DE1117824B

DE1117824B - Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums F.I. 1600, Aminosydin

Info

Publication number: DE1117824B
Application number: DES67815A
Authority: DE
Inventors: Federico Arcamone; Mario Ghione; Tullio Scotti
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1959-03-31
Filing date: 1960-03-30
Publication date: 1961-11-23

Description

Herstellung und Gewinnung des Antibiotikums F. I.1600, Aminosydin Die Erfindung bezieht sich auf ein neues und therapeutisch nützliches Breitbandantibiotikum, dessen Herstellung durch Fermentierung sowie auf seine Isolierung.
Es wurde gefunden, daß bei Verwendung einer neuen Art von Streptomyceten eine antibiotische Substanz in hoher Konzentration in der Nährflüssigkeit gebildet wird, die von den bisher bekannten Stoffen verschieden ist, daß dieses Antibiotikum unter bestimmten, im folgenden beschriebenen Verfahrensbedingungen isoliert werden kann und Eigenschaften aufweist, die es zu einem neuen und nützlichen Therapeutikum machen. Das durch die vorliegende Erfindung erhaltene neue Antibiotikum wurde als F.I. 1600 oder Aminosydin bezeichnet, und unter diese Bezeichnung fallen sowohl die freie Base als auch ihre Salze und deren Lösungen. Der neue Organismus, welcher die Herstellung des Antibiotikums F.I.1600 gestattet, wurde Streptomyces Krestomycetius (n. sp.) benannt und in der National Collection of Industrial Bacteria hinterlegt; er erhielt dort die Indexnummer von N.C.I.B. 8995. Weiterhin wurde S. Krestomyceticus im Commonwealth Mycological Institute unter der Nummer 79 589 hinterlegt.
Der Stamm S. Krestomyceticus wurde in. einer bei Massa marittima (Grosseto) entnommenen Bodenprobe gefunden, isoliert und sowohl aus synthetischen als auch organischen Medien innerhalb eines Temperaturbereiches von 28 bis 37°C gezüchtet. Unter dem Elektronenmikroskop zeigt S. Krestomyceticus glatte Sporen, die ziemlich regelmäßig zylindrisch oder oval geformt und etwas transparent sind. Die Hyphen sind gewöhnlich gerade, aber manchmal werden auch Haken und Spiralen beobachtet. Der Stamm S. Krestomyceticus wurde für seine Klassifikation geprüft; in Tabelle 1 sind seine Züchtungsergebnisse angegeben. Tabelle 1 Agar-Glyzerin-Glyzin Gutes Wachstum, farblos, mit starker Sporenbildung, Lufthyphen und Sporen weiß. Bodenextrakt-Agar Gutes Wachstum, farblos, bedeckt mit mäßig gebildetem, weißlichem Luftmycel.
Czapek-Agar Sehr oberflächliches Wachstum, farblos, gute weiße Sporenbildung.
YED Salz-Agar (Hefeextrakt und Salze) Voluminöses Wachstum, gelblich, nicht sehr tief in das Substrat; mäßige weiße Sporenbildung. Pepton und Salzagar Gutes Wachstum, farblos bis gelblich, mit guter weißer Sporenbildung; sehr-kurze Hyphen. Glyzerin-Agar Voluminöses Wachstum, fast farblos, schüttere Bildung von Luftmycel.
Asparagin-Dextrose-Agar Gelbliche, kleine Kolonien, trüb, flach und wachsig, nicht sehr auffällig, ohne Luftmycel. Kartoffel-Dextrose-Agar Nicht sehr voluminöses Wachstum, farblos, mit schütterem, weißlichem Luftmycel. Typische konzentrische Risse oder Sprünge am Boden der Kulturen.
Kaseinhydrolysat-Agar, versehen mit Salzen und Aminosäuren Geringes, schütteres Wachstum, farblos, kein Luftmycel.
PYS-Agar (Pepton, Hefe, Salze) Starkes Wachstum, farblos, flach mit schütterem Luftmycel, Oberflächenrisse.
Kartoffelstücke Ausgezeichnetes Wachstum durch das ganze Stück, welches völlig mit gut sporuliertem Luftmycel bedeckt ist. Emersons-Agar Gelblich mit welliger Oberfläche, die viele Sprünge zeigt. Die ganze Oberfläche ist mit einem sehr kurzen, weißlichen Luftmycel bedeckt, das dort, wo das Wachstum dicker ist, auffälliger ist. Kaseinhydrolysat-Agar Sehr starkes und dickes Wachstum, nicht sehr tief in das Substrat, auffällige Sprünge mit nach innen verlaufenden Rändern, gleichmäßig verteiltes, kurzes, aber sehr starkes Luftmycel. Die Rückseite ist stark gelb.
Sojabohnenmehl-Agar Gewelltes Wachstum mit Sprüngen, gelbliches vegetatives Mycel, bedeckt durch sehr kurzes, weißliches Luftmycel.
Sojabohnenmehl-Glyzerin-Agar Flache, trübe und bräunliche Kolonien mit sehr kurzem Luftmycel am Boden der Kultur. Getreideweiche-Agar Ähnliche wie Sojabohnenmehl-Agar. Pepton-Getreideweiche-Agar Flaches Wachstum, gelblich, mit wenig Sprüngen, kurzes Luftmycel, kräftig, auffälliger an den Kulturrändern.
Anderson-Sporulationsmedium Im allgemeinen flaches Wachstum, gelblich, mit Sprüngen, wo das Agar dicker ist. Etwas Luftmycel an den Falten.
