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Technisches Gebiet
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Hierin beschriebene Ausführungsformen beziehen sich allgemein auf ein Analyseverfahren, ein Reagenzienkit und eine Analysevorrichtung.
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Allgemeiner Stand der Technik
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In den letzten Jahren wurden Verfahren zum Detektieren von Zielsubstanzen in Proben unter Verwendung stimuli-sensitiver Makromoleküle durchgeführt. Die stimuli-sensitiven Makromoleküle beziehen sich auf Makromoleküle, die ihre Polarität bei Änderungen von Temperatur, pH-Wert, Licht, Salzkonzentration oder dergleichen ändern.
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Zum Beispiel wird ein Verfahren zum Detektieren einer Zielsubstanz beschrieben, das wie folgt funktioniert. Und zwar werden eine erste Affinitätssubstanz, an die auf Temperatur ansprechende Makromoleküle gebunden sind und die eine Affinität zu einem zu detektierenden Objekt hat, eine zweite Affinitätssubstanz, die mit einer Substanz markiert ist, die eine Ladung hat und Affinität zu einem zu detektierenden Objekt aufweist, und eine Probe miteinander vermischt und dann einer Hochtemperaturbedingung unterzogen, um die auf Temperatur ansprechenden Makromoleküle hydrophob zu machen, so dass sie zusammen aggregieren. Dann wird das Aggregat durch Magnetkraft getrennt und das Absorptionsvermögen der getrennten Fraktions-ID gemessen, wodurch die Zielsubstanz nachgewiesen wird.
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Außerdem wurden das ELISA-Verfahren und das CLEIA-Verfahren als Techniken zum Detektieren einer Zielsubstanz in einer Probe mit hoher Empfindlichkeit und in einem breiten Bereich eingesetzt.
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Literaturliste
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Patentliteratur
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Patentliteratur 1:
JP 5276890 B -
Kurzdarstellung der Erfindung
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Technische Aufgabe
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Mit dem oben beschriebenen Verfahren ist es jedoch schwierig, eine Zielsubstanz genau zu detektieren oder zu quantifizieren, wenn deren Menge sehr gering ist. Andererseits erfordern das ELISA-Verfahren und das CLEIA-Verfahren jeweils unabdingbar Trennung und Wäsche während des Prozesses, was kompliziert auszuführen ist.
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Mittel zum Lösen des Problems
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Mit den vorliegenden Ausführungsformen können ein Analyseverfahren, ein Reagenzienkit und eine Analysevorrichtung bereitgestellt werden, die einfacher und weitaus präziser sind.
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Im Allgemeinen wird gemäß einer Ausführungsform ein Analyseverfahren zum Detektieren einer Zielsubstanz in einer Probe bereitgestellt. Das Analyseverfahren umfasst: Mischen, mit einer Probe, a) eine erste Substanz, die ein stimuli-sensitives Makromolekül und eine auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz enthält, die an ein Ende des stimuli-sensitiven Makromoleküls gebunden ist, b) eine zweite Substanz, die einen ersten Einfangkörper enthält, der spezifisch an eine Zielsubstanz bindet, und c) eine dritte Substanz, die einen zweiten Einfangkörper enthält, der mit einem Aggregationshemmer markiert ist, der die Aggregation von stimuli-sensitivem Makromolekül hemmt, das spezifisch an die Zielsubstanz bindet; Halten des Gemisches unter einer Bedingung, bei der stimuli-sensitive Makromoleküle aggregieren; Detektieren von Fluoreszenz von der auf die Umgebung ansprechenden fluoreszierenden Substanz; und Bestimmen des Vorhandenseins/Nichtvorhandenseins der Zielsubstanz im Probenbestand oder einer Menge davon basierend auf einem Ergebnis des Detektierens.
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Figurenliste
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- 1 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für die erste bis dritte Substanz einer Ausführungsform zeigt.
- 2 ist ein Flussdiagramm, das ein Beispiel für ein Analyseverfahren der Ausführungsform veranschaulicht.
- 3 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für Komplexe der Ausführungsform zeigt.
- 4 ist ein schematisches Diagramm, das ein Beispiel für einen Komplex und ein Aggregat der Ausführungsform zeigt.
- 5 ist ein schematisches Diagramm, das ein weiteres Beispiel für einen Komplex und ein Aggregat der Ausführungsform zeigt.
- 6 ist eine Draufsicht, die ein Beispiel für eine Analyseeinheit eines Autoanalysators der Ausführungsform zeigt.
- 7 ist ein Blockdiagramm, das ein Beispiel für einen Autoanalysator der Ausführungsform zeigt.
- 8 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für die erste bis dritte Substanz der Ausführungsform zeigt.
- 9 ist ein schematisches Diagramm, das einen Prozess eines Analyseverfahrens zeigt, bei dem der Autoanalysator der Ausführungsform verwendet wird.
- 10 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für die erste bis dritte Substanz der Ausführungsform zeigt.
- 11 ist ein Flussdiagramm, das ein Beispiel für das Analyseverfahren der Ausführungsform veranschaulicht.
- 12 ist ein schematisches Diagramm, das ein Beispiel für den Komplex der Ausführungsform zeigt.
- 13 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für einen Komplex und ein Aggregat der Ausführungsform zeigt.
- 14 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für den Komplex und das Aggregat der Ausführungsform zeigt.
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Modus zum Ausführen der Erfindung
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- Analyseverfahren
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Das Analyseverfahren gemäß einer Ausführungsform ist eine Technik zum Detektieren einer Zielsubstanz in einer Probe. Das Analyseverfahren der Ausführungsform wird unter Verwendung der ersten bis dritten Substanz durchgeführt. 1 ist ein schematisches Diagramm, das Beispiele für die erste bis dritte Substanz zeigt.
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Die erste Substanz enthält ein stimuli-sensitives Makromolekül und eine auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz.
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Stimuli-sensitive Makromoleküle sind Substanzen, deren Löslichkeit in Wasser sich unter einer bestimmten Bedingung reversibel ändert. D. h. in einer wässrigen Lösung unter einer bestimmten Bedingung sind die Makromoleküle hydrophil und aggregieren daher nicht, werden aber unter einer bestimmten, von der obigen Bedingung abweichenden Bedingung hydrophob und aggregieren durch hydrophobe Bindung. In einem hier bereitgestellten Beispiel ist das stimuli-sensitive Makromolekül ein auf Temperatur ansprechendes Makromolekül 1. Das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 ist unter einer Niedrigtemperaturbedingung hydrophil und aggregiert nicht, wird aber unter einer Hochtemperaturbedingung hydrophob und aggregiert durch hydrophobe Bindung. Das stimuli-sensitive Makromolekül ist nicht auf ein auf Temperatur ansprechendes Makromolekül beschränkt, und es kann eine andere Art von Makromolekül verwendet werden.
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Eine auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz ist eine fluoreszierender Substanz, bei der sich die Wellenlänge der zu emittierenden Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Umgebung ändert. Hier im Beispiel ist die auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz eine auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2. Die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 ist eine fluoreszierende Substanz, bei der sich die Wellenlänge der zu emittierenden Fluoreszenz in Abhängigkeit von der umgebenden Polarität, d. h. ob hydrophil oder hydrophob, ändert. Die auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz ist nicht auf die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz beschränkt, sondern es kann auch eine andere Art von fluoreszierender Substanz verwendet werden.
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Die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 ist an ein Ende 3 des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 gebunden.
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Die zweite Substanz enthält einen ersten Einfangkörper 5. Der erste Einfangkörper 5 ist eine Substanz, die sich spezifisch an eine Zielsubstanz binden kann. In diesem Beispiel ist der erste Einfangkörper 5 ein Antikörper.
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Der erste Einfangkörper 5 und ein anderes Ende 4 des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 sind so beschaffen, dass sie aneinander binden. Die Stelle des ersten Einfangkörpers 5, die an das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 binden soll, beeinflusst die Bindung an eine Zielsubstanz nicht.
