CN102326074B - 液体色谱仪、液体色谱仪用反应柱以及液体色谱仪用反应柱过滤器的应用 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于，在液体色谱仪中，通过避开柱过滤器中铁原子的二硫化物吸附现象，来防止液体色谱仪的拖尾峰现象，防止试样的回收率下降。为了解决该目的，其特征在于，具备：中空管状的柱本体、填充在柱本体中空部的微珠状填充剂、具有比填充剂粒径小的尺寸的网孔的过滤器以及将过滤器压向填充剂且将填充剂密封在所述柱本体内的盖，过滤器的主成分为镍或哈氏合金。

Description

液体色谱仪、液体色谱仪用反应柱以及液体色谱仪用反应柱过滤器的应用

技术领域

本发明涉及液体色谱仪、液体色谱仪用柱以及液体色谱仪用柱过滤器。

背景技术

在液体色谱仪中，使用用于使分析对象试样进行分离的分离柱或在氨基酸分析时使用与试剂进行混合且使其反应的反应柱。当填充在该柱中的填充剂形成为微珠状时，为了将填充剂密封在柱内，在柱两端设置过滤器。过滤器的网孔大小设定为比微珠状的填充剂的粒径小。

作为该过滤器的材料以往以来使用以铁Fe为主成分且含有铬Cr、锰Mn、镍Ni和钼Mo的不锈钢。根据该不锈钢的种类，有铬Cr、锰Mn、镍Ni之外，还含有铌Nb、铝Al的情况。不锈钢的主要成分含有镍Ni从10到14％左右，含有主成分的铁Fe为70％左右。

氨基酸、氨基酸类似物质和由这些氨基酸构成的蛋白质具有在不锈钢原材料表面吸附的性质。因此，在流路中使用不锈钢原材料的液体色谱仪装置中，分析氨基酸或蛋白质等化学物质时，在流路的表面吸附这些物质，有坏影响波及到分析结果的可能性。

特别是，含有作为氨基酸一种的胱氨酸的肽或蛋白质已知与铁离子显示强的相互作用。据非专利文献1的报道，具有2个硫原子的二硫化物会特异性地吸附在金属表面的铁原子上，一度形成铁硫醇盐。最终，C-S键被切断而成为在硫化铁的状态下覆盖不锈钢原材料的表面。该现象被称为二硫化物吸附现象。

当在液体色谱仪的柱中所使用的过滤器为不锈钢原材料时，含有胱氨酸的肽吸附于不锈钢原材料的表面，有引起由作为分析结果的色谱仪所得到的峰后沿变宽这样的拖尾峰现象的可能性。

进一步，当向过滤器吸附的肽非常极端时，产生大部分不从柱上溶出，从而试样的回收率降低这样的问题。

非专利文献1：E.S.Forbes，etal：ASLETrans.，16(1973)50

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于，在液体色谱仪中，通过避开柱过滤器中铁原子的二硫化物吸附现象，来防止液体色谱仪的拖尾峰现象，防止试样的回收率下降。

解决问题的手段

为了解决上述课题，本发明的实施方式其特征在于，液体色谱仪的分离柱或反应柱具备：中空管状的柱本体、填充在柱本体中空部的微珠状填充剂、具有比填充剂粒径小的尺寸的网孔的过滤器、以及将过滤器压向填充剂且将填充剂密封在所述柱本体内的盖，过滤器的主成分为镍或哈氏合金。

发明效果

由本发明，在液体色谱仪中，避开了柱中铁原子的二硫化物吸附现象，可以防止在流路中吸附氨基酸、氨基酸类似物质和由这些氨基酸构成的蛋白质，防止液体色谱仪的拖尾峰现象，能够防止试样的回收率下降。

附图说明

图1为显示液体色谱仪的简要构成的构成图。

图2为显示分离柱构成的纵截面图。

具体实施方式

以下，参照附图说明本发明的实施例。

实施例

装置的概要

图1为显示液体色谱仪的简要构成的构成图。一般在氨基酸分析中使用液体色谱仪的情况被称为氨基酸分析仪。连接各构成仪器的线段表示配管等流路。运输分析对象试样的第1缓冲液保管在容器1中，第2缓冲液保管在容器2中，第3缓冲液保管在容器3中，第4缓冲液保管在容器4中。另外，用于洗净分离柱且进行再生的柱再生液保管在容器5中。通过未图示的控制装置来控制电磁阀6A、6B、6C、6D、6E的开关，通过缓冲液泵7将被选择的缓冲液送液至流路。缓冲液通过除去缓冲液中的氨的氨过滤器8，由自动取样器9注入分析对象试样，到达分离柱10。在分离柱10中，分离分析对象试样例如氨基酸，然后送至搅拌器13中。而另一方面，茚三酮试剂被保管在容器11中，通过茚三酮试剂泵12，将茚三酮试剂送至搅拌器13。通过搅拌器13将分离的氨基酸和茚三酮试剂进行混合，通过反应柱14而被加热，两者进行反应，然后通过检出器15检出由反应而显色的氨基酸的罗曼紫色(Ruhemannn′spurple)，将数据送至数据处理装置16中。在数据处理装置16中，制作色谱图，进行画面显示和数据的保存。

