DE1082599B - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsaeure - Google Patents

Description

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DER ANMELDUNG
UND AUSGABE DER
AUSLEGESCHRIFT.·

2. JUNI 19 60

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Glutaminsäure aus Fumarsäure.

In den bisher bekanntgewordenen Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure unter Verwendung von Mikroorganismen wurden als hauptsächlichste Materialien Kohlehydrate, wie z. B. Stärke* Glucose oder andere Zucker, oder a-Ketoglutarsäure gebraucht. Die Erfinder haben festgestellt, daß alle diese Verfahren vom industriellen und wirtschaftlichen Standpunkt aus unbefriedigend sind, und sie sind durch Studien der Vergärung von Fumarsäure zu einem direkten Herstellungsverfahren von L-Glutaminsäure in außerordentlich befriedigender Ausbeute gelangt.

Wenn eine Verbindung im Zitronensäure-Gyclus (vgl. hierzu Ernest Baldwin, »Dynamic Aspects of Biochemistry«, 3. Auflage [1957], S. 447) als Substrat ausgewählt ist, wird die Menge der erzeugten L-Glutaminsäure als abhängig von dem Gleichgewicht zwischen konjugierten Enzymen angesehen. Experimente von Enzymreaktionen in tierischen Geweben, z. B. Leber in Verbindungen im Zitronensäure-Cyclus, die als Substrat gewählt wurde, haben gezeigt, daß die Menge der aus Fumarsäure umgewandelten Glutaminsäure sehr gering ist im Vergleich zu der Bildung von Zitronensäure, Bernsteinsäure oder α-Ketoglutarsäure. Dies kommt daher, daß eine bemerkenswerte Menge von Asparaginsäure durch die Wirkung von Aspartase erzeugt wird, wodurch die Bildung von Glutaminsäure weitgehend unterdrückt wird, für den Fall, daß als Substrat Fumarsäure gewählt wurde. Auch mit gewissen Bakterien, wie Escherichia coli, wurden ähnliche Ergebnisse festgestellt.

Die Erfinder haben gefunden, daß viele Arten von Mikroorganismen L-Glutaminsäure erzeugen, wenn sie unter eigenen Bedingungen in Medien kultiviert werden, die Fumarsäure als Hauptkohlenstoffquelle zusammen mit einer anorganischen Stickstoffverbindung als Stickstoffquelle enthalten. Im Hinblick auf die günstigste Aussicht für industrielle Erzeugung von L-Glutaminsäure durch Gärung aus Fumarsäure als Hauptkohlenstoffquelle haben sie nach geeigneten Mikroorganismen gesucht und viele Stämme gefunden.

Es wurde gefunden, daß die von den Erfindern isolierten Mikroorganismen, welche Fumarsäure in L-Glutaminsäure umwandeln, mit anderen Worten, daß die Mikroorganismen, welche L-Glutaminsäure im Kulturmedium anreichern, die hauptsächlich Fumarsäure als Kohlenstoffquelle enthalten, weitgehend in der Natur verteilt sind. Sie können fast überall da gefunden werden, wo üblicherweise Mikroorganismen überhaupt lebensfähig sind, beispielsweise im Erdboden und in Abwässern. Es handelt sich hauptsächlich um aerobe Bakterien oder fakultativ anaerobe Bakterien. Zu diesen Mikroorganismen gehören Pseudomonas, Xanthomonas, Protaminbakterium, Mikro-Verfahren zur Herstellung
von L-Glutaminsäure

Anmelder:

Ajinomoto Co., Inc.,
Chuo-ku, Tokio (Japan)