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Die dritte Substanz schließt einen zweiten Einfangkörper 6 ein, der mit einem Aggregationshemmer 7 markiert ist. Der erste Einfangkörper 5 ist eine Substanz, die spezifisch an eine Zielsubstanz binden kann. Vorzugsweise sind der erste Einfangkörper und der zweite Einfangkörper so beschaffen, dass sie jeweils an unterschiedliche Stellen der Zielsubstanz binden. In diesem Beispiel ist der zweite Einfangkörper 6 ein Antikörper.
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Der Aggregationshemmer 7 ist eine Substanz, die die Aggregation des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 hemmen kann, wenn es in der Nähe des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 vorhanden ist. Der Aggregationshemmer 7 wird an die Stelle gebunden, an der er die Bindung des zweiten Einfangkörpers 6 an die Zielsubstanz nicht beeinflusst.
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2 zeigt kurz einen Ablauf eines Beispiels für das Analyseverfahren der Ausführungsform. Das Analyseverfahren umfasst folgende Schritte:
- (S1) Herstellen der ersten Substanz, der zweiten Substanz und der dritten Substanz;
- (S2) Mischen der Probe mit der ersten Substanz, der zweiten Substanz und der dritten Substanz;
- (S3) Halten eines durch das Mischen erhaltenen Gemisches auf einer Temperatur, bei der ein stimuli-sensitives Makromolekül aggregiert;
- (S4) Detektieren von Fluoreszenz von der auf die Umgebung ansprechenden fluoreszierenden Substanz; und
- (S5) Bestimmen von
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Vorhandenseins/Nichtvorhandensein oder Menge einer Zielsubstanz in der Probe basierend auf einem Ergebnis des Detektierens.
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Nachfolgend wird das Prinzip des Detektierens oder Quantifizierens einer Zielsubstanz durch Ausführen der oben beschriebenen Schritte näher beschrieben. Hier wird ein Beispiel bereitgestellt, bei dem das stimuli-sensitive Makromolekül das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 ist und die auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 ist.
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Zuerst werden in Schritt (S1) die erste bis dritte Substanz hergestellt. Als Nächstes werden in Schritt (S2) eine Probe und die erste bis dritte Substanz miteinander vermischt. 3 zeigt einen Zustand der einzelnen Komponenten in dem Gemisch beim Mischen der Probe und der ersten bis dritten Substanz in einem Fall, in dem die Zielsubstanz 8 in der Probe vorhanden ist. Durch Mischen kann ein Komplex 9, der die Zielsubstanz 8 enthält, gebildet werden. Der Komplex 9 umfasst zum Beispiel die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2, das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1, den ersten Einfangkörper 5, die Zielsubstanz 8, den zweiten Einfangkörper 6 und den Aggregationshemmer 7, die aneinander gebunden sind (siehe 3, Teil (a)). Handelt es sich bei dem ersten Einfangkörper 5 und dem zweiten Einfangkörper 6 um Substanzen, die wie in diesem Beispiel eine Vielzahl von Zielsubstanz-Bindungsstellen aufweisen, können an jede der Zielsubstanz-Bindungsstellen eine weitere Zielsubstanz 8 und ein erster Einfangkörper 5 oder ein zweiter Einfangkörper 6 binden. Wenn andererseits keine ausreichende Menge der Zielsubstanz 8 in der Probe vorhanden ist, sind auch die erste bis dritte Substanz, die den Komplex 9 nicht erzeugen, in dem Gemisch vorhanden (siehe 3, Teil (b)). In diesem Fall können die erste Substanz und die zweite Substanz aneinander verbinden.
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In Schritt (S3) wird das durch das Mischen erhaltene Gemisch auf einer Temperatur gehalten, bei der das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 aggregiert. 4 zeigt den Zustand jeder Komponente zu diesem Zeitpunkt. Für den Fall, dass die erste bis dritte Substanz den Komplex 9 bilden (siehe 4, Teil (a), ist der Aggregationshemmer 7 in der Nähe eines auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1a vorhanden. Daher wird das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1a in einem hydrophilen Zustand gehalten, wodurch die Aggregation gehemmt wird. Daher ist der Zustand, den die Umgebung der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2a behält, hydrophil, und die Wellenlänge der Fluoreszenz ändert sich nicht.
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Dagegen ist in der ersten und zweiten Substanz, die nicht den Komplex 9 bilden (siehe 4, Teil (b)), der Aggregationshemmer 7 nicht in der Nähe des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1b vorhanden. Daher wird das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1b hydrophob, so dass es aggregiert (die erste Substanz und die zweite Substanz, in denen das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1b aggregiert, werden nachfolgend als „Aggregat 10“ bezeichnet). Wie in 4 Teil (b) gezeigt, wird das Aggregat 10 gebildet, indem ein auf Temperatur ansprechendes Makromolekül 1B innerhalb des Moleküls aggregiert oder indem eine Vielzahl von auf Temperatur ansprechenden Makromolekülen 1B zusammen aggregieren. In dem aggregierten auf Temperatur ansprechenden Makromolekül 1b wird eine auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2b in das hydrophobe Innere aufgenommen. D. h. die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2b ist unter hydrophober Bedingung vorhanden. Somit ändert sich die Wellenlänge der Fluoreszenz, die von der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2b emittiert wird.
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5 zeigt die Bedingungen der ersten bis dritten Substanz in Proben, die unterschiedliche Mengen von Zielsubstanzen enthalten. Wenn zum Beispiel eine Anzahl von Zielsubstanzen vorhanden ist, wie in 5, Teil (a) gezeigt, werden mehr Komplexe 9 gebildet. Dadurch ist die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2a, deren Fluoreszenz-Wellenlänge nicht variiert, größer als die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2b, deren Fluoreszenz-Wellenlänge variierte. Wenn weniger Zielsubstanzen vorhanden sind, wie in 5, Teil (b) gezeigt, ist die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2a geringer als die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2b. Wenn keine Zielsubstanz vorhanden ist, wie in 5, Teil (c) gezeigt, ist die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2a möglicherweise nicht vorhanden, sondern nur die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2b ist möglicherweise vorhanden.
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Als Nächstes wird in Schritt (S4) Fluoreszenz von der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2 detektiert. Das Detektieren der Fluoreszenz erfolgt zum Beispiel auf folgende Weise. Und zwar wird das Gemisch mit Anregungslicht von auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2b bestrahlt, deren Fluoreszenz-Wellenlänge variierte, und so aus dem Gemisch gebildete Fluoreszenz wird detektiert. In diesem Fall ist bei Vorhandensein mehrerer Zielsubstanzen, zum Beispiel wie in 5, Teil (a) gezeigt, die Intensität detektierter Fluoreszenz gering. Wenn weniger oder keine Zielsubstanzen vorhanden sind, wie in 5, Teil (b) oder (c) gezeigt, ist die Intensität detektierter Fluoreszenz höher als im Fall von 5, Teil (a). D. h. mit zunehmender Anzahl von Zielsubstanzen wird die detektierte Fluoreszenz schwach.
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Das Detektieren von Fluoreszenz kann durch Einstrahlen des Anregungslichts der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2b, wie oben beschrieben, oder durch Einstrahlen von Anregungslicht der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2a, deren Wellenlänge nicht variierte, erfolgen. In diesem Fall ist das Ergebnis der erhaltenen Fluoreszenz-Intensität umgekehrt. Oder es kann Anregungslicht sowohl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2a als auch der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2b eingestrahlt werden, und die Fluoreszenz-Intensität kann für beide gemessen werden.
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Das Detektieren der Fluoreszenz-Intensität kann zum Beispiel mit der Zeit erfolgen. Der Begriff „mit der Zeit“ ist dabei so definiert, dass es zu einer Vielzahl von Zeitpunkten mit Intervallen oder kontinuierlich durchgeführt werden kann.
