DE1088975B

DE1088975B - Verfahren zum Abtrennen und Konzentrieren von Glutaminsaeure

Info

Publication number: DE1088975B
Application number: DEK31331A
Authority: DE
Inventors: Yoshiki Maruta; Masao Tanaka
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1956-07-19
Filing date: 1957-03-08
Publication date: 1960-09-15
Also published as: GB811688A; CH359445A

Description

Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abtrennen und Konzentrieren von Glutaminsäure aus Glutaminsäure enthaltenden Lösungen, ζ. Β. einer natürlichen Quelle oder einer vergorenen Kulturflüssigkeit, durch Behandeln mit einer Kombination eines stark sauren Kationenaustauschharzes, eines Anionenaustauschharzes und eines schwach basischen Anionenaustauschharzes.

Diese Ionenaustauschharze sind für qualitative und quantitative analytische Verfahren bei Aminosäuren des Proteins verwendet worden. Stein und Moore (The Journal of Biological Chemistry, 192 [1951], S. 663) haben ζ. B. eine gemischte Lösung von Aminosäuren durch Dowex 50 (Handelsname, ein stark saures Kationenaustauschharz) getrennt und quantitativ analysiert. Cannon (The Journal of Biological Chemistry, 152 [1944], S. 401) und Partridge und Brimley (The Biochemical Journal, 44 [1949], S. 513) haben saure Aminosäuren durch Amberlite IR-4B (Handelsname, ein schwach basisches Anionenaustauschharz) getrennt. Die gleichen Erfinder (Journal of Agricultural Chemical Society of Japan, 28 [1954], S. 775) haben eine gemischte Lösung von Aminosäuren in neutrale, saure und basische Aminosäuregruppen quantitativ getrennt und jede Aminosäure mit Amberlite IR-4B (Handelsname) und Amberlite IRC-50 (Handelsname, ein schwach saures Kationenaustauschharz) quantitativ bestimmt.

Bei jedem der oben beschriebenen Verfahren wird die Gewinnung der Aminosäuren durchgeführt, indem auf dem Ionenaustauschharz alle in der Flüssigkeit vorhandenen absorbierbaren Ionen absorbiert und diese Ionen dann durch ein Eluiermittel, wie unten beschrieben, verdrängt werden.

Im Falle eines schwach basischen Anionenaustauschharzes ist dieses Harz in alkalischem Medium inert. Im sauren Medium absorbiert dieses Harz alle sauren Aminosäuren wie auch Mineralsäuren oder organischen Säuren, die die Flüssigkeit sauer halten.

Im Falle eines stark basischen Anionenaustauschharzes absorbiert das Harz Anionen und alle in der Flüssigkeit vorhandenen Aminosäuren, und im Falle eines stark sauren Kationenaustauschharzes absorbiert es Kationen und alle Aminosäuren in der Flüssigkeit.

In jedem Fall ist, wenn jedes Harz getrennt verwendet wird, die Menge des erforderlichen Harzes im Hinblick auf die in der Flüssigkeit enthaltenen Menge der sauren Aminosäuren groß. Außerdem sind die Mengen an Säuren und Pufferlösungen, die als Eluiermittel zum Verdrängen der durch das Harz absorbierten Aminosäuren benötigt werden, sehr groß, und die Konzentrierung der Aminosäuren in der abfließenden Flüssigkeit ist sehr gering.

Im Vergleich zu diesen bekannten Verfahren werden Verfahren zum Abtrennen
und Konzentrieren von Glutaminsäure

Anmelder:

Fa. Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki
Kaisha, Tokio

Vertreter: Dipl.-Ing. H. Leinweber, Patentanwalt,
München 2, Rosental 7

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 19. Juli 1956

Yoshiki Maruta und Masao Tanaka, Tokio,
sind als Erfinder genannt worden

bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wesentlich kleinere Mengen der obenerwähnten Ionenaustauschharze benötigt. Hierbei wird eine Glutaminsäure und andere Aminosäuren enthaltende Flüssigkeit nacheinander mit einem stark sauren Kationenaustauschharz, einem Anionenaustauschharz und einem schwach basischen Anionenaustauschharz behandelt. Die ersten beiden Harze können die Reihenfolge miteinander wechseln, oder sie können als Gemisch verwendet werden.

