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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten der Blutplasmaprotein-Aktivität.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Blutplasma ist die leicht gelblich gefärbte flüssige Komponente von Blut, die die Blut-Zellen in Gesamtblut normalerweise in Suspension hält; Dies macht Plasma zu einer extrazellulären Matrix von Blut-Zellen. Es besteht hauptsächlich aus Wasser und enthält gelöste Proteine (beispielsweise, Serumalbumine, Globuline und Fibrinogen), Glucose, Gerinnungsfaktoren, Elektrolyte, Hormone, Vitamine und Kohlendioxid. Plasma spielt bei dem intravaskulären osmotischen Effekt, der die Elektrolyte in ausgewogener Form hält und den Körper vor Infektionen und anderen Störungen des Blutes schützt eine vitale Rolle.
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Blutplasma kann durch Zentrifugieren eines Röhrchens mit frischem Blut, das ein Anti-Koagulans enthält in einer Zentrifuge, bis die Blut-Zellen auf den Boden des Röhrchens kommen, erhalten werden. Die Verwendung von Blutplasma als Ersatz für Gesamtblut und zur Transfusion wurde bereits 1918 vorgestellt. Eine getrocknete Plasma-Packung für das Militär wurde entwickelt, da Bruchschaden verringert und der Transport, die Verpackung und die Lagerung stark vereinfacht wurde. Serumalbumin ersetzte während des Korea-Kriegs getrocknetes Plasma zur Verwendung während des Gefechts.
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Plasma dient vielerlei Funktionen, um einen zweckdienlichen Blut-Druck und ein Blut-Volumen aufrecht zu halten, um wichtige Proteine zur Blutgerinnung und für eine Immunität zu liefern. Es dient auch als Medium zum Austausch vitaler Mineralien, wie Natrium und Kalium, und unterstützt eine Aufrechterhaltung eines zweckmäßigen pH-Werts (Säure-Bases) in dem Körper, welche für die Zellfunktion wichtig ist. Plasma als von Blutspendern hergestelltes Blut-Produkt wird in Blut-Transfusionen eingesetzt, typischerweise als frisch gefrorenes Plasma (FFP) oder Plasma, das binnen 24 Stunden nach Aderlass (PF24) erhalten wurde. Plasma wird nach einer Gewinnung schnell gefroren (bis zu 24 Stunden), um Gerinnungsfaktoren zu erhalten, bis zu einem Jahr gelagert und kurz vor Verwendung aufgetaut. Es wird nun gewöhnlich mit Thrombin in Fällen von übermäßigem Bluten verwendet, oder um Blutungen in Patienten mit abnormalem Koagulations-Tests, die einem invasiven Vorgang unterzogen werden, zu verhindern. Es wird im allgemeinen Trauma-Patienten und Patienten mit Leberversagen, schweren Infektionen, schweren Verbrennungen, oder multiplen Gerinnungsfaktor-Störungen, infundiert. Die Verwendung von FFP in Krankenhäusern stieg in letzten Jahren um über 20 % und es kamen Fragen auf hinsichtlich der Zweckmäßigkeit dessen klinischer Verwendung.
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Der Stand der Technik der Plasma-Lagerung besteht darin, Plasma binnen 24 Stunden nach einem Aderlass schnell einzufrieren und dieses gewöhnlich als Frisch Gefrorenes Plasma (FFP) bis zu einem Jahr zu lagern. Das FFP kurz vor Verwendung aufgetaut werden. Derartige Lager-Verfahren weisen jedoch mindestens die folgenden Nachteile auf: (1) Plasma kann nicht für lange Zeit gelagert werden ausser es wird als FFP gefroren und in einem Tieftemperatur-Kühlschrank gelagert; und (2) die Fibrinogen-Aktivität kann nachdem Auftauen zur Verwendung nicht gut erhalten werden.
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KURZE ZUSAMMENFASSUG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Erhalt der Blutplasmaprotein-Aktivität, welches umfasst, Mischen von Blutplasma mit zwei oder mehr Schutzhilfsmitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triglycerid, Glycerol, Propylenglycol, Alanin, Serin, Glycin, Alginat, und Saccharose um ein Gemisch zu erhalten, und Lyophilisieren des Gemisches.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel ein erstes Schutzhilfsmittel von Glycerol, und ein zweites Schutzhilfsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triglycerid, Alanin und Serin.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel ein erstes Schutzhilfsmittel von Propylenglycol, und ein zweites Schutzhilfsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triglycerid, Glycin, Alginat und Saccharose.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Glycerol, Triglycerid und Propylenglycol.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmitteln Glycerol, Triglycerid und Saccharose.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Blutplasma weiter in dem Mischschritt mit einem Schutzhilfsmittel gemischt werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Albumin und Gelatine.
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Es sollte aus der vorstehenden allgemeinen Beschreibung und der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung klar sein, dass diese beispielhaft und erläuternd sind und die Erfindung nicht einschränken sollen.
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Figurenliste
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Die vorstehende Zusammenfassung sowie die nachfolgende ausführliche Beschreibung der Erfindung wird in Zusammenhang mit den anliegenden Zeichnungen besser verständlich. In den Zeichnnugen:
- 1A-1C zeigt die Menge an Wachstumsfaktor in Plasma, das aus Plasma-Pulver unter Verwendung von Albumin als ein Schutzhilfsmittel wiederhergestellt wurde. 1A zeigt die Menge an PDGF-AB, 1B zeigt die Menge an TGF-β1, und 1C zeigt die Menge an VEGF. Die Menge an verwendetem Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balken-Stil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- Die 2A-2C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in dem Plasma, wiederhergestellt aus Plasma-Pulver unter Verwendung von Alginat als ein Schutzhilfsmittel. 2A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 2B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 2C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Schutzhilfsmittel-Menge basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 3A-3C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in dem Plasma, wiederhergestellt aus Plasma-Pulver unter Verwendung von Dextran als ein Schutzhilfsmittel. 3A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 3B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 3C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 4A-4C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus Plasma-Pulver unter Verwendung von Gelatine als ein Schutzhilfsmittel. 4A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 4B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 4C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 5A-5C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Glucose als ein Schutzhilfsmittel. 5A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 5B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 5C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 6A-6C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Glutaminsäure als ein Schutzhilfsmittel. 6A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 6B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 6C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 7A-7C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Glycerol als ein Schutzhilfsmittel. 7A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 7B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 7C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Vol./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 8A-8C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Glycin als ein Schutzhilfsmittel. 8A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 8B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 8C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 9A-9C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Propylenglycol als ein Schutzhilfsmittel. 9A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 9B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 9C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Vol./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 10A-10C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Saccharose als ein Schutzhilfsmittel. 10A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 10B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 10C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 11A-11C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Trehalose als ein Schutzhilfsmittel. 11A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 11B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 11C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Gew./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 12A-12C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von Triglycerid als ein Schutzhilfsmittel. 12A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 12B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 12C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Vol./Vol.). Kontrolle: Nur Plasma. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 13A-13C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von zwei (2) Schutzhilfsmitteln. 13A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 13B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 13C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmittel. Kontrolle: Nur Plasma. 1: 2% Glycerol+ 2% Dextran; 2: 0,1% Triglycerid+ 2% Dextran; 3: 0,16% Glycerol + 3% Albumin; 4: 0,1% Triglycerid + 2% Propylenglycol; 5: 0,1% Triglycerid + 2% Glycerol; 6: 0,8% Glycin + 1,6% Dextran; 7: 1,6% Glycin + 1,6% Propylenglycol; 8: 0,8% Propylenglycol + 4% Alginat; 9: 0,4% Propylenglycol + 2,4% Albumin; 10: 1,6 % Dextran +1,0% Propylenglycol; 11: 1% Glycerol + 2% Alanin; 12: 0,6% Glycerol + 1,2% Serin; 13: 0,08% Propylenglycol + 2% Saccharose; 14: 0,08% Dextran + 3.2% Albumin; und 15: 0,8% Glycin + 1% Trehalose. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 14A-14C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von drei (3) Schutzhilfsmitteln. 14A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 14B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 14C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmitteln. Kontrolle: Nur Plasma. 1: 4% Glutaminsäure + 0,4% Propylenglycol + 0,04% Dextran; 2: 0,4% Triglycerid + 4% Glycerol + 0,8% Dextran; 3: 0,1% Triglycerid + 4% Glycerol + 0,3% Saccharose; 4: 1% Triglycerid + 1,6% Glycerol + 0,8% Propylenglycol; 5: 0,4 % Glutaminsäure + 0,4% Albumin + 4% Gelatine; 6: 1% Glutaminsäure + 4% Albumin + 0,8% Dextran; 7: 0,01% Triglycerid + 4% Dextran + 0,8% Albumin; 8: 0,04% Triglycerid + 0,08% Glycerol + 4% Albumin; 9: 4% Triglycerid + 0,4% Glycerol + 0,8% Glycin; 10: 3% Trehalose + 4% Alginat + 0,8% Dextran; 11: 0,1% Glutaminsäure + 1% Trehalose + 4% Dextran; 12: 3% Glutaminsäure + 3% Trehalose + 3 % Alginat. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
- 15A-15C zeigen die Wachstumsfaktor-Mengen in Plasma, wiederhergestellt aus dem Plasma-Pulver unter Verwendung von vier (4) Schutzhilfsmitteln. 15A zeigt die Mengen an PDGF-AB, 15B zeigt die Mengen an TGF-β1, und 15C zeigt die Mengen an VEGF. Die verwendete Menge an Schutzhilfsmittel basiert auf dem Plasma-Volumen: % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmitteln. Kontrolle: Nur Plasma. 1: 0,4% Albumin + 0,8% Polyethylenglycol + 4% Glycerol + 0,4% Glycin; 2: 1% Polyethylenglycol + 0,4% Gelatine + 0,4% Glutaminsäure + 0,4% Glucose; 3: 4% Triglycerid + 0,4% Albumin + 0,4% Dextran + 0,4% Glycerol; 4: 0,04% Triglycerid + 0,4% Albumin + 0,4% Polyethylene glycol + 0,4% Glucose; 5: 0,01% Albumin + 2% Dextran + 0,4% Serin + 4% Saccharose; 6: 0,04% Triglycerid + 4% Albumin + 0,4% Glycin + 0,4% Trehalose; 7: 4% Albumin + 0,4% Polyethylenglycol + 0,4% Alanin + 4% Trehalose; 8: 0,4% Triglycerid + 4% Gelatine + 0,4% Alginat + 0,4% Glycin; 9: 2% Gelatine + 2% Alginat + 0,4% Glycin + 0,4% Trehalose. Der Unterschied zwischen in dem gleichen Balkenstil gezeigten Daten (Plasma wiederhergestellt nach der gleichen Zeitspanne (1 Stunde, 1 Monat, oder 6 Monate) nach Lyophilisierung) mit unterschiedlichen Buchstaben ist statistisch signifikant (P < 0,05).
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung liefert ein Verfahren zum Erhalten der Blutplasmaprotein-Aktivität, welches umfasst, Mischen von Blutplasma mit zwei oder mehreren Schutzhilfsmitteln ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triglycerid, Glycerol, Propylenglycol, Alanin, Serin, Glycin, Alginat, und Saccharose um ein Gemisch zu erhalten, und Lyophilisieren des Gemisches.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung, können die Schutzhilfsmittel in den folgenden Mengen zugesetzt werden: (1) 0,01-10% (Vol./Vol.) Triglycerid basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,05-2% (Vol./Vol.); (2) 0,01%-10% (Vol./Vol.) Glycerol basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,5-5% (Vol./Vol.); (3) 0,01%-10% (Vol./Vol.) Propylenglycol basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,5-5% (Vol./Vol.); (4) 0,01%-10% (Gew./Vol.) Alanin basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,5-5% (Gew./Vol.); (5) 0,01%-10% (Gew./Vol.) Serin basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,05-5% (Gew./Vol.); (6) 0,01%-10% (Gew./Vol.) Glycin basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,5-5% (Gew./Vol.); (7) 0,01%-10% (Gew./Vol.) Alginat basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,5-10% (Gew./Vol.); (8) 0,01%-10% (Gew./Vol.) Saccharose basierend auf dem Plasma-Volumen, vorzugsweise 0,5%-5% (Gew./Vol.).
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel ein erstes Schutzhilfsmittel von Glycerol, und ein zweites Schutzhilfsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triglycerid, Alanin und Serin. In einigen Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Glycerol und Triglycerid. In einigen Ausführungsformen sind zwei oder mehr Schutzhilfsmitteln Glycerol und Alanin. In einigen Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmitteln Glycerol und Serin.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel ein erstes Schutzhilfsmittel von Propylenglycol, und ein zweites Schutzhilfsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Triglycerid, Glycin, Alginat und Saccharose. In einigen Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Propylenglycol und Triglycerid. In einigen Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Propylenglycol und Glycin. In einigen Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Propylenglycol und Alginat. In einigen Ausführungsformen sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Propylenglycol und Saccharose.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Glycerol, Triglycerid und Propylenglycol. In einer Ausführungsform sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Glycerol, Triglycerid und Propylenglycol. So können beispielsweise die folgenden Mengen an Schutzhilfsmittel zugesetzt werden (basierend auf dem Plasma-Volumen): etwa 1% (Vol./Vol.) Triglycerid, etwa 1,6% (Vol./Vol.) Glycerol, und etwa 0,8 % (Vol./Vol.) Propylenglycol.
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In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Glycerol, Triglycerid und Saccharose. In einer Ausführungsform sind die zwei oder mehr Schutzhilfsmittel Glycerol, Triglycerid und Saccharose. So können beispielsweise die folgenden Mengen an Schutzhilfsmittel zugesetzt werden (basierend auf dem Plasma-Volumen): etwa 0,1% (Vol./Vol.) Triglycerid, etwa 4% (Vol./Vol.) Glycerol, und etwa 2% (Gew./Vol.) Saccharose.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Blutplasma n dem Mischschritt weiter mit einem Schutzhilfsmittel gemischt werden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Dextran, Albumin und Gelatine.
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Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert, welche zum Zwecke der Darstellung und nicht zur Begrenzung gegeben werden.
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Beispiel 1: Blutplasma-Isolierung
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Gesamtblut wurde von freiwilligen Spendern, was durch im Aderlass /Blutabnahme trainiertes Personal erfolgen musste, unter Verwendung eines Blut-Doppelbeutelsystems (about 50ml) (TerumoBCT, Japan) mit Antikoagulans (1 ml Antikoagulans Citratdextrose (ACD) Lösungs-Formel/ pro 10 ml Blut) gewonnen. Nach Gewinnung des Bluts wurde das Blut sorgsam gemischt indem das Röhrchen mehrmals invertiert wurde, um ein gründliches Vermischen mit dem anti-Koagulans sicherzustellen. Für ein gründliches Vermischen des gewonnenen Bluts in den Citrat-Röhrchen ist es angeraten, das Röhrchen 3-4 mal zu invertieren/umzukehren, während ACD-Röhrchen acht-Mal invertiert werden sollten. Blutproben sollten bei gemäßigten Bedingungen (20-24°C) gehalten und binnen 4 Stunden nach der Blut-Gewinnung zentrifugiert werden. Um das Plasma abzutrennen wurden die Blutproben bei 1200 x g für 10 Minuten bei 22°C zentrifugiert. Bei Bedarf kann ein RCF für eine Zentrifuge berechnet werden. Nach Zentrifugation wird die Plasma-Schicht die obere Schicht des getrennten Bluts sein als ein klare, strohgelbes Fluid erscheinen.
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Beispiel 2: Zubereitung von lyophilisiertem Plasma-Pulver
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Eine zweckmäßige Menge an Schutzhilfsmitteln wurde dem frisch gewonnenen Plasma zugesetzt und gründlich vermischt um ein Gemisch zu erhalten. Das Gemisch wurde dann zu Pulver lyophilisiert.
Table 1: Verwendete Menge an Schutzhilfsmitteln
| Schutzhilfsmittel | Menge |
| Triglycerid | 0,01%-10% (Vol./Vol.) |
| Glycerol | 0,01%-10% (Vol./Vol.) |
| Propylenglycol | 0,01%-10% (Vol./Vol.) |
| Alanin | 0,1 %-5% (Gew./Vol.) |
| Serin | 0,01%-10% (Gew./Vol.) |
| Glycin | 0,01%-10% (Gew./Vol.) |
| Alginat | 0,01%-10% (Gew./Vol.) |
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Beispiel 3: Überprüfung der Fibrinogen-Aktivität
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20 mg Plasma-Pulver eine Stunde, einen Monat bzw. sechs Monate nach Lyophilisierung, wurde in 1 ml Kochsalzlösung gelöst und gründlich vermischt. Das wiederhergestellte Plasma wurde mit Thrombin-Lösung (35-45 IU/ml) in einem Volumen von 1:1 vermischt. (1) Gerinnungs-Aktivität: Fibrinogen-Aktivität wurde durch Überwachen der Gerinnungsbildung überwacht und als ausgezeichnet (+++), gut (++), mittel (+), oder keine Aktivität (-) bewertet. (2) Viskosität: Die Viskosität von mit Thrombin-versetztem Plasma wird als mit der Fibrinogen-Aktivität positiv korreliert angesehen und als ausgezeichnet (+++), gut (++), mittel (+), oder keine Viskosität (-) bewertet. Die Ergebnisse sind in den nachstehenden Tabellen 2-5 gezeigt.
Table 2: Fibrinogen-Aktivität (ein Schutzhilfsmittel)
| Schutzhilfs mittel | Menge (basierend auf dem Plasma-Volumen; % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmitte 1) | Eine Stunde | Ein Monat | Sechs Monate |
| | | Gerinnungs Aktivität | Viskosität | Gerinnungs Aktivität | Viskosität | Gerinnungs Aktivität | Viskosität |
| | - (Nur Plasma) | - | - | - | - | - | - |
| Ester - Triglycerid | 0,01% (Vol./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| 0,1% (Vol./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 1% (Vol./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 10% (Vol./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| Glycerol | 0,01% (Vol./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 0,1% (Vol./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 1% (Vol./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| 10% (Vol./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| Aminosäure - Glycin | 0,01% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| Aminosäure - Alanin | 0,01% (Gew./Vol.) | - | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | - | - | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | - | - | - | - | - | - |
| Aminosäure - Glutaminsäure | 0,01% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| Aminosäure - Serin | 0,01% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| Albumin | 0,01% (Gew./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | + | - |
| | 10% (Gew./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| Gelatine | 0,01% (Gew./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | + | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| Synthetisches Polymer - Propylenglycol | 0,01% (Vol./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| 0,1% (Vol./Vol.) | + | + | + | - | - | - |
| 1% (Vol./Vol.) | + | + | + | + | - | - |
| 10% (Vol./Vol.) | + | + | + | + | - | - |
| Poly Saccharide - Dextran | 0,01% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | + | + |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | + | + |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | + | + |
| 10% (Gew./Vol.) | + | + | + | + | + | + |
| Poly saccharide - Alginat | 0,01% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| Mono saccharide - Glucose | 0,01% (Gew./Vol.) | - | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | - | - | - | - | - | - |
| Disaccharide - Trehalose | 0,01% (Gew./Vol.) | - | - | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | - | - | - | - | - |
| Disaccharide - Saccharose | 0,01% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 0,1% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 1% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
| 10% (Gew./Vol.) | + | + | - | - | - | - |
Tabelle 3: Fibrinogen-Aktivität (zwei Schutzhilfsmittel)
| Schutzhilfsmittel / Mengen (basierend auf dem Plasma-Volumen; % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmittel) | Eine Stunde | Ein Monat | Sechs Monate |
| Gerinnungs-Aktivität | Viskosität | Gerinnungs-Aktivität | Viskosität | Gerinnungs-Aktivität | Viskosität |
| - (Nur Plasma) | - | - | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid + 2% Glycerol | ++ | ++ | + | + | + | - |
| 0,1%Triglycerid + 2% Glycin | + | + | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid + 2 % Glutaminsäure | + | + | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid + 2 % Albumin | ++ | + | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid + 2 % Gelatine | ++ | ++ | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid + 2 % Propylenglycol | ++ | ++ | + | + | + | - |
| 0,1%Triglycerid + 2 % Dextran | ++ | ++ | ++ | + | + | - |
| 0,1%Triglycerid + 2 % Alginat | ++ | ++ | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid +1% glucose | + | + | - | - | - | - |
| 0,1%Triglycerid+ 1% Trehalose | + | + | + | - | - | - |
| 1 % Glycerol+2 % Alanin | + | + | + | + | + | - |
| 0,6 % Glycerol+1,2 % Serin | + | + | + | + | + | - |
| 0,16 % Glycerol+3 % Albumin | ++ | ++ | ++ | + | + | - |
| 2% Glycerol+ 2 % Dextran | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + |
| 0,08% Glycerol+ 2 % Gelatine | ++ | ++ | + | - | - | - |
| 1% Glycerol+ 2 % Alginat | + | + | + | - | - | - |
| 0,6% Glycerol + 2% Saccharose | + | + | + | - | - | - |
| 0,8 % Glycin + 1,6 % Albumin | + | - | - | - | - | - |
| 1,6% Glycin + 2% Propylenglycol | + | + | + | + | + | + |
| 0,8 % Glycin +1,6% Dextran | + | + | + | + | + | + |
| 0,8 % Glycin + 1% Trehalose | + | + | + | - | - | - |
| 2% Propylenglycol + 4 % Alginat | + | + | + | + | + | + |
| 3.2% Propylenglycol + 1 % Gelatine | + | + | + | - | + | - |
| 0,4% Propylenglycol + 2,4% Albumin | + | + | + | + | + | + |
| 0,08 % Propylenglycol + 2% Saccharose | + | + | + | + | + | - |
| 0,08 % Dextran +3.2 % Albumin | + | + | + | + | + | - |
| 0,06 % Dextran + 1,6 % Gelatine | + | + | + | + | - | - |
| 1,6 % Dextran +1,0% Propylenglycol | + | + | + | + | + | + |
| 2 % Dextran + 1% Trehalose | + | + | + | - | - | - |
Table 4: Fibrinogen-Aktivität (drei Schutzhilfsmittel)
| Schutzhilfsmittel / Mengen (basierend auf dem Plasma-Volumen; % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmitteln) | Eine Stunde | Ein Monat | Sechs Monate |
| Gerinnungs-Aktivität | Viskosität | Gerinnungs-Aktivität | Viskosität | Gerinnungs-Aktivität | Viskosität |
| - (Nur Plasma) | - | - | - | - | - | - |
| 4%Triglycerid+0,4% Glycerol+0,8 % Glycin | ++ | ++ | ++ | + | + | - |
| 1%Triglycerid+1,6% Glycerol+0,8 % Propylenglycol | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + |
| 0,4%Triglycerid+4% Glycerol+0,8 % Dextran | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + |
| 0,1%Triglycerid+4% Glycerol+ 2% Saccharose | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + |
| 0,04%Triglycerid+0,08% Glycerol+4% Albumin | ++ | ++ | + | + | + | + |
| 0,01%Triglycerid+4% Dextran+0,8% Albumin | ++ | ++ | + | + | + | + |
| 4 % Glutaminsäure +2 % Propylenglycol + 0,04 % Dextran | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 1 % Glutaminsäure +4 % Albumin+ 0,8% Dextran | ++ | ++ | + | + | + | + |
| 0,4 % Glutaminsäure +0,4% Albumin+ 4% Gelatine | ++ | ++ | + | + | + | + |
| 0,3% Trehalose + 4 % Alginat+ 0,8 % Dextran | ++ | ++ | + | + | + | - |
| 0,1% Glutaminsäure + 1% Trehalose + 4% Dextran | + | + | + | + | + | - |
| 3% Glutaminsäure + 1% Trehalose +3% Alginat | ++ | ++ | - | - | - | - |
Table 5: Fibrinogen-Aktivität (vier Schutzhilfsmittel)
| Schutzhilfsmittel / Mengen (basierend auf dem Plasma- | Eine Stunde | Ein Monat | Sechs Monate |
| Gerinnungs- | Viskosität | Gerinnungs- | Viskosität | Gerinnungs- | Viskosität |
| Volumen; % bezeichnet % (Vol./Vol.) für Triglycerid, Glycerol und Propylenglycol, und bezeichnet % (Gew./Vol.) für andere Schutzhilfsmitteln) | Aktivität | | Aktivität | | Aktivität | |
| - (Nur Plasma) | - | - | - | - | - | - |
| 4%Triglycerid+ 0,4 % Albumin + 0,4% Dextran + 4% Glycerol | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + |
| 0,4%Triglycerid + 4% Gelatine + 0,4% Alginat + 0,4% Glycin | ++ | ++ | ++ | + | - | - |
| 0,04%Triglycerid + 0,4% Albumin + 0,4% Polyethylene glycol + 1% Glucose | ++ | ++ | ++ | + | + | + |
| 0,04%Triglycerid + 4% Albumin + 0,4% Glycin + 1% Trehalose | ++ | ++ | + | + | + | - |
| 1 % Polyethylene glycol + 0,4% Gelatine +0,4%Glutaminsäure +1% Glucose | +++ | ++ | ++ | + | + | + |
| 0,01% Albumin +2% Dextran +0,4% Serin+ 2% Saccharose | ++ | ++ | + | + | + | - |
| 2%Gelatin+2% Alginat+0,4 % Glycin+ 1% Trehalose | ++ | ++ | + | - | - | - |
| 4%Albumin+ 0,4 % Polyethylene glycol +0,4 % Alanin+ 1% Trehalose | ++ | ++ | + | + | + | - |
| 0,4%Albumin+0,8 % Polyethylene glycol +4% Glycerol+0,4 % Glycin | +++ | +++ | +++ | ++ | + | + |
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Die Schutzhilfsmittel Triglycerid, Glycerol, Propylenglycol, Alanin, Serin, Glycin, Alginat, und Saccharose können bei alleiniger Verwendung in der Zubereitung des lyophilisierten Plasma-Pulvers die Fibrinogen-Aktivität für bis zu einem oder sechs Monate nicht aufrechterhalten. Die Fibrinogen-Aktivität kann jedoch für bis zu einem Monat oder sechs Monate erhalten werden, wenn diese Schutzhilfsmittel in Kombination verwendet werden.
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Beispiel 4: Überprüfung der Wachstumsfaktor-Menge
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20 mg Plasma-Pulver eine Stunde, einen Monat und sechs Monate nach Lyophilisierung, wurde in 1 ml Kochsalzlösung gelöst und gründlich vermischt. Die Proben wurden binnen 1 Stunde nach Wiederherstellung mittels im Handel erhältlicher Immunassays überprüft. Standards und Proben wurden im Triplikat überprüft, und mittlere Werte wurden berechnet. Die Ergebnisse wurden durch den bei den Proben angewendeten Verdünnnungsfaktor multipliziert.
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PDGF-AB, TGF-β1, und VEGF-Mengen wurden mittels des ELISA-Assays getestet.
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1, PDGF-AB: PDGF-AB Mengen wurden unter Verwendung von DueSet® ELISA Kits (#DY222, R&D Systems, Minneapolis, Minn.) bestimmt. Proben wurden 20mal in dem Reagent-Diluent verdünnt. Die Platten wurden für 2 Stunden inkubiert, gewaschen und mit Enzym-konjugierten Antikörpern gegen PDGF-AB für weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden unter Verwendung des Wasch-Puffers gewaschen, worauf die Substrat-Lösung für 20 Minuten bei Raumtemperatur zugesetzt wurde. Die Vertiefungen wurden vor Licht geschützt. Zu jeder Vertiefung wurde eine Stopp-Lösung zugesetzt, und die Absorption bei 450 nm wurde unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesers (Gen5, Biotek, VT, USA) bestimmt. Der Bereich The erfassbare Dosis-Bereich ware 15,6-1000 pg/ml.
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2, TGF-β1: TGF-β1 mengen wurden durch DueSet® ELISA Kits (#DY240, R&D Systems) bestimmt. Proben wurden in dem Reagenz-Diluenten 20-fach verdünnt. Eine Verdünnungsreihe von TGF-β1 Standards wurden in 100-µl Volumina in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die mit TGF-β-Rezeptor II beschichtet waren, erstellt. Vor Analyse von TGF-β1, wurde eine Säure-Aktivierung und Neutralisierung durchgeführt, um latentes TGF-β1 in die immunreaktive Form zu aktivieren. Zu diesem Zweck wurden 0,5 ml Proben mit 0,1 ml 1N HCl vermischt, bei Raumtemperatur für 10 Minuten inkubiert, durch Zugabe von 0,1 ml 1,2N NaOH/0,5M HEPES (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-N0-[2-ethanesulfonsäure]) von Sigma (H-7523) neutralisiert und zentrifugiert. Die Überstand-Fraktion wurde dann auf den Gesamt-TGF-β1 Gehalt überprüft. Aliquots (50 µl) wurden im Duplikat zu den Mikrotiterplatten gegeben, welche dann bedeckt und für 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert wurden. Die Vertiefungen wurden dann gewaschen, mit Enzym-konjugierter polyklonaler Antikörper gegen TGF-b1 wurde zugesetzt, und die Inkubation wurde für 2 Std. bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Bestimmungen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Der Erfassungsgrenzbereich von TGF-β1 war 31,20-2000 pg/ml.
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3. VEGF: VEGF-Mengen wurden unter Verwendung von DueSet® ELISA-Kits (#DY293B, R&D Systems, Minneapolis, Minn.) bestimmt. Die Proben wurden 2-fach in Reagenz-Diluent verdünnt. Der erfassbare Dosisbereich liegt gewöhnlich unter 31,2-2000 pg/ml. 100µl Assay-Reagenz-Diluent wurde zu jeder Vertiefung zugesetzt, gefolgt von 100 µl Standard (VEGF-Standard). Die Platten wurden Klebstreifen bedeckt und für 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Vertiefungen wurden 4 mal gewaschen und dann mit Enzym-konjugiertem VEGF für 2 Std bei Raumtemperatur inkubiert. Die Bestimmungen wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
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Alle Untersuchungen wurden dreimal wiederholt, und die Ergebnisse wurden mittels Einweg-ANOVA, F-Test und Duncan Test durch SPSS22 Software analysiert, und als Mittel ±SD ausgedrückt. Mittel in den gleichen Balkenstreifen der Lagerzeit mit unterschiedlichen Buchstaben sind signifikant unterschiedlich (P<0,05). Die Ergebnisse sind in den 1A-15C gezeigt.
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Es sollte dem Fachmann klar sein, dass Änderungen an den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne von dem breiten erfinderischen Konzept davon abzuweichen. Es ist daher klar, dass diese Erfindung nicht auf die bestimmten Ausführungsformen beschränkt sind, sondern dass beabsichtigt ist, Modifikationen im Geist und Bereich der vorliegenden Erfindung zu umfassen, wie sie in den anliegenden Ansprüchen definiert sind.