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Als Nächstes wird in Schritt (S5) das Vorhandensein/Nichtvorhandensein oder die Menge der Zielsubstanz 8 in der Probe basierend auf dem Ergebnis des Detektierens bestimmt. Wenn zum Beispiel das Anregungslicht der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2b, deren Fluoreszenz-Wellenlänge variierte, eingestrahlt und keine Fluoreszenz detektiert wird, kann bestimmt werden, dass die Zielsubstanz vorhanden ist. Oder wenn die Fluoreszenz-Intensität unter einem vorbestimmten Schwellenwert liegt, kann bestimmt werden, dass die Zielsubstanz vorhanden ist, und wenn sie über dem Schwellenwert liegt, kann bestimmt werden, dass die Zielsubstanz nicht vorhanden ist. Der Schwellenwert wird vorbestimmt, indem zum Beispiel die Fluoreszenz-Intensität einer Standardprobe gemessen wird, deren Zielsubstanz-Konzentration bereits bekannt ist. Alternativ kann eine Kalibrierkurve durch Messen der Fluoreszenz-Intensität einer Standardprobe wie oben erstellt werden und kann die Menge der Zielsubstanz einer zu analysierenden Probe entsprechend der Kalibrierkurve bestimmt werden. Oder es kann eine Kalibrierkurve erstellt werden, die die Beziehung zwischen der Anstiegszeit der Fluoreszenz und einer Zielsubstanz angibt, und anhand der Anstiegszeit der Fluoreszenz kann die Menge der Zielsubstanz bestimmt werden.
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Gemäß dem oben beschriebenen Analyseverfahren wird der Detektionsschritt durch Messen der Fluoreszenz-Intensität von auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen durchgeführt. Mit dieser Struktur kann eine Zielsubstanz präziser und in einem breiteren Bereich detektiert werden als mit den herkömmlichen Techniken. Mit diesem Verfahren kann das Detektieren und Quantifizieren einer Zielsubstanz zum Beispiel mit 100- bis 1000-facher oder noch höherer Präzision im Vergleich zu der herkömmlichen Vorgehensweise, bei der auf Temperatur ansprechende Makromoleküle verwendet werden, durchgeführt werden. Außerdem kann das Detektieren und Quantifizieren sogar mit höherer Genauigkeit als beim ELISA-Verfahren und beim CLEIA-Verfahren erfolgen.
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Zusätzlich ist bei diesem Verfahren, da Fluoreszenz als Index verwendet wird, das Ergebnis kaum durch den Einfluss von Verunreinigungen zu beeinflussen. Aus diesem Grund ist es im Gegensatz zu den herkömmlichen Techniken nicht erforderlich, das Gemisch, das eine Probe und ein Reagenz enthält, zu trennen oder zu waschen. Somit erfordert das Analyseverfahren dieser Ausführungsform nur die Zugabe der ersten bis dritten Substanz in die Probe und das Steuern der Temperatur des Gemisches. Auf diese Weise kann Verunreinigung verhindert und hochpräzises Detektieren oder Quantifizieren wesentlich einfacher durchgeführt werden als mit dem herkömmlichen Verfahren. Da die Vorgehensweise einfach ist, kann das Analyseverfahren dieser Ausführungsform, wie beschrieben, auch mit einem Gerät durchgeführt werden, das für allgemeine Analyseverfahren vorgesehen ist.
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Für das oben beschriebene Analyseverfahren verwendete Proben sind zu analysierende Objekte, in denen Zielsubstanzen enthalten sein können. Ein Beispiel für die Proben ist eine Flüssigkeit. Die Proben können zum Beispiel ein biologisches Material, ein aus der Umgebung stammendes Material, ein aus einem Lebensmittel oder Getränk stammendes Material, ein Material industriellen Ursprungs, eine künstlich hergestellte Formulierung oder eine Kombination davon sein.
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Die Zielsubstanz ist zum Beispiel eine Nukleinsäure, ein Protein, ein Endokrin, eine Zelle, ein Hämozyt, ein Virus, eine Mikrobe, eine organische Verbindung, eine anorganische Verbindung oder eine niedermolekulare Verbindung.
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Das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 sollte vorzugsweise zum Beispiel eine Substanz sein, die in einem Bereich von 0 °C bis 30 °C hydrophil ist und bei 32 °C oder höher hydrophob wird, so dass sie aggregiert. Verwendbare Beispiele für das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 sind Polymere mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur (nachfolgend als „LCST“ für „Lower Critical Solution Temperatur“ bezeichnet) und Polymere mit einer oberen kritischen Lösungstemperatur. Beispiele für die Polymere mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur sind: Polymere aus N-substituierten (Metha)acrylamidderivaten wie N-n-Propylacrylamid, N-Isopropylacrylamid, N-Ethylacrylamid, N,N-Dimethylacrylamid, N-Acryloylpyrrolidin, N-Acryloylpiperidin, N-Acryloylmorpholin, N-n-Propylmethacrylamid, N-Isopropylmethacrylamid, N-Ethylmethacrylamid, N,N-Dimethylmethacrylamid, N-Methacryloylpyrrolidin, N-Methacryloylpiperidin und N-Methacryloylmorpholin; Polyoxyethylenalkylaminderivate wie Hydroxypropylcellulose, teilweise acetylierter Polyvinylalkohol, Polyvinylmethylether, (Polyoxyethylen-Polyoxypropylen)-Blockcopolymer und Polyoxyethylenelaurylamin; ein Polyoxyethylensorbitanesterderivat wie Polyoxyethylensorbitanlaurat; (Polyoxyethylenalkylphenylether)(metha)acrylate wie (Polyoxyethylennonylphenylether)acrylat und (Polyoxyethylenoctylphenylether)methacrylat; Polyoxyethylen(metha)acrylsäureester-Derivate wie (Polyoxyethylenalkylether)(metha)acrylate, zum Beispiel (Polyoxyethylenlaurylether)acrylat und (Polyoxyethylenoleylether)methacrylat. Ferner können auch Copolymere von diesen und Polymere von mindestens zwei Arten von Monomeren von diesen verwendet werden. Außerdem können auch Copolymere von N-Isopropylacrylamid und N-t-Butylacrylamid verwendet werden. Bei Verwendung eines Polymers, das ein (Metha)acrylamidderivat enthält, können andere copolymerisierbare Monomere mit diesem Polymer in einem Bereich copolymerisiert werden, der die untere maximale kritische Lösungstemperatur einschließt. Ein Beispiel für das Polymer mit einer unteren kritischen Lösungstemperatur ist ein Polymer, das aus mindestens einer Art von Monomeren gebildet ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Acloylglycinamid, Acloylnipecotamid, Acryloylasparaginamid, Acryloylglutaminamid und dergleichen, oder ein Copolymer, das aus mindestens zwei Arten dieser Monomere besteht. Mit diesen Polymeren können andere copolymerisierbare Monomere in einem Bereich copolymerisiert werden, der die obere maximale kritische Lösungstemperatur einschließt, Beispiele hierfür sind Acrylamid, Acetylacrylamid, Biotinolacrylat, N-biotinyl-N'methacloyltrimethylenamid, Acloylsarcosinamid, Methacrylsarcosinamid und Acloylmethyluracil.
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Die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 ist eine Substanz, deren Fluoreszenz-Wellenlänge sich ändert, zum Beispiel mindestens etwa 400 nm bis 700 nm , wenn die Umgebung von hydrophil zu hydrophob wird. Als auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 kann zum Beispiel POLARIC (eingetragene Marke) oder dergleichen verwendet werden.
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Die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 kann unter Verwendung eines Verfahrens einer kovalenten Bindung, zum Beispiel unter Verwendung einer Carboxylgruppe oder Thiolgruppe, an das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 gebunden werden. Zum Beispiel kann die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 an das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 gebunden werden, indem die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 mit einer polymerisierenden funktionellen Gruppe wie einer Methacrylgruppe oder Acrylgruppe zu einem additionspolymerisierenden Monomer kombiniert wird und dann mit anderen Monomeren copolymerisiert wird. Oder es kann durchgeführt werden, indem während der Polymerisation der Polymere ein Monomer, das eine funktionelle Gruppe wie Carbonsäure, eine Aminogruppe oder eine Epoxygruppe aufweist, mit anderen Monomeren copolymerisiert wird und über diese funktionelle Gruppe nach einem auf diesem technischen Gebiet allgemein bekannten Verfahren kovalent gebunden wird.