Trypton-Agar Ähnlich wie Andersons Medium, aber mit farblosem, vegetativem Mycel; starkes Luftmycel. NZ-Aminasparagin-Agar Flache, gelbe Kolonien mit kleinen Tupfen von weißem Luftmycel.
Pridhams Medium mit Stärke und anorganischen Salzen Flache, gelbliche Kolonien, die dort, wo das Substrat dicker ist, faltiger sind.
Hafermehl-Agar Flache, gelbliche Kolonien mit farblosen Rändern, Luftmycel fehlt im allgemeinen, erscheint nur gelegentlich an einigen Falten.
Sabou raud Agar Gutes Wachstum, farblos oder cremegefärbt, bedeckt mit starkem, weißem Luftmycel. Hefebrühe Oberflächliches, voluminöses Wachstum, gelblich, bedeckt mit weißem Luftmycel.
S. Krestomyceticus hydrolysiert sowohl Stärke als auch Gelatine und zersetzt Tyrosin innerhalb 6 Tagen. Unter Verwendung der folgenden Substanzen als einziger Kohlenstoffquelle werden Säuren gebildet: Inulin, Threalose, Lävulose, Sorbit, Mannose, Galaktose, Lactose, Adonit, Mannit, Maltose, Glyzerin, Dextrose, Dextrin.
Milch wird nach 13 Tagen nur schwach koaguliert. Neutrale Reaktion, keine Peptonisation.
Die Züchtungseigenschaften des Stammes, welcher F. I. 1600 produziert, wurden mit den Eigenschaften bereits bekannter Stämme verglichen.
Von diesen unterscheiden sich S. virgatus und S. flocculus vom vorliegenden Stamm, da deren vegetatives Mycel grünlich ist und ersterer auch in einigen Medien ein braunes Pigment produziert. Außerdem hat S. flocculus seine Oberfläche mit einem samtigen oder wattigen Luftmycel bedeckt.
S. termophilus zeigt ein tiefes Wachstum in das Medium und ein weißliches Luftmycel; außerdem liegt sein Wachstumsoptimum bei 50'C. Der Stamm, welcher F.I. 1600 produziert, zeigt ein sehr gutes Wachstum bei 37°C, es werden aber bei 33'C oder darüber nur sehr geringe Mengen an Antibiotikum erzeugt.
S. kanamyceticus zeigt ein tiefes Wachstum in das Substrat und manchmal grünliche oder rosige Schatten im vegetativen Mycel. Manchmal produziert er auch ein braunes Pigment. Keiner der vorerwähnten Stämme zeigt jedoch die typischen Risse an der Oberfläche der Kultur, welche die besten Charakteristika des F.I. 1600 reproduzierenden Stammes sind. Auf Grund dieser Eigenschaften, die mit keinen der bekannten Stämme übereinstimmen, wurde S. Krestomyceticus als neuer Stamm betrachtet. Die Herstellung des Antibiotikums F.I. 1600 wurde durch FermentierunginsubmersenbelüftetenKulturenineiner wäßrigen Nährlösung, welche Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff und Mineralsalze enthielt, durchgeführt.
Als Stickstoffquelle wurden die besten Resultate unter Verwendung von proteinhaltigem Material wie Gerstenmalzextrakt, Getreidemalzextrakt, Getreidequellflüssigkeit, enzymatisches Kaseinhydrolysat, Erdnußmehl, Sojabohnenmehl, Baumwollbohnenmehl sowie Fleischextrakt erhalten.
Als Quelle von assimilierbarem Stickstoff eignen sich auch die anorganischen Ammoniumsalze, wie Ammonsulfat und Ammonphosphat. Es können auch organische Stoffe als Stickstoffquelle verwendet werden, wie z. B. die Arninosäuren und verschiedene proteinhaltige Naturstoffe.
Als Kohlenstoffquelle kann entweder ein lösliches Kohlehydrat wie Dextrose oder ein unlösliches wie Stärke, beispielsweise Getreidestärke, verwendet werden. Eine gute Ausbeute an Antibiotikum wird auch mit Maltose, Dextrin, Laktose und anderen Zuckern erhalten. Als Mineralsalze, welche für die Nährflüssigkeit notwendig sind, werden vorzugsweise Phosphate verwendet, welche entweder als Ammonphosphat oder als Metallphosphat, wie z. B. als Kaliumphosphat, vorliegen können, weiterhin Chloride wie Kochsalz und Sulfate wie Ammonium- oder Magnesiumsulfat.
Geeignete Puffer sind Calciumcarbonat und Salze organischer Säuren wie Citrate, Acetate und Lactate, welche dazu dienen, den pH-Wert innerhalb des geeigneten Bereiches zu halten.
Manchmal ist es notwendig, auch Schwermetalle zuzusetzen, die gegebenenfalls auch bereits als Verunreinigungen anwesend sein können; unter diesen befinden sich Kupfer, Zink, Mangan, Eisen und Chrom.
Bei sehr großen Fermentationsgefäßen ist die Verwendung von Entschäumungsmitteln wünschenswert, obwohl dieses Schäumen bei der Fermentation kein besonders schwieriges Problem darstellt und leicht durch die Verwendung von üblichen Entschäumungsmitteln wie Octadecanol in Schweinefettöl oder anderen geeigneten handelsüblichen Entschäumungsmitteln wie Silikonen kontrolliert werden kann.

