DE112004002032T5 - Concentricolid und seine Derivate, Verfahren zum Herstellen pharmazeutischer Zusammensetzungen umfassend deren Verwendung - Google Patents

Abstract

Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und ihrer Derivate,

wobei
R1 C₁-C₄-Alkyl darstellt;
R2 H, Halogen, -OH, NRR' oder -NO₂ darstellt, wobei R und R' H oder C₁-C₆- Alkyl darstellen;
R3 H, Halogen, -OH, NRR' oder -NO₂ darstellt, wobei R und R' H oder C₁-C₆- Alkyl darstellen;
R4 H, Halogen oder -NO₂ darstellt.

Description

• GEBIET DER ERFINDUNG
• Die Erfindung betrifft Concentricolid und seine Derivate, ein Verfahren zum Herstellen der Verbindung und seiner Derivate, eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend Concentricolid und seine Derivate sowie die Verwendung der Verbindung und seiner Derivate zur Behandlung und Prävention von Infektionen, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wurden.
• STAND DER TECHNIK
• Schlauchpilze der Gattung Daldinia und andere Xylariaceae sind reich an einzigartigen sekundären Metaboliten. Europäische und amerikanische Daldinia sp. wurden jeweils von Allport und Bu'Lock (D.C. Allport, J.D. Bulock J. Chem. Soc., 1958, 4090; D.C. Allport, J.D. Bulock, J. Chem. Soc., 1960, 654.) und Anke et al., (H. Anke, M. Stadler, A. Mayer, O. Sterner, Can. J. Bot., 1995, 73, 802) untersucht, wobei dies zur Ermittlung charakteristischer Metaboliten in deren Stromata und Kulturen führte. Vor kurzem wurden zwei japanische Daldinia sp. intensiv von Hashimoto und Asakawa untersucht (M. Stadler, H. Wollweber, A. Muhlbauer, T. Henkel, Y. Asakawa, T. Hashimoto, Y.M. Ju, J.D. Rogers, H.G. Wetzstein, H.W. Tichy, Mycotaxon 2001, 77, 379; M.S. Buchanan, T. Hashimoto, S. Takaoka, et al., Phytochemistrv 1996, 42, 173; D.N. Quang, T. Hashimoto, M. Tanaka. M. Baumgartner, M. Stadler, Y. Asakawa. Phytochemistry 2002, 61, 345; M.
• Buchanan, T. Hashimoto und Y. Asakawa, Phytochemistry 1995, 40, 135; M.S. Buchanan, T. Hashimoto und Y. Asakawa, Phytochemistry 1996, 41, 821.5-9). Mehr als 20 neue Metaboliten wurden entdeckt, wobei einige dieser Verbindungen eine große Bandbreite an biologischen Aktivitäten umfassend antimikrobielle und nematizide Aktivitäten aufweisen.
• KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
• Der Erfinder hat eine neuartige Verbindung mit Benzonfuranlakton als Hauptkette der Chinesischen Daldinia concentrica entdeckt, die in Lijiang in Yunnan gesammelt wird, deren Verbindung als Concentricolid A bezeichnet wird.
• Das Concentricolid weist eine gute biologische Antifusionsaktivität auf. Es kann das Eindringen von HIV in normale Zellen verhindern, die Reproduktion von HIV hemmen sowie die Zerstörung des menschlichen Immunsystems hinauszögern. Dementsprechend lässt sich das Concentricolid zur Prävention und/Behandlung von HIV-Infektionen verwenden.
• Die Erfindung betrifft in erste Linie Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder Verfahren davon.
• 
• In denen
  R1 C1-C4-Alkyl darstellt;
  R2 H, Halogen, -OH, NRR' oder No2 darstellt, wobei R und R' H oder C1-C6-Alkyl darstellen;
  R3 H darstellt, Halogen, -OH, NRR' oder -No2, darstellen, wobei R und R' H oder C1-C6-Alkyl darstellen;
  R4 H darstellt, Halogen oder -NO2 darstellt.
• Die Erfindung betrifft unter einem anderen Gesichtspunkt eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend als aktive Substanzen die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder Derivate hiervon und pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe oder Transportsubstanzen.
• Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Herstellen der Verbindungen aus der allgemeinen Formel (I) oder seine Derivate umfassend:
• a) Das Extrahieren des Fruchtkörpers von Daldinia concentrica aus Yunnan oder seiner fermentierten Flüssigkeit mit einem organischen Lösungsmittel;
• b) Das Trennen des Extrakts durch Säulenchromatographie mit Kieselgel, um die Verbindung der Formel (II) zu erhalten.
  