Vertreter: Dr. O. Faust, Patentanwalt,
Göttingen, Am Goldgraben 26

Beanspruchte Priorität:
Japan vom 16. April 1957

Tetsuo Ogawa, Shinaga-wa-ku, Tokio,

Toshinao Tsunoda, Zushi-shi, Kanagawa-ken,

Ryohei Aoki, Chofu-chidori-cho, Ota-ku, Tokio,

Kazumoto Kinoshita, Meguro-ku, Tokio,

Shinji Okumura, Nerima-ku, Tokio,
und Yasuhiro Kondo, Kawaguchi-shi, Saitama-ken

(Japan),
sind als Erfinder genannt worden

kokkus, Corynebakterium, Serratia, Alcaligenes, Achromobakterium, Flavobakterium, Escherichia, Aerobakterium, Sarcina, Proteus, Bacillus, Bakterium.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung von L-Glutaminsäure kann in der nachstehend beschriebenen Weise ausgeführt werden. Entweder wird ein Medium, das hauptsächlich Fumarsäure als Kohlenstoffquelle neben einer Stickstoffquelle, wie Ammoniumnitrat oder Harnstoff, enthält, ebenso als auch Mineralsalze, die für Mikroorganismen wesentlich sind, wie Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Ferrosulfat, nach Neutralisation verwendet oder ein Medium, das in der Hauptsache Fumarsäure enthält, zu der eine geringe Menge Zucker, wie Glucose, Fructose, Lactose, Maltose, Rohrzucker, Pentose oder Melasse, zugefügt ist, sowie organische Säuren, organische oder anorganische stickstoffhaltige Mittel, wie Sojabohnenkuchen, Fischmehl, Casein, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Malzextrakt, Koji-Extrakt oder eine Aminosäure, anorganische Salze und Vitamine, mit L-Glutaminsäure bildenden Bakterien geimpft, die aus der oben aufgeführten Mikroorganismenaufzählung gewählt werden, in einer aeroben Kultur oder einer statischen Kultur der Wachstemperatur ausgesetzt. Die eingeimpften Mikroorganismen wachsen in dem

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Medium, Fumarsäure wird assimiliert und L-Glutaminsäure wachsend in dem Medium angesammelt, wobei deren Menge gradweise anwächst in dem Maß, wie die Vergärungsperiode fortschreitet. Entgegen der Erwartung ist die Bildung von anderen Aminosäuren als L-Glutaminsäure recht gering, und es mag wohl eine kleine Menge von Asparaginsäure erzeugt werden, und zwar nur in Fällen, in denen gewisse Arten der Mikroorganismen verwendet werden. Die Trennung von L-Glutaminsäure aus der Gärmaische und die Reinigung derselben kann leicht in bekannter Weise durchgeführt werden. Beispielsweise wird eine Gärmasse, aus der die Bakterienzellen abgetrennt waren, zwecks Kristallisation der L-Glutaminsäure bei deren isoelektrischem Punkt konzentriert. Ionenaustauschharze können für die Abtrennung verwendet werden.

Beispiel 1

100 ecm eines Kulturmediums mit 1,0 g Fumarsäure, 0,1 g Glucose, 0,1 g Monokaliumphosphat, 0,02 g Magnesiumsulfat und 0,1 g Ammoniumsulfat werden mit Natriumhydroxyd auf einen p_H-Wert von 7,0 neutralisiert und mit Bacillus pumilus geimpft und unter Schütteln bei einer Temperatur von 30° C gehalten. Nach 38 Stunden wurden 0,22 g L-Glutaminsäure aus der Gärmasse erhalten. Diese Ausbeute zeigt nahezu eine quantitative Bildung von L-Glutaminsäure aus 21 mg in dem Kulturmedium enthaltenem Stickstoff.

Beispiel 2

Jede der drei Kulturen enthielt 100 ecm mit 4 g Fumarsäure, 2 g Glucose, 0,1 g Monokaliumphosphat und 0,04 g Magnesiumsulfat. Hierzu wurden je 3 ecm Ammoniakwasser (20 g/dl) hinzugefügt, mit wäßriger Kahlauge neutralisiert und sodann mit den folgenden Stämmen geimpft und die Kultur bei 30⁰C geschüttelt. Nach 72 Stunden wurden folgende Mengen L-Glutaminsäure in jeder der drei Kulturen ermittelt:

L-Glutaminsäure
Mikroorganismen (g/dl)

Bacillus pumilus Variätät α 2,80

Bacillus pumilus Variätät β 3,60

Bacillus pumilus Variätät γ 3,00

Beispiel 3

Je 100 ecm von elf Kulturmedien mit 4 g Fumarsäure, 1 g Glukose, 0,1 g Monokaliumphosphat und 0,04 g Magnesiumsulfat wurden mit 3 ecm Ammoniakwasser (20 g/dl) versetzt, mit wäßriger Kalilauge neutralisiert und mit den folgenden Mikroorganismen geimpft und die Kultur bei 3O⁰C geschüttelt. Nach 72 Stunden wurden nachstehende Mengen L-Glutaminsäure jeweils in den einzelnen Kulturen ermittelt:

L-Glutaminsäure

Mikroorganismen (g/dl)

Pseudomonas aeruginosa 0,20

Xanthomonas pruni 0,20

Micrococcus pyogenes 0,30

Escherichia coli 0,60

Aerobacter aerogenes 0,50

Serratia marcescens 0,50

Bacillus subtüis Nr. 1 2,00

Bacillus subtüis Nr. 2 1,10

Bacillus cereus 0,20

Bacillus megatherium 0,30

Bacillus natto 0,40

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure, dadutch gekennzeichnet, daß man ein Medium, das hauptsächlich Fumarsäure als Kohlenstoffquelle neben Mineralsalzen enthält, die für das Leben von Mikroorganismen wesentlich sind, angenähert neutralisiert mit einer oder mehreren Arten von Mikroorganismen aus dem Genus Micrococcus, Serratia, Escherichia, Aerobacter, Bacillus oder Bacterium impft, die Kultur der Wachstemperatur aussetzt und dann die L-Glutaminsäure abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus pumilus verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Bacillus subtüis verwendet.

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