Das relative Verhältnis der Bestandteile der Nährflüssigkeit wurde mengenmäßig wie folgt festgelegt:

Stickstoffquelle. . . . . . . . . . . . . . . . 0,5 bis 40/0

Kohlenstoffquelle . . . . . . . . . . . . . 1 bis 5 0/0

Phosphate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,01 bis 0,3 0/0

Sulfate. . .......... ..... ...... 0,05 bis 0,25°/o

CaC0....................... 0,1 bis 0,7°/0

Chloride ..................... 0,1 bis 0,30/0

Spurenelemente . . . . . . . . . . . . . . . 0,0001 bis 0,00050/0

Die genauen Mengen a11 dieser Stoffe sind in den Beispielen besonders angegeben. Die Fermentation wird bei einer Temperatur von 24 bis 32°C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis zu 1 Woche bei einem p$ von 6,3 bis 7,8 durchgeführt. Der AnfangspH-Wert, welcher den günstigsten Fermentationsprozeß sicherstellt, beträgt 6,4 bis 6,7; er steigt gegen Ende der Fermentation auf 7,6 bis 7,8.

Um eine gute Ausbeute zu erhalten, muß auch gelüftet werden. Das Verhältnis zwischen der Luftmenge, die in den Fermentationstank eingebracht werden muß, und dem Volumen der Kulturflüssigkeit schwankt während den Fermentationsphasen zwischen 0,1 und 0,8.
F.I. 1600 kann sowohl als Hydrochlorid als auch als Sulfat aus der Nährflüssigkeit abgetrennt werden unter Anwendung der angegebenen Verfahrensbedingungen, welche sich als hochwirksam zum Abtrennen eines Produktes frei von inaktiven Verunreinigungen und von anderen gleichzeitig in der Brühe gebildeten antibiotischen Substanzen erwiesen hat. Dieses Verfahren wird im folgenden angegeben. Im Grunde besteht es aus folgenden Schritten: a) Ausfällen von Calcium++ mit Oxalsäure und Abfiltrieren von Mycel und Calciumoxalat nach Einstellen des pH-Wertes auf 7 bis 7,5.
b) Absorption des Antibiotikums auf einem Kationenaustauscherharz und Eluieren mit verdünnten Säuren wie 1 n-H Cl.
e) Neutralisieren der eluierten Lösung mit einem Anionenaustauscherharz in hydroxyliertem Zustand, bis der pH-Wert auf 7 bis 7,5 steigt, und anschließendes Filtrieren.
d) Einengen der filtrierten Lösung unter Vakuum zur Trockne.
e) Auflösen des Antibiotikums in einem geeigneten organischen Lösungsmittel wie Methanol.
f) Ausfällen des F.I. 1600-Hydrochlorids durch Zusatz von Azeton zur organischen Lösung.
g) Das filtrierte F.I. 1600-Hydrochlorid wird in Wasser gelöst, und die wäßrige, filtrierte Lösung wird nach Einengen auf ein kleines Volumen unter Vakuum mit Triäthylaminsulfat behandelt. Nach Filtrieren wird die Lösung unter Rühren zu Methanol zugesetzt. Das F.1. 1600-Sulfat wird filtriert, mit Methanol gewaschen und im Vakuum über P205 bei 50°C getrocknet.
Es wurde gefunden, daß das Antibiotikum F.1. 1600 auch durch Absorbieren und Eluieren von Kohle gewonnen werden kann, insbesondere, daß F.I. 1600 entweder aus seinen wäßrigen Lösungen oder aus den Kulturflüssigkeiten mit Hilfe von Kohlenstoff, vorzugsweise bei einem pff über 7, abgetrennt werden kann.
F.I. 1600 kann von Adsorptionskohle entweder mit Hilfe wäßriger Lösungen, mit Hilfe von alkoholischen Lösungen oder mit Hilfe von anorganischen oder organischen Säuren eluiert werden.
F.I. 1600 ist eine basische Substanz und ist wasserlöslich. In Form des Sulfats oder Hydrochlorids ist es ein weißes Pulver, löslich in Wasser und unlöslich in fast allen organischen Lösungsmitteln. Das Hydrochlorid von F.I. 1600 ist löslich in Methanol.
Das Ultraviolettspektrum zeigt keine Absorption innerhalb des Bereiches von 220 bis 440 m#t. Das Infrarotspektrum des F.I. 1600-Sulfats in KBr (1,5 und 50/00), welches in der Zeichnung angegeben ist, zeigt deutliche Spitzen bei 2,94, 3,41, 6,15, 6,55, 9,00 und 9,52 #t, schwache Banden bei 6,82, 7,08, 7,28, 7,46, 10,70, 11,17, 11,62, 13,08 #t und Minima bei 3,09 und 10,23 @Z, was für die Anwesenheit folgender Gruppen spricht: O H, N H, C H, C H2, N H3+-Ion, C - O - C.
Es besteht kein Hinweis auf Carbonylgruppen in Keto-, Amid- oder Esterform.
Das optische Drehungsvermögen von sehr reinem F.I. 1600-Hydrochlorid und Sulfat in Wasser wurde bestimmt.
Hydrochlorid [oc]ö5 = -E-55° (c = 10/0 in Wasser). Sulfat [x) 2"o = +51' (c = 10/0 in Wasser).

