'-diphosphat. Tabelle 2: Umwandlung von Ribonukleosid-5'-phosphaten in 5'-Phosphorimidazolide

Nukleosid-5'-phosphat	Freischaltung	Imidazolid-Produkt	Masse (mg)	Ausbeute (%)	Reinheit (%)
AMP	Imidazol	imAMP	76.4	46.9	97.0
CMP	Imidazol	imCMP	107.7	61.1	98.6
GMP	Imidazol	imGMP	3602.7	91.0	74.0
ADP	Imidazol	imADP	138.1	55.0	97.0
CDP	Imidazol	imCDP	92.0	56.1	94.1
BIP	Imidazol	imGDP	294.4	99.1	91.5
UDP	Imidazol	imUDP	164.5	61.0	96.7
ATP	Imidazol	imATP	120.2	60.7	93.9
CTP	Imidazol	imCTP	102.1	63.3	95.7
GTP	Imidazol	imGTP	110.1	62.1	96.4
UTP	Imidazol	imUTP	121.7	60.8	97.6
IDP	Imidazol	imIDP	106.6	62.3	96.0
BIP	2-Methylimidazol	MeimGDP	112.2	54.4	93.9
BIP	Benzimidazol	BnimGDP	102.9	53.1	95.0

Beispiel 3: Chemische Kappung von RNAs

Sechzehn verschiedene 5'-Monophosphat-25mer-RNAs (5'-p-NNAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:20), wobei N für G, C, A oder U steht) wurden durch Standard-Festphasensynthese hergestellt. In Tabelle 3 sind die Sequenzen der einzelnen synthetischen 5'-Monophosphat-RNA-Oligonukleotide aufgeführt. Die chemische Verkappung jeder einzelnen 5'-Monophosphat-RNA (5 nmol) erfolgte in einem 250 µL Reaktionsgemisch mit 100 µM 5'-Monophosphat-RNA in einem chemischen Verkappungspuffer mit einem pH-Wert von 6,0, der ein organisches Co-Lösungsmittel enthielt, zu dem eine 100 mM-Lösung eines Imidazolid-NMP, -NDP oder -NTP hinzugefügt wurde. Die Verkappungsreaktion wurde entweder 5 Stunden lang bei 50 °C (imNMPs), 4 Stunden lang bei 37 °C (imNDPs) oder 4 Stunden lang bei Raumtemperatur (imNTPs) inkubiert. Die in dieser Kopplungsreaktion verwendeten Phosphorimidazolide sind in Tabelle 2 aufgeführt. Nach dieser Zeit wurde das nicht umgesetzte Phosphorimidazolid zusammen mit den Salzen und dem organischen Lösungsmittel mit einer Sep-Pak C18-Kartusche (Waters, Milford, MA) aus der Reaktion entfernt. Das verkappte Oligonukleotid wurde mit 1: 1 TEAB:Acetonitril (2 mL) von der Säule eluiert und mit einem SpeedVac® (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) konzentriert. Jede 5'-verkappte RNA wurde durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt und ihre Identität durch Massenspektrometrie (Oligo HTCS, Novatia, Newtown, PA) bestätigt. Tabelle 3: Sequenzen synthetischer Oligonukleotid-5'-Monophosphat-RNAs

Oligonukleotid-ID	Sequenz
AA	5'-p-AAAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:21)
AC	5'-p-ACAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:22)
AG	5'-p-AGAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:23)
AU	5'-p-AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:24)
CA	5'-p-CAAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:28)
CC	5'-p-CCAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:29)
CG	5'-p-CGAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:30)
CU	5'-p-CUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:31)
GA	5'-p-GAAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:32)
GC	5'-p-GCAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:33)
GG	5'-p-GGAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:34)
GU	5'-p-GUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:35)
UA	5'-p-UAAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:36)
UC	5'-p-UCAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:37)
UG	5'-p-UGAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:38)
UU	5'-p-UUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:39)

Die Kopplung eines von einem Ribonukleosid-5'-Monophosphat abgeleiteten Phosphorimidazolids (z. B. Guanosin-5'-monophosphat-Imidazolid, imGMP) an ein Oligonukleotid-5'-Monophosphat (z. B., 5'-p-AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:24)) führte zu einem Nukleosid-5'-5'-Diphosphatverkappten Oligonukleotid (z.B. G(5')-pp-(5')AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:25)). Die Kopplung eines von einem Ribonukleosid-5'-diphosphat abgeleiteten Phosphorimidazolids (z. B. Guanosin-5'-diphosphat-Imidazolid, imGDP) an ein Oligonukleotid-5'-monophosphat (z. B., 5'-p-AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:24)) führte zu einem Nukleosid-5'-5'-Triphosphatverkappten Oligonukleotid (z.B. G(5')-ppp-(5')AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:26)). Die Kopplung eines von einem Ribonukleosid-5'-Triphosphat abgeleiteten Phosphorimidazolids (z. B. Guanosin-5'-Triphosphat-Imidazolid, imGTP) an ein Oligonukleotid-5'-Monophosphat (z. B., 5'-p-AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:24)) zu einem Nukleosid-5'-Tetraphosphatverkappten Oligonukleotid (z. B. G(5')-pppp-(5')AUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:27)). Tabelle 4 und 2A-2F zeigen einige Beispiele von Nukleosid-5'-verkappten Oligonukleotiden, die mit diesem chemischen Ansatz erhalten wurden (der Einfachheit halber wurden die Oligonukleotid-IDs aus Tabelle 3 verwendet, um einzelne Oligonukleotid-5'-Monophosphat-Sequenzen darzustellen). In allen Fällen bestehen die verkappten Produkte aus einer 5'-5'-Polyphosphatverknüpfung. Weitere Beispiele für Nukleosid-5'-Phosphat-Aktivierungschemikalien zum Anhängen eines gewünschten Nukleosid-5'-Phosphats an den 5'-Phosphat-Terminus einer RNA sind in 1A-1B dargestellt. Tabelle 4. Beispiele für 5'-verkappte Nukleosid-Oligonukleotide, die durch chemische Verkappung erhalten wurden (die Oligonukleotidsequenz wird durch die ersten beiden Nukleotide dargestellt)

5'-Phosphonnndazohd	Oligonukleotid 5'-Monophosphat Sequenz-ID
5'-Phosphonnndazohd	GU	AU	CU	UU
imGMP	GppGU	GppAU	GppCU	GppUU
imCMP	CppGU	CppAU	CppCU	n.a.
imAMP	AppGU	AppAU	AppCU	n.a.
imUMP	UppGU	UppAU	UppCU	UppUU
imGDP	GpppGU	GpppAU	GpppCU	GpppUU
imCDP	CpppGU	CpppAU	CpppCU	n.a.
imADP	ApppGU	ApppAU	ApppCU	n.a.
imUDP	UpppGU	UpppAU	UpppCU	n.a.
imIDP	IpppGU	IpppAU	IpppCU	IpppUU
imGTP	GppppGU	GppppAU	GppppCU	GppppUU
imCTP	CppppGU	CppppAU	n.a.	n.a.
imATP	AppppGU	AppppAU	n.a.	n.a.
imUTP	UppppGU	UppppAU	n.a.	n.a.

n.a. bedeutet, dass die Kopplungsreaktion nicht versucht wurde.