• c) Das Unterziehen der Verbindung der Formel (II) einem Bromieren, Nitrieren oder Alkylieren, um die Verbindung der Formel (I) zu erhalten.
• Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der Verbindungen der Formel (I) zum Herstellen eines Medikaments zur Behandlung/Prävention der gesundheitlichen Zustände oder Krankheiten im Zusammenhang mit HIV-Infektionen.
• Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Prävention/Behandlung der gesundheitlichen Zustände oder Krankheiten im Zusammenhang mit HIV-Infektionen umfassend die Verabreichung der Verbindung der Formel (I) oder seiner Derivate an einen Patienten, der mit HIV infiziert ist.
• Die Erfindung betrifft ferner einen Extrakt Dalidinia concentrica aus Yunnan, der dadurch gekennzeichnet ist, dass der Extrakt eine Verbindung der Formel (II) enthält.
• 
• Die Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung umfassend wirksame Substanzen, einen Extrakt von Daldinia concentrica sowie pharmazeutisch akzeptable Trägerstoffe oder Transportsubstanzen, in denen der Extrakt von Daldinia concentrica Concentricolid der Formel (II) enthält.
• Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung des Extrakts von Daldinia concentrica zum Herstellen eines Produkts für die Prävention/Behandlung von gesundheitlichen Zuständen oder Krankheiten im Zusammenhang mit HIV-Infektionen.
• Erfindungsgemäß erfolgt die Auswahl der Verbindung der Formel (I) oder seiner Derivate vorzugsweise aus Verbindungen, die durch die nachstehenden Formeln dargestellt sind:

  