In Tabelle 2 ist die Elementaranalyse der Salze von F.I. 1600 angegeben.

Tabelle 2

F. I. 1600-Salze C °/o H °/o N °1o S °/o Cl °/o

Hydrochlorid ................ 33,79 6,76 3,17 - 21,05

Sulfate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30,57 bis 30,8 6,44 bis 7,00 7,19 bis 7,38 8,99 bis 9,08 -

p-(p-Hydroxy-phenylazo)-

benzol-sulfonat . . . . . . .. . . ... 58,58 5,25 10,27 7,72 -

Helianthinsalz . .. . . . . .. .... . . . 51,29 6,20 12,23 7,50 -

Durch Analyse von F.I. 1600-Sulfat uns seinen Abbauprodukten wurde festgestellt, daß F.I. 1600 wahrscheinlich die empirische Formel C23 H45 N5 014 besitzt und daß die Formel des Sulfats vermutlich C33 H45 N5 014 ' 2,5I-12S04 2H20 ist (berechnet C 30,80, H 6,03, N 7,8 1, S 8,93). F.I. 1600 gibt durch Acylierung Pentaacylderivate; es wurden so Pentabenzoyl-und Pentaacetylderivate erhalten. Es wurde weiterhin gefunden, daß 1 Mol Pentaacetyl-F.I. 1600 in 0,02-molarer Perjodatlösung bei Raumtemperatur 2,95 MoI Perjodat verbraucht.

Auf Grund der Elementaranalyse, der Grundeigenschaften des Produktes, der Tatsache, daß der gesamte Stickstoff basisch ist, sowie auf Grund seines UV- und IR-Spektrums wird eine polypeptidartige Struktur ausgeschlossen und es wird angenommen, daß F.1. 1600 eine Struktur ähnlich der Gruppe von basischen, wasserlöslichen Oligosaccharid-Antibiotika wie Streptomycin und Neomycin besitzt.
Chromatographisch kann F.I.1600 von Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Neomycin, Viomycin und anderenglykopeptidischenbasischen Stoffenwie Streptotricin und den Geomycinen unterschieden werden.

Längere saure Hydrolyse von Neomycinen oder von Catenulin (J. W. Davisson u. a., Antibiot. and Chem., 2, 1952, S.460) ergibt ein mikrobiologisch aktives Bruchstück, das durch Papierchromatographie als Neamin identifiziert wurde. Saure Hydrolyse von F.I. 1600 mit 6n-HCl ergibt kein aktives Bruchstück. . Tabelle 3 zeigt die Unterschiede zwischen F.I. 1400 und den anderen Antibiotika der gleichen Gruppe.

Tabelle 3

Antibiotikum Organismus Analyse des Sulfats I_aDI Andere Eigenschaften und Unterschiede

des Sulfats

F. I. 1600- Strept. kresto- C = 30,8 - 30,57 -f-51 Durch Säurehydrolyse keine Bildung eines

Sulfat myceticus H = 7,00 - 6,44 mikrobiologisch aktiven Bruchstücks.

N= 7,19- 7,38

S = 8,99 - 9,08

empirische Formel

C23H45N5014

2,5H2S04-2H20

Neomycin- Strept. fradiae C = 29,35 a) Durch Säurehydrolyse Bildung eines

Sulfat BH = 6,86*) B =-f-56(2) aktiven Bruchstücks (Neamin).

(1) S 04 = 28,3 b) Infrarotspektrum ist verschieden von

C = 31,18 C =-f-82(2) dem von F. I. 1600.

CH = 6,14 c) Es ist ehromatographisch verschieden

N = 8,93 von F. I. 1600.

(2) S = 9,90

*) N = 9,21

Streptomycin- Strept. griseus C = 34,62 -79°(3) a) Infrarotspektrum ist verschieden von

Sulfat H = 5,77 dem von F. I. 1600.