Die chemischen Kappungsbedingungen wurden variiert, um die Reaktionsausbeute zu erhöhen (3B-3E). Die Kopplung zwischen einem Guanosin-5'-monophosphat-Imidazolid (imGMP) und einem Oligonukleotid-5'-monophosphat wurde bei pH-Werten von 6 bis 8 (3B), bei zunehmendem molaren Überschuss an imGDP von 5x bis 1000x (3C) und bei zunehmenden Reaktionszeiten bei 37 °C (3D) und 50 °C (3E) untersucht.
Die in 3B-3C dargestellten Ergebnisse zeigen, dass (i) ein pH 6-Puffer anstelle eines pH 7-Puffers zu einer Erhöhung der Ausbeute von 31 % auf 63 % führte; und (ii) die Verwendung eines höheren molaren Überschusses an Imidazolid-Reagenz (im-GDP) von 10x auf 1000x zu einer Erhöhung der Ausbeute von 12 % auf 73 % führte. Wenn die Verkappungsreaktion bei 37°C in pH 6-Puffer unter Verwendung von 1000x imGDP durchgeführt wurde, wurde eine Ausbeute von etwa 85% in 4 Stunden und eine Ausbeute von 91% in 6 Stunden erzielt (3D). Wenn die Verkappungsreaktion bei 50°C in pH 6-Puffer unter Verwendung von 1000x imGDP durchgeführt wurde, wurde eine Ausbeute von etwa 62% in 1 Stunde oder 68% in 2 Stunden erzielt (3E).
Die in diesem Beispiel beschriebene Methode lieferte eine Ausbeute von 85 % in 4 Stunden oder 91 % in 6 Stunden bei 37 °C.
Beispiel 4. Synthese von kontrollverkappten Polynukleotiden durch enzymatisches 7-Methylguanosin-5'-capping von RNAs
Wie in Tabelle 5 dargestellt, wurden verschiedene 25mer-Oligonukleotid-RNAs mit 5'-Kappen und m⁷G-Modifikationen konstruiert.
Vier Zubereitungen von 5'-Triphosphat-RNAs (5'-ppp-NUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:40), wobei N für G, C, A oder U steht) wurden gemäß Goldeck, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 4694-4698 (2014) erhalten. GTP, dGTP, G _2'FTP und AraGTP wurden von TriLink Biotechnologies, San Diego, CA, bezogen. G _3'PrTP und G _3'DTBTP wurden gemäß Ettwiller, et al. BMC Genomics, 17, 199 (2016) synthetisiert.

Enzymatisches Verkappen von 5'-Triphosphat-RNAs (5 nmol) wurde in einer 500-µl-Rcaktion mit dem Vaccinia Capping System (New England Biolabs, Ipswich, MA) durchgeführt, das mit anorganischem Hefepyrophosphat (New England Biolabs, Ipswich, MA) wie folgt ergänzt wurde: 10 µM 5'-Triphosphat-RNA, IX Capping Buffer, 30 µM GTP oder 500 µM GTP-Analog (dGTP, G_2'FTP, G _3'PrTP, G_3'DTB TP oder AraGTP), 200 µM S-Adenosylmethionin (SAM), 50 µL Pyrophosphat (0,1 Einheiten/µL) und 50 µL Vaccinia Capping Enzyme (1 Einheiten/µL) wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Für die Synthese der 5'-verkappten Oligonukleotide m ⁷GpppNm wurden 2500 Einheiten der mRNA Kappe 2'-O-Methyltransferase (New England Biolabs, Ipswich, MA) in die Reaktion gegeben. 7-Methylguanosin-5'-verkappte-Oligonukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und anschließende Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Die Identität der 5'-verkappten 25mer-RNAs wurde durch Massenspektrometrie (Oligo HTCS, Novatia, Newtown, PA) bestätigt. Tabelle 5. Beispiele für 7-Methylguanosin-Oligonukleotide mit 5'-Verkappung, die durch enzymatische Verkappung erhalten wurden die Oligonukleotidsequenz wird durch das erste Nukleotid dargestellt)

NTP	Kappe 2'-O-Methyl Transferase	Oligonukleotid 5'-Triphosphat Sequenz-ID
NTP	Kappe 2'-O-Methyl Transferase	G	A	C	U
GTP	-	m ⁷GpppG	m ⁷GpppA	m ⁷GpppC	m ⁷GpppU
GTP	+	m ⁷GpppGm	m ⁷GpppAm	m ⁷GpppCm	m ⁷GpppUm
dGTP	-	m ⁷dGpppG	m ⁷dGpppA	m ⁷dGpppC	m ⁷dGpppU
G_2'F TP	-	m⁷ G_2'F pppG	m⁷G_2'F pppA	m⁷G_2'F pppC	m⁷G_2'F pppU
G_3'Pr TP	-	m⁷ G_3'Pr pppG	m⁷G_3'PrpppA	m⁷G_3'Pr pppC	m⁷G_3'Pr pppU
G_3'DTB TP*	-	G_3'DTB pppG	G_3'DTB pppA	G_3'DTB pppC	G_3'DTB pppU
AraGTP	-	m⁷ AraGpppG	m⁷ AraGpppA	m⁷ AraGpppC	m⁷ AraGpppU

m ⁷G steht für 7-Methylguanosin, N steht für die ersten Nukleotide der Oligonukleotid-25mer-RNA-Sequenz; Nm steht für ein Nukleotid mit einer 2'-O-Methylierung; dG steht für ein 2'-Desoxyriboguanosin; G_2'F2'-Desoxy-2'-fluoroguanosin, G_3'Pr ein 3'-O-Propargylguanosin, G_3'DTB ein 3'-O-desthiobiotinyliertes Guanosin und AraG ein Araguanosin darstellen).