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Verwendbare Beispiele für den ersten Einfangkörper 5 sind ein Antikörper, ein antigenbindendes Fragment (zum Beispiel Fab, F(ab')2, F(ab'), Fv, scFv oder dergleichen), eine natürlich abgeleitete Nukleinsäure, eine künstliche Nukleinsäure, ein Aptamer, ein Peptidaptamer, Oligopeptid, Enzym und Coenzym.
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Der erste Einfangkörper 5 und das andere Ende 4 des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 können vorab aneinander gebunden werden, um in Schritt (S1) die erste Substanz und die zweite Substanz als einen einzigen Körper herzustellen. Die Bindung kann direkt oder indirekt sein. Wie später ausführlich beschrieben wird, können beide so beschaffen sein, dass sie über Biotin und Streptavidin aneinander gebunden werden.
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Verwendbare Beispiele für den zweiten Einfangkörper 6 sind ein Antikörper, ein antigenbindendes Fragment (wie Fab, F(ab')2, F(ab'), Fv, scFv oder dergleichen), eine natürlich abgeleitete Nukleinsäure, eine künstliche Nukleinsäure, ein Aptamer, Peptid-Aptamer, Oligopeptid, Enzym und Coenzym.
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Der Aggregationshemmer 7 ist eine Substanz, die Aggregation des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 hemmt, zum Beispiel wenn es sich dem auf Temperatur ansprechenden Makromolekül 1 räumlich nähert. Ein verwendbares Beispiel für den Aggregationshemmer 7 ist ein wasserlösliches Makromolekül. Verwendbare Beispiele für das wasserlösliche Makromolekül sind natürliche Polymere (wie Polysaccharide pflanzlichen Ursprungs, wasserlösliche Makromoleküle aus Mikroorganismen, wasserlösliche Makromoleküle von Tieren), halbsynthetische Polymere (Makromoleküle auf Zellulosebasis, Makromoleküle auf Stärkebasis und Alginsäure-Makromoleküle) sowie synthetische Polymere (Makromoleküle auf Vinylbasis).
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Vorzugsweise sollte der Aggregationshemmer 7 an eine Stelle gebunden sein, an der er die Bindung an die Zielsubstanz des zweiten Einfangkörpers 6 nicht beeinträchtigt. Der Aggregationshemmer 7 kann unter Verwendung eines allgemein bekannten Verfahrens an den zweiten Einfangkörper 6 gebunden sein.
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Die erste bis dritte Substanz können in Zuständen hergestellt werden, in denen sie jeweils in geeigneten Lösungsmitteln enthalten sind. Beispiele für geeignete Lösungsmittel sind wässrige Lösungen wie Wasser und Pufferlösung.
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Wenn zum Beispiel ein anderes stimuli-sensitives Makromolekül als ein auf Temperatur ansprechendes Makromolekül in dem Analyseverfahren der Ausführungsform verwendet wird, kann Schritt (S3) durchgeführt werden, indem das Gemisch unter einer spezifischen Bedingung gehalten wird, durch die das verwendete stimuli-sensitive Makromolekül aggregiert werden kann, d. h. zum Beispiel Bedingungen eines spezifischen pH-Werts, Lichts und einer spezifischen Salzkonzentration.
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Bei einer weiteren Ausführungsform kann der Schritt (S2), d. h. der Schritt des Mischens der Probe mit der ersten bis dritten Substanz, in den folgenden zwei Schritten durchgeführt werden: (S2-1) die zweite Substanz und die dritte Substanz werden mit der Probe gemischt, um den ersten Einfangkörper und den zweiten Einfangkörper an die Zielsubstanz zu binden; und (S2-2) anschließend wird die erste Substanz zu der Probe hinzufügt, um den ersten Einfangkörper an das andere Ende des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls zu binden, wodurch ein Komplex gebildet wird. Auf diese Weise kann, indem das Hinzufügen der zweiten und dritten Substanz und das Hinzufügen der ersten Substanz getrennt und nacheinander erfolgen, eine größere Menge der zweiten und dritten Substanz an die Zielsubstanz gebunden werden, bevor der Schritt (S3) durchgeführt wird. Ein bevorzugtes Beispiel für ein solches Verfahren wird später beschrieben.
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Das Analyseverfahren der vorstehend beschriebenen Ausführungsform kann zum Detektieren oder Quantifizieren von Substanzen in verschiedenen Bereichen eingesetzt werden wie zum Beispiel in-vitro-Diagnose von Krankheiten, Diagnose mikrobieller Infektion, Lebensmittelbewertung und Doping-Test. Das erfindungsgemäße Analyseverfahren eignet sich speziell zum Detektieren einer Mikrodosis einer in einer Probe enthaltenen Zielsubstanz.
- - Analyseverfahren mit Autoanalysator
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Das Analyseverfahren der Ausführungsform kann zum Beispiel unter Verwendung eines Autoanalysators durchgeführt werden. Der Autoanalysator umfasst ein Analysesystem, das zum Beispiel die erste bis dritte Substanz zu einer Probe hinzufügt, Anregungslicht einer auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz einstrahlt, um die Fluoreszenz zu messen, und die Daten über die Fluoreszenz generiert. Ein solches Analysesystem wird anhand von 6 beschrieben.
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6 ist eine Draufsicht, die ein Beispiel für ein Analysesystem 200 zeigt. Das Analysesystem 200 umfasst zum Beispiel eine Probenvorbereitungs-/Detektionseinheit 201 und eine Analysesteuerung 202.
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Die Probenvorbereitungs-/Detektionseinheit 201 umfasst einen Reaktor 211. Der Reaktor 211 umfasst eine ringförmige Reaktionsscheibe 212 und einen ringförmigen Block 213, der innerhalb der Reaktionsscheibe 212 koaxial zu dieser angeordnet ist, während ein vorbestimmter Spalt dazwischen verbleibt.
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Die Reaktionsscheibe 212 dreht sich intermittierend, zum Beispiel gegen den Uhrzeigersinn durch ein (nicht dargestelltes) Antriebselement. Auf der Reaktionsscheibe 212 ist eine Vielzahl von Reaktionsbehältern 214 entlang einer Umfangsrichtung derselben eingebettet. Nachfolgend wird die räumliche Beziehung der Reaktionsscheiben 212 und der anderen Elemente beschrieben, wobei davon ausgegangen wird, dass die Reaktionsscheibe 212 eine Uhrplatte ist, zum Beispiel als 3 Uhr, 6 Uhr, 9 Uhr, 12 Uhr usw.
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Auf einem ringförmigen Block 213 sind kreisförmige Aussparungen 215 vorgesehen, und ein äußerer Umfangsring 216 und ein innerer Umfangsring 217 sind in Bezug zu den Aussparungen 215 gebildet. Eine Außenumfangsfläche des ringförmigen Blocks 213 umfasst zum Beispiel eine Zahnstange, in die eine Vielzahl von Zähnen (nicht gezeigt) eingraviert sind, und dreht sich intermittierend, zum Beispiel gegen den Uhrzeigersinn, mit einem Antriebszahnrad, um in die Zähne der Zahnstange einzugreifen. In den Aussparungen 215 des ringförmigen Blocks 213 ist eine Vielzahl von zweiten Reagenzbehältern 218 jeweils entlang der Umfangsrichtung befestigt. Jeder der zweiten Reagenzbehälter 218 hat eine abgeschrägte Form mit einem breiten Ende, die sich zum anderen Ende hin in der Breite verjüngt. Jeder der zweiten Reagenzbehälter 218 wird so bereitgestellt, dass er mit einem Ende an den Außenumfangsring 216 angrenzt und mit dem anderen Ende an den Innenumfangsring 217 angrenzt und einen zweiten Reagenzauslass 219 auf einer Seite des einen Endes umfasst, das an den Außenumfangsring 216 angrenzt. Ein Abschnitt des ringförmigen Blocks 213, der sich auf einer Innenseite in Bezug zum Außenumfangsring 216 befindet, dient als zweite Reagenzienkühlbox.