Wenn die Flüssigkeit mit einem stark sauren Kationenaustauschharz behandelt wird, wird das Harz mit allen in der Flüssigkeit enthaltenen Aminosäuren und Kationen gesättigt, und im Durchlauf befinden sich zunächst Anionen. Da Glutaminsäure gegenüber einem stark sauren Kationenaustauschharz eine niedrigere Affinität als neutrale und basische Aminosäuren und Kationen hat, wird durch weiteres Zuführen der Flüssigkeit Glutaminsäure durch die letzteren wieder verdrängt und erscheint dadurch in der abfließenden Flüssigkeit. Demzufolge wird nunmehr aus der abfließenden Flüssigkeit eine Fraktion erhalten, die an Glutaminsäure reich ist, die aber von anderen sauren Aminosäuren und Anionen begleitet ist.

Durch Behandeln dieser Fraktion mit einem Anionenaustauschharz wird das Harz mit allen sauren Aminosäuren und Anionen gesättigt. Da Glutaminsäure gegenüber einem Anionenaustauschharz eine niedrigere Affinität als Anionen hat, wird sie bei weiterem Durchleiten der Lösung durch die Anionen

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wieder verdrängt, die in der nachfolgenden Flüssigkeit enthalten sind, die als Ausgangsmaterial darauf folgt. Demzufolge wird aus der abfließenden Flüssigkeit ohne Desorption durch Eluiermittel, z. B. eine Säure oder eine Pufferlösung, eine an Glutaminsäure reiche Fraktion erhalten, die von anderen sauren Aminosäuren begleitet wird. Bei der sogenannten »chromatographischen« Arbeitsweise erfolgen das Konzentrieren und Reinigen daher gleichzeitig.

Schließlich wird die Fraktion mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz behandelt. Alle sauren Aminosäuren werden auf dem Harz absorbiert. Beim Verdrängen mit einem Eluiermittel wird eine an Glutaminsäure reiche Fraktion erhalten. Durch Einstellen des p_H-Wertes der endgültigen Fraktion auf 3,2, den isoelektrischen Punkt der Glutaminsäure, kristallisiert die Glutaminsäure aus.

Als Rohmaterial wird eine Flüssigkeit verwendet, die Glutaminsäure aus einer natürlichen Quelle enthält, wie Steffens-Filtrat oder Gärungslösungen. '

Alle erhältlichen Anionenaustauschharze können verwendet werden. Als stark saures Kationenaustauschharz ist Amberlite IR-120, Dowex 50, Chempro C-20, Permutit O oder Diaion SK 1 (Handelsname), als Anionenaustauschharz IRA-400, Amberlite IR-4B, Amberlite IR-45, Dowex 1, DuoliteA-42 oder Diaion SKlOO (Handelsname) und als schwaches Anionenaustauschharz Amberlite IR-4B oder IR-45 (Handelsname) brauchbar.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird wie folgt durchgeführt: Die obenerwähnten drei Arten der Harze werden jeweils in Säulen gebracht. Das in die Säule gefüllte stark saure Kationenaustauschharz wird regeneriert, indem eine Chlorwasserstofflösung durch die Säule geleitet wird, um es in die Η-Form überzuführen, worauf mit Wasser gewaschen wird. Die Glutaminsäure enthaltende Flüssigkeit wird auf ein p_H von 3,2 bis 7, vorzugsweise 4 bis 6, eingestellt und der Säule mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1 bis 2 Volumteilen pro Volumteil Austauscher pro Stunde zugeführt. Aus der abfließenden Flüssigkeit, die ein p_H von 2,5 bis 3,5 aufweist, wird eine an Glutaminsäure reiche Fraktion erhalten. Diese Fraktion wird als das erste Konzentrat bezeichnet. Das Ausmaß der Konzentrierung an Glutaminsäure beträgt das 2- bis 4fache der Ausgangslösung.