Beispiel 5. Bewertung der Matrizenwechsel-Fähigkeit von viralen reversen Transkriptasen
Vier verschiedene RTs vom Typ Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV) wurden auf ihre TS-Fähigkeit untersucht: SuperScript II, Maxima™ H Minus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), SMARTScribe und Template Switching Reverse Transcriptase (hier abgekürzt als TS RT (New England Biolabs, Ipswich, MA).
Die RNA-Matrizen in diesem Beispiel haben die allgemeine Sequenz m ⁷Gppp-NUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA (SEQ ID NO:41), mit N= G, C, A oder U.
Reverse Transkriptionsreaktionen wurden mit einem 5'-FAM-DNA-Primer (siehe Tabelle 1) durchgeführt, der komplementär zum 3'-Ende der RNA-Matrizen war. Der TSO war ein Hybrid-Oligonukleotid mit 39 DNA-Nukleotiden am 5'-Ende und drei RNA-Nukleotiden am 3'-Ende, die rGrGrG-3' TSO waren (Tabelle 1).
Die TS-Reaktion (10 µL Gesamtvolumen) wurde mit 0,5 µM RNA-Matrize (2 µL, 100 nM Endkonzentration), TS-RT-Puffer (2 µL), dNTP-Mix (1 µL, 1 mM Endkonzentration von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP (New England Biolabs, Ipswich, MA)), 1 µM Primer (0.3 µL, 30 nM Endkonzentration), 10 µM rGrGrG-3' TSO (1 µL, 1 µM Endkonzentration), Wasser (3,2 µL) und eine RT (0,5 µL). Die Reaktionen wurden bei 42 °C für 90 Minuten durchgeführt, gefolgt von einem 10-minütigen Hitze-Denaturierungsschritt bei 72 °C. Die TS-Reaktionen wurden direkt durch Kapillarelektrophorese analysiert.
Die Kapillarelektrophorese wurde wie folgt durchgeführt: 1 µL einer 1-20 nM Probe wurde zu 10 µL einer Mischung aus HiDi™ Formamid (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) und GeneScan™-120 LIZ™ Größenstandard (1 µl Größenstandard auf 40 µl Formamid) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) hinzugefügt. Als Gerät wurde entweder ein Applied Biosystems 3130x1 Genetic Analyzer (16-Kapillar-Array) oder ein Applied Biosystems 3730x1 Genetic Analyzer (96-Kapillar-Array) mit einer 36 cm langen, mit POP7-Polymer beschichteten Kapillare verwendet. Die Daten wurden mit der Applied Biosystems Data Collection Software erfasst und mit der Applied Biosystems Peak Scanner Software (Applied Biosystems, Foster City, CA) ausgewertet.
Wie in 6 gezeigt, waren die TS-Effizienzen innerhalb einer gegebenen RNA-Matrize bei den verschiedenen MMLV-RTs ähnlich, mit Ausnahme der Maxima H Minus RT, die eine insgesamt niedrigere TS-Aktivität aufwies.
Beispiel 6. Bewertung der Effizienz und der Verzerrungen von Matrizenwechsel-Reaktionen mit synthetischen RNA-Matrizen-Oligonukleotiden
TS RT von New England Biolabs, Ipswich, MA, wurde in dieser Studie verwendet. Die Reaktionen zur reversen Transkription wurden in Gegenwart eines 5'-FAM-DNA-Primers und eines rGrGrG-3'-TSO durchgeführt (DNA-Primer- und TSO-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt). RNA-Matrizen mit 5'-Termini, die 5'-Hydroxyl (5'-HO-N), 5'-Monophosphat (5'-p-N), 7-Methylguanosin 5'-verkappt (5'-m ⁷GpppN) und Guanosin 5'-verkappt (5'-GpppN) Oligonukleotid 25mers waren, wurden verglichen, um festzustellen, welcher 5'-Terminus in ansonsten identischen TS-Reaktionen besser funktionierte. Die allgemeine Sequenz der RNA-Matrize war 5'-NUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:42), wobei N an Position 1 G, C, A oder U war.Die TS-Reaktion (10 µL Gesamtvolumen in 1x TS RT-Puffer) wurde mit 0,1 µM RNA-Matrize, dNTP-Mischung (1 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 30 nM Primer, 1 µM rGrGrG-3' TSO und TS RT (0,5 µL) durchgeführt. Die Reaktionen wurden bei 42 °C für 90 Minuten durchgeführt, gefolgt von einem 10-minütigen Hitze-Denaturierungsschritt bei 72 °C. Die TS-Reaktionen wurden direkt durch Kapillarelektrophorese analysiert, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Die in 5A dargestellten Ergebnisse zeigen, dass TS für 5'-verkappte Guanosin-RNA-Matrizen (5'-Gppp; hier auch manchmal als unmethyliertes Gppp bezeichnet) effizienter war als für 5'-verkappte 7-Methylguanosin-RNA-Matrizen (5'-m⁷ Gppp). Unverkappte RNAs (5'-HO-N und 5'-p-N) waren unter diesen Bedingungen 2- bis 5-mal weniger effizient als verkappte RNAs. Innerhalb einer gegebenen RNA-Matrize-Sequenz, die sich nur durch das Nukleotid an Position 1 unterscheidet (relativ zum 5'-Ende; beachte, dass das Kapp-Nukleotid selbst bei der Bestimmung der Positionen 1, 2, 3 usw. nicht mitgezählt wird), ist die Reihenfolge der Effizienz bei TS-Reaktionen wie folgt G > A ~ C > U (d. h. RNA-Matrizen, die mit einem Guanosin an Position 1 beginnen, sind bei TS am effizientesten, während RNA-Matrizen, die mit einem Uridin beginnen, am wenigsten effizient sind). Tatsächlich werden RNAs, die mit einem Uridin beginnen, kaum erkannt, wenn die Matrize nicht verkappt ist (5B). Bemerkenswert ist, dass das Vorhandensein einer unmethylierten Guanosin-Kappe (5'-Gppp) die TS-Sequenzverzerrungen erheblich reduziert und eine genauere Darstellung der Häufigkeitsverhältnisse der Matrizen ermöglicht. Die chemisch gebundene Guanosin-Kappe bietet daher nicht nur einen erheblichen Gewinn an TS-Effizienz im Vergleich zu der ursprünglichen RNA-Matrize ohne Kappe, sondern reduziert auch unerwartet die sequenzabhängige Verzerrung der TS-Reaktion im Vergleich zu den natürlich vorkommenden 7-Methylguanosin-Kappen.
Beispiel 7. Die Auswirkung von nicht-äquimolaren dNTP-Mischungen auf die Effizienz von Matrizenwechsel-Reaktionen
Die Konzentrationen der dNTPs wurden in einer TS-Reaktion untersucht, um ihre optimalen relativen Konzentrationen zu bestimmen.
Die reversen Transkriptionsreaktionen wurden in Gegenwart eines 5'-FAM-DNA-Primers durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurde ein rGrGrG-3' TSO oder ein ^2'FrG^2'F rG ^2'FrG-3' TSO verwendet. Die DNA-Primer- und TSO-Sequenzen sind in Tabelle 1 aufgeführt. 7-Methylguanosin-5'-verkappt (m ⁷GpppN) Oligonukleotid 25mers wurden als RNA-Matrizen verwendet (wobei N für G, C, A oder U in der Sequenz 5'-NUAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:42) steht).
Die TS-Reaktion (10 µL Gesamtvolumen) wurde mit 0,1 µM RNA-Templat, TS RT-Puffer (2 µL), dNTP-Mix (1 mM von jedem dATP, dCTP, dGTP und dTTP; oder 1 mM von jedem dATP, dGTP und dTTP und 10 mM dCTP; oder 1 mM von jedem dCTP, dGTP und dTTP und 0.1 mM dATP; oder weitere Kombinationen wie in den Tabellen 6 und 7 beschrieben), 1 µM Primer, 1 µM TSO und TS RT (0,5 µL). Die Reaktionen wurden 90 Minuten lang bei 42 °C inkubiert, gefolgt von einem 10-minütigen Hitze-Denaturierungsschritt bei 72 °C. Die TS-Reaktionen wurden direkt mittels Kapillarelektrophorese analysiert, wie in Beispiel 5 beschrieben. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in 7 und den Tabellen 6 und 7 dargestellt. Tabelle 6. Effizienz von TS-Reaktionen unter Verwendung einer äquimolaren dNTP-Mischung oder nicht-äquimolaren dNTP-Mischungen, die entweder einen Überschuss an dCTP (10X dCTP) oder eine Unterversorgung mit dATP (0,1X dATP) oder eine Kombination davon enthalten. Die RNA-Matrizensequenz wird durch die Identität des Nukleotids N an Position 1 dargestellt. Alle Reaktionen wurden in Gegenwart des TSO rGrGrG-3' durchgeführt.