N = 13,45 b) Es ist chromatographisch verschieden

S = 6,61 von F. I. 1600.

Catenulin- nicht C = 31,53 a) Infrarotabsorption (nicht angegeben)

sulfat beschrieben 31,58 ist typisch für ein Polypeptid-

H = 5,29 spektrum(4).

5,26(4) -f-51,9(4) b) Durch saure Hydrolyse Bildung eines

N = 7,92 aktiven Bruchstücks (Neamin)(4).

7,93 c) Es zeigt Kreuzresistenz mit Neo-

S04 = 28,11 mycin(s).

28,13

Kanamycin- Strept. kana- C = 37,3 Infrarotspektrum ist verschieden von dem

sulfat myceticus 37,4 von F. I. 1600.

H=6,8

6,3(5) -f-146°(5)

N=9,3

9,6

S=5,5

Hydroxymicin Strept. paucis- N = 6,2(7) -f-51(7) Sein Pentabenzoat, löslich in 5 Teilen

porogenes Angegebene (7) heißem Methanol, schmilzt bei 233'C

wahrscheinliche unter Zersetzung; [a] = -f-36; diese

empirische Formel Eigenschaften sind verschieden von

der Base: den Eigenschaften von F.I.1600-Penta-

C25H47N5015 benzoat. Die Formel der Base ist ver-

schieden von F. I. 1600.

Paromomycin- Strept. rimosus Angegebene ($) -f-50,5(8) Infrarotspektrum ist verschieden von

sulfat forma paro- wahrscheinliche F. I. 1600 (Abwesenheit einiger Ab-

momysinus empirische Formel sorptionsbanden) und auch die ein-

der Base pirische Formel ist verschieden.

(C10H18-22N200

H2 S 04)x

Literatur:

(1) Regna u. a., J. Am. Chem. Soc., 1950, S. 1045. (1) Cron u. a., J. Am. Chem. Soc., 80, 1958, S. 752.

(z) Ford u. a., J. Am. Chem. Soc., 1955 S. 5311. (s) Szybalsky u. a., Am. Rev. Tuberc., 69, 1954, S. 267.

(3) Regna u. a., J. Biol. Chem., 165, 1946, S. 631. (') G. Hagemann u. a., Phann. Franc., 16, 1958, S. 585.

(') Davisson u. a., Antibiotic and Chem., 2, 1952, S. 460. (8) Britische Patentschrift 797 568.

Aus obigem ist ersichtlich, daß das durch die vorliegende Erfindung vorgesehene F.I. 1600 ein neues Antibiotikum von der Gruppe der basischen wasserlöslichen Oligosaccharid-Antibiotika ist. Pharmakologische Eigenschaften F.I. 1600 zeigt folgende pharmakologische Eigenschaften: a) Breites, antibiotisches Spektrum, das grampositive, gramnegative undsäureresistenteBakterienumfaßt. b) Hemmwirkung gegen die vorerwähnten Organismen in sehr niedriger Konzentration.

c) Wirksam gegen antibiotisch resistente Stämme. d) Sehr geringe Toxizität.

Tabelle 4 zeigt die Minimaldosis in mcg/ml (MID) von F.I.1600-Sulfat, welche das Wachstum des jeweils erwähnten Mikroorganismus in Hefeextraktbrühe hemmt.

Tabelle 4

Nach Nach

Testorganismus 24 Stunden 48 Stunden

Bebrütung Bebrütung

M. Pyogenes Aureus ..... 1 1

B. subtilis . . . . . . . . . . . . . . 1 1

S.faecalis ..... ........ 1 1

Mycobacterium 607 ..... 1 5

M. phlei . . . . . . . . . . . . . . . 1 5

A. bostromi A . . . . . . . . . . 1 1

E.coli ................. 5 5

K. friedländeri . . . . . . . . . . 5 25

P. vulgaris . . . . . . . . . . . . . . 25 25

P.aeruginosa ........... 100 100

S. flexneri Y . . . . . . . . . . . . 25 25

O.albicans ............. 100 100

G.graphii .............. 100 100

I. mentagrophytes ....... 100 100

Die gleiche Konzentration des Antibiotikums hemmt das Wachstum von M. tbc oder M.607 und das von vielen anderen antibiotisch resistenten Stämmen der gleichen Species (s. Tabelle 5).

Tabelle 5

MID mcg/ml

Testorganismus flüssiges

Dubos Medium

M. Tuberculosis H 37 Rv ...... 1

M. tbc - isoniazide resistent ... 2,5

Mycobacterium sp. ATCC 607.. 2,5

M. 607 Strept. resistent . . . . . . . . 2,5

M. 607 Chlortetracycl.resistent.. 2,5

M. 607 Oxytetracycl. resistent . . 2,5

M. 607 Neom. resistent ....... 5,0

M. 607 Viom. resistent . . . . . . . . 2,5

M. 607 Oxam. resistent . . . . . . . . 2,5

M. 607 Eritrom. resistent ...... 5,0

M. 607 Vancom. resistent ...... 5,0

M. phlei . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,98

M. para-smegmatis . . . . . . . . . . . . 0,124

Tabelle 6 zeigt die relativen Mengen in mcg/ml (MID) von F. L 1600-Sulfat, welche benötigt werden, um eine Anzahl von repräsentativen Organismen über verschiedene Kulturen zu hemmen.

Tabelle 6

In der Tabelle werden die Werte von baktereostatischen und bakteriziden Konzentrationen von F. I. 1600

in verschiedenen Kulturmedien angegeben.

MID in mcg/ml

Testorganismus Penessay-Brühe Gehirn-Herz-

Hefebrühe Nährbrühe 1 Difco I Infusion Difco

baktereostatisch

Staphyl. aureus 114 . . . . . . . . . . . . . . 0,35 0,6 1,6 3,8

Staphyl. aureus 209 P . . . . . . . . . . . . 0,62 1,05 4,0 12,0

Staphyl. aureus 503 MB . . . . . .. . .. 0,075 0,31 0,13 0,35

Staphyl. aureus CAMP .......... - 0,15 1,45 4,8

Staphyl. Londres . . . . . . . . . .. . . . . . 0,15 0,45 3,5 6,0

bakterizid nach 24 Stunden

Staphyl.aureus 114 .............. 2,5 2,5 10 20

Staphyl. aureus 209 P . . . . . . . . . . . . 10 20 20 20

Staphyl. aureus 503 MB . . . . . . . . . . 0,3 1,25 20 5

Staphyl. aureus CAMP . . . . . . . . . . 5 20 5 10

Staphyl. Londres . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 10 20

bakterizid nach 48 Stunden

Staphyl.aureus 114 .............. 2,5 2,5 10 20

Staphyl. aureus 209 P . . . . . . . . . . . . 10,0 20 20 20

Staphyl. aureus 503 MB . . . . . . . . . . 0,3 1,25 20 5

Staphyl. aureus CAMP . . . . . . . . . . 5,0 20 5 10

Staphyl. Londres . . . . . . . . . . . . . . . . 5 5 10 20

Die folgenden Beispiele sind angegeben, um die Produktion und Gewinnung von F. L 1600 durch Fermentation unter submersen aeroben Bedingungen anzugeben. Die gleichen Medien können zur Fermentation in Schüttelflaschen in kleinerem Maßstab oder in Tanks in größerem Maßstab verwendet werden.

Die Erfindung soll jedoch nicht auf die in den Beispielen angegebenen Einzelheiten beschränkt sein; der Fachmann auf diesem Gebiet kann zahlreiche Modifikationen an Verfahren und Material durchführen, ohne vom Grundgedanken der Erfindung abzuweichen.

Beispiel 1 Es wurden 300-mI-Kolben mit je 60m1 eines Mediums folgender Zusammensetzung:

Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20/0

Na Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/,

Dextrose........................... 30/0

Getreide-Quellflüssigkeit ............. 1,50/0

CaC0............................. 0,70/0

bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert und dann mit je 0,25 Mol einer Sporensuspension von S. Krestomyceticus angeimpft.

Die Kolben werden bei 28°C auf einer Schüttelmaschine bebrütet. Innerhalb 7 bis 8 Tagen wird ein gutes Wachstum erhalten, und es werden ungefähr 500 mcg/ml Antibiotikum produziert.

Beispiel 2 2000-ml-Erlenmeyerkolben mit je 500 ml eines geeigneten Mediums folgender Zusammensetzung:

Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20/0

Kasein ....... « ................... 0,50/0

CaC0............................ 0,40/0

MgS 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10%

(N H4)2 S 04 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0

Zn S O4 - 7 HZ O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,0002 0/0

werden mit einer Sporensuspension von S. Krestomyceticus angeimpft. Nach 48stündigem Rühren bei 28'C werden 0,4"/, der Kultur in einen 10-1-Tank übergeführt, welcher folgendes Medium enthält:

Dextrin ........................... 20/0

Kasein . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,501,

Ca C 03 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,40/,

(N H4)2 S O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,10/0

KZ H P O4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..... 0,010/0

Getreide-Quellfiüssigkeit ............ 0,50/0

(p$ nach Sterilisation = 6,6)

Nach 7stündiger Fermentierung unter Rühren bei 28°C unter aeroben Bedingungen (1,11/Min.) hat die Kultur ihr maximales Wachstum erreicht.

Beispiel 3 Ein 2000-ml-Kolben mit 500m1 eines Mediums folgender Zusammensetzung:

Kaseinhydrolysat ................... l0/0

Na Cl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,20/0

wird 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert und mit einer Sporensuspension von S. Krestomyceticus (gezüchtet auf Kartoffelagar) angeimpft. Der Kolben wird 48 Stunden lang unter Rühren bei 28'C bebrütet.