分离柱的过滤器

图2为显示分离柱构成的纵截面图。分离柱10为将填充剂18填充在管状的柱本体17的内部且用柱过滤器19来密封两端部的结构。另外，通过用填料20压住柱过滤器19的周围来防止漏出，并且将装配盖21拧紧在柱本体17上等，从而构成为柱过滤器19压向填充剂18而进行密封。

表1

	Fe重量％	Ni重量％	30％盐酸(24℃)
				哈氏合金	1～18	43～71	◎
SUS316	68	12	×
				钛	≒0	≒0	○

◎腐蚀速度＜0.127mm/年

○腐蚀速度0.127～1.27mm/年

×腐蚀速度＞1.27mm/年

表1为显示在哈氏合金、不锈钢和钛中的铁和镍的含量和耐蚀性的一览表。对于耐腐蚀性，在摄氏24度的环境下、连续加入30％盐酸水溶液进行喷撒时，腐蚀速度由于哈氏合金最慢，因此可知哈氏合金在耐蚀性上优异。在本发明的实施例中，作为该柱过滤器19的原材料采用镍系合金，特别是使用哈氏合金。柱过滤器19的过滤器部分的规格，相对于作为填充剂的离子交换树脂的粒径3微米，使用标称0.5微米的过滤精度的过滤器。另外，柱过滤器19的外径为4.6毫米，厚度为1.6毫米。

哈氏合金由于主成分为镍，铁只为1到18重量％，因此几乎不会引起二硫化物吸附现象。由此，当将氨基酸作为分析对象试样时，由于避开了作为氨基酸一种的二硫化物系分子胱氨酸的对柱过滤器19的吸附，因此，可以抑制所得到的光谱图的拖尾峰现象。同样地，作为二硫化物系分子的同型胱氨酸、半胱氨酸·同型半胱氨酸·二硫化物等也可以抑制光谱图的拖尾峰现象。

进一步，如果在柱过滤器19的过滤部分吸附有肽，那么就会堵塞流动，可能会不溶出来自分离柱10的试样的大部分，因此，变得不能分析。根据本实施例，由于氨基酸成分不吸附于柱过滤器19上，因此，可以防止氨基酸试样的回收率的下降。

对于将在构成分子中具有二硫化物系氨基酸的肽或蛋白质作为分析对象试样时的回收率，根据发明者的实验，在柱过滤器中使用不锈钢时为50％，使用哈氏合金时为100％。

另外，对于柱过滤器19也要求耐酸性和耐腐蚀性。例如，在40成分氨基酸生物体液分析法时，作为缓冲液将酸度pH为2.8的数十毫摩尔/L的柠檬酸锂系缓冲液进行送液。哈氏合金为耐酸性金属，试样液体的酸度可以在pH到2的范围内使用。另外，如前面的表1可知，相比于不锈钢或钛，其耐蚀性优异。

反应柱的过滤器

在氨基酸分析仪中，在由分离柱10分离氨基酸成分后，与茚三酮反应试剂进行混合，由于通过由反应柱14加温至摄氏135度，生成罗曼紫色，因此通过检出器15检出可见光570纳米的吸光度。作为进行从该混合到显色反应的装置，在反应柱14上使用柱状反应器。反应柱14的结构与图2所示的分离柱10相同，柱本体的内径为3到6毫米，长为40到80毫米。在其内部作为填充剂填充有以粒径为100微米左右的化学反应上非活性的球形或破碎型陶瓷系微珠等。为了防止从反应柱14流出该微珠，在两端部设置过滤器。

在反应柱14中虽然运送有通过分离柱10的氨基酸，但是如果在反应柱14的过滤器中产生二硫化物吸附现象，那么就会引起光谱图的拖尾峰现象或试样的回收率下降。因此，对于反应柱14的过滤器也使用哈氏合金。为了密封粒径为50到100微米的微珠粒子，过滤器部分选择1到30微米。外径为3到6毫米，厚度为0.5到2.5毫米。