m⁷GpppA m⁷GpppC m⁷GpppG m ⁷GpppU

Äquimolare dNTP-Mischung 37% 27% 64% 9%

10X dCTP 69% 62% 92% 46%

0,1X dATP 46% 29% 70% 17%

10X dCTP/0,5X dATP 66% 59% 81% 43%

Tabelle 7. Effizienz von TS-Reaktionen unter Verwendung einer äquimolaren dNTP-Mischung oder nicht-äquimolaren dNTP-Mischungen, die entweder einen Überschuss an dCTP (10X dCTP) oder eine Unterversorgung mit dATP (0,1X dATP) enthalten. Die RNA-Matrizensequenz wird durch die Identität des Nukleotids N an Position 1 dargestellt. Alle Reaktionen wurden in Gegenwart von ^2'FrG ^2'FrG ^2'FrG-3' TSO durchgeführt.

m⁷GpppA m⁷GpppC m⁷GpppG m ⁷GpppU

Äquimolare dNTP-Mischung 73% 37% 83% 15%

10X dCTP 92% 80% 87% 58%

0,1X dATP 80% 40% 90% 29%
Die Ergebnisse in Tabelle 6 zeigen, dass bei Verwendung eines 10-fachen dCTP-Überschusses (10X dCTP) in der reversen Transkriptionsreaktion die TS-Effizienz für verkappte RNAs je nach Ausgangsnukleotid um das 1,5- bis 5-fache anstieg (siehe auch 7). Die ⁷-m-GpppU-RNA, die typischerweise eine schlechte TS aufweist, zeigte die höchste Effizienzsteigerung, die mit den anderen RNA-Matrizen vergleichbar ist. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass die Zugabe von nicht-matrizierten Desoxycytidinen am 3'-Ende des cDNA-Strangs die Bildung einer stärkeren, stabileren Wechselwirkung zwischen der cDNA und dem TSO begünstigt. Dementsprechend kann die Effizienz von TS weiter erhöht werden, indem chemische Modifikationen eingesetzt werden, die die Stabilität des Nukleinsäure-Doppelstrangs stärken (z. B. die 2'-Fluormodifikation im ^2'FrG ^2'FrG ^2'FrG-3'-TSO), was die Interaktion der cDNA mit dem TSO begünstigt (Tabelle 7).
Die reverse Transkriptionsreaktion, die mit einer nicht-äquimolaren dNTP-Mischung mit 1/10 dATP (0,1X dATP) durchgeführt wird, führt zu einem geringeren, aber deutlichen Anstieg der TS-Effizienz bei allen RNA-Matrizen. Es wurde auch auf die Verwendung verschiedener dNTP-Zusammensetzungen und Kombinationen davon zugegriffen (z. B. eine 10X dCTP/0,5X dATP-Kombination, 7).
Beispiel 8. Bewertung von Matrix-Verzerrungen bei der Vorbereitung einer Sequenzierungsbibliothek aus einem Pool diskreter und äquimolarer synthetischer Oligonukleotide
Die Minimierung von Verzerrungen bei der Vorbereitung von Polynukleotidbibliotheken für das Next Generation Sequencing (NGS) ist für die Erzeugung zuverlässiger Sequenzierungsdaten wünschenswert. Ein äquimolarer Pool, der die 16 synthetischen 5'-Monophosphat-25mer-RNAs aus Tabelle 3 umfasst, wurde hergestellt, um eine kollektive Bewertung der TS-Verzerrungen aufgrund der ersten beiden Nukleotide (Positionen 1 und 2) am 5'-Ende der verkappten und nicht verkappten RNA-Matrizen zu ermöglichen. Der Matrizen-P ool wurde durch Mischen gleicher Mengen dieser 16 diskreten Sequenzen hergestellt, und die Sequenzen wurden durch Massenspektrometrie bestätigt.
Die Verkappungsreaktion des RNA-Pools (20 µM Endkonzentration) wurde gemäß Beispiel 3 bei 37° C für 4 Stunden in einer 60 µL Reaktion durchgeführt. Die Reaktion wurde mit Wasser (180 µL) verdünnt und mit XRN-1 (5,5 µL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert (die Behandlung mit XRN-1 ist optional; sie kann verwendet werden, um verbleibende nicht verkappte Sequenzen im Matrizen-Pool abzubauen). Die Produkte der Kappungsreaktion wurden mit einem Oligo Clean-up and Concentration Kit (Norgen Biotek, Ontario, Kanada) gereinigt.
Eine TS RT-Reaktion (16,5 µL Gesamtvolumen in 1x TS RT-Puffer) wurde wie folgt durchgeführt: Eine Mischung aus 0,1 µM RNA-Matrize, dNTP-Mischung (1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP), 30 nM i7-Primer, 1 µM i5-rGrGrG-3' TSO wurde 10 Minuten lang bei 50 °C vorinkubiert und dann langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Zu dieser Mischung wurden BsrDI (1 µL) (New England Biolabs, Ipswich, MA), RNAse-Inhibitor, Murine (0,5 µL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) und TS RT (2 µL) (New England Biolabs, Ipswich, MA) hinzugefügt. Die Reaktion wurde 90 Minuten lang bei 42 °C durchgeführt, gefolgt von einem 10-minütigen Hitze-Denaturierungsschritt bei 72 °C. Anschließend wurde 1 µL der RT-Reaktion einer PCR-Amplifikation mit Universal- und Index-Primern unter Verwendung des NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix (New England Biolabs, Ipswich, MA) unterzogen. Die Bibliotheken wurden mit NEBNext Sample Purification Beads (New England Biolabs, Ipswich, MA) aufgereinigt und mit einem Illumina MiSeq oder NextSeq sequenziert. Bibliotheken, die den 16-RNA-Pool enthalten, wurden unter Zugabe von 30 % PhiX Control spike-in (Illumina, San Diego, CA) sequenziert. Adapteren wurden mit Cutadapt beschnitten und auf ihre jeweiligen Sequenzen abgebildet, bevor sie mit BBMap gezählt wurden.
Das Hinzufügen einer unmethylierten Guanosin-Kappe zum Pool der RNA-Matrize zur Bildung von Guanosin-RNAs mit 5'-Kappe (5'-GpppNN) war wirksam bei der deutlichen Verringerung von Verzerrungen der TS-Reaktion, die durch Variationen der Basenzusammensetzung an Position 1 und 2 auf der RNA-Matrize am 5'-Ende verursacht werden. Wie in 8A gezeigt, wurde eine gleichmäßige Sequenzierungsabdeckung (innerhalb des 2-fachen des erwarteten Wertes) für den Pool von 16 verkappten Matrizen erzielt, die alle möglichen Nukleotidvariationen an Position 1 und 2 enthalten. Zusätzliche Experimente zeigten, dass Nukleotide an den Positionen 3 und 4 die Verzerrung nicht signifikant zu beeinflussen scheinen. Im Vergleich dazu zeigte die TS-Reaktion mit dem nicht verkappten RNA-Matrizen-Pool, der aus 5'-Monophosphat-RNAs (5'-pNN) bestand, unter denselben Bedingungen eine starke Verzerrung gegen Sequenzen, die mit Uridin oder Adenosin beginnen ( 8B; Sequenzen, die mit AA, AC, UG und UU beginnen, waren in den Sequenzierungs-Lesungen besonders unterrepräsentiert).
Darüber hinaus übertraf die reverse TS-Transkription von Guanosin-5'-verkappten RNA-Matrizen ein Bibliotheksvorbereitungsprotokoll mit herkömmlichen 3'- und 5'-enzymatischen Ligationsschritten (NEXTflex™ Small RNA-Seq Kit V3 (Bioo Scientific, Austin, TX); die Sequenzierungsbibliothek wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers vorbereitet). Bei Verwendung des kommerziellen Kits (siehe 8C-8D) wird bei der 3'- und 5'-Ligations-basierten Bibliotheksvorbereitung eine signifikant größere Abweichung von den erwarteten Sequenzierlesezahlen beobachtet (Sequenzen, die mit AG, GG, GU und UG beginnen, waren besonders unterrepräsentiert, während die Sequenzen, die mit GA beginnen, in den Sequenzierlesezahlen besonders überrepräsentiert waren).