Nach 48 Stunden wird die Kultur in einen 100-1-Tank übergeführt, welcher folgendes Medium enthält:

Sojabohnenmehl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20/,

Dextrin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29/,

CaC0............................. 0,30/,

(p$ = 6,16)

Nach 36stündiger Fermentierung unter Rühren bei 28°C unter aeroben Bedingungen werden ungefähr 15 0/0 der Kultur in einen 1000-1-Tank übergeführt, welcher ein Medium folgender Zusammensetzung enthält:

Sojabohnenmehl .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2,50/0

Dextrin ........................... 2,50/0

Treber (Distillers) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,51110

NaCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0,250/,

Sojabohnenöl ..................... 0,03

CaC0............................ 0,030/0

(p$ = 6,4 bis 6,5)

Die Fermentierung wird 80 bis 90 Stunden lang bei 28'C unter Rühren und unter aeroben Bedingungen fortgesetzt.

Beispiel 4 Zu etwa 5001 Nährflüssigkeit wird unter Rühren Oxalsäure zugesetzt (in einer Menge, die den in der Flüssigkeit enthaltenen Ca++-Ionen entspricht), worauf der pH-Wert mit Natronlauge auf 7 bis 7,5 eingestellt wird. Das Rühren wird 30 Minuten lang fortgesetzt, und die Suspension wird filtriert. Der Filterkuchen wird mit Wasser gewaschen.
Die filtrierte Lösung wird über 51 IRC 50 (Natriumphase) absorbiert.
Bei der Eluierung mit 1 n-HCl werden verschiedene getrennte Fraktionen erhalten.
Die aktiven Fraktionen werden mit einem Anionenaustauscherharz neutralisiert, unter Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird zweibis dreimal mit 11 Methanol behandelt, wobei jeweils 30 Minuten lang gerührt wird; die Suspension wird jedesmal filtriert. Durch Zusatz der Methanollösung zum 2- bis 3fachen Volumen Aceton wird das F. I. 1600-Hydrochlorid erhalten; das weiße flockige Produkt wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet; Ausbeute 80 bis 90 g.
Beispiel 5 Das F.I. 1600-Hydrochlorid wird in Wasser gelöst, und die Lösung wird filtriert. Das Filtrat wird unter Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt, worauf Triäthylaminsulfat zugesetzt wird. Nach Kühlen in einem Kühlschrank wird das ausgeschiedene Calciumsulfat abfiltriert. Die filtrierte Lösung wird unter Rühren zu Methanol zugesetzt. Nach Ende des Zusatzes wird 30 Minuten lang weitergerührt, worauf das F.I.1600-Sulfat abfiltriert und mit Methanol gewaschen wird; es wird im Vakuum bei 50°C über P205 getrocknet. Das rohe Sulfat wird durch Chromatographie auf Kohle und Celit und darauffolgende Eluierung mit verdünnter Schwefelsäure gereinigt. Beispiel 6 1 g des Sulfats, gelöst in 50 ml Wasser, wird mit einem leichten Überschuß an Natrium-p-hydroxyphenylazo-benzolsulfonat behandelt. Das ausgefällte Farbstoffsalz wird abfiltriert und mehrere Male aus heißem Wasser umkristallisiert. Aus diesem Salz kann auf folgende Weise ein sehr reines Sulfat hergestellt werden: Das Farbstoffsalz, suspendiert in Methanol, wird mit getrockneter Salzsäure behandelt. Aus der so erhaltenen Lösung wird das Hydrochlorid mit Azeton ausgefällt (Ausbeute 0,6 g). Durch Auflösen des Hydrochlorids in Wasser und Zusatz von 3 ml Triäthylaminsulfatlösung (mit einem Gehalt von 0,25 g S 04"/M1) wird das Sulfat erhalten. Das Produkt wird auf einem Filter gesammelt, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die Ausbeute an sehr reinem F. I. 1600-Sulfat beträgt 0,65 g. Die Analyse ergibt 30,570/, Kohlenstoff, 6,44 °/o Wasserstoff, 7,38 % Stickstoff und 9,08 °/a Schwefel. Infrarotspektrum von F. I. 1600-Sulfat in KBr (50/0) zeigte starke Absorptionsmaxima bei 2,94, 3,41, 6,15, 9,00, 9,52 #t, schwache Banden bei 6,82, 7,08, 7,28, 7,46, 10,70, 11,17, 11,62, 13,08 #t und Minima bei 3,09 und 10,23 p,.
Prüfung von F.I. 1600 Ein mikrobiologisches Verfahren zum Feststellen der Wirkung von F.I. 1600 beruht auf der Messung der Hemmzonen, um die Agarwell, welche Lösungen von verschiedenen serienmäßigen Verdünnungen des Antibiotikums enthalten, gegen ein mit B. subtilis ATCC 6633 angeimpftes Agarmedium. Es wird eine wäßrige Lösung von F.I. 1600-Sulfat verwendet.

