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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und einen ArthritisChip in Gestalt
eines mehrteiligen Werkzeugs zur Diagnostik, Verlaufskontrolle sowie
zur Charakterisierung der rheumatoiden Arthritis (RA) und der Osteoarthrose
(OA). Der ArthritisChip besteht zum einen aus einem DNA-basierten
Array, der die relevanten Gensequenzen enthält, um spezifische Genexpressionsprofile
insbesondere bei Patienten mit RA und OA bestimmen zu können, ferner
aus einer geeigneten Software, die es ermöglicht, aus den komplexen m-dimensionalen Geneexpressionsdaten
ein individuelles Expressionsprofil eindeutig als RA- bzw. OA-zugehörig zu identifizieren, bzw.
die Zugehörigkeit
zu einer solchen Erkrankung auszuschließen. Ferner ermöglicht es
diese Software, die Zugehörigkeit
zu einer Untergruppe der RA oder OA zu definieren und zu indizieren,
den weiteren Krankheitsverlauf zu prognostizieren und erfolgreiche
Therapieempfehlungen zu erstellen. Weitere Bestandteile des ArthritisChips
sind n-dimensionale Referenz-Genexpressionsprofile, die unter Verwendung
der relevanten Gene u.a. RA- und OA-spezifische Genexpressionsprofile
darstellen, um über
den Abgleich Diagnostik-Entscheidungen zu ermöglichen. Schließlich ist
es mit Hilfe des ArthritisChips möglich, den molekularen Einfluss
neuer Arzneien und Therapien zu bestimmen und im Verlauf zu kontrollieren.
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Stand der
Technik
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Problemstellung
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RA
und OA (Abkürzungsverzeichnis
hinter den Beispielen) gehören
zu dem rheumatischen Formenkreis. Ihre Entstehung ist unbekannt,
beide Erkrankungen sind bis heute unheilbar und verursachen direkte und
indirekte Kosten, die zusammen über
denen der Herz-Kreislauf-Erkrankungen liegen. Die RA ist durch Entzündung und
zunehmende Zerstörung
der Gelenke charakterisiert, darüber
hinaus treten bei einem Teil der Patienten auch extra-artikuläre Symptome
auf. Die OA ist durch Gelenkzerstörung primär ohne Entzündung charakterisiert, in späteren Stadien
wird aber auch hier regelmäßig Entzündung beobachtet.
Insbesondere die RA ist sehr heterogen und die Erkrankung weist
bzgl. der Einzelmerkmale bei weitem keine hundertprozentige Penetranz
auf.
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In
der Therapie der RA werden derzeit u.a. Methotrexat, Azathioprin
sowie verschiedene Therapieformen, die sich der TNF-α-Blockade
bedienen, eingesetzt. Diese Ansätze
erlauben es, jeweils bei einem Teil der Patienten ein Fortschreiten
der Erkrankung über
einen gewissen Zeitraum einzudämmen
oder zu verhindern. Die Wirkprinzipien sind nicht vollständig bekannt,
und es existiert keine Verlaufskontrolle, anhand derer sich der
Therapieerfolg messen ließe.
Darüber
hinaus gibt es auch keine Möglichkeit
vorherzusagen, ob ein Patient therapierbar ist oder ob er sich als
Therapieversager erweisen wird und eine alternative Medikation benötigt.
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Etablierte
Werkzeuge
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Patienten
mit RA (1 – Referenzen
hinter den Beispielen) oder OA werden im klinischen Alltag beurteilt nach
Krankheitsverlauf, klinischen Untersuchungen (Befallsmuster der
Gelenke, Organbefall), Entzündungsparametern
(Blutsenkung, C-reaktives Protein, Rheumafaktor), genetischer Disposition über HLA-Marker
und erweiterte Organdiagnostik durch Routineparameter der Labordiagnostik
(Leberenzyme, Muskelenzyme, Nierenretentionswerte). Diese Parameter
erlauben keine prognostische Abschätzung des weiteren Krankheitsverlaufes.