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Ein zweiter Reagenzspender 220 umfasst einen Arm 221, der mit einem Ende einer Welle (nicht gezeigt) gekoppelt ist, die senkrecht verläuft und sich an einer 10 Uhr-Position der Uhrplatte der Reaktionsscheibe 212 befindet. Der Arm 221 ist so konfiguriert, dass er mit der Welle in beide Richtungen drehbar ist. Der Arm 221 umfasst einen Strömungsweg (nicht gezeigt) im Inneren sowie eine Saug-/Abgabedüse 222, die in einer unteren Oberfläche des Endes auf einer der Welle gegenüberliegenden Seite vorgesehen ist und mit dem Strömungsweg in Verbindung steht. Die Saug-/Abgabedüse 222 wird durch den Arm 221 angehoben und abgesenkt. Es ist zu beachten, dass eine Spenderpumpeneinheit (nicht gezeigt) an einer Innenseite des Arms 221 angebracht ist. In dem zweiten Reagenzspender 220 mit einer solchen Struktur befinden sich einer der Reaktionsbehälter 214 und einer der zweiten Reagenzauslässe 219 der zweiten Reagenzbehälter 218 unter einer Spur (in Figur als gestrichelte Linie dargestellt) der Saug-/Abgabedüse 222 bei wechselseitiger Drehung des Arms 221.
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Ein Rührarm (nicht gezeigt) umfasst einen auf-/abbewegbaren und drehbaren Rührstab an einer unteren Oberfläche davon. Der Rührstab wird an einer beliebigen Stelle der Uhrplatte der Reaktionsscheibe 212 platziert. In dem Rührarm mit einer solchen Struktur wird der Rührstab, wenn er sich direkt über dem Reaktionsbehälter 214 befindet, der durch die Drehung der Reaktionsscheibe 212 gegen den Uhrzeigersinn bewegt wird, abgesenkt und in den Reaktionsbehälter 214 eingeführt und dann gedreht, um die Flüssigkeit in dem Behälter 214 zu rühren.
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Die Detektionseinheit 223 ist in einem äußeren Randabschnitt vorgesehen, der sich an einer 6-Uhr-Position der Uhrplatte der Reaktionsscheibe 212 befindet. Die Detektionseinheit 223 umfasst ein Bestrahlungselement (nicht gezeigt) zum Einstrahlen von Anregungslicht in Richtung des zu detektierenden Reaktionsbehälters 214 und einen Detektor (nicht gezeigt), der Fluoreszenz vom Reaktionsbehälter 214 detektiert, der mit dem Anregungslicht vom Bestrahlungselement bestrahlt wird.
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Eine Probenscheibe 224 ist angrenzend an eine Stelle ungefähr an der 5-Uhr-Position der Uhrplatte der Reaktionsscheibe 212 des Reaktors 211 gegenüberliegend vorgesehen. In einem Außenumfangsrandabschnitt der Probenscheibe 224 ist eine Vielzahl von Probenbehältern 225 entlang der Umfangsrichtung angeordnet und befestigt, um zum Beispiel Proben oder Standardproben zu enthalten.
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Ein Probenspender 226 umfasst einen Arm 227, dessen eines Ende mit einer senkrecht verlaufenden Welle (nicht gezeigt) gekoppelt ist. Der Arm 227 hat eine Struktur, die in beide Richtungen mit der Achse drehbar ist. Der Arm 227 umfasst einen Strömungsweg (nicht gezeigt) und ist mit einer mit dem Strömungsweg in Verbindung stehenden Saug-/Abgabedüse 228 auf einer unteren Oberfläche eines Endes auf einer der Welle gegenüberliegenden Seite versehen. Die Saug-/Abgabedüse 228 kann durch den Arm 227 angehoben und abgesenkt werden. Es ist zu beachten, dass eine Spenderpumpeneinheit (nicht gezeigt) an der Innenseite der Welle angebracht ist. In dem Probenspender 226 mit einer solchen Struktur befinden sich einer der Reaktionsbehälter 214 und einer der Reaktionsbehälter 215 unter einer Spur (in Figur als gestrichelte Linie dargestellt) der Saug-/Abgabedüse 228 bei wechselseitiger Drehung des Arms 227.
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Benachbart zur 3-Uhr-Position der Uhrplatte der Reaktionsscheibe 212 ist gegenüberliegend ein kreisförmiger Block 229 für das erste Reagenz vorgesehen. Am ringförmigen Block 229 für das erste Reagenz sind kreisförmige Aussparungen 230 vorgesehen, wobei durch die Aussparungen 230 ein äußerer Umfangsring 231 und ein innerer Umfangsring 232 gebildet sind. Eine Außenumfangsfläche des ringförmigen Blocks 229 für das erste Reagenz umfasst zum Beispiel eine Zahnstange, in die eine Vielzahl von Zähnen (nicht gezeigt) eingraviert sind, und dreht sich intermittierend, zum Beispiel gegen den Uhrzeigersinn, mit einem Antriebszahnrad, um in die Zähne der Zahnstange einzugreifen. In den Aussparungen 230 des ringförmigen Blocks 229 für das erste Reagenz sind eine Vielzahl erster Reagenzbehälter 233 jeweils entlang der Umfangsrichtung befestigt. Jeder der ersten Reagenzbehälter 233 hat eine abgeschrägte Form mit einem breiten Ende, die sich zum anderen Ende hin in der Breite verjüngt. Jeder der ersten Reagenzbehälter 233 ist so vorgesehen, dass er mit einem Ende an den Außenumfangsring 231 angrenzt und mit dem anderen Ende an den Innenumfangsring 232 angrenzt und einen ersten Reagenzauslass 234 auf einer Seite des einen Endes umfasst, das an den Außenumfangsring 231 angrenzt. Ein Abschnitt des ringförmigen Blocks 229 für das erste Reagenz, der sich auf einer Innenseite in Bezug zum Außenumfangsring 231 befindet, fungiert als erste Reagenzienkühlbox.
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Ein erster Reagenzspender 235 umfasst einen Arm 336, dessen eines Ende mit einer senkrecht verlaufenden Welle (nicht gezeigt) gekoppelt ist. Der Arm 236 hat eine Struktur, die in beide Richtungen mit der Achse drehbar ist. Der Arm 236 umfasst einen Strömungsweg (nicht gezeigt) und ist mit einer mit dem Strömungsweg in Verbindung stehenden Saug-/Abgabedüse 237 auf einer unteren Oberfläche eines Endes auf einer der Welle gegenüberliegenden Seite versehen. Die Saug-/Abgabedüse 237 kann durch den Arm 221 angehoben und abgesenkt werden. Es ist zu beachten, dass eine Spenderpumpeneinheit (nicht gezeigt) an der Innenseite des Arms 236 angebracht ist. In dem ersten Reagenzspender 226 mit einer solchen Struktur befinden sich einer der Reaktionsbehälter 214 und einer der ersten Reagenzbehälter 233 unter einer Spur (in Figur als gestrichelte Linie dargestellt) der Saug-/Abgabedüse 237 bei wechselseitiger Drehung des Arms 236.
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Die Analysesteuerung 202 steuert den intermittierenden Drehzeitpunkt der Reaktionsscheibe 212, des ringförmigen Blocks 213, der Probenscheibe 224 und des kreisförmigen Blocks 229 für erste Reagenzien, steuert den Antriebszeitpunkt des zweiten Reagenzspenders 220, des Probenspenders 226, des ersten Reagenzspenders 235 und des Rührstabs des Rührarms und steuert auch den Zeitpunkt der Einstrahlung von Anregungslicht vom Bestrahlungselement und den Detektionszeitpunkt der Detektionseinheit 223 usw. Außerdem steuert die Analysesteuerung 202 die Temperatur des Reaktionsbehälters 214, des Probenbehälters 225, der ersten Reagenzienkühlbox und der zweiten Reagenzienkühlbox.
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7 ist ein Blockdiagramm, das ein Beispiel für einen Autoanalysator 100 zeigt.