  vorzugsweise aus der Verbindung der Formel (II).
• Erfindungsgemäß umfasst die Verbindung der Formel (I) oder ihrer Derivate optische Stereoisomere davon, vorzugsweise ein Stereoisomer, das durch Formel (II) dargestellt ist.
• Erfindungsgemäß bezeichnet der Terminus „Derivate einer Verbindung von Formel (I)" pharmazeutisch akzeptable Salze, Stereoisomere, Hydrate oder Solvate der Verbindung der Formel (I).
• Erfindungsgemäß bilden die erfindungsgemäßen Verbindungen Salze mit einer Vielzahl organischer oder anorganischer Säuren umfassend physiologisch akzeptabler Salze, die in der Pharmaindustrie allgemein verwendet werden. Die Erfindung umfasst auch solche Salze. Beispiele typischer anorganischer Säuren, zur Bildung solcher Salze umfassen Salzsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Ähnliches. Beispiele typischer organischer Säuren umfassen: mono- und bialiphatische Säuren, Phenyl-substituierte Alkansäuren, Hydroxyalkansäuren und Hydroxyalkandisäuren, aromatische Säuren, aliphatische und aromatische Sulfonsäuren usw. Die pharmazeutisch akzeptablen Salze umfassen Azetate, Phenylazetate, Trifluorazetate, Acrylate, Ascorbate, Benzoate, Chlorbenzoate, Dinitritobenzoate, Hydroxybenzoate, Methoxybenzoate, Methylbenzoate, O-Acetoxybenzoate, Naphthalin-2-Benzoate, Bromide, Isobutyrate, Phenylbutyrate, β-Hydroxybutyrate, Butyn-1,4-Dioate, Hexyn-1,4-Dioate, Decanoate, Octanoate, Chloride, Cinnamate, Citrate, Formiate, Fumarate, Glycolate, Heptanoate, Hippurate, Lactate, Malate, Maleate, Hydroxymaleate, Malonate, Mandelate, Mesylate, Nicotinate, Isonicotinate, Nitrate, Oxalate, Phthalate, Teraphthalate, Phosphate, Monohydrogenphosphate, Dihydrogenphosphate, Metaphosphate, Pyrophosphate, Propiolate, Propionate, Phenylpropionate, Salicylate, Sebacate, Succinate, Suberate, Sulfate, Bisulfate, Pyrosulfate, Sulfite, Bisulfite, Sulfonate, Benzensulfonate, p-Bromophenylsulfonate, Chlorobenzensulfonate, Ethansulfonate, 2-Hydroxyethansulfonate, Methansulfonate, Naphthalen-1-Sulfonate, Naphthalen-2-Sulfonate, p-Toluensulfonate, Xylensulfonate, Tartarate und Ahnliches. Das bevorzugte Salz ist Hydrochlorid.
• Erfindungsgemäß wird die Verbindung der Formel (II) aus Pilzmaterial von Daldinia sp. hergestellt. Das zerkleinerte Pilzmaterial von Daldinia sp. wird mit einem organischen Lösungsmittel (z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform, Diethylether, t-Butylmethylether, Tetrahydrofuran, Acetonitril) extrahiert, der Extrakt wird auf einem festen Träger konzentriert und absorbiert. Der feste Träger umfasst geschliffene Naturerze (z.B. Kaolin, Ton, Talk, Kreide, Quarz, Montmorillonit) sowie geschliffene Kunststoffe (z.B. Kieselsäure, Tonerde, Silicate) oder Absorberharze (z.B. Phenol-Formaldehydharze oder Polyamidharze). Der absorbierte Extrakt wird einer Gradientenelution mit gemischten Lösungsmitteln steigender Polariät unterzogen, die Elution wird auf einer Kieselgelsäule konzentriert und weiter gereinigt.
• Alternativ wird die Verbindung der Formel (II) durch Extraktion der fermentierten Flüssigkulturen von Daldinia concentrica mit einem organischen Lösungsmittel (beispielsweise Ethylacetat, Diethylether, Chloroform, Methylenchlorid, Butanol) hergestellt, wobei das Extrakt auf einem festen Träger konzentriert wird, umfassend geschliffene Naturerze (z.B. Kaolin, Ton, Talk, Kreide, Quarz, Montmorillonit) sowie geschliffene Kunststoffe (z.B. Kieselsäure, Tonerde, Silicate) oder Absorberharze (z.B. Phenol-Formaldehydharze oder Polyamidharze), wobei der absorbierte Extrakt einer Gradientenelution zur Konzentration des Elutionsmittels und zur Reinigung auf einer Kieselgelsäule unterzogen wird.
• Erfindungsgemäß eignen sich die Verbindungen der Formel (I) oder (II) zur Behandlung des erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS), das durch Infektion mit dem menschlichen Immunschwächevirus (HIV) verursacht wird. Die Verbindungen lassen sich direkt aus den Pilzen isolieren oder durch Vollsynthese oder Halbsynthese erzielen. Alle erfindungsgemäßen Verbindungen werden separat oder in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen benutzt, wenn diese zur Behandlung der Infektion verwendet werden, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wird. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Extrakten von Dalidinia sp. zur Behandlung der Infektion, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wird. Die Extakte umfassen die Verbindung der Formel (II) und lassen sich kombiniert mit anderen Verbindungen oder Formulierungen verwenden, die sich zur Behandlung der Infektion eignen, die durch HIV verursacht wird.
• Darüber hinaus lassen sich die Extrakte von Daldinia sp. durch herkömmliche Extraktionsschritte unter Verwendung der oben aufgeführten organischen Lösungsmittel erzielen. Es können Extrakte verschiedener Reinheitsgrade verwendet werden. Der Gehalt der Verbindung der Formel (II) im Extrakt liegt im Bereich von 0,01 bis 2 Masseprozent, vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1 Masseprozent.
• Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Pilzen der Gattung Daldinia sp. zur Behandlung der Infektion, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wird. Die Pilze liegen vorzugsweise in Form von zerkleinerten Fruchtkörpern oder -stromata und -kulturen vor. Die zerkleinerten Pilze lassen sich zusammen mit anderen Verbindungen oder Formulierungen zur Behandlung der Infektion verwenden, die durch HIV verursacht wird.