从图1所示的搅拌器13向反应柱输送的茚三酮反应试剂，由于在数摩尔/L的醋酸锂系缓冲液中酸度为pH6左右，因此，对于反应柱14中使用的过滤器没有必要考虑耐酸性。但是，在搅拌器13中将茚三酮反应试剂混合到缓冲液时，万一没有运送茚三酮反应试剂时，由于在摄氏135度左右的高温下，酸度为pH2.8的数十摩尔/L的柠檬酸锂系缓冲液被运送，因此反应柱14的过滤器也需要具备耐酸性。

在不锈钢制的过滤器中，在摄氏135度的环境下、运送酸度pH为2.8的缓冲液时，通过经过24小时后的观察确认出腐蚀。而相对于此，对于哈氏合金制的过滤器即使以相同的条件运送缓冲液，也完全没有确认出腐蚀。

由以上的叙述，根据本发明，在液体色谱仪中，由于避开了柱的过滤器中铁原子的二硫化物吸附现象，防止在流路中吸附氨基酸、氨基酸类似物质和由这些氨基酸构成的蛋白质，从而防止色谱图的拖尾峰现象，能够防止试样的回收率下降。通过每次分析，可以得到稳定的结果，提高了定量分析的准确性和再现性。

符号说明

1、2、3、4、5、11容器

6A、6B、6C、6D、6E电磁阀

7缓冲泵

8氨过滤器

9自动取样器

10分离柱

12茚三酮试剂泵

13搅拌器

14反应柱

15检出器

16数据处理装置

17柱本体

18填充剂

19柱过滤器

20填料

21装配盖

Claims (4)

1.一种液体色谱仪用反应柱在对液体试样中含有胱氨酸、半胱氨酸、同型胱氨酸、同型半胱氨酸中的至少一种的试样成分进行分析中的应用，所述液体色谱仪具备：

将缓冲液送液的第1泵，

向由所述第1泵送液的缓冲液的流路中注入所述液体试样的试样自动取样器，

从注入了所述试样的缓冲液分离试样的分离柱，

配置于所述分离柱的下游侧并对由所述分离柱分离的试样送出反应试剂的第2泵，

配置于由所述分离柱分离的试样和由所述第2泵送出的反应试剂的合流部的下游侧，通过使所述试样和由所述第2泵送出的反应试剂加热反应来对所述试样进行反应的反应柱，和

将由所述反应柱进行反应的试样进行检出的检出器；

其特征在于，所述反应柱具备：

中空管状的柱本体、

填充在该柱本体中空部的微珠状填充剂、

具有比该填充剂粒径小的尺寸的网孔的过滤器、和

将该过滤器压向所述填充剂且将所述填充剂密封在所述柱本体内的盖，

所述过滤器的材质为哈氏合金。

2.一种液体色谱仪用反应柱的过滤器在对液体试样中含有胱氨酸、半胱氨酸、同型胱氨酸、同型半胱氨酸中的至少一种的试样成分进行分析中的应用，所述液体色谱仪具备：

将缓冲液送液的第1泵，

向由所述第1泵送液的缓冲液的流路中注入所述液体试样的试样自动取样器，

从注入了所述试样的缓冲液分离试样的分离柱，

配置于所述分离柱的下游侧并对由所述分离柱分离的试样送出反应试剂的第2泵，

配置于由所述分离柱分离的试样和由所述第2泵送出的反应试剂的合流部的下游侧，通过使所述试样和由所述第2泵送出的反应试剂加热反应来对所述试样进行反应的反应柱，和

将由所述反应柱进行反应的试样进行检出的检出器；

其特征在于，所述过滤器具有比填充在所述液体色谱仪用反应柱中的填充剂粒径小的网孔，且材质为哈氏合金。

3.一种液体色谱仪在对液体试样中含有胱氨酸、半胱氨酸、同型胱氨酸、同型半胱氨酸中的至少一种的试样成分进行分析的应用，所述液体色谱仪具有：

将缓冲液送液的第1泵，

向由所述第1泵送液的缓冲液的流路中注入所述液体试样的试样自动取样器，

从注入了所述试样的缓冲液分离试样的分离柱，

配置于所述分离柱的下游侧并对由所述分离柱分离的试样送出反应试剂的第2泵，

配置于由所述分离柱分离的试样和由所述第2泵送出的反应试剂的合流部的下游侧，通过使所述试样和由所述第2泵送出的反应试剂加热反应来对所述试样进行反应的反应柱，和

将由所述反应柱进行反应的试样进行检出的检出器；

其特征在于，所述反应柱具备：

中空管状的柱本体、

填充在该柱本体中空部的微珠状填充剂、

具有比该填充剂粒径小的尺寸的网孔的过滤器、

将该过滤器压向所述填充剂且将所述填充剂密封在所述柱本体内的盖，

所述过滤器的材质为哈氏合金。

4.根据权利要求3所述的应用，其中，由所述第2泵送出的反应试剂是含有茚三酮的试剂。