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Der Autoanalysator 100 umfasst eine Datenverarbeitungseinheit 30, die die vom Analysesystem 200 erzeugten Daten über die Fluoreszenz zur Verarbeitung empfängt und Daten zum Vorhandensein/Nichtvorhandensein oder zur Menge der Zielsubstanz (nachfolgend als „Analysedaten“ bezeichnet) und Standarddaten erzeugt. Die Datenverarbeitungseinheit 30 umfasst eine Bedieneinheit 31 und eine Speichereinheit 32. Die Bedieneinheit 31 bezieht sich auf Analysedaten und ist dafür konfiguriert, Standarddaten (zum Beispiel Kalibrierdaten) zu generieren, die den Zusammenhang zwischen einem Fluoreszenzwert und der Konzentration einer Zielsubstanz angeben. Außerdem ist die Bedieneinheit 31 auf die zu analysierende Probe bezogen und zum Generieren von Analysedaten unter Verwendung der Standarddaten konfiguriert. Ferner umfasst die Speichereinheit 32 eine Speichervorrichtung und speichert die Standarddaten und Analysedaten, die von der Bedieneinheit 31 generiert werden.
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Der Autoanalysator 100 umfasst eine Ausgabeeinheit 40, die in der Datenverarbeitungseinheit 30 generierte Daten ausgibt. Die Ausgabeeinheit 40 umfasst eine Druckeinheit 41, die die Standarddaten oder die Analysedaten, die von der Datenverarbeitungseinheit 30 generiert werden, ausdruckt, und/oder eine Anzeigeeinheit 42, die die Daten auf einem Monitor oder dergleichen ausgibt und anzeigt.
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Der Autoanalysator 100 umfasst eine Bedieneinheit 50, die eine Eingabe zum Einstellen eines zur Analyse erforderlichen Analyseparameters, eine Eingabe zum Starten des Analysesystems 200, eine Eingabe zum Durchführen einer Kalibrierung und dergleichen durchführt. Die Bedieneinheit 50 umfasst Eingabevorrichtungen wie eine Tastatur, eine Maus, eine Taste und ein Touchpanel.
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Der Autoanalysator 100 umfasst eine im Analysesystem 200 enthaltene Analysesteuerung 202 und eine Systemsteuereinheit 60, die die Datenverarbeitungseinheit 30 und die Ausgabeeinheit 40 steuert. Die Systemsteuereinheit 60 umfasst eine CPU und eine Speicherschaltung. Die Speicherschaltung speichert die von der Bedieneinheit 50 eingegebenen Daten, das Programm, die Daten über die Fluoreszenz, die Analysedaten, die Standarddaten und dergleichen. Die CPU steuert das gesamte System durch Steuern der Analysesteuerung 202, der Datenverarbeitungseinheit 30 und der Ausgabeeinheit 40 gemäß den Eingangsdaten und/oder dem Programm.
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Nachfolgend wird das mit dem oben beschriebenen Autoanalysator 100 durchzuführende Analyseverfahren beschrieben.
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In diesem Beispiel werden die erste Substanz und die zweite Substanz als getrennte Materialien hergestellt. 8 ist ein schematisches Diagramm, das ein Beispiel für die erste bis dritte Substanz zeigt, die für dieses Analyseverfahren verwendet werden. In diesem Beispiel enthalten das andere Ende 4 des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 und der erste Einfangkörper 5 weitere Komponenten, um sich miteinander zu verbinden. Es reicht aus, wenn es sich bei den weiteren Komponenten um zwei Substanzen handelt, die aneinander binden. Vorzugsweise sollte es sich dabei um Substanzen mit einem Molekulargewicht handeln, das die Funktionen der Komponenten der ersten bis dritten Substanz nicht blockiert. Außerdem sollte die Affinität dieser beiden Substanzen höher sein als die Affinität zwischen dem ersten und zweiten Einfangkörper und der Zielsubstanz. Verwendbare Beispiele für diese Substanzen sind Biotin und Streptavidin, Protein A, Protein G, Melonengel und Nukleinsäure. In dem in 8 gezeigten Beispiel ist Streptavidin 11 an das andere Ende 4 des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 der ersten Substanz gebunden und ist Biotin 12 an den ersten Einfangkörper 5 der zweiten Substanz gebunden. Für die anderen Strukturen können ähnliche Strukturen verwendet werden wie oben beschrieben.
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Der Ablauf des Analysenverfahrens wird nun unter Bezugnahme auf das in 6 dargestellte Analysensystems 200 und das schematische Diagramm aus 9 beschrieben, das das Verhalten der ersten bis dritten Substanz zeigt.
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Zuerst werden unterschiedliche Proben jeweils in die Probenbehältern 225 des Autoanalysators 100 gefüllt. Dann wird das zweite Reagenz (d. h. die erste Substanz) der gleichen Art in jeden der zweiten Reagenzbehälter 218 gefüllt und das erste Reagenz (d. h. die zweite und dritte Substanz) der gleichen Art in jeden der ersten Reagenzbehälter 233 gefüllt. Jeder der Probenbehälter 225 wird von der Analysesteuerung 202 so gesteuert, dass er auf 2 °C bis 20 °C gehalten wird. Der zweite Reagenzbehälter 218 und der erste Reagenzbehälter 233 werden durch die zweite Reagenzienkühlbox bzw. die erste Reagenzienkühlbox auf 2 °C bis 20 °C gehalten.
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Anschließend wird der Arm 227 des Probenspenders 226 in Richtung der Probenscheibe 224 gedreht, so dass die Saug- und Auslassdüse 228 bis direkt über den Probenbehälter 225 bewegt wird, in den die zu detektierende Probe gefüllt ist, und dann wird die Spitze der Saug-/Abgabedüse 228 auf die Probe im Probenbehälter 225 abgesenkt. Anschließend saugt die Saug-/Abgabedüse 228 die in den Probenbehälter 225 gefüllte Probe an. Dann wird die Saug-/Abgabedüse 228 angehoben und der Arm 227 in Richtung der Reaktionsscheibe 212 gedreht, um die Saug-/Abgabedüse 228 direkt über einem Reaktionsbehälter 214 auf der Reaktionsscheibe 212 zu platzieren. Danach wird die Spitze der Saug-/Abgabedüse 228 in den Reaktionsbehälter 214 abgesenkt. Dann wird die Probe in der Saug-/Abgabedüse 228 in den Reaktionsbehälter 214 abgegeben, um die Probe in den Reaktionsbehälter 214 einzuspritzen. Anschließend wird die Saug-/Abgabedüse 228 angehoben, und der Arm 227 wird gedreht, um sie in die ursprüngliche Position zurückzubringen.
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Die Reaktionsscheibe 212 wird gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um den Reaktionsbehälter 214, der die Probe enthält, an eine Stelle zu bewegen, die der 3-Uhr-Position der Uhrplatte entspricht, die dem kreisförmigen Block 229 für das erste Reagenz gegenüberliegt. Hier wird beim ersten Reagenzspender 235 wie beim Einspritzen der Probe der Arm 236 betätigt, um ihn in Richtung des kreisförmigen Blocks 229 für das erste Reagenz zu drehen. Somit wird das erste Reagenz aus dem ersten Reagenzbehälter 233 in den Reaktionsbehälter 214 eingespritzt, um die zweite Substanz und die dritte Substanz zu der Probe hinzuzufügen (siehe 9, Teil (a)).
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Danach wird die Reaktionsscheibe 212 gegen den Uhrzeigersinn gedreht, so dass sich der Reaktionsbehälter 214 direkt unter dem Rührstab des Rührarms (nicht gezeigt) befindet. Dann wird der Rührstab in das Gemisch im Reaktionsbehälter 214 abgesenkt und gedreht, wodurch das Gemisch gerührt wird. Zu diesem Zeitpunkt werden, wie in 9, Teil (b) gezeigt, die zweite Substanz, die Zielsubstanz in der Probe und die dritte Substanz miteinander verbunden.