• Eine oder mehrere Verbindungen der Formel (I) oder (II) werden zusammen mit Transportsubstanzen, Verdünnungsmitteln oder Trägern zu Tabletten oder anderen Dosierungen zur oralen Verabreichung komprimiert oder als pharmazeutische Dosierung zur intramuskulären oder intravenösen Injektion oder als Präparat- Dosierung und Ähnliches erstellt.
• Pharmazeutische Formulierungen werden durch Verfahren hergestellt, die im Fachgebiet bekannt sind. Insbesondere können die Verbindungen erfindungsgemäß mit herkömmlichen Transportsubstanzen, Lösungsmitteln oder Trägern formuliert und in Tabletten-, Kapsel-, Suspensions-, Puderform u. ä. gebracht werden.
• Beispiele für Transportsubstanzen, Lösungsmittel und Träger umfassen Füllstoffe und Streckmittel (wie beispielsweise Stärke, Zucker, Mannitol und Siliziumderivate), Bindemittel (wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, andere Cellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon), Feuchtmittel (wie beispielsweise Glycerol), langsame Trennmittel (wie beispielsweise Paraffin), Resorptionsbeschleuniger (wie beispielsweise quaternäre Ammoniumsalze, Tenside (wie beispielsweise Cetylalkohol, Glycerolmonostearat), adsorptive Träger (wie beispielsweise Kaolin und Bentonit) und Schmiermittel (wie beispielsweise Talk, Kalziumstearat, Magnesiumstearat und feste Polyethylglycole).
• Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich als nicht-orale Dosierungen, wie beispielsweise Dosierungen zur intramuskulären, subkutanen oder intravenösen Injektion, oder als Depot-Dosierung und Ähnliches formulieren. Die Formulierungen können so ausgestaltet sein, dass der aktive Wirkstoff in einem bestimmten Teil des Verdauungstrakts über einen Zeitraum freigesetzt wird. Die Beschichtungen, Ummantelungen und Schutzmatrizen können dabei aus Polymerwerkstoffen oder Wachsen bestehen.
• Die bestimmte Dosierung der Verbindung von Formel (I) oder (II) zur Behandlung der Infektion, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wird, hängt von vielen Faktoren ab, wie beispielsweise dem Schweregrad der Erkrankungen, dem Körpergewicht, dem Alter, dem Geschlecht, dem Verabreichungsweg sowie der spezifischen Diagnose des Klinikarztes. In der Regel liegen die üblichen und wirksamen Tagesdosen zwischen 0,1 und 1000 mg/Person/Tag, vorzugsweise zwischen 50 und 200 mg/Person/Tag. Solche Dosierungen werden ein- bis dreimal pro Tag verabreicht.
• BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
• 1 Die Zytotoxität von Concentricolid A oder II bei C8166-Zellen (CC₅₀ entspricht 76,66 μg/ml);
• 2 Die Zytotoxität von AZT bei C8166-Zellen (CC₅₀ entspricht 258,88 μg/ml);
• 3 Das Blockieren von Concentricolid A oder II bei Bindung und Fusion zwischen HIV-1 und Zellen (EC₅₀ entspricht 0,83 μg/ml);
• 4 Das Blockieren von T20 bei Fusion von HIV-infizierten Zellen (EC₅₀ entspricht 6,02 μg/ml);
• 5 Hemmung von Concentricolid A oder II bei zytopathischer Wirkung (CPE) von HIV-1 (EC₅₀ entspricht 0,31 μg/ml);
• 6 Hemmung von AZT bei zytopathischer Wirkung (CPE) von HIV-1 (EC₅₀ entspricht 0,092 μg/ml);
• 7 Erfindungsgemäßes Gitterbeugungsmuster von Concentricolid A.
• Ausführungsformen
• Die nachstehenden Beispiele dienen der weiteren Beschreibung der Erfindung, beschränken die Erfindung jedoch in keiner Weise.
• Beispiel 1 Herstellen von Concentricolid A
• Getrocknete und zerkleinerte Fruchtkörper (750 g) von Daldinia concentrica wurden jeweils bei Raumtemperatur dreimal mit CHCl₃-MeOH (1:1, vol/vol) und MeOH extrahiert. Die organische Phase wurde in vacuo kombiniert und verdampft, um einen tiefbraunen und cremigenRohextraxt (60 g) zu gewinnen.
• Der Extrakt wurde mit 80-100 Maschen Kieselgel vermengt und einer anschließenden Kieselgelchromatographie unterzogen, wobei mit CHCHl₃/MeOH (100:0, 95:5, 90:10, vol/vol) eluiert wurde, um 15 Anteile zu gewinnen. Anteil 8 (hergestellt durch Eluieren mit CHCl₃/MeOH, 95:5, 9 g) wurde einer Kieselgelchromatographie unterzogen und anschließend mit Petroleumether/-aceton (99:1, 95:5, 90:10, 80:20, vol/vol) eluiert. Aus dem mit 99:1 Petroleumether/-aceton eluierten Anteil wurden 120 mg Concentricolid A direkt gewonnen.
• Alternativ wurde die Flüssigkultur (80 L) von Daldinia concentrica bei Raumtemperatur fünfmal mit EtOAc extrahiert. Die kombinierte organische Phase wurde in vacuo verdampft, um ein tiefbraunes und cremiges Rohextrakt (24 g) zu gewinnen. Der Rohextrakt wurde mit 80-100 Maschen Kieselgel vermengt und einer Kieselgelchromatographie unterzogen, wobei mit CHCl₃/MeOH (100:0, 95:5, 90:10, vol/vol) eluiert wurde, um 15 Anteile zu gewinnen. Anteil 8 (hergestellt durch Eluieren mit CHCl₃/MeOH; 95:5, 1,7 g) wurde einer Gelchromatographie unterzogen, wobei mit Petroleumether/-aceton (99:1, 95:5, 90:10, 80:20, vol/vol) eluiert wurde. Aus dem mit 99:1 Petroleumether/-aceton eluierten Anteil wurden 173 mg Concentricolid A direkt gewonnen.
• Concentricolid A besitzt die folgenden physikalisch-chemischen und das Wellenspektrum betreffende Eigenschaften: blassgelbe Nadeln, Schmelzpunkt 89 ∼ 90° (Petroleumether/-aceton); [α]_D ^21,9 = –59,23° (c 0,48, MeOH); EI-MS m/z (rel. int.): 202 [M]⁺ (20), 173 (100), 145 (48); HR-TOF-MS m/z: 225,0526 ([M+Na]⁺, 225,0527 calcd. für C₁₂H₁₀O₃Na); UV (MeOH)λ_max nm: 226 (log ε 4,08), 256,5 (3,88), 297 (3,63); IR ν^KBR _maxcm^–1: 1757, 1641, 1534, 1437. Eigenschaften 'H und ¹³C-NMR von Concentricolid (500 MHz, CD₃OD, δ in ppm, J in Hz)

  
• Ergebnisse der Röntgenbeugungsanalyse:
• C₁₂H₁₀O₃, M 202, triklin, Raumgruppe P1; a = 7,728 (1), b = 8,289 (1), c = 9,043 (1) Å; α = 106,450(5)°, β = 96,321 (6)°, γ = 108,946 (6)°; V = 512,36 (3), ų, Z = 2. Endgültiger verlässlicher Faktor R_f = 0,073 und R_w = 0,066 (w = 1/σ |F|²). Insgesamt wurden im Rastermodus ϖ mit einem MAC-DIP-2030K-Beugungsmesser 1369 mit graphit-monochromatischer MoKα-Rasterstrahlung Reflexionen erfasst. Die Struktur wurde im Direktverfahren SHELXS86 gelöst. Dessen Beugungsbild wurde in 7 dargestellt.
• BEISPIEL 2
• Die Herstellung von 2.3-Dibrom-2,3-Dihydroconcentricolid |(B)| aus Concentricolid A
• 60 mg Concentricolid (A, 0,30 mmol) wurden in 2 ml CHCl₃ aufgelöst, 65 g Brom (0,41 mmol) wurden in 1 ml CHCl₃ aufgelöst. Die Bromlösung wurde der Lösung von A tropfenweise hinzugegeben und bei Raumtemperatur 120 Stunden lang gerührt. Das Produkt wurde konzentriert, um blassgelbe Nadeln zu gewinnen, die umkristallisiert wurden, um 50,8 mg von B mit einem Gehalt von 47,2% zu gewinnen. Das Produkt zeigte bei HPLC zwei Höchstwerte, die sich als ein Paar optischer Isomere (B₁ und B₂) herausstellten.
• Die blassgelbe Nadelverbindung B wurde durch Additionsreaktion von Concentricolid A und Brom gewonnen. Das EI-MS-Spektrum zeigte bei 364, 362 und 360 drei Isotopen-Höchstwerte mit einer relativen Dichte von 1:2:1. Dies deutet darauf hin, dass das Molekül zweiatomig ist. Der Vergleich mit Concentricolid A ergab lediglich einen Unterschied im Molekulargewicht von zwei Bromatomen, was weiter die Existenz von zwei Bromatomen beweist. Im Bereich des 'H-NMR-Spektrums wurde die gegenseitige Kopplung zwei olefinischer Wasserstoffe [δ 7,79 (1H, d, J = 7,7), 7,19 (1H, d; J = 7,7)] beobachtet. Ausgehend von der Kopplungskonstante J = 7,7, lässt sich schließen, dass es sich dabei um Wasserstoff auf dem Phenylring handelt, was vermuten lässt, dass die Brom-Additionsreaktion auf den Positionen 2 und 3 erfolgte. In HMBH δ_H war 7,79 mit C-3, 5A und 8A verbunden, und δ_H 7,19 war mit C-3A, 4, 5A und 8A verbunden, was weiter bestätigte, dass die Additionsreaktion auf dem Furanring erfolgte. Aus diesem Grund hat sich die Struktur von B als 2,3-Dibrom omo-2,3-Hydrocentricolid herausgestellt. HPLC von B zeigte, dass zwei Höchstwerte bestehen, da es sich bei der Brom-Additionsreaktion um einen Brom-Oniumion-Mechanismus handelt, wobei zwei Bromatome gegensätzliche Richtungen einschlugen, um den olefinischen Kohlenstoff anzugreifen. Das Produkt der Additionsreaktion sollte ein Paar optischer Isomere sein, d.h., B bei B handelte es sich in der Tat um eine Mischung, in der die Strukturen der beiden Verbindungen jeweils (2S,3S)-2,3-Dibrom-2,3-Hydroconcentricolid (B₁) und (2R,3R)-2,3-Dibrom-2,3-Hydroconcentricolid (B₂) lauteten.
  2,3-Dibrom-2,3-Dihydroconcentricolid (B₁ und B₂). Weißgelbe Nadeln (Petroleumether/-aceton);
  EI-MS m/z (rel. int.): 364 [M₁]⁺ (0,5), 362[M₂]⁺ (1,0), 360[M₃]⁺ (0,5), 284 (7), 282 (13), 280 (31), 278 (7), 202 (20), 173 (100), 145 (50), 117 (7), 89 (12);
  ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7,79 (1H, d, J = 7,7), 7,19 (1H, d, J = 7,7), 7,02 (1H, d, J = 3,8), 5,79 (1H, d, J = 4,2), 5,46 (1H, m), 2,14 (1H, m), 1,86 (1H, m), 1,06 (3H, t, J = 7,4);
  ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 166,6, 166,6, 153,9, 153,9, 153,8, 153,8, 131,6, 131,5, 128,1, 128,0, 117,1, 117,1, 112,2, 112,0, 90,1, 90,0, 82,8, 82,8, 50,9, 50,8, 27,8, 27,7, 9,1, 9,0.
• Beispiel 3
• Die Herstellung von 3-Bromconcentricolid (C) aus 2,3-Dibrom-2,3-Dihydroconcentricolid (B)
• 32 mg B (0,09 mmol) wurden in 2 ml Methanol aufgelöst, der Lösung wurde 1 ml gesättigte Methanollösung von Kaliumhydroxid hinzugefügt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 8 Std. lang gerührt. Die Reaktionslösung wurde mit 1 %-iger Salzsäure in Methanol auf den pH-Wert 7,0 neutralisiert und mit einer geringen Menge Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet, um ein Rohprodukt zu gewinnen. Das Rohprodukt wurde wieder rekristallisiert, um 11,8 mg weißgelbe Nadeln C mit einem Gehalt von 47,5% zu gewinnen.
• Die Verbindung C mit den weißgelben Nadeln C wurde als Produkt einer Abspaltungsreaktion von B gewonnen. Das EI-MS-Spektrum zeigte zwei Höchstwerte für Molekülionen bei 282 und 280 mit einer relativen Dichte von 1:1, was auf das Vorhandensein eines Bromatoms schließen lässt. Drei olefinische Wasserstoffsignale [δ 7,84 (1H, d, J = 8,0), 7,80 (1H, s), 7,34 (1H, d, J = 8,0)] wurden in ¹H-NMR beobachtet. Im Vergleich der Signale mit denen von A [δ 7,74 (1H, d, J = 2,2, H-2), 6,86 (1H, d, J = 2,2, H-3), 7,86 (1H, dd, J = 8.3, 3,6, H-4), 7,24 (1H, d, J = 8.3, H-5)] wurde H-3 abgespalten. HMBC zeigte, dass es relevante Höchstwerte von δ_H 7,80 (1H, s) und C-3, 3A, 8B vorlagen, was weiter bewies, dass es sich bei der Struktur der Verbindung um 3-Bromconcentricolid handelte.
  3-Bromconcentricolid (C). Weißgelbe Nadeln (Petroleumether/-aceton);.
  Schmelzpunkt: 88 ∼ 89,5°C, EI-MS m/z (rel. int): 282 [M₁]⁺ (20), 280 [M₂]⁺ (21), 253 [M₁-C₂H₅]⁺ (80), 251 [M₂-C₂H₅]⁺ (100), 225 (52), 223 (68); ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃); δ 7,84 (1H, d, J = 8,0), 7,80 (1H, s), 7,34 (1H, d, J = 8,0), 5,56 (1H, m), 2,18 (1H, m), 1,84 (1H, m), 0,99 (3H, t, J = 7,4); ¹³C-NMR (100 MHz, CDCl₃): δ 167,2, 149,5, 149,2, 144,1, 128,8, 126,5, 116,8, 116,6, 98,3, 82,9, 27,8, 8,7; 2D-NMR.
• BEISPIEL 4
• Die Herstellung von 2,5-Dinitroconcentricolid (D) aus Concentricolid A
• 50 mg A (0,25 mmol) wurden in 1 ml CHCl₃ aufgelöst, der Lösung wurde unter Abkühlbedingungen 1,5 ml dicke Schwefelsäure hinzugefügt sowie 1 ml dicke Salpetersäure zugetropft. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt und anschließend auf zerstoßenes Eis gegeben. Verbliebene Säure wurde mit Natriumcarbonat entfernt. Die Mischung wurde mit einer geringen Menge Wasser verdünnt und mit Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet, um ein Rohprodukt zu gewinnen, das rekristalliert wurde, um 31,8 mg weißgelbe Nadeln D in 44%-iger Ausbeute zu gewinnen.
  2,5-Dinitroconcentricolid (D). Weißgelbe Nadeln (Petroleumether/-aceton);
  Schmelzpunkt 203 ∼ 205°C; EI-MS m/z (rel. int): 292 [M]⁺ (25), 263 [M-C₂H₅]⁺ (100); HR-TOF-MS m/z: C₁₂H₈N₂O₇ ([M+Na]^– 315,0220, berechn. für C₁₂H₈N₂O₇Na 315,0229); ¹H-NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 8,98 (1H, s), 7,96 (1H, s), 6,13 (1H m), 2,29 (1H, m), 1,77 (1H, m), 0,91 (3H, t, J = 7,4); ¹³C-NMR(100 MHz, CDCl₃): δ 163,9, 155,3, 149,7, 147,1, 140,9, 128,2, 126,8, 114,6, 106,9, 84,1, 26,3, 9,1.
• In den Rezepturen wird mit „aktiver Substanz" eine Verbindung von Formel (I) oder (II) bezeichnet. Beispiel 5: Gelatinekapseln

