CN110381962A - 用于血浆蛋白的活性保存的新颖方法 - Google Patents

用于血浆蛋白的活性保存的新颖方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于血浆蛋白的活性保存的方法。该方法包含步骤：将血浆与选自由三酸甘油酯、甘油、丙二醇、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖所组成的群组中的两种或更多种保护剂混合以获得混合物；以及将该混合物冻干。

Description

用于血浆蛋白的活性保存的新颖方法
技术领域
本发明涉及一种用于血浆蛋白的活性保存的方法。
背景技术
血浆是血液的淡黄色液体成分，通常将血球保持悬浮在全血中；此举使得血浆成为血球的细胞外基质。血浆主要是水，并含有溶解的蛋白质(例如血清白蛋白、球蛋白及纤维蛋白原)、葡萄糖、凝血因子、电解质、激素、维生素及二氧化碳。血浆在血管内渗透作用中扮演至关重要的角色，血管内渗透作用使电解质保持在平衡的形式并保护身体免于感染和其他血液病症。
血浆可以通过在离心机中旋转含有抗凝血剂的新鲜血液的(试)管直到血球落到管的底部的方式来制备。使用血浆作为全血的替代品和用于输血的目的在1918年被提出。供武装部队的干血浆包，因为其可减少破损并使输送、包装及储存更加简单而被开发出来。在韩战期间，血清白蛋白取代干血浆用于战斗的用途。
血浆提供各种功能，从保持适当的血压和体积到提供用于凝血和免疫的关键蛋白质。血浆还充当交换诸如钠和钾的重要矿物质的介质，并有助于在体内保持适当的pH(酸碱)平衡，此举对细胞功能是至关重要的。血浆(从血液捐赠制备的血液产物)被用于输血，通常在放血术(PF24)后24小时内作成新鲜冷冻血浆(FFP)或冷冻血浆。血浆在捐赠后(上至24小时)被迅速冷冻以保存凝血因子，储存时间上至一年，并在使用前不久解冻。目前，新鲜冷冻血浆通常与凝血酶一起使用于过量出血的情况下，或是使用于正进行侵入性程序的异常凝血试验的那些患者身上以防止出血。新鲜冷冻血浆通常被输注给创伤患者和肝衰竭、严重感染、严重烧伤、或多种凝血因子缺乏的患者。在过去几年中，新鲜冷冻血浆在医院实务中的使用增加了超过20％，而且有关新鲜冷冻血浆在临床使用的适当性引起了关注。
血浆储存的现有技术是在放血术之后24小时内将血浆快速冷冻，并可将其典型地作为新鲜冷冻血浆(FFP)储存达一年。FFP可以在使用前不久解冻。然而，此类储存方法至少具有以下缺点：(1)除非冷冻为FFP并储存在超低温冰箱中，否则血浆可能无法长期储存；以及(2)解冻后使用时，纤维蛋白原无法保持良好的活性。
发明内容
本发明提供一种用于血浆蛋白的活性保存的方法，包含将血浆与选自由三酸甘油酯、甘油、丙二醇、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖所组成的群组中的两种或更多种保护剂混合以获得混合物，以及将该混合物冻干。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含甘油为第一保护剂，以及选自由三酸甘油酯、丙氨酸及丝氨酸所组成的群组中的第二保护剂。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含丙二醇为第一保护剂，以及选自由三酸甘油酯、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖所组成的群组中的第二保护剂。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含甘油、三酸甘油酯、及丙二醇。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含甘油、三酸甘油酯、及蔗糖。
根据本发明，在混合步骤中可以将血浆进一步与选自由葡聚糖、白蛋白、及明胶所组成的群组中的保护剂混合。
应当理解的是，前文的一般性描述和以下的实施方式都只是例示性和说明性的，而不是对本发明的限制。
附图说明
当结合附图阅读时，将可更好地理解前述发明内容以及如后的本发明的详细描述。在附图中：
图1A-图1C显示自使用白蛋白作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图1A显示PDGF-AB的量，图1B显示TGF-β1的量，图1C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图2A-图2C显示自使用藻酸盐作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图2A显示PDGF-AB的量，图2B显示TGF-β1的量，图2C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图3A-图3C显示自使用葡聚糖作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图3A显示PDGF-AB的量，图3B显示TGF-β1的量，图3C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图4A-图4C显示自使用明胶作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图4A显示PDGF-AB的量，图4B显示TGF-β1的量，图4C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图5A-图5C显示自使用葡萄糖作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图5A显示PDGF-AB的量，图5B显示TGF-β1的量，图5C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图6A-图6C显示自使用谷氨酸作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图6A显示PDGF-AB的量，图6B显示TGF-β1的量，图6C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图7A-图7C显示自使用甘油作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图7A显示PDGF-AB的量，图7B显示TGF-β1的量，图7C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(v/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图8A-图8C显示自使用甘氨酸作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图8A显示PDGF-AB的量，图8B显示TGF-β1的量，图8C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图9A-图9C显示自使用丙二醇作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图9A显示PDGF-AB的量，图9B显示TGF-β1的量，图9C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(v/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图10A-图10C显示自使用蔗糖作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图10A显示PDGF-AB的量，图10B显示TGF-β1的量，图10C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图11A-图11C显示自使用海藻糖作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图11A显示PDGF-AB的量，图11B显示TGF-β1的量，图11C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(w/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图12A-图12C显示自使用三酸甘油酯作为保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图12A显示PDGF-AB的量，图12B显示TGF-β1的量，图12C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％表示(v/v)％。对照组：仅血浆。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图13A-图13C显示自使用两种(2)保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图13A显示PDGF-AB的量，图13B显示TGF-β1的量，图13C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％用于三酸甘油酯、甘油和丙二醇以(v/v)％表示，用于其他保护剂以(w/v)％表示。对照组：仅血浆。1：2％甘油+2％葡聚糖；2：0.1％三酸甘油酯+2％葡聚糖；3：0.16％甘油+3％白蛋白；4：0.1％三酸甘油酯+2％丙二醇；5：0.1％三酸甘油酯+2％甘油；6：0.8％甘氨酸+1.6％葡聚糖；7：1.6％甘氨酸+1.6％丙二醇；8：0.8％丙二醇+4％藻酸盐；9：0.4％丙二醇+2.4％白蛋白；10：1.6％葡聚糖+1.0％丙二醇；11：1％甘油+2％丙氨酸；12：0.6％甘油+1.2％丝氨酸；13：0.08％丙二醇+2％蔗糖；14：0.08％葡聚糖+3.2％白蛋白；以及15：0.8％甘氨酸+1％海藻糖。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图14A-图14C显示自使用三种(3)保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图14A显示PDGF-AB的量，图14B显示TGF-β1的量，图14C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％用于三酸甘油酯、甘油和丙二醇表示(v/v)％，用于其他保护剂表示(w/v)％。对照组：仅血浆。1：4％谷氨酸+0.4％丙二醇+0.04％葡聚糖；2：0.4％三酸甘油酯+4％甘油+0.8％葡聚糖；3：0.1％三酸甘油酯+4％甘油+0.3％蔗糖；4：1％三酸甘油酯+1.6％甘油+0.8％丙二醇；5：0.4％谷氨酸+0.4％白蛋白+4％明胶；6：1％谷氨酸+4％白蛋白+0.8％葡聚糖；7：0.01％三酸甘油酯+4％葡聚糖+0.8％白蛋白；8：0.04％三酸甘油酯+0.08％甘油+4％白蛋白；9：4％三酸甘油酯+0.4％甘油+0.8％甘氨酸；10：3％海藻糖+4％藻酸盐+0.8％葡聚糖；11：0.1％谷氨酸+1％海藻糖+4％葡聚糖；12：3％谷氨酸+3％海藻糖+3％藻酸盐。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
图15A-图15C显示自使用四种(4)保护剂的血浆粉末还原的血浆中的生长因子的量。图15A显示PDGF-AB的量，图15B显示TGF-β1的量，图15C显示VEGF的量。使用的保护剂量基于血浆的体积：％用于三酸甘油酯、甘油和丙二醇表示(v/v)％，用于其他保护剂表示(w/v)％。对照组：仅血浆。1：0.4％白蛋白+0.8％聚乙二醇+4％甘油+0.4％甘氨酸；2：1％聚乙二醇+0.4％明胶+0.4％谷氨酸+0.4％葡萄糖；3：4％三酸甘油酯+0.4％白蛋白+0.4％葡聚糖+0.4％甘油；4：0.04％三酸甘油酯+0.4％白蛋白+0.4％聚乙二醇+0.4％葡萄糖；5：0.01％白蛋白+2％葡聚糖+0.4％丝氨酸+4％蔗糖；6：0.04％三酸甘油酯+4％白蛋白+0.4％甘氨酸+0.4％海藻糖；7：4％白蛋白+0.4％聚乙二醇+0.4％丙氨酸+4％海藻糖；8：0.4％三酸甘油酯+4％明胶+0.4％藻酸盐+0.4％甘氨酸；9：2％明胶+2％藻酸盐+0.4％甘氨酸+0.4％海藻糖。以相同式样(在冻干后相同时间(1小时、1个月或6个月)后还原的血浆)但不同字母的条形显示的数据之间的差异是统计学上显著的(P<0.05)。
具体实施方式
本发明提供一种用于血浆蛋白的活性保存的方法，包含将血浆与选自由三酸甘油酯、甘油、丙二醇、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖所组成的群组中的两种或更多种保护剂混合以获得混合物、以及将该混合物冻干。
根据本发明，保护剂可被以以下的量添加：(1)基于血浆的体积0.01-10％(v/v)、优选0.05-2％(v/v)的三酸甘油酯；(2)基于血浆的体积0.01％-10％(v/v)、优选0.5-5％(v/v)的甘油；(3)基于血浆的体积0.01％-10％(v/v)、优选0.5-5％(v/v)的丙二醇；(4)基于血浆的体积0.01％-10％(w/v)、优选0.5-5％(w/v)的丙胺酸；(5)基于血浆的体积0.01％-10％(w/v)、优选0.05-5％(w/v)的丝胺酸；(6)基于血浆的体积0.01％-10％(w/v)、优选0.5-5％(w/v)的甘胺酸；(7)基于血浆的体积0.01％-10％(w/v)、优选0.5-10％(w/v)的藻酸盐；(8)基于血浆的体积0.01％-10％(w/v)、优选0.5％-5％(w/v)的蔗糖。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含第一保护剂甘油和选自由三酸甘油酯、丙氨酸及丝氨酸所组成的群组中的第二保护剂。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是甘油和三酸甘油酯。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是甘油和丙氨酸。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是甘油和丝氨酸。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含第一保护剂丙二醇和选自由三酸甘油酯、甘氨酸、藻酸盐及蔗糖所组成的群组中的第二保护剂。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是丙二醇和三酸甘油酯。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是丙二醇和甘氨酸。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是丙二醇和藻酸盐。在一些具体实施例中，该两种或更多种保护剂是丙二醇和蔗糖。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含甘油、三酸甘油酯及丙二醇。在一个具体实施例中，该两种或更多种保护剂是甘油、三酸甘油酯及丙二醇。例如，可以添加以下量的保护剂(基于血浆的体积)：约1％(v/v)的三酸甘油酯、约1.6％(v/v)的甘油、及约0.8％(v/v)的丙二醇。
在本发明的部分具体实施例中，该两种或更多种保护剂包含甘油、三酸甘油酯及蔗糖。在一个具体实施例中，该两种或更多种保护剂是甘油、三酸甘油酯及蔗糖。例如，可以添加以下剂量的保护剂(基于血浆的体积)：约0.1％(v/v)的三酸甘油酯、约4％(v/v)的甘油、及约2％(w/v)的蔗糖。
根据本发明，可以在混合步骤中将血浆与选自由葡聚糖、白蛋白及明胶所组成的群组中的保护剂进一步混合。
以下实施例进一步说明本发明，实施例的提供是为了说明而非以限制为目的。
实施例1：血浆分离
从志愿捐赠者收集全血必须由受过放血术/静脉穿刺训练的个人使用具有抗凝血剂(1ml抗凝血柠檬酸盐右旋糖(ACD)溶液配方/每10ml血液)的双联血袋系统(约50ml)(TerumoBCT，日本)进行。收集血液之后，通过将管反转数次来和缓地混合血液，以确保与抗凝血剂充分混合。为了将收集的血液充分混合到柠檬酸盐管中，建议将管反转3-4次，而ACD管应被反转8次。应将血液样品保持在温和条件下(20-24℃)，并在血液收集的4小时内离心。为了将血浆分离，在22℃下将血液样品以1200×g离心10分钟。若需要的话，可以计算离心机的RCF。离心之后，血浆层将是分离血液的上层，并且看起来是清澈的稻草黄色液体。
实施例2：血浆冻干粉末的制备
将适量的保护剂加到新鲜收集的血浆中并充分混合以获得混合物。然后将混合物冻干成粉末。
表1：使用的保护剂量
保护剂 量
三酸甘油酯 0.01％-10％(v/v)
甘油 0.01％-10％(v/v)
丙二醇 0.01％-10％(v/v)
丙氨酸 0.1％-5％(w/v)
丝氨酸 0.01％-10％(w/v)
甘氨酸 0.01％-10％(w/v)
藻酸盐 0.01％-10％(w/v)
实施例3：纤维蛋白原活性检查
将冻干后分别经过1小时、1个月及6个月的20mg血浆粉末溶解在1mL盐水中并充分混合。将还原的血浆与凝血酶溶液(35-45IU/mL)以1：1体积比混合。(1)凝血活性：通过观察凝血形成来检查纤维蛋白原活性，并评估为优异(+++)、良好(++)、中等(+)、或无活性(-)。(2)黏度：将添加凝血酶的血浆的黏度视为与纤维蛋白原活性正相关，并评估为优异(+++)、良好(++)、中等(+)、或无黏度(-)。将结果列于下表2-5中。
表2：纤维蛋白原活性(一种保护剂)
表3：纤维蛋白原活性(两种保护剂)
表4：纤维蛋白原活性(三种保护剂)
表5：纤维蛋白原活性(四种保护剂)
当单独使用保护剂三酸甘油酯、甘油、丙二醇、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖于制备血浆冻干粉末时，无法保存纤维蛋白原活性持续达一个月或六个月。然而，当这些保护剂组合使用时，可以将纤维蛋白原活性保存达一个月或六个月。
实施例4：生长因子的量的检验
将冻干后分别经过1小时、1个月及6个月的20mg血浆粉末溶解在1mL盐水中并充分混合。在重组后1小时内通过市售免疫分析以分析样品。以一式三份化验标准品和样品，并计算平均值。将结果乘以应用于样品的稀释因子。
通过ELISA分析量测PDGF-AB、TGF-β1、及VEGF的量。
1.PDGF-AB：使用ELISA套组(#DY222,R&D Systems,Minneapolis,Minn.)测定PDGF-AB的量。将样品在试剂稀释剂中稀释20倍。将盘(微量多孔盘)培养2小时、洗涤、并在室温下与酶结合的抗PDGF-AB抗体培养另外2小时。使用洗涤缓冲液洗涤孔，然后在室温下加入基质溶液20分钟。保护孔免于光线照射。将终止溶液加到每个孔中，并使用微孔盘读取机(Gen5,Biotek,VT,USA)测定在450nm处吸收。范围可检测剂量是15.6-1000pg/ml。
2.TGF-β1：通过ELISA套组(#DY240,R&D Systems)测定TGF-β1的量。将样品在试剂稀释剂中稀释20倍。在涂有TGF-β受体II的96孔微量盘中制备一个稀释系列的、体积100μl的TGF-β1标准品。在分析TGF-β1之前，进行酸活化和中和以将潜伏的TGF-β1活化成免疫反应的形式。为此目的，将0.5ml的样品与0.1ml的1N HCl混合、在室温下培育10分钟、通过添加0.1ml来自Sigma(H-7523)的1.2N NaOH/0.5M HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N0-[2-乙磺酸])而中和、并离心。然后测定上清液部分的总TGF-β1含量。将等分试样(50μl)一式两份施加于微量盘，然后将微量盘覆盖并在室温下培育2小时。接着将孔进行洗涤、加入针对TGF-b1的酶结合多株抗体、并在室温下继续培育2小时。如上所述完成测量。TGF-β1的范围检测限值为31.20-2000pg/ml。
3.VEGF：使用ELISA套组(#DY293B,R&D Systems,Minneapolis,Minn.)测定VEGF量。将样品在试剂稀释剂中稀释2倍。范围可检测剂量通常小于31.2-2000pg/ml。将100μl的试验试剂稀释剂加到每个孔中，然后加入100μl的标准品(VEGF标准品)。将盘用胶条覆盖并在室温下培育2小时。将孔洗涤4次，然后在室温下用结合酶的VEGF培育2小时。如上所述完成测量。
将所有测试都重复三次，并通过SPSS22软件以单向ANOVA、F检验、及Duncan检定分析结果，而且将结果表示为平均值±SD。相同储存时间条形条纹中具有不同字母的平均值是有显著差异的(P<0.05)。结果显示于图1A-图15C中。
本领域技术人员将理解的是，可以在不脱离本发明的广义概念之下对上述具体实施例进行改变。因此，应当理解的是，本发明并不限于所公开的特定具体实施例，而是意图包含权利要求书所界定的具本发明的精神和范围内的修改。

Claims (10)

1.一种用于血浆蛋白的活性保存的方法，包含：将血浆与选自由三酸甘油酯、甘油、丙二醇、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖所组成的群组中的两种或更多种保护剂混合以获得混合物；以及将该混合物冻干。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该两种或更多种保护剂包含甘油为第一保护剂，以及选自由三酸甘油酯、丙氨酸及丝氨酸所组成的群组中的第二保护剂。
3.根据权利要求1所述的方法，其中该两种或更多种保护剂包含丙二醇为第一保护剂，以及选自由三酸甘油酯、甘氨酸、藻酸盐、及蔗糖所组成的群组中的第二保护剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该两种或更多种保护剂包含甘油、三酸甘油酯、及丙二醇。
5.根据权利要求2所述的方法，其中该两种或更多种保护剂包含甘油、三酸甘油酯、及蔗糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在混合步骤中，将该血浆进一步与选自由葡聚糖、白蛋白、及明胶所组成的群组中的保护剂混合。
7.根据权利要求2所述的方法，其中在混合步骤中，将血浆进一步与选自由葡聚糖、白蛋白、及明胶所组成的群组中的保护剂混合。
8.根据权利要求3所述的方法，其中在混合步骤中，将该血浆进一步与选自由葡聚糖、白蛋白、及明胶所组成的群组中的保护剂混合。
9.根据权利要求4所述的方法，其中在混合步骤中，将该血浆进一步与选自由葡聚糖、白蛋白、及明胶所组成的群组中的保护剂混合。
10.根据权利要求5所述的方法，其中在混合步骤中，将该血浆进一步与选自由葡聚糖、白蛋白、及明胶所组成的群组中的保护剂混合。
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