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Als Nächstes wird die Reaktionsscheibe 212 gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um den Reaktionsbehälter 214 in die 9-Uhr-Position der Uhrplatte zu bewegen. Hier wird beim zweiten Reagenzspender 220 wie beim Einspritzen der Probe der Arm 221 betätigt, um ihn in Richtung des ringförmigen Blocks 213 zu drehen. Somit wird das zweite Reagenz aus dem zweiten Reagenzbehälter 218 in den Reaktionsbehälter 214 eingespritzt, um es dem Gemisch im Reaktionsbehälter 214 hinzuzufügen. Durch Hinzufügen des zweiten Reagenz (der ersten Substanz) (9, Teil (c)) sinkt die Temperatur des im Reaktionsbehälter 214 enthaltenen Gemisches. Außerdem werden, wie in 9, Teil (d) gezeigt, die erste Substanz und die zweite Substanz über das Streptavidin 11 und das Biotin 12 zu einem Komplex miteinander verbunden. Da hier der Reaktionsbehälter 214 vorab so gesteuert wird, dass er auf 30 °C bis 40 °C gehalten wird, steigt das im Reaktionsbehälter 214 enthaltene Gemisch dann automatisch zum Beispiel in etwa 1 Minute bis 30 Minuten auf diese Temperatur an. Dadurch bildet das auf Temperatur ansprechende Makromolekül der ersten Substanz, das nicht die Komplex-Aggregate bildet, ein Aggregat (9, Teil (e)).
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Der Zeitraum von Schritt (a) des Hinzufügens der zweiten und dritten Substanz zu der Probe bis zum Temperaturanstieg nach Schritt (d) beträgt zum Beispiel etwa 1 Minute bis etwa 30 Minuten. Dieser Zeitraum ist ausreichend dafür, dass der erste Einfangkörper und der zweite Einfangkörper an die Zielsubstanz gebunden werden. Währenddessen beträgt der Zeitraum von Schritt (c) des Hinzufügens der ersten Substanz bis zum Temperaturanstieg nach Schritt (d) zum Beispiel etwa 1 Minute bis etwa 30 Minuten. Dieser Zeitraum ist kürzer als der Zeitraum unmittelbar vor den Schritten (a) bis (d), doch dieser Zeitraum reicht für die Bindung aus, da die Affinitäten des Streptavidins 11 und des Biotins 12 höher sind. Mit einem solchen Verfahren ist es möglich, zu verhindern, dass das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 aggregiert, was durch Temperaturanstieg vor dem Binden der ersten und zweiten Substanz an die Zielsubstanz verursacht werden kann. Spezieller kann in dem Fall, dass die erste Substanz und die zweite Substanz vorher zusammen binden, eine Aggregation stattfinden, bevor die zweite Substanz an die Zielsubstanz bindet, da der Zeitraum vom Hinzufügen dieses gebundenen Materials bis zum Temperaturanstieg etwa 1 Minute bis etwa 30 Minuten beträgt. Andererseits sind gemäß dem Verfahren das Hinzufügen der zweiten Substanz und das Hinzufügen der ersten Substanz getrennt und wird zuerst die zweite Substanz hinzugefügt, um der zweiten Substanz genügend Zeit zu geben, um an die Zielsubstanz zu binden. Auf diese Weise kann selbst dann, wenn der Zeitraum bis zur Wiederherstellung der Temperatur nach Hinzufügen der ersten Substanz kurz ist, immer noch verhindert werden, dass das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 aggregiert, bevor die zweite Substanz an die Zielsubstanz bindet.
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Nachdem die Temperatur des Gemisches im Reaktionsbehälter 214 angestiegen ist, wird die Reaktionsscheibe 212 gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um den Reaktionsbehälter 214 gegenüber der Detektionseinheit 223 in der 6-Uhr-Position der Uhrplatte zu platzieren. Dann wird das Anregungslicht zum Anregen der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz unter hydrophoben Bedingungen von dem Bestrahlungselement (nicht gezeigt) der Detektionseinheit 223 auf das Gemisch im Reaktionsbehälter 214 gestrahlt. Anschließend wird die aus dem Gemisch im Reaktionsbehälter 214 erzeugte Fluoreszenz vom Detektor (nicht gezeigt) der Detektionseinheit 223 detektiert.
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Die durch Detektieren erhaltenen Daten über die Fluoreszenz werden an die in 7 gezeigte Datenverarbeitungseinheit 30 gesendet, und die Daten (Analysedaten) über das Vorhandensein/Nichtvorhandensein oder die Menge der Zielsubstanz und Standarddaten werden generiert. Die Analysedaten und die Standarddaten werden an die Ausgabeeinheit 40 ausgegeben. Ein Teil oder alle der oben beschriebenen Schritte können durch geschriebene Programme automatisch ausgeführt werden.
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Bei der oben beschriebenen automatischen Analyse der Zielsubstanz in der Probe durch den Autoanalysator wird die Probe im Probenbehälter 225 der Probenscheibe 224 in den Reaktionsbehälter 214 eingespritzt und anschließend die Probenscheibe 224 gedreht, zum Beispiel gegen den Uhrzeigersinn, um den Probenbehälter 225 um einen Abschnitt zu bewegen. Dann wird das erste Reagenz im ersten Reagenzbehälter 233 des kreisförmigen Blocks 229 für erste Reagenzien in den Reaktionsbehälter 214 eingespritzt, und danach wird die Scheibe zum Beispiel gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um den ersten Reagenzbehälter 233 um einen Abschnitt zu bewegen. In ähnlicher Weise wird nach Einspritzen des zweiten Reagenz im zweiten Reagenzbehälter 218 des ringförmigen Blocks 213 in den Reaktionsbehälter 214 der ringförmige Block 213 zum Beispiel gegen den Uhrzeigersinn gedreht, um den zweiten Reagenzbehälter 218 um einen Abschnitt zu bewegen. Mit einem solchen Vorgang werden die folgenden Proben für die automatische Analyse vorbereitet.
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Wie oben beschrieben, kann das Analyseverfahren der Ausführungsform vom Autoanalysator durchgeführt werden. Gemäß dem Analyseverfahren der Ausführungsform ist es auch bei Durchführung durch einen solchen Autoanalysator nicht erforderlich, das Gemisch zum Beispiel bei jedem Hinzufügen eines Reagenz nacheinander vom Schritt des Hinzufügens der Probe bis zum Detektieren von Fluoreszenz zu trennen oder zu waschen. Somit kann die Zielsubstanz mit einem Reaktionsbehälter 214 detektiert oder quantifiziert werden, wodurch Verunreinigung verhindert und das Detektieren und Quantifizieren einfacher mit hoher Genauigkeit durchgeführt werden kann.
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- Analyseverfahren unter Verwendung eines kompetitiven Verfahrens
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Bei der weiteren Ausführungsform kann das Analyseverfahren unter Verwendung des kompetitiven Verfahrens durchgeführt werden.
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Die erste bis dritte Substanz, die für dieses Verfahren verwendet werden, werden unter Bezugnahme auf 10 beschrieben. Hier können die gleichen ersten und zweiten Substanzen verwendet werden wie oben beschrieben. Die dritte Substanz enthält eine kompetitive Substanz 13, die mit einem Aggregationshemmer 7 markiert ist. Der gleiche Aggregationshemmer 7 wie einer der vorstehend beschriebenen kann verwendet werden.
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Die kompetitive Substanz 13 ist eine Substanz, die Affinität zum ersten Einfangkörper aufweist und mit einer Zielsubstanz bei der Bindung an den ersten Einfangkörper konkurriert. Die kompetitive Substanz hat zum Beispiel eine Stelle, deren Konfiguration der der Bindungsstelle an den ersten Einfangkörper der Zielsubstanz ähnelt. Vorzugsweise ist zum Beispiel die Affinität des ersten Einfangkörpers 5 und der kompetitiven Substanz 13 schwächer als die Affinität des ersten Einfangkörpers 5 und der Zielsubstanz.