  
• Die Wirkstoffe wurden gemischt, durch ein Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln gefüllt. Beispiel 6: Concentricolid-Kapseln

  

  Beispiel 7: Tabletten

  
• Die oben stehenden Komponenten wurden gemischt und zu Tabletten komprimiert. Die Tabletten, jeweils 0,1-1000 mg aktiven Wirkstoff umfassend, setzten sich wie folgt zusammen: Beispiel 8: Tabletten

  
• Der aktive Wirkstoff, die Stärke und Cellulose wurden durch ein Sieb gegeben und gemischt. Der Mischung wurde Polyvinylpyrrolidon hinzugefügt, um eine Lösung zu gewinnen. Die Lösung wurde durch ein Sieb gegeben, um pharmazeutisches Granulat zu gewinnen. Das Granulat wurde bei 50-60°C getrocknet und durch ein Sieb gegeben. Carboxymethylcellulosenatrium und Magnesiumstearat, die durch ein Sieb gegeben wurden, wurden gemischt und zu Tabletten komprimiert. Suspensionen, jeweils 0,1-1000 mg aktiven Wirkstoff pro 5 ml-Dosis umfassend, setzten sich wie folgt zusammen: Beispiel 9: Suspensionen

  

  
• Der Wirkstoff wurde durch ein Sieb gegeben und mit Carboxymethylcellulosenatrium und Sirup gemischt, um eine gleichmäßige Paste zu gewinnen. Die Benzoesäurelösung, das Aromamittel und das Farbmittel wurden durch Verrühren mit Wasser verdünnt und anschließend der pharmazeutischen Paste hinzugefügt sowie mit Wasser bis zum erforderlichen Volumen abgestimmt.
• Versuch zur biologischen Aktivität
• Materialien und Verfahren
• Reagenzien und Chemikalien
• MTT (3,(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid) wurde bei Amresco gekauft; SDS (Natriumdodecylsulfat) wurde bei Serva gekauft; AZT (3P-Acido-3P-Deoxythmidin) wurde bei Sigma gekauft; DMF (N,N'-Dimethylformamin) wurde bei der Shanghai Chemical Reagents Company (China) gekauft.
• Nährlösung
• Das vollständiges RPMI-1640-Medium, das 10%-iges fetales Kälberserum (Gibco) enthält, 2mML-Glutamin, 10Mm HEPES, 50μM 2-Mercaptoehtanol, 100,000 IU Penicillin, 100μg/ml Streptomycinsulfat
• Verbindungen
• Als Testsubstanz wurde Concentricolid A verwendet. Positivkontrolle: AZT, einer der reversen Transkriptasehemmer und T20, einer der Fusionshemmer, wurden verwendet.
• Zellen und Virus
• Die C8166 und HIV-1_IIIB chronisch infizierten H9-Zellen wurden vom Medical Research Council (MRC), AIDS Reagent Project, GB, gespendet. Alle Zellen und Viren wurden nach einem konventionellen Verfahren gelagert und reanimiert.
• Beispiel 1
• Die Zytotoxität von Concentricolid A gegenüber C8166-Zellen
• C8166 war eine der Wirtszellen für HIV-1. 100 μl von 4 × 10⁵/ml Zellen wurden auf einer Mikrotestplatte entkernt, 100 μl Concentricolid in unterschiedlicher Konzentration wurde hinzugefügt und bei 37°C in feuchter Atmosphäre mit 5 % CO₂ 72 Std. lang inkubiert. Die Zellentoxizität wurde anhand des kolorimetrischen Versuchs MTT bewertet. Die Platten wurden auf dem Photometer Bio Tek Elx 800 ELISA bei 595/630 nm (OD_{595/630 nm}) abgelesen. 50% der zytotoxischen Konzentration (CC₅₀) wurden wie folgt berechnet: Zellenvitalität in %=(ODexp – ODblank)/(ODcontrol – ODblank) × 100.
• Die Ergebnisse wurden in 1 und 2 dargestellt.
• Beispiel 2
• Das Blockieren von Concentricolid A bei Fusion zwischen normalen Zellen und HIV-1 infizierten Zellen
• Beim Kokultivieren von Zellen, die mit HIV infiziert sind, mit normalen T-Lymphozytenzellen war das Glycolprotein gpl20 der Außenhülle, das auf infizierten Zellen vorlag, nach Zellenfusion und Syncytiumbildung an die zellulären CD4-Rezeptoren der nicht-infizierten CD4⁺-Zellen gebunden. Verbindungen mit dieser Zielsequenz würden die Syncytiumbildung hemmen. Daher könnte dieses Verfahren dazu verwendet werden, zu bestimmen, ob die Verbindungen Einfluss auf Bindung und Fusion zwischen Virus und Wirtszelle haben. Concentricolid A in Beispiel 1 wurde fünffach auf einer 96 Behälter fassenden Mikrotestplatte verdünnt, mit 3 wiederholten Behältern in jedem Gradienten, 100 μl pro Behälter. Die Negativkontrolle des verbindungsfreien Behälters und die Positivkontrolle T-20 wurden vorbereitet. Anschließend wurden 50 μl der C8166-Zellen in logarithmischer Wachstumsperiode (6 × 10⁵/ml) und 50 μl chronisch mit HIV-1 infizierte H9-Zellen (2 × 10⁵/ml) jedem Behälter hinzugefügt. Die Platte wurde in einem feuchten Brutschrank bei 37 °C und 5%-igem CO₂ 24 Std. lang gezüchtet, wobei die Syncytiumbildung unter dem Mikroskop beobachtet wurde, um herzuleiten, ob Concentricolid A den Fusionsprozess von Virus und Zelle blockiert. Die Ergebnisse wurden in 3 und 4 dargestellt.
• Beispiel 3
• Der Inhibitionsversuch zur zytopathischen Wirkung (CPE) von Concentricolid A bei HIV-1 infizierten C8166-Zellen
• 100 μl einer Nährlösung, die entsprechende Concentricolid A-Konzentration aus Beispiel 1 umfassend, wurden C8166-Zellen (4 × 10⁵/ml) und HIV-1_IIIB bei einer Multiplizität der Infektionen (M.O.I) von 0,06 hinzugefügt. Das Endvolumen betrug 200 μl. AZT wurde als Produkt für die Positivkontrolle verwendet. Die Platten wurden einem feuchten Brutschrank bei 37 °C und 5 %-igem CO₂ gezüchtet. Nach 3-tägiger Züchtung wurde die zytopathische Wirkung durch Auszählen der Syncytiumanzahl in jedem Behälter unter einem inversen Mikroskop beobachtet.
• EC₅₀ (50%-ige Wirkkonzentration) war die Konzentration der Verbindung, bei der 50% der Syncytiumbildung gehemmt wurden. Die Hemmung der zytopathischen Wirkung (CPE) in % = (1-Syncytiumanzahl_exp/Syncytiumanzahl_Kontrolle) × 100. Die Ergebnisse wurden in 5 und 6 dargestellt.
• Schlussfolgerung
• Die Daten zeigten, dass Concentricolid in vitro eine geringe Zytotoxizität und gute Aktivität gegen HIV-1 aufweist. Der gewählte Index (S.I) ist 222. Die Zielsequenz von Concentricolid ist wahrscheinlich die Bindung und Fusion zwischen HIV und Zelle. Somit hat Concentricolid A, als kleinmolekulare Verbindung, welche die Bindung und Fusion zwischen HIV und Zelle blockiert, große Bedeutung.
• Zusammenfassung
• Die vorliegende Erfindung betrifft Concentricolid und seine Derivate, ein Verfahren zum Herstellen der Verbindung und ihrer Derivate, eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Concentricolid und seine Derivate und die Verwendung der Verbindung und seiner Derivate zur Behandlung und Prävention von Infektionen, die durch das menschliche Immunschwächevirus (HIV) verursacht wurden.

Claims (10)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) und ihrer Derivate,

   

   wobei R1 C₁-C₄-Alkyl darstellt; R2 H, Halogen, -OH, NRR' oder -NO₂ darstellt, wobei R und R' H oder C₁-C₆- Alkyl darstellen; R3 H, Halogen, -OH, NRR' oder -NO₂ darstellt, wobei R und R' H oder C₁-C₆- Alkyl darstellen; R4 H, Halogen oder -NO₂ darstellt.
2. Verbindungen nach Anspruch 1, ausgewählt aus den Verbindungen, die durch die folgenden Formeln dargestellt sind:

   
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, ausgewählt aus den Verbindungen der Formel (II):

   
4. Extrakt, die Verbindung der Formel (II) umfassend:

   
5. Pharmazeutische Zusammensetzung, die Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-3 oder seiner Derivate umfassend, oder der Extrakt, wie in Anspruch 4 beansprucht, und ein pharmazeutisch brauchbarer Träger oder eine Transportsubstanz.
6. Verfahren zum Herstellen der Verbindungen von Formel (I), umfassend: a) Extrahieren von Fruchtkörpern von Daldinia concentrica aus Yunnan oder ihre fermentierte Flüssigkeit mit einem organischen Lösungsmittel; b) Isolieren des Extrakts von a) durch Kieselgelchromatographie, um die Verbindung der Formel (II) zu gewinnen:

   

   c) Unterziehen der Verbindung von Formel (II) einer Bromierung, Nitrierung und Alkylierung, um die Verbindung der Formel (I) zu erhalten.
7. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1-3 zum Herstellen eines Medikaments zur Prävention/Behandlung der Bedingungen oder Krankheiten im Zusammenhang mit HIV-Infektionen.
8. Verwendung des Extrakts nach Anspruch 4 zum Herstellen eines Medikaments zur Prävention/Behandlung der Bedingungen oder Krankheiten im Zusammenhang mit HIV-Infektionen.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Verbindung ausgewählt wird aus

   
10. Verfahren zur Prävention und/oder Behandlung der Bedingungen oder Krankheiten im Zusammenhang mit HIV-Infektionen, umfassend die Verabreichung von Verbindungen nach einem der Ansprüche 1-3 und des Extrakts nach Anspruch 4, an einen Patienten, der mit HIV infiziert ist.