Insbesondere ist in der Frühphase
der Erkrankung oftmals keine gesicherte Diagnosestellung möglich. Jedoch
sind bei der Mehrzahl der Patienten nach erst einem Jahr Krankheitsdauer
irreversible Gelenkschäden eingetreten.
Früh-Arthritis-Studien
haben jedoch gezeigt, dass konventionelle Therapie bei sehr frühzeitiger Anwendung
erfolgreich die Progression der Erkrankung verhindern kann. Dies
verdeutlicht die dringende Notwendigkeit einer frühen und
gesicherten Diagnosestellung.
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Auch
die Verlaufskontrolle für
den Therapie-Erfolg wird bislang mittels der genannten Methoden
durchgeführt.
Einige dieser Parameter verändern
sich nicht oder nur sehr langsam, so dass eine vielwöchige bis
Monate andauernde Verlaufsbeobachtung erforderlich ist, um die Wirksamkeit
eines Medikamentes beurteilen zu können. Nicht selten muss wegen
der Progredienz der Erkrankung auf ein anderes Medikament umgestellt werden.
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Experimentelle
Ansätze
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Zur
Verbesserung der Diagnostik der RA und OA wurden zahlreiche experimentelle
Ansätze
entwickelt. Hierzu zählen
im Wesentlichen der Nachweis einer erhöhten oder erniedrigten Genexpression
eines oder weniger bestimmter Gene sowie der Nachweis von Autoantikörpern. In
keinem der Fälle
konnte jedoch bisher ein spezifischer Krankheitsnachweis geführt werden.
Dies hat seine Ursachen in erster Linie in der großen Heterogenität der Erkrankungen
und ferner in den Ansätzen,
die traditionell eine Mono- oder Oligokausalität der Erkrankungen zugrunde
legen. So sind beispielsweise zur Therapie-Entwicklung chronischer entzündlicher
Gelenkerkrankungen und anderer entzündlicher, infektiöser oder
tumoröser
Erkrankungen auf der Grundlage von Genom-, Proteom- und Immunomdaten
Diagnose-Werkzeuge vorgeschlagen worden, die auf der Verwendung
von Gensequenzen sowie abgeleiteten mRNAs und Proteinen sowie auf
Antikörpern
mit Spezifität
für die
abgeleiteten Proteine zur Charakterisierung von entzündlich-rheumatischen
und nicht-entzündlichen
rheumatischen Gelenkerkrankungen, Autoimmunerkrankungen und Infektionserkrankungen
beruhen (WO 02/097125).
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Das Wesen
der Erfindung
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, chronische Gelenkerkrankungen
besser erkennbar und behandelbar zu machen. Diese Aufgabe wird durch
die Bereitstellung eines Verfahrens zur Diagnostik und des nachfolgend
beschriebenen ArthritisChips in Gestalt eines mehrteiligen Werkzeugs
(Kombinationswerkzeugs) zur Diagnostik, Verlaufskontrolle, Therapiekontrolle,
Therapieentwicklung, zu Therapieentscheid und zur molekularen Definition
der rheumatoiden Arthritis und der Osteoarthrose beim Menschen gelöst. Dieses
Werkzeug, der erfindungsgemäße ArthritisChip,
besteht aus 1.) bestimmten Zusammenstellungen von Gensequenzen,
2.) einer geeigneten Software, die in der Lage ist, m-dimensionale
Genexpressionsprofile multiparametrisch mit n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen
zu vergleichen, zu gruppieren oder Gruppen zuzuordnen und 3.) aus
n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen, die als Referenz
für die
Diagnostik, Sub-Diagnostik/-Typisierung
und Therapieentscheide erforderlich sind.
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Eine
Komponente des erfindungsgemäßen ArthritisChips
besteht aus einem DNA-basierten
Array (bekannter Bestandteil), der eine Zusammensetzung von Gensequenzen
aufweist, die neu ist und die geeignet ist, um spezifische m-dimensionale
Genexpressionsprofile insbesondere bei Patienten mit Verdacