DE112010001428T5

DE112010001428T5 - Flüssigkeitschromatograph, Flüssigkeitschromatographiesäule und Filter für dieFlüssigkeitschromatographiesäule

Info

Publication number: DE112010001428T5
Application number: DE112010001428T
Authority: DE
Inventors: Hiroyuki Tanai; Kiyotoshi Mori; Norimasa Minamoto; Masahito Ito; Kisaburo Deguchi
Original assignee: Hitachi High Technologies Corp; Hitachi High Tech Corp
Current assignee: Hitachi High Tech Corp
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2012-08-30
Anticipated expiration: 2030-03-11
Also published as: CN102326074A; US9110073B2; US20110303599A1; JPWO2010113392A1; JP5707317B2; WO2010113392A1; CN102326074B; DE112010001428B4

Abstract

In einem Flüssigkeitschromatographen wird die Disulfidadsorption an den Eisenatomen eines Filters für eine Säule vermieden, wodurch in einem Chromatogramm kein Maximalwert-Nachzieheffekt auftritt und die Proben-Wiedergewinnungsrate nicht herabgesetzt ist. Eine Flüssigkeitschromatographiesäule umfaßt dazu einen hohlen röhrenförmigen Säulenkörper, ein Füllmaterial in der Form von Kügelchen im hohlen Teil des Säulenkörpers, einen Filter mit einer Lochgröße, die kleiner ist als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials, und eine Abschlußkappe, die den Filter gegen das Füllmaterial drückt und das Füllmaterial im Säulenkörper einschließt, wobei die Hauptkomponente des Filters Nickel oder Hastelloy ist.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Flüssigkeitschromatograph, eine Flüssigkeitschromatographiesäule und einen Filter für die Flüssigkeitschromatographiesäule.
STAND DER TECHNIK
Bei der Flüssigkeitschromatographie wird zum Abtrennen der zu analysierenden Probe eine Trennsäule verwendet sowie eine Reaktionssäule zum Vermischen eines Reagens mit der Probe, um bei einer Aminosäureanalyse eine Reaktion hervorzurufen. Wenn das in der Säule befindliche Füllmaterial die Form von Kügelchen hat, sind an den beiden Enden der Säule Filter angebracht, die das Füllmaterial in der Säule einschließen. Die Lochgröße der Filter ist kleiner als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials, das die Form von Kügelchen hat.
Als Material für die Filter wird herkömmlich Edelstahl verwendet, der als Hauptkomponente Eisen (Fe) enthält sowie Chrom (Cr), Mangan (Mn), Nickel (Ni) und Molybdän (Mo). In Abhängigkeit von der Art des Edelstahls kann dieser außer Chrom (Cr), Mangan (Mn), Nickel (Ni) und Molybdän (Mo) noch Niob (Nb) und Aluminium (Al) enthalten. Der Edelstahl enthält etwa 10 bis 14% Nickel (Ni) und etwa 70% Eisen (Fe) als der Hauptkomponente.
Aminosäuren, Aminosäureanalogons und Proteine aus diesen Aminosäuren haben die Eigenschaft, sich an der Oberfläche von Edelstahlmaterialien anzulagern. Bei der Analyse von chemischen Stoffen wie Aminosäuren und Proteinen mittels einer Flüssigkeitschromatographievorrichtung, die in einem Durchflußkanal Edelstahl enthält, lagern sich die chemischen Stoffe an der Oberfläche des Durchflußkanals an, wovon das Analyseergebnis beeinflußt werden kann.
Insbesondere ist bekannt, daß Peptide und Proteine, die Cystin, eine Aminosäure, enthalten, eine starke Wechselwirkung mit Eisenionen zeigen. Nach der Nicht-Patent-Druckschrift 1 lagert sich besonders Disulfid mit zwei Schwefelatomen an den Eisenatomen einer metallischen Oberfläche an, wobei vorübergehend Eisenmercaptid entsteht. In der Folge bricht die C-S-Bindung schließlich auf, und die Oberfläche des Edelstahlmaterials ist mit Eisensulfid bedeckt. Dieses Phänomen wird Disulfidadsorptionsphänomen genannt.
Wenn der Filter einer Säule für die Flüssigkeitschromatographie aus einem Edelstahlmaterial besteht, lagert sich somit ein Cystin enthaltendes Peptid an der Oberfläche des Edelstahlmaterials an, so daß sich in einem Chromatogramm, dem Analyseergebnis, ein Nachzieheffekt ergibt, bei dem der Maximalwert langsam ausläuft.
Wenn die Adsorption des Peptids am Filter extrem ist, läßt sich nur mehr wenig von dem Peptid aus der Säule eluieren, so daß die Proben-Wiedergewinnungsrate herabgesetzt ist.
ZITIERLISTE
NICHT-PATENT-DRUCKSCHRIFT

Nicht-Patent-Druckschrift 1: E. S. Forbes et al.: ASLE Trans., 16 (1973) 50.

DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
TECHNISCHES PROBLEM
Aufgabe der Erfindung ist es, das Disulfidadsorptionsphänomen an den Eisenatomen der Filter für Flüssigkeitschromatographiesäulen zu vermeiden und dadurch zu verhindern, daß im Chromatogramm ein Maximalwert-Nachzieheffekt auftritt und die Proben-Wiedergewinnungsrate herabgesetzt ist.
LÖSUNG DES PROBLEMS
Zur Lösung des obigen Problems ist eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß eine Trennsäule oder eine Reaktionssäule eines Flüssigkeitschromatographen einen hohlen röhrenförmigen Säulenkörper, ein Füllmaterial in der Form von Kügelchen im hohlen Teil des Säulenkörpers, einen Filter mit einer Lochgröße, die kleiner ist als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials, und eine Abschlußkappe zum Drücken des Filters gegen das Füllmaterial und zum Einschließen des Füllmaterials im Säulenkörper umfaßt, wobei die Hauptkomponente des Filters Nickel oder Hastelloy ist.
VORTEILE DER ERFINDUNG
Mit der vorliegenden Erfindung ist es möglich, in einem Flüssigkeitschromatographen das Disulfidadsorptionsphänomen an den Eisenatomen einer Säule zu vermeiden und dadurch zu verhindern, daß Aminosäuren, Aminosäurenanalogons und Proteine aus den Aminosäuren in einem Durchflußkanal adsorbiert werden, so daß in einem Chromatogramm kein Maximalwert-Nachzieheffekt auftritt und die Proben-Wiedergewinnungsrate nicht herabgesetzt ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus eines Flüssigkeitschromatographen.
2 zeigt einen vertikalen Schnitt durch eine Trennsäule.
BESCHREIBUNG EINER AUSFÜHRUNGSFORM
Anhand der Zeichnungen wird eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erläutert.
AUSFÜHRUNGSFORM
(Aufbau der Vorrichtung)
Die 1 ist eine schematische Darstellung des Aufbaus eines Flüssigkeitschromatographen. Wenn ein Flüssigkeitschromatograph für die Analyse von Aminosäuren verwendet wird, wird er Aminosäure-Analysevorrichtung genannt. Linien, die einzelne Komponenten verbinden, stellen Durchflußkanäle wie Rohre und dergleichen dar. Ein Behälter 1 enthält eine erste Pufferlösung zum Transportieren der zu analysierenden Probe. In einem Behälter 2 wird eine zweite Pufferlösung aufbewahrt, in einem Behälter 3 eine dritte Pufferlösung und in einem Behälter 4 eine vierte Pufferlösung. Ein Behälter 5 enthält eine Säulenregenerationslösung zum Reinigen und Regenerieren einer Trennsäule. Eine nicht gezeigte Steuervorrichtung steuert das Öffnen und Schließen von elektromagnetischen Ventilen 6A, 6B, 6C, 6D und 6E derart, daß von einer Pufferlösungspumpe 7 eine bestimmte Pufferlösung einem Durchflußkanal zugeführt wird. Die Pufferlösung läuft durch ein Ammoniakfilter 8, das Ammoniak aus der Pufferlösung entfernt. Von einer automatischen Probenentnahmevorrichtung 9 wird die zu analysierende Probe in die Pufferlösung injiziert und zu einer Trennsäule 10 geführt. In der Trennsäule 10 wird die zu analysierende Probe, z. B. eine Aminosäure, abgetrennt und zu einem Mischer 13 geleitet. Von einer Ninhydrinreagenspumpe 12 wird ein Ninhydrinreagens aus einem Behälter 11 zum Mischer 13 geführt. Die abgetrennte Aminosäure und das Ninhydrinreagens werden im Mischer 13 vermischt und in einer Reaktionssäule 14 aufgeheizt, um miteinander zu reagieren. Ein Detektor 15 erfaßt das Ruhemanns-Purpur der Aminosäure, das sich durch die Reaktion entwickelt, und sendet die Daten zu einer Datenverarbeitungsvorrichtung 16. In der Datenverarbeitungsvorrichtung 16 wird ein Chromatogramm erstellt und auf einem Bildschirm dargestellt. Außerdem werden dort die Daten gespeichert.
(Filter der Trennsäule)
Die 2 zeigt einen vertikalen Schnitt durch die Trennsäule. Bei der Trennsäule 10 befindet sich in einem rohrförmigen Säulenkörper 17 ein Füllmaterial 18. Die beiden Endabschnitte des Säulenkörpers 17 werden von Säulenfiltern 19 verschlossen. Am Umfang des Säulenfilters 19 befindet sich eine Dichtung (Packung) 20, die ein Undichtwerden verhindert. Auf den Säulenkörper 17 ist eine Abdeckkappe 21 zum Beispiel aufgeschraubt, die den Säulenfilter 19 gegen das Füllmaterial 18 drückt und dieses dadurch einschließt. Tabelle 1

Korrosionsrate: < 0,127 mm/Jahr
O: Korrosionsrate: 0,127–1,27 mm/Jahr
X: Korrosionsrate: > 1,27 mm/Jahr
In der Tabelle 1 sind der Gehalt an Eisen und Nickel und die Korrosionsraten von Hastelloy, Edelstahl und Titan aufgelistet. Hinsichtlich der Korrosionsrate hat Hastelloy die niedrigste Korrosionsrate, wenn eine 30%-ige Salzsäurelösung kontinuierlich bei 24 Grad Celsius aufgesprüht wird. Hastelloy hat damit eine hervorragende Korrosionsfestigkeit. Bei der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird als Material für den Säulenfilter 19 eine Nickellegierung verwendet, insbesondere wird Hastelloy verwendet. Hinsichtlich der Spezifikationen für den Filterabschnitt des Säulenfilters 19 wird für den Filter unter Berücksichtigung des Teilchendurchmessers von drei Mikrometern des Ionenaustauschharzes, das das Füllmaterial ist, ein Filter mit einer nominalen Filtergenauigkeit von 0,5 Mikrometern verwendet. Der Säulenfilter 19 hat einen Außendurchmesser von 4,6 mm und eine Dicke von 1,6 mm.
Die Hauptkomponente von Hastelloy ist Nickel, wobei Hastelloy nur 1 bis 18 Gew.-% Eisen enthält, so daß das Disulfidadsorptionsphänomen kaum auftritt. Wenn die zu analysierende Probe eine Aminosäure ist, wird daher am Säulenfilter 19 das Disulfidmolekül Cystin, das eine Aminosäure ist, nicht adsorbiert, so daß im erhaltenen Chromatogramm kein Maximalwert-Nachzieheffekt auftritt. Auch bei Homocystin, Cystein-Homocysteindisulfid und dergleichen, die Disulfidmoleküle sind, tritt im Chromatogramm kein Maximalwert-Nachzieheffekt auf.
Wenn sich am Filterabschnitt des Säulenfilters 19 Peptide anlagern, blockieren diese den Durchfluß, so daß die Probe nur mehr zu einem kleinen Teil aus der Trennsäule 10 eluiert werden kann und keine Analyse mehr durchgeführt werden kann. Bei der vorliegenden Ausführungsform lagern sich am Säulenfilter 19 keine Aminosäurekomponenten an, so daß keine Verringerung der Aminosäuren-Proben-Wiedergewinnungsrate auftritt.
Experimente der Anmelderin haben gezeigt, daß die Wiedergewinnungsrate in dem Fall, daß Peptide und Proteine mit Disulfid-Aminosäuren als Molekülbausteinen die zu analysierende Probe darstellen, bei der Verwendung von Edelstahl für den Säulenfilter 50% und bei der Verwendung von Hastelloy für den Säulenfilter 100% beträgt.
Für den Säulenfilter 19 sind eine hohe Säurefestigkeit und Korrosionsfestigkeit erforderlich. Zum Beispiel werden bei einer biologischen Fluidanalyse mit einer 40-Komponenten-Aminosäure einige zehn Millimol/l Lithiumcitratpufferlösung mit einem Säuregrad von pH 2,8 als Pufferlösung abgegeben. Hastelloy ist ein säurefestes Material und kann für Probenlösungen mit einem Säuregrad bis zu pH 2 verwendet werden. Wie sich aus der obigen Tabelle 1 ergibt, hat Hastelloy im Vergleich mit Edelstahl und Titan eine sehr gute Korrosionsfestigkeit.
(Filter der Reaktionssäule)
In einer Aminosäure-Analysevorrichtung wird, nachdem die Aminosäurekomponente in der Trennsäule 10 abgetrennt wurde, die Aminosäurekomponente mit einem Ninhydrinreaktionsreagens vermischt und in der Reaktionssäule 14 auf 135 Grad Celsius aufgeheizt, wodurch Ruhemanns-Purpur erzeugt wird. Der Detektor 15 mißt die Absorption von sichtbarem Licht bei 570 Nanometern. Als Vorrichtung zum Ausführen des Mischens und der Farbentwicklungsreaktion wird in der Reaktionssäule 14 ein Säulenreaktor verwendet. Der Aufbau der Reaktionssäule 14 entspricht dem Aufbau der Trennsäule 10 der 2, wobei der Säulenkörper einen Innendurchmesser von drei bis sechs Milimetern und eine Länge von 40 bis 80 Millimeter hat. Darin befinden sich als Füllmaterial kugelförmige oder granulare Keramikkügelchen und dergleichen mit einem Teilchendurchmesser von etwa 100 Mikrometern, die gegenüber der chemischen Reaktion inert sind. Damit die Kügelchen in der Reaktionssäule 14 bleiben, sind an den beiden Endabschnitten davon Filter vorgesehen.
Die Aminosäuren, die die Trennsäule 10 durchlaufen haben, werden der Reaktionssäule 14 zugeführt. Wenn am Filter der Reaktionssäule 14 ein Disulfidadsorptionsphänomen auftritt, zeigt das Chromatogramm einen Maximalwert-Nachzieheffekt, und die Proben-Wiedergewinnungsrate ist herabgesetzt. Deshalb wird auch für die Filter der Reaktionssäule 14 Hastelloy verwendet. Zum Einschließen der kugelförmigen Partikel mit einem Teilchendurchmesser von 50 bis 100 Mikrometern wird für die Filterabschnitte 1 bis 30 Mikrometer ausgewählt. Der Außendurchmesser beträgt 3 bis 6 Millimeter und die Dicke 0,5 bis 2,5 Millimeter.
Das vom Mischer 13 der 1 der Reaktionssäule 14 zugeführte Ninhydrinreaktionsreagens umfaßt einige Mol/l an Lithiumcitratpufferlösung mit einem Säuregrad von etwa pH 6. Es könnte daher angenommen werden, daß die für die Reaktionssäule 14 verwendeten Filter nicht besonders säurefest zu sein brauchen. Wenn jedoch kein Ninhydrinreaktionsreagens abgegeben wird, während das Ninhydrinreaktionsreagens im Mischer 13 mit der Pufferlösung vermischt wird, werden bei einer Temperatur von etwa 135 Grad Celsius mehrere Millimol/l Lithiumcitratpufferlösung mit einem Säuregrad von pH 2,8 ausgegeben. Die Filter der Reaktionssäule 14 müssen daher auch säurefest sein.
Wenn bei 135 Grad Celsius ein Filter aus Edelstahl einer Pufferlösung mit einem Säuregrad von pH 2,8 ausgesetzt wird, kann bereits nach 24 Stunden eine Korrosion festgestellt werden. Wenn dagegen ein Filter aus Hastelloy unter den gleichen Bedingungen der Pufferlösung ausgesetzt wird, läßt sich keine Korrosion feststellen.
Da es mit der vorliegenden Erfindung möglich ist, in einem Flüssigkeitschromatograph das Disulfidadsorptionsphänomen an Eisenatomen in den Filtern der Säulen zu vermeiden und zu verhindern, daß sich Aminosäuren, Aminosäureanalogone und Proteine aus den Aminosäuren an den Durchflußkanälen anlagern, tritt im Chromatogramm kein Maximalwert-Nachzieheffekt auf, und die Proben-Wiedergewinnungsrate verringert sich nicht. Die Analysen zeigen ein stabileres Ergebnis, und die Genauigkeit und Wiederholbarkeit von quantitativen Analysen wird erhöht.
Bezugszeichenliste

1, 2, 3, 4, 5, 11: Behälter
6A, 6B, 6C, 6D, 6E: Elektromagnetisches Ventil
7: Pufferlösungspumpe
8: Ammoniakfilter
9: Automatische Probenentnahmevorrichtung
10: Trennsäule
12: Ninhydrinreagenspumpe
13: Mischer
14: Reaktionssäule
15: Detektor
16: Datenverarbeitungsvorrichtung
17: Säulenkörper
18: Füllmaterial
19: Säulenfilter
20: Dichtung
21: Abschlußkappe

Claims

Flüssigkeitschromatographiesäule mit einem hohlen röhrenförmigen Säulenkörper; einem Füllmaterial in der Form von Kügelchen im hohlen Teil des Säulenkörpers; einem Filter mit einer Lochgröße, die kleiner ist als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials; und mit einer Abschlußkappe, die den Filter gegen das Füllmaterial drückt und das Füllmaterial im Säulenkörper einschließt; wobei die Hauptkomponente des Filters Nickel ist.
Flüssigkeitschromatographiesäule nach Anspruch 1, wobei der Nickelgehalt des Filters 40% oder mehr beträgt und der Eisengehalt 20% oder weniger.
Flüssigkeitschromatographiesäule nach Anspruch 1, wobei der Filter aus Hastelloy besteht.
Filter für eine Flüssigkeitschromatographiesäule mit einer Lochgröße, die kleiner ist als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials in der Flüssigkeitschromatographiesäule, wobei die Hauptkomponente des Filters Nickel ist.
Filter für eine Flüssigkeitschromatographiesäule nach Anspruch 4, wobei der Nickelgehalt 40% oder mehr beträgt und der Eisengehalt 20% oder weniger.
Filter für eine Flüssigkeitschromatographiesäule nach Anspruch 4, wobei das Material dafür Hastelloy ist.
Flüssigkeitschromatograph, bei dem eine zu analysierende Probe mit einer Pufferlösung einer Trennsäule zugeführt wird und eine in der Trennsäule abgetrennte Komponente erfaßt wird, um ein Chromatogramm zu erstellen, wobei die Trennsäule einen Filter mit einer Lochgröße umfaßt, die kleiner ist als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials in der Trennsäule; und wobei die Hauptkomponente des Filters Nickel ist.
Flüssigkeitschromatograph nach Anspruch 7, wobei der Nickelgehalt des Filters 40% oder mehr beträgt und der Eisengehalt 20% oder weniger.
Flüssigkeitschromatograph nach Anspruch 7, wobei der Filter aus Hastelloy besteht.
Flüssigkeitschromatograph nach Anspruch 7, mit einer Reaktionssäule, in der eine Reaktionslösung mit der zu analysierenden Probe vermischt und durch Aufheizen mit der zu analysierenden Probe zur Reaktion gebracht wird, wobei die Reaktionssäule einen Filter für die Reaktionssäule mit einer Lochgröße umfaßt, die kleiner ist als der Teilchendurchmesser des Füllmaterials in der Reaktionssäule, wobei die Hauptkomponente des Filters für die Reaktionssäule Nickel ist.
Flüssigkeitschromatograph nach Anspruch 10, wobei der Nickelgehalt des Filters für die Reaktionssäule 40% oder mehr beträgt und der Eisengehalt davon 20% oder weniger.
Flüssigkeitschromatograph nach Anspruch 10, wobei der Filter für die Reaktionssäule aus Hastelloy besteht.