Beispiel 9. Sequenzanalyse von RNA-Bibliotheken mit alternativen Verkappungsstrukturen
Die chemische Verkappung wurde ferner verwendet, um RNA-Matrizen mit der allgemeinen Struktur 5'-Xp_mpNN zu erzeugen, wobei NN für die ersten beiden variablen Nukleotide am 5'-Ende der 25mer-Sequenz 5'-p-NNAGAACUUCGUCGAGUACGCUCAA-3' (SEQ ID NO:20); X ist ein Nukleotid wie Guanosin (G), Inosin (I), Adenosin (A), Cytidin (C) oder Uridin (U); und m = 1, 2 oder 3 ist die Anzahl der durch die chemische Verkappungsreaktion hinzugefügten Phosphate. In allen Fällen bestehen die verkappten Produkte aus einer 5'-5'-Polyphosphatverknüpfung.
Der Pool von 16 Oligonukleotid-5'-Monophosphat-25mer-RNAs wurde zunächst mit einem bestimmten Nukleosid-5'-Phosphorimidazolid aus Tabelle 2 chemisch verkappt, gefolgt von einem optionalen Schritt, der die Behandlung der Reaktionsmischung mit XRN-1 umfasst. Die chemische Verkappung der RNA-Matrizen wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Die Verkappungsreaktion erfolgte entweder bei 50 °C für 5 Stunden (imNMPs), 37 °C für 4 Stunden (imNDPs) oder Raumtemperatur für 4 Stunden (imNTPs). Der chemisch 5'verkappte Oligonukleotidpool wurde dann unter den TS-Bedingungen von Beispiel 8 revers transkribiert. Die PCR-Amplifikation und das Barcoding der resultierenden cDNA-Bibliothek sowie die Sequenzierung und Analyse der Bibliothek wurden gemäß Beispiel 8 durchgeführt
Repräsentative Ergebnisse sind in 9 dargestellt. Sie bestätigen, dass die unmethylierte Guanosin-Kappe, die eine 5'-5'-Triphosphat-Bindung mit der RNA-Matrize bildet (5'-GpppNN), die gleichmäßigste und genaueste Verteilung der Sequenzierungsleseergebnisse liefert. Eine Inosin-Kappe, die eine 5'-5'-Triphosphat-Bindung mit der RNA-Matrize bildet (5'-IpppNN), und unmethylierte Guanosin-Kappen, die eine 5'-5'-Diphosphat- (5'-GppNN) oder eine 5'-5'-Tetraphosphat-Bindung (5'-GppppNN) bilden, lieferten ebenfalls genaue Sequenzierungsdaten.
Beispiel 10. Herstellung einer Sequenzierbibliothek aus einem äquimolaren Pool von 962 einzigartigen miRNAs
Eine universelle Referenz von 962 einzelsträngigen synthetischen 5'-Monophosphat-RNA-Oligonukleotiden, die reifen microRNAs entsprechen (miRXplore, Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Deutschland), wurde verwendet, um zu zeigen, dass eine Methode, die chemisches Verkappen und TS-Reverse Transkription umfasst, vorteilhaft eingesetzt werden kann, um cDNA-Bibliotheken aus einer großen Sammlung von RNA-Matrizen zu erzeugen.
Die chemische Kappung der miRXplore 962 einzigartigen miRNAs mit Guanosin-5'-diphosphat-Imidazolid (imGDP) wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Gereinigte Guanosin 5'-verkappt (5'-Gppp) miRNAs wurden entweder an einen 3'-SR Adapter (NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set für Illumina, einen 3'-Random Adapter (Fuchs, et al. (2015) PLoS ONE 10(5):e0126049), oder einen 3'-Splint Adapter ( US provisional patent application serial number 62839191 ) ligiert. Die Sequenzen des 3'-SR-Adapters, des 3'-Random-Adapters, des 3'-Splint-Adapters und des SR-RT-Primers sind in Tabelle 1 aufgeführt. Diese drei Sätze von 3'-Adapter-ligierten miRNAs wurden unabhängig voneinander unter den TS-Bedingungen von Beispiel 8 revers transkribiert (1 µL SR RT Primer wurde für die reverse Transkription von Matrizen verwendet, die entweder an den 3'-SR-Adapter oder den 3'-Random-Adapter ligiert waren; USER Enzym wurde verwendet, um den entsprechenden Primer für die reverse Transkription von Matrizen zu erzeugen, die an den 3'-Splint-Adapter ligiert waren). Die PCR-Amplifikation und das Barcoding der resultierenden cDNA-Bibliotheken sowie die Sequenzierung und Analyse der Bibliotheken wurden wie in Beispiel 8 durchgeführt. Zu Vergleichszwecken wurden die miRXplore 962 einzigartigen miRNAs einer cDNA-Bibliotheksvorbereitung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (TruSeq Small RNA Library Prep Kit) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen.
Die in 10A-10B dargestellten Ergebnisse zeigen, dass miRNAs, die mit einem Guanosin (5'-Gppp) verkappt wurden, wesentlich weniger anfällig für Verzerrungen sind als solche, die aus der konventionellen Herstellung von kleinen RNA-Bibliotheken stammen. Mit Guanosin 5'-verkappte miRNAs, die an einen 3'-SR-Adapter, einen 3'-Random-Adapter oder einen 3'-Splint-Adapter ligiert wurden, führten zu cDNA-Bibliotheken, bei denen 45%-78% der Sequenzier-Lesungen innerhalb eines Intervalls von 2-fach vom erwarteten Wert lagen. Andererseits ergaben cDNA-Bibliotheken, die mit dem TruSeq Small RNA Library Prep Kit vorbereitet wurden, nur 22 % der Sequenzierungs-Lesungen, die innerhalb eines Intervalls von 2-fach vom erwarteten Wert lagen. Letzteres führte zu einer großen Anzahl von unterrepräsentierten miRNA-Sequenzen, wie in 10B zu sehen ist. Darüber hinaus war die relative Variabilität in den Datensätzen, berechnet als das Verhältnis der Standardabweichung zum Mittelwert (auch bekannt als Variationskoeffizient, CV), in den Bibliotheken, die aus Guanosin-5'-verkappten miRNAs gewonnen wurden, ähnlich (CV im Bereich von 0,54 bis 1,0), was auf eine vergleichbare Leistung hinweist. Im Gegensatz dazu wiesen die TruSeq-Bibliotheken eine deutlich höhere Varianz auf (CV etwa 2,6).
Beispiel 11. Herstellung einer Sequenzierungsbibliothek aus einem nicht-äquimolaren Pool von 12 einzigartigen synthetischen miRNAs in einem Gesamt-RNA-Hintergrund

Ein Pool von 12 diskreten synthetischen miRNAs (hier als Mix4v7 bezeichnet), bei dem der relative Anteil der einzelnen Sequenzen zwischen dem 1- und 250-fachen lag, wurde mit einer Probe von Gesamt-RNA kombiniert, die aus menschlichem, erwachsenem, normalem Hirngewebe (Biochain, Newark, CA) extrahiert wurde, und aus der Mischung wurden mittels chemischen Verkappens und TS-Reverse Transkription cDNA-Bibliotheken erstellt. Die Sequenzen und relativen Mengen der einzelnen miRNAs sind in Tabelle 8 aufgeführt. Tabelle 8 Mix4v7 Synthetische miRNAs.