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11 zeigt einen schematischen Fehler eines Beispiels für das Analseverfahren unter Verwendung des kompetitiven Verfahrens. Das Analyseverfahren umfasst zum Beispiel folgende Schritte:
- (S11) Herstellen der ersten Substanz, der zweiten Substanz und der dritten Substanz;
- (S12) Mischen der zweiten Substanz und der dritten Substanz in die Probe und anschließend Einmischen der ersten Substanz;
- (S13) Halten des durch das Mischen (S12) erhaltenen Gemisches auf einer Temperatur, bei der ein stimuli-sensitives Makromolekül aggregiert;
- (S14) Detektieren von Fluoreszenz einer auf die Umgebung ansprechenden fluoreszierenden Substanz; und
- (S15) Bestimmen von Vorhandensein/Nichtvorhandensein oder Menge einer Zielsubstanz in der Probe basierend auf dem Ergebnis des Detektierens.
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Nachfolgend wird das Analyseverfahren beschrieben. Hier wird ein Beispiel bereitgestellt, bei dem das stimuli-sensitive Makromolekül das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1 ist und die auf die Umgebung ansprechende fluoreszierende Substanz die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2 ist.
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In Schritt (S12) werden die zweite und dritte Substanz in eine Probe gemischt, um einen ersten Komplex 14 zu bilden, wie in 12, Teil (a) gezeigt. Der erste Komplex 14 umfasst zum Beispiel eine auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2a, ein auf Temperatur ansprechendes Makromolekül 1a, einen ersten Einfangkörper 5, eine kompetitive Substanz 13, einen zweiten Einfangkörper 6 und einen Aggregationshemmer 7. Für den Fall, dass der erste Einfangkörper 5 eine Substanz ist, die wie in diesem Beispiel eine Vielzahl von Zielsubstanz-Bindungsstellen aufweist, können eine weitere kompetitive Substanz 13 und ein weiterer Aggregationshemmer 7 an mehrere Zielsubstanz-Bindungsstellen gebunden werden. Anschließend wird, wenn eine Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist, die Bindung der kompetitiven Substanz 13 an den ersten Einfangkörper 5 im ersten Komplex 14 durch die Bindung der Zielsubstanz 8 ersetzt, indem die erste Substanz eingemischt wird, und somit ein zweiter Komplex 15 gebildet (12, Teil (b)). Der zweite Komplex 15 umfasst zum Beispiel die auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz 2b, das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1b, den ersten Einfangkörper 5 und die Zielsubstanz 8.
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In Schritt (S13) wird die Temperatur gehalten, bei der das auf Temperatur ansprechende Makromolekül aggregiert. 13 zeigt den ersten Komplex 14 und den zweiten Komplex 15 zu diesem Zeitpunkt. Das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1a des ersten Komplexes 14 befindet sich in der Nähe des Aggregationshemmers 7 und aggregiert dadurch nicht (13, Teil (a)). Daher variiert die Wellenlänge der Fluoreszenz der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2a nicht. Andererseits wird das auf Temperatur ansprechende Makromolekül 1b, das im zweiten Komplex 15 enthalten ist, hydrophob, so dass es aggregiert, wodurch ein Aggregat 10 gebildet wird (13, Teil (b)). Daher ändert sich die Wellenlänge der Fluoreszenz der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2b.
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Unter diesen Umständen tritt, wenn eine Anzahl von Zielsubstanzen vorhanden ist, wie in 14, Teil (a) gezeigt, die Substitution mehr auf und ist die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2a, deren Fluoreszenz-Wellenlänge nicht variiert, geringer als die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2bs, deren Fluoreszenz-Wellenlänge variierte. Wenn eine geringere Anzahl von Zielsubstanzen vorhanden ist, wie in 14, Teil (b) gezeigt, ist die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanzen 2a größer als die Anzahl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2bs.
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In Schritt (S14) wird die Fluoreszenz von der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2 detektiert. Das Detektieren von Fluoreszenz kann zum Beispiel mit einem ähnlichen Verfahren wie dem von Schritt (S4) erfolgen. Doch in dem Fall, dass Anregungslicht der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2b, deren Fluoreszenz-Wellenlänge variierte, eingestrahlt wird, ist das Verhältnis zwischen der vorhandenen Menge der Zielsubstanz und der erhaltenen Fluoreszenz-Intensität entgegengesetzt zu dem von Schritt (S4). D. h. je mehr Zielsubstanzen vorhanden sind, desto höher wird die Intensität der detektierten Fluoreszenz.
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Zum Detektieren der Fluoreszenz kann das Anregungslicht der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2b wie oben beschrieben eingestrahlt werden oder das Anregungslicht der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2a, deren Wellenlänge nicht variierte, eingestrahlt werden. In diesem Fall wird hinsichtlich der Fluoreszenz-Intensität ein umgekehrtes Ergebnis erhalten. Oder es kann Anregungslicht von sowohl der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2a als auch der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2b eingestrahlt werden, um die Fluoreszenz-Intensitäten von beiden zu messen.
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In Schritt (S15) wird das Vorhandensein/Nichtvorhandensein oder die Menge der Zielsubstanz 8 in der Probe basierend auf dem Ergebnis des Detektierens bestimmt. Zum Beispiel kann bestimmt werden, dass eine Zielsubstanz vorhanden ist, wenn die Fluoreszenz in dem Fall detektiert wird, dass Anregungslicht der auf Polarität ansprechenden fluoreszierenden Substanz 2b, deren Fluoreszenz-Wellenlänge variierte, eingestrahlt wird. Oder es kann bestimmt werden, dass eine Zielsubstanz vorhanden ist, wenn die Fluoreszenz-Intensität höher als ein vorbestimmter Schwellenwert ist, oder dass eine Zielsubstanz vorhanden ist, wenn die Intensität geringer als der Schwellenwert ist. Der Schwellenwert wird vorab zum Beispiel durch Messen der Fluoreszenz-Intensität mit einer Standardprobe bestimmt, deren Zielsubstanz-Konzentration bereits bekannt ist. Oder es kann durch Messen der Fluoreszenz-Intensität einer solchen Standardprobe eine Kalibrierkurve erstellt werden, um die Menge der Zielsubstanz der zu analysierenden Probe entsprechend der Kalibrierkurve zu bestimmen. Oder es kann die Menge einer Zielsubstanz basierend auf der Anstiegszeit der Fluoreszenz bestimmt werden.
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Das Analyseverfahren unter Verwendung des beschriebenen kompetitiven Verfahrens kann auch mit dem Autoanalysator 100 durchgeführt werden. Nach dem Analyseverfahren unter Verwendung des kompetitiven Verfahrens können Zielsubstanzen mit geringerem Molekulargewicht präziser detektiert oder quantifiziert werden.
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- Reagenzienkit
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Reagenzienkit zur Verwendung für das Analyseverfahren der Ausführungsform bereitgestellt. Das Reagenzienkit der Ausführungsform enthält zum Beispiel die erste Substanz, die zweite Substanz und die dritte Substanz der Ausführungsform. Die erste bis dritte Substanz können jeweils in getrennte Behälter gefüllt sein, oder die zweite und dritte Substanz können zusammen in denselben Behälter gefüllt sein. Oder das andere Ende 4 des auf Temperatur ansprechenden Makromoleküls 1 der ersten Substanz und der erste Einfangkörper der zweiten Substanz können vorher miteinander verbunden worden sein und in einen einzigen Behälter gefüllt sein.
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Die erste bis dritte Substanz können zum Beispiel in entsprechenden, oben beschriebenen Lösungsmitteln enthalten sein.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Auf Temperatur ansprechendes Makromolekül
- 1a
- Auf Temperatur ansprechendes Makromolekül
- 1b
- Auf Temperatur ansprechendes Makromolekül
- 2
- Auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz
- 2a
- Auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz
- 2b
- Auf Polarität ansprechende fluoreszierende Substanz
- 3
- Ein Ende
- 4
- Anderes Ende
- 5
- Erster Einfangkörper
- 6
- Zweiter Einfangkörper
- 7
- Aggregationshemmer
- 8
- Zielsubstanz
- 9
- Komplex
- 11
- Streptavidin
- 12
- Biotin
- 13
- Kompetitive Substanz
- 14
- Erster Komplex
- 15
- Zweiter Komplex
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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