Das in die Säule gefüllte Anionenaustauschharz wird zur OH-Form regeneriert, indem Natronlauge durch die Säule geleitet wird, worauf mit Wasser gewaschen wird. Das erste Konzentrat wird mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 1 bis 2 Volumteilen pro Volumteil Austauschharz pro Stunde durch die Säule geleitet. Aus der abfließenden Flüssigkeit mit einem p_H von 6 bis 9 wird eine Fraktion erhalten, die eine größere Konzentration an Glutaminsäure hat als die eintretende Lösung. Diese Fraktion wird als das zweite Konzentrat bezeichnet. Das Ausmaß der Konzentrierung an Glutaminsäure ist das 1- bis 2fache der Ausgangslösung.

Die mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz gefüllte Säule wird zur OH-Form regeneriert, indem eine Alkalilauge durch die Säule geschickt wird, worauf mit Wasser gewaschen wird. Wie oben beschrieben, verbleiben nur saure Aminosäuren in dem zweiten Konzentrat. Indem dieses Konzentrat durch die Säule geschickt wird, werden alle sauren Aminosäuren durch das Harz absorbiert. Dann werden durch Hindurchleiten einer I- bis 5 η-Chlorwasserstoff lösung durch die Säule die absorbierten Säuren verdrängt. Aus der abfließenden Flüssigkeit wird eine Fraktion erhalten, die eine noch höhere Konzentration an Glutaminsäure hat. Diese Fraktion wird das Endkonzentrat genannt. Das Ausmaß der Konzentrierung an Glutaminsäure ist das 2- bis 3fache der Ausgangslösung. Durch Einstellen des p_H-Wertes des Endkonzentrats auf 3,2 tritt die Kristallisation von Glutaminsäure ein. Das Gesamtausmaß der Konzentrierung der Glutaminsäure beträgt etwa das 1Ofache der ursprünglichen Ausgangslösung.

Wie oben beschrieben, kann das Rohmaterial auch umgekehrt zuerst mit einem Anionenaustauschharz und dann mit einem stark sauren Kationenaustauschharz oder mit einem Gemisch dieser Harze behandelt werden. Bei dem ersteren Verfahren wird die die Glutaminsäure enthaltende Flüssigkeit auf ein p_H unter 3,2, vorzugsweise 2 bis 3,2, eingestellt, und das erste Konzentrat aus der abfließenden Flüssigkeit mit einem p_H von 6 bis 9 enthält Kationen und alle Aminosäuren. Durch Hindurchleiten des ersten Konzentrats durch die Säule, die mit einem stark sauren Kationenaustauschharz gefüllt ist, wird das zweite Konzentrat aus der abfließenden Flüssigkeit mit einem p_H von 2,5 bis 3,5 erhalten, das saure Aminosäuren einschließlich Glutaminsäure enthält. Das letztere Verfahren ist anwendbar, wenn die Konzentration der Glutaminsäure in dem Rohmaterial im Vergleich zu der der anderen Aminosäuren verhältnismäßig hoch ist. Bei dieser Verfahrensweise wird die die Glutaminsäure enthaltende Flüssigkeit auf ein p_H von 6 bis 11, vorzugsweise 7 bis 9, eingestellt und weist die nach der Konzentrierung erhaltene abfließende Flüssigkeit ein p_H von 8 bis 9 auf und ist reich an Glutaminsäure neben einer geringen Menge anderer Aminosäuren. Die Behandlung des Konzentrats durch das dritte Harz, das schwach basische Anionenaustauschharz, ist bei den letzten beiden Verfahren die gleiche wie bei dem ersten Verfahren.

Um 100 g Glutaminsäure aus einem Rohmaterial, das diese Säure enthält, nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu gewinnen, werden 650 g des stark sauren Kationenaustauschharzes, 650 g des Anionenaustauschharzes und 400 g des schwach basischen Anionenaustauschharzes benötigt. Die Ausbeute an Glutaminsäure ist 95 bis 99%.

Beispiel 1

50 g Amberlite IR-120 (Handelsname) wurden in ein Rohr mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Länge von 25 cm gefüllt und dort zur Η-Form regeneriert, indem 1 n-Chlorwasserstoffsäure durch die Säule geleitet wurde, worauf bis zum Erreichen eines p_H-Wertes von 6 bis 7 mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Eine Glutaminsäure enthaltende Fermentationsflüssigkeit eines Mikroorganismus wurde filtriert, um die Pilze zu entfernen. Das Filtrat wurde auf ein p_H von 5,5 eingestellt und durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. geleitet. In der ersten Fraktion von 450 ecm der abfließenden Flüssigkeit wurde keine Aminosäure gefunden. Die nächste Fraktion von 350 ecm (p_H 2,5 bis 3,5), die reich an Glutaminsäure war, wurde als erstes Konzentrat erhalten.