Toxizität

Toxizität für Mäuse:

DLso (intravenös verabreicht) ... 110 mg/kg

DLSo (subkutan verabreicht) .... 1,062 g/kg

DL5o (oral verabreicht) . . . . . . . . 25 g/kg.

Toxizität für Hunde: Die Verabreichung einer Dosis von 20 mg/kg (intravenös) an einen gesunden Hund verursacht lediglich ein leichtes astenisches Syndrom. Toxizität für Kaninchen: Die Verabreichung einer Dosis von 2,5 mg (intracisternal) bewirkt keine Zeichen von Toxizität.
Es wurde gefunden, daß Mäuse Injektionen von 200 mg/kg (pro Tag) 2 Monate lang ohne Krankheitserscheinungen überleben.
Ratten zeigen ebenfalls keine Beeinflussung bei einer täglichen subcutanen Injektion von 200 mg/kg während 2 Monaten.
Katzen, welche täglich intramuskuläre Injektionen von 50 mg/kg erhalten, zeigen keine neurotoxischen Symptome.
Beispiel 7 1,4 g F. I. 1600-Sulfat und 5 g Kaliumbikarbonat werden in 20m1 Wasser gelöst. Es werden 3m1 Benzoylchlorid obiger Lösung bei 0°C zugesetzt, und die Mischung wird 1 Stunde lang bei 0°C gerührt, dann über Nacht zwischen 0 und 5°C und schließlich bei Raumtemperatur einige Minuten lang stehengelassen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit einer wäßrigen Natriumbikarbonatlösung, dann mit Wasser und schließlich mit Äther gewaschen. Das Produkt wird aus 40 Teilen heißem Methanol umkristallisiert. Es werden so 0,34 g F. I. 1600-Pentabenzoat als weiße Kristalle, die bei 208 bis 211'C ohne Zersetzung schmelzen, erhalten. Nach mehrmaligem Umkristallisieren aus Methanol steigt der Schmelzpunkt nicht über 208 bis 211'C. Die Analyse ergibt 60,60 °/o Kohlenstoff, 6,14"/, Wasserstoff, 6,050/, Stickstoff. Der Stoff hat die wahrscheinliche empirische Formel C53Hs5N501s' CH30H (berechnet: C 60,66, H 5,95, N 6,01). [a]D = +26 ± 2 (c = 0,3 °/o in Methanol). Beispiel 8 Eine Suspension von 0,70 g F. I. 1600 in 30 ml Methanol und 5 ml Essigsäureanhydrid wird über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Hierauf werden 3 Volumteile Aceton zugesetzt; der Niederschlag wird in wäßrigem Methanol gelöst und dann mit Aceton ausgefällt. Es werden 0,31g Pentaacetat von F. I. 1600 als amorphes Produkt mit einem Schmelzpunkt von 198 bis 204°C erhalten. [a]D = -E-62,6 ± 2 (c = 1 % in Methanol).
Die Analyse ergibt 43,23 °/o Kohlenstoff, 7,34 % Wasserstoff und 7,45 % Stickstoff. Das Produkt hat die wahrscheinliche empirische Formel C33H55N5019 - 5 Hz 0 (berechnet: C 43,27, H 7,15, N 7,65).
1 Mol Pentaacetyl F.I. 1600 in 0,02molarer Perjodatlösung verbraucht bei Raumtemperatur 0,92 Mol Perjodat (dieser Verbrauch wird nach 18 Stunden erreicht und bleibt auch nach 42 Stunden konstant). Beispiel 9 In einer Kulturflüssigkeit, welche 266 y/ml des Antibiotikums F. I. 1600 enthält (Volumen 41, Gesamtgehalt 1,06 g), wird der pH-Wert auf 8,5 eingestellt, und die Mischung wird zweimal 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit 40 g Kohle (Darco G 60) gerührt.
Die zwei abfiltrierten Kohlekuchen werden 1 Stunde lang in 600 ml einer 50°/oigen wäßrigen Lösung gerührt, welche durch Zusatz von wäßriger Salzsäure auf einen pH-Wert von ungefähr 3 gebracht wurde.
Die Mischung wird filtriert, das Filtrat mit wäßriger Natronlauge neutralisiert und auf 210 ml eingeengt (Gehalt 2100 -y/ml F. I. 1600). Die Lösung wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird in Methanol aufgenommen, filtriert, und zur filtrierten Methanollösung werden 3 Volumteile Aceton zugesetzt. Das Produkt wird abfiltriert und getrocknet. Ausbeute 1,06 g mit einem Gehalt an 33 °/o Antibiotikum.

Claims

PATENTANSPRUCH: Die Verwendung des Streptomyces-Krestomyceticus-Stammes N. C. I. B. Nr.8995 und Commonwealth Mycological Institute Nr. 79 859 zur Herstellung des Antibiotikums F. I. 1600, Aminosydin, auf biologischem Wege, Abtrennung und Gewinnung des Antibiotikums aus der Gärlösung durch Adsorption an ein festes Adsorbens, wie Kohle oder Ionenaustauscher, und Elution und gegebenenfalls Überführung in seine Salze.