ID	SEQ ID NO	Sequenz	Relativer Betrag
26e Spike	43	CAAGUUUUAAUACUUAUUAGUAU	2
32c Spike	44	UUUCAUAGUACUUUAGUAACAUG	16
32g Spike	45	GCAUGCAUAGAUUCUUAAUAUUU	31.25
38z Spike	46	UUAUGAAGGACGCAUCAUUUUAC	4
38c Ähre	47	UAUCUUUAGCGCCUAGUUAAAAG	125
44d Spike	48	AUCCGAUUACGACGUGUACGUUA	4
50g Spike	49	UAUUUGGACUUAACCAGCCUGUG	2
56z Spike	50	GUAGGCUAACCUGACGGCUACUU	1
62b Stachel	51	AUCCGUGGCGCGGCAUCAUCUAG	8
68b Stachel	52	CUAGCCGCCUGGCUAUAGGGUUC	250
74a Spike	53	AGCGUGCGUCCGUGGCCAUCUCG	62.5
74c Spike	54	UCGCGCGCGGCUCGUAACAGCGU	1

Die 5'-monophosphorylierte Mix4v7-miRNA-Spike-in-Humanhirn-RNA wurde einem chemischen Verkappen mit Guanosin-5'-diphosphat-Imidazolid (imGDP) unterzogen, wie in Beispiel 8 beschrieben. Gereinigte 5'-verkappte (5'-Gppp) RNAs wurden entweder an einen 3'-SR-Adapter, einen 3'-Random-Adapter oder einen 3'-Splint-Adapter ligiert und unabhängig voneinander nach den in Beispiel 10 beschriebenen Protokollen revers transkribiert. Die PCR-Amplifikation und das Barcoding der resultierenden cDNA-Bibliotheken sowie die Sequenzierung und Analyse der Bibliothek wurden gemäß Beispiel 8 durchgeführt.
Die in 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die normalisierten Sequenzierungslesungen, die von Guanosin-5'-verkappte (5'-Gppp) miRNAs abgeleitet sind, weitgehend unabhängig von der relativen Häufigkeit der einzelnen miRNAs sind. Darüber hinaus wurde keine offensichtliche Korrelation zwischen den Leseraten und der Menge der miRNA-Sequenzen in der Probe festgestellt. Somit kann eine unvoreingenommene Sequenzierung einer Population von chemisch verkappten (unmethylierten Guanosin-) RNAs erreicht werden, wobei das Fehlen einer Verzerrung durch die Erfassung aller Sequenzen innerhalb einer 2-fachen Bandbreite um den theoretischen Wert gemessen wird.
Beispiel 12. Herstellung einer Sequenzierungsbibliothek aus Proben von Gesamt-RNA aus menschlichem Gehirn, Herz- und Lebergewebe
Die Methode, die chemisches Verkappen und TS-Reverse Transkription umfasst, wurde auf die Herstellung von cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen Gesamt-RNA-Proben ausgedehnt, einschließlich Gesamt-RNAs, die aus normalem Gehirngewebe eines erwachsenen Menschen, aus normalem Herzgewebe eines erwachsenen Menschen und aus formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem (FFPE) Lebergewebe eines erwachsenen Menschen gewonnen wurden. Vor dem chemischen Verkappen wurden die Gesamt-RNA-Proben mit T4-Polynukleotid-Kinase (T4 PNK) vorbehandelt, um die 5'-Enden der RNA zu phosphorylieren und die Phosphorylgruppen (einschließlich der terminalen 2',3'-zyklischen Phosphate) von den 3'-Enden der RNA zu entfernen.
Die Phosphorylierung der Gesamt-RNA des menschlichen Gehirns (1 µg) (Biochain, Newark, CA) oder der Gesamt-RNA des menschlichen Herzens (1 µg) (Biochain, Newark, CA) oder der FFPE-Gesamt-RNA der menschlichen Leber (0.2 µg) (Biochain, Newark, CA) wurde durchgeführt, indem die Gesamt-RNA-Probe mit Wasser (bis zu einem Endvolumen von 50 µl), 10X T4 PNK Reaction Buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), ATP (Endkonzentration 1 mM) (New England Biolabs, Ipswich, MA) und T4 PNK (1 µl) kombiniert wurde. Die Reaktion wurde 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Danach wurde das Material mit dem Monarch ^®RNA Cleanup Kit (New England Biolabs, Ipswich, MA) nach dem Protokoll für die Isolierung von kleinen RNAs aus großen RNAs gereinigt.
Die gereinigte 5'-monophosphorylierte menschliche Hirn-, Herz- oder Leber-RNA wurde einem chemischen Verkappen mit Guanosin-5'-diphosphat-Imidazolid (imGDP) unterzogen, wie in Beispiel 8 beschrieben. Gereinigte Guanosin-5'-verkappt (5'-Gppp) RNAs wurden entweder an einen 3'-Random-Adapter oder einen 3'-Splint-Adapter ligiert und unabhängig voneinander nach den in Beispiel 10 beschriebenen Protokollen revers transkribiert. Die PCR-Amplifikation und das Barcoding der resultierenden cDNA-Bibliotheken sowie die Sequenzierung und Analyse der Bibliothek wurden gemäß Beispiel 8 durchgeführt.
Die Ergebnisse in 12A-12C zeigen die häufigsten miRNAs, die in den menschlichen Gehirn-, Wärme- und Leber-Total-RNA-Proben identifiziert wurden, was zeigt, dass die Methode, die chemisches Verkappen und TS-Reverse Transkription umfasst, mit verschiedenen Arten von biologischen Proben verwendet werden kann (die Gesamt-RNA wird aus Geweben durch modifizierte Guanidin-Thiocyanat-Techniken isoliert und in RNA-Lagerung gelagert; FFPE-Total-RNA wird aus formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Materialien isoliert). Wichtig ist, dass die Methode für FFPE-Proben geeignet ist (12C). Die Kombination aus chemischem Verkappen und TS-Reverse Transkription kann vorteilhaft für die Herstellung von cDNA-Bibliotheken aus FFPE-Proben eingesetzt werden, da dies den Nachweis von Nukleinsäurefragmenten (einschließlich fragmentierter mRNAs) ermöglicht, sofern die 5'- und 3'-Enden mit einem Enzym wie T4 PNK repariert wurden. PNK phosphoryliert die 5'-Enden von DNA oder RNA und entfernt die Phosphorylgruppen von den 3'-Enden der DNA oder RNA.
Beispiel 13. cDNA-Sequenzierungsbibliotheken, hergestellt durch Matrizenwechsel aus einzelsträngigen DNA-Matrizen

Zur Erzeugung von cDNA-Bibliotheken aus DNA-Matrizen wurden chemisches Verkappen und TS-Reverse Transkription verwendet. Es wurde ein nicht-äquimolarer Pool von 16 diskreten ssDNA-Matrizen erhalten, bei denen der relative Anteil der einzelnen Sequenzen zwischen dem 1- und 250-fachen lag. Die Sequenzen und relativen Mengen der einzelnen ssDNA sind in Tabelle 9 aufgeführt. Tabelle 9 Synthetische ssDNAs.

ID	SEQ ID NO	Sequenz	Relativer Betrag
26e	55	d(CAAGTTTTAATACTTATTAGTAT)	2
32c	56	d(TTTCATAGTACTTTAGTAACATG)	16
32g	57	d(GCATGCATAGATTCTTAATATTT)	31.3
38z	58	d(TTATGAAGGACGCATCATTTTAC)	4
38c	59	d(TATCTTTAGCGCCTAGTTAAAAG)	125
44d	60	d(ATCCGATTACGACGTGTACGTTA)	4
50g	61	d(TATTTGGACTTAACCAGCCTGTG)	2
56z	62	d(GTAGGCTAACCTGACGGCTACTT)	1
62b	63	d(ATCCGTGGCGCGGCATCATCTAG)	8
68b	64	d(CTAGCCGCCTGGCTATAGGGTTC)	250
74a	65	d(AGCGTGCGTCCGTGGCCATCTCG)	62.5
74c	66	d(TCGCGCGCGGCTCGTAACAGCGT)	1
50e	67	d(GTAGGTTCATATTCTCTAGGCAC)	62.5

		3'-Splint-Adapter (für DNA-Matrizen)
	18	5'-p-d(AGATCGGAAGAGCACACGTCT)-ddC-3'
	19	3'-NH 2-d(NNNNNNUCTAGCCTTCTCGTGTGCAGA)-5'

Die Verkappungsreaktion wurde wie in Beispiel 8 beschrieben durchgeführt. Ein Pool von sechzehn 5'-Monophosphat-sDNAs (20 µM Endkonzentration) in einem Endvolumen von 60 µL in einem chemischen Verkappungspuffer mit einem pH-Wert von 6,0, der ein organisches Co-Lösungsmittel enthält, wurde mit 30 mM Guanosin-5'-diphosphat-Imidazolid (imGDP) kombiniert, und die Verkappungsreaktion wurde 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Die Produkte der Verkappungsreaktion wurden mit einem Oligo Clean-up and Concentration Kit gereinigt.
3'-Adapteren wurden zu Guanosin 5'-verkappten (5'-Gppp) oder unverkappten (5'-p) ssDNA-Matrizen durch Splintligation hinzugefügt, wie in der U.S. Provisional Application No. 62/839,191 beschrieben.
Für die Kapillarelektrophorese-Analyse wurden 5'-verkappte (5'-Gppp) oder nicht verkappte (5'-p) ssDNA-Matrizen in Gegenwart von 10 µM 5'-FAM SRRT Primer (1,25 µL; Primersequenz 5'-FAM-AGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3' (SEQ ID NO: 68)) wie in Beispiel 5 beschrieben revers transkribiert. Für die Deep-Sequencing-Analyse wurde der 5'-FAM-SR-RT-Primer in der TS-Reverse-Transkriptionsreaktion weggelassen. Die PCR-Amplifikation und das Barcoding der resultierenden cDNA-Bibliotheken sowie die Sequenzierung und Analyse der Bibliothek wurden gemäß Beispiel 8 durchgeführt.
Die Ergebnisse in 13A-13C stimmen mit denen für RNA-Matrize überein. Die Ergebnisse zeigen, dass die Methode, die chemisches Verkappen und TS-Reverse Transkription umfasst, tatsächlich für die Erzeugung von cDNA-Bibliotheken aus DNA-Matrizen verwendet werden kann. 13A zeigt, dass TS mit Guanosin 5'-verkappten (5'-Gppp) ssDNA-Matrizen effizienter ist als mit unverkappten (5'-p) ssDNA-Matrizen unter den gleichen Bedingungen. Außerdem wird, wie in 13B gezeigt, für Guanosin-5'-verkappte (5'-Gppp) ssDNA-Matrizen eine weniger verzerrte Sequenzierabdeckung erzielt als für unverkappte (5'-p) ssDNA-Matrizen. Die Analyse von ssDNA durch TS findet Anwendung bei der Vorbereitung von Sequenzbibliotheken degradierter und/oder fragmentierter DNA wie z. B. alter DNA, Umwelt-DNA, forensischer DNA, zirkulierender DNA (z. B. Exosomen), denaturierter DNA und viraler DNA. Mehrere dieser DNAs können als Biomarker und in der medizinischen Diagnostik eingesetzt werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 2018/0195061 [0092]
US 62839191 [0112, 0156, 0167]

Claims

Verfahren zum chemischen Verkappen einer Population von Polynukleotiden mit einem 5'-Monophosphat, umfassend: (a) Kombinieren eines aktivierten Nukleosid-5'-Monophosphats oder eines aktivierten Nukleosid-5'-Polyphosphats mit der Population der Polynukleotide, die ein 5'-Monophosphat umfasst, um eine Reaktionsmischung herzustellen; und (b) Inkubation der Reaktionsmischung zur Herstellung von Reaktionsprodukten, die jeweils ein Polynukleotid umfassen, das durch eine 5'-5'-Polyphosphatbindung an eine 5'-Nukleosidkappe gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Population der Polynukleotide RNAs sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die RNA-Population eine oder mehrere RNA-Spezies umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus kleinen RNAs, microRNAs, tRNAs, langen nichtcodierenden RNAs und fragmentierten mRNAs besteht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Polynukleotide in der Population einzelsträngige oder teilweise einzelsträngige DNAs sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, wobei die Population der Polynukleotide eine Polynukleotidpopulation einer Zelle, eine Polynukleotidpopulation eines Virus, eine Polynukleotidpopulation einer Flüssigbiopsie oder eine Polynukleotidpopulation eines formalinfixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebes ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die Polynukleotide mit einem 5'-Monophosphat durch enzymatische Anfügung eines einzelnen Phosphats an das 5'-Ende von Polynukleotiden, die kein terminales Phosphat aufweisen, hergestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das einzelne Phosphat unter Verwendung einer Polynukleotidkinase hinzugefügt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5 umfassend ferner ein Entkappen von 5'-verkappten RNAs, um die Polynukleotide mit einem 5'-Monophosphat herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Entkappen ferner das Inkontaktbringen der 5'-verkappten RNAs mit einem Enzym, ausgewählt aus einer Deadenylase, einer Apyrase, einer 5'-RNA-Polyphosphatase (RppH), einer Nudix-Phosphohydrolase, einer Tabaksäure-Polyphosphatase, einem Mitglied der Histidin-Triad (HIT)-Superfamilie von Pyrophosphatasen, einem DcpS, einem Dcp1-Dcp2-Komplex, einem NudC oder einem Aprataxin (APTX), umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das aktivierte Nucleosid-5'-Mono- oder - Polyphosphat ein Imidazol umfasst und das Inkubieren der Reaktionsmischung ferner das Inkubieren der Reaktionsmischung umfasst, um eine nucleophile Substitutionsreaktion zu ermöglichen, die das Imidazol verdrängt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 10, wobei die Reaktionsmischung einen pH-Wert im Bereich von pH 5 bis pH 6,5 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 11, wobei das Inkubieren der Reaktionsmischung ferner das Inkubieren der Reaktionsmischung für weniger als 10 Stunden bei einer Temperatur von weniger als 60°C umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, (i) wobei das aktivierte 5'-Mono- oder -Polyphosphat von (a) ein Imidazolid-Nucleosid-5'-Monophosphat, -5'-Diphophat oder -5'-Triphosphat ist und das Inkubieren der Reaktionsmischung weiterhin das Inkubieren der Reaktionsmischung entweder bei 50 °C für 5 Stunden, 37 °C für 4 Stunden oder Raumtemperatur für 4 Stunden umfasst, und (ii) ferner umfassend (c) das Verdrängen des Imidazols zur Bildung der 5'-verkappten Polynukleotide.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die 5'-Nukleosidkappe die Formel (I) aufweist:
worin X eine stickstoffhaltige Base ist; R1 und/oder R2 = O-Alkyl, Halogen, ein Linker, Wasserstoff oder ein Hydroxyl; n eine beliebige ganze Zahl von 1-9 ist; und die Polynukleotidkappe ein einzelnes Stereoisomer oder eine Vielzahl von Stereoisomeren einer oder mehrerer der durch Formel (I) beschriebenen Verbindungen oder ein Salz oder Salze davon ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die stickstoffhaltige Base der 5'-Nukleosidkappe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Guanin, Adenin, Cytosin, Uracil und Hypoxanthin und Analoga von Guanin, Adenin, Cytosin, Uracil und Hypoxanthin.
Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, wobei die stickstoffhaltige Base der 5'-Nucleosidkappe eine modifizierte Base umfasst, die ausgewählt ist aus N6-Methyladenin, N1-Methyladenin, N6-2'-O-Dimethyladenosin, Pseudouridin, N1-Methylpseudouridin, 5-Iodouridin, 4-Thiouridin, 2-Thiouridin, 5-Methyluridin, Pseudoisocytosin, 5-Methoxycytosin, 2-Thiocytosin, 5-Hydroxycytosin, N4-Methylcytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, Hypoxanthin, N1-Methylguanin, O6-Methylguanin, 1-Methyl-guanosin, N2-Methyl-guanosin, N7-Methyl-guanosin, N2,N2-Dimethylguanosin, 2-Methyl-2'-O-methyl-guanosin, N2,N2-Dimethyl-2'-O-methyl-guanosin, 1-Methyl-2'-O-methyl-guanosin, N2,N7-Dimethyl-2'-O-methylguanosin oder Isoguanin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-16, wobei die stickstoffhaltige Base der 5'-Nukleosidkappe an einen Zucker gebunden ist, der aus einer Ribose oder einer modifizierten Ribose, ausgewählt aus 2'- oder 3'-O-Alkylribose, Alkoxyribose, O-Alkoxyalkylribose, Fluoribose, Azidoribose, Allylribose, Desoxyribose, einer Arabinose oder einer modifizierten Arabinose, einer Thioribose, einem 1,5-Anhydrohexitol oder einer Threofuranose besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-17, wobei das eine oder die mehreren Phosphate der 5'-Nukleosidkappe aus einem Phosphorothioat, einem Phosphorodithioat, einem Alkyphosphonat, einem Arylphosphonat, einem N-Phosphoramidat, einem Boranophosphat oder einem Phosphonoacetat bestehen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-18, wobei die 5'-Nukleosidkappe Guanosin umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-29, wobei das Polynukleotid ferner umfasst einen 3'-Poly-A-Schwanz oder einen 3'-ligierten Adapter an den 5'-verkappten Polynukleotiden zum Primen einer reversen Transkriptase; und (e) Bilden einer cDNA.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die cDNA ferner eine Sequenz an dem 3'-Ende umfasst, die komplementär zu einem Matrizenwechsel-Oligonukleotid (TSO) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, ferner umfassend die Amplifikation der cDNA zur Herstellung eines Amplifikationsprodukts.
Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, ferner umfassend das Sequenzieren der cDNA oder ihres Amplifikationsprodukts.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19-23, wobei die cDNA, die der Population von Polynukleotiden entspricht, nicht wesentlich zugunsten von einem oder mehreren der folgenden Punkte beeinflusst wird: (i) Polynukleotide, die ein spezifisches Nukleotid der vier Nukleotide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus A, G, C und U oder T, in der ersten oder zweiten Position am 5'-Ende gegenüber jedem anderen der vier Nukleotide aufweisen, oder (ii) eine Kappe, die Guanosin und ein, zwei, drei oder vier Phosphate zwischen der Guanosin-Kappe und dem ersten Nukleotid am 5'-Ende umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, wobei die Effizienz des Matrizenwechsels im Vergleich zu 5'-verkappten Polynukleotiden, die kein unmethyliertes Guanosin enthalten, um mindestens das Zweifache erhöht ist.
Verfahren zur Synthese einer cDNA aus einem einzelsträngigen Polynukleotid, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kombinieren eines aktivierten 5'-Mono- oder -Polyphosphats mit einer Population von Polynukleotiden mit einem 5'-Monophosphat, um eine Reaktionsmischung herzustellen; (b) Inkubation der Reaktionsmischung zur Herstellung von Reaktionsprodukten, die jeweils ein Polynukleotid und eine 5'-Nukleosidkappe umfassen, die durch eine 5'-5'-Polyphosphatbindung verbunden sind; und (c) reverse Transkription der Produkte aus Schritt (c) in Gegenwart eines Matrizenwechsel-Oligonukleotids (TSO) zur Herstellung von cDNA, die das Komplement des TSO am 3'-Ende der cDNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das Verfahren ferner umfasst: (i) Ligieren eines 3'-Adapters an die Polynukleotide vor Schritt (a) oder (ii) das Ligieren eines 3'-Adapters an die Reaktionsprodukte von (b), wobei der Adapter optional eine cDNA-Primingstelle enthält und wobei die reverse Transkription unter Verwendung eines cDNA-Syntheseprimers erfolgt, der an den Adapter hybridisiert.
Verfahren nach Anspruch 26 oder 27, wobei das Verfahren eines der Verfahren der Ansprüche 1 bis 26 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 28, wobei die 5'-Nukleosidkappe ein Guanosintriphosphat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 29, ferner umfassend ein Sequenzieren der cDNA.
Verfahren nach Anspruch 29 oder 30, wobei die Ausbeute an cDNA mit 5'- und 3'-Adaptersequenzen, die das Produkt der reversen Transkription der DNA-Population mit einem 5'-Cap-Guanosintriphosphat ist, im Vergleich zur Ausbeute des cDNA-Produkts aus einer DNA-Population, die nicht mit einem 5'-Cap-Guanosintriphosphat verkappt ist, um mindestens das Zweifache erhöht ist.
Kit, das ein Nukleosid 5'-Phosphorimidazolid, einen Verkappungspuffer pH 5-pH 6,5, eine reverse Transkriptase und optional ein Matrizenwechsel-Oligonukleotid (TSO) in einem oder mehreren verschiedenen Lagerbehältern enthält.
Kit, umfassend eine Vielzahl von Modulen, wobei sich jedes Modul in einem oder mehreren Behältern befindet, wobei ein erstes Modul ein Verkappungsmodul ist, das Reagenzien zum chemischen Verkappen einer Polynucleotidpopulation umfasst, und ein zweites Modul, das ein cDNA-Synthese- und Amplifikationsmodul umfasst, wobei das zweite Modul optional (i) ein Matrizenwechsel-Oligonucleotid (TSO) und/oder einen 3'-Splint-Adapter umfasst.
Zusammensetzung, umfassend: ein aktiviertes 5'-Nukleosidmono- oder -polyphosphat in einem Puffer mit einem sauren pH-Wert.