Das Filtrat enthielt 0,19% Aminostickstoff, 0,95% Glutaminsäure, 0,05% Asparaginsäure und 0,75% Alanin. Die Konzentration der Glutaminsäure in dem ersten Konzentrat betrug 2,1%.

Die Ausbeute an Glutaminsäure im ersten Konzentrat betrug 100%, und die gewonnene Menge war 7,3 g. Das Ausmaß der Konzentrierung betrug das 2,2fache der Ausgangslösung.

Um das erste Konzentrat nunmehr mit einem anionenaustauschenden Harz zu behandeln, wurden 50 g Amberlite IRA-400 (Handelsname) in ein Rohr mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Lange von 25 cm gefüllt und zur O Η-Form regeneriert, in- dem eine 1 n-Alkalilauge durch die Säule geleitet wurde, worauf bis zum Erreichen eines p_H-Wertes von 7 mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. Das erste Konzentrat wurde durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. geleitet, wobei in der ersten Fraktion von 130 ecm der abfließenden Flüssigkeit keine Aminosäure gefunden wurde.' Die nächste Fraktion von 170 ecm (p_H 6 bis 9), die reich an Glutaminsäure war, wurde als zweites Konzentrat erhalten. Die Konzentration der Glutaminsäure in dem zweiten Konzentrat betrug 3,6%, die Ausbeute 98%. Die gewonnene Menge betrug 6,1 g. Das Ausmaß der Konzentrierung betrug das l,7fache der Ausgangslösung.

Zur weiteren Behandlung dieser Lösung mit einem schwachen Anionenaustauscher wurden 25 g Aberlite IR-4B (Handelsname) in ein Rohr mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Länge von 25 cm gefüllt und zur O Η-Form regeneriert, indem eine 1 n-Alkalilauge durch die Säule geleitet wurde, worauf mit destilliertem Wasser bis zum Erreichen eines p_H-Wertes von 7 gewaschen wurde. Eine weitere, gleiche Säule wurde hergestellt. Die beiden Säulen wurden in Reihe miteinander verbunden, wobei die eine mit A und die andere mit B bezeichnet wurde. Nachdem 150 ecm des zweiten Konzentrats von Beispiel 2 durch Säule A der beiden in Reihe miteinander verbundenen Säulen mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. geleitet worden waren, war das in Säule A gefüllte Harz mit sauren Aminosäuren gesättigt, während die restlichen sauren Aminosäuren durch das Harz in Säule B absorbiert wurden. Die in Reihe verbundenen Säulen wurden getrennt, wobei beim Eluieren von Säule A mit 2,5 n-Chlorwasserstoffsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. 50 ecm einer 10%igen Glutaminsäurelösung erhalten wurden. Beim Eluieren von Säule B mit 2,5 n-Chlorwasserstoffsäure wurden 20 ecm einer 2,0%igen Glutaminsäurelösung erhalten.

Die Ausbeuten an Glutaminsäure betrugen in Säule A 93% und in Säule B 7%. Wenn die Fraktion von Säule A mit Alkalilauge auf einen pfj-Wert von 3,2 eingestellt und in einem Kühlraum bei 5° C stehengelassen wurde, kristallisierte Glutaminsäure aus. Die gewonnenen Mengen betrugen bei Säule A 5 g und bei Säule B 0,4 g. Das Ausmaß der Konzentrierung in Säule A betrug das 2,8fache der. Ausgangslösung.

Beispiel 2

25 g Amberlite IR-120 (Handelsname) wurden zur Η-Form mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure regeneriert und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der PH-Wert 6 bis 7 betrug, und 25 g Amberlite IRA-400 (Handelsname) wurden zur OH-Form mit einer 1 n-Alkalilauge regeneriert und dann mit destilliertem Wasser gewaschen, bis der p_H-Wert 7 betrug. Die beiden Harze wurden miteinander vermischt und in ein Rohr mit 2,5 cm Durchmesser und einer Länge von 25 cm gefüllt. Eine durch Vergären mit einem Mikroorganismus erhaltene Fermentationslösung wurde filtriert, um die Pilze zu entfernen, und das so erhaltene Filtrat wurde auf ein p_H von 7,5 eingestellt. Beim Durchschicken des Filtrats durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. wurden in der ersten Fraktion von 100 ecm der abfließenden Flüssigkeit keine Aminosäuren gefunden. Ein Konzentrat der Aminosäuren wurde in der nächsten Fraktion von 150 ecm (p_H 8 bis 9) erhalten.

Das Filtrat enthielt 0,30% Aminostickstoff, 2,32% Glutaminsäure, 0,05% Asparaginsäure, 0,50% Alanin und 0,05% Valin. Die Konzentration der Glutaminsäure betrug in dem Konzentrat 3,7%.

Die Ausbeute an Glutaminsäure betrug 95%. Die gewonnene- Menge betrug 5,5 g. Das Ausmaß der Konzentrierung betrug das l,7fache der Ausgangslösung.

Zur weiteren Behandlung dieser Lösung mit einem schwachen Anionenaustauscher wurden 25 g Amberlite IR-4B (Handelsname) in ein Rohr mit einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Länge von 25 cm gefüllt und zur OH-Form regeneriert, indem eine In-Alkalilauge durch die Säule geschickt wurde, worauf mit destilliertem Wasser gewaschen wurde, bis ein Pjj-Wert von 7 erreicht war. Eine weitere, gleiche Säule wurde hergestellt. Diese beiden Säulen wurden in Reihe miteinander verbunden und als Säulen A bzw. B bezeichnet. Nachdem 140 ecm des in Beispiel 4 erhaltenen Konzentrats durch Säule A der beiden in Reihe miteinander verbundenen Säulen mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. geleitet worden waren, war das in Säule A gefüllte Harz mit sauren Aminosäuren gesättigt, während die restlichen sauren Aminosäuren durch das Harz in Säule B absorbiert wurden. Neutrale und basische Aminosäuren wurden nicht absorbiert, sondern verließen die Säule. Die in Reihe verbundenen Säulen wurden getrennt, wobei beim Eluieren von Säule A mit 3 n-Chlorwasserstoffsäure mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ccm/Min. 40 ecm einer 12%igen Glutaminsäurelösung erhalten wurden. Wenn diese Lösung mit Chlorwasserstoffgas gesättigt und in einem Kühlraum bei 5° C stehengelassen wurde, schieden sich Kristalle von Glutaminsäurehydrochlorid ab.

Die Ausbeute an Glutaminsäure war 92%. Die gewonnene Menge betrug 4,8 g. Das Ausmaß der Konzentrierung betrug das 3,2fache der Ausgangslösung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Abtrennen und Konzentrieren von Glutaminsäure aus Glutaminsäure enthaltenden Lösungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösungen mit einer solchen Geschwindigkeit durch Säulen leitet, die mit einem stark sauren Kationenaustauschharz und einem Anionenaustauschharz gefüllt sind, daß zunächst eine glutaminsäurefreie Fraktion und alsdann eine an Glutaminsäure r'eiche Fraktion abfließt und man die aus der abfließenden

. Flüssigkeit der letzten Säule erhaltene glutaminsäurereiche Fraktion mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz behandelt und die auf dem Harz absorbierte Glutaminsäure durch eine Säurelösung verdrängt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung zuerst mit einem stark sauren Kationenaustauschharz, dann mit einem Anionenaustauschharz und schließlich mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz behandelt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung zuerst mit einem Anionenaustauschharz, dann mit einem stark sauren Kationenaustauschharz und schließlich mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz behandelt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung zunächst mit einem Gemisch aus einem stark sauren Kationenaustauschharz und einem Anionenaustauschharz und anschließend mit einem schwach basischen Anionenaustauschharz behandelt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glutaminsäure enthaltendes Ausgangsmaterial Steffens-Lösung verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glutaminsäure enthaltendes Ausgangsmaterial eine vergorene Maische verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Deutsche Patentschriften Nr. 944 129, 950 556;
USA.-Patentschrift Nr. 2 528 047;
französische Patentschrift Nr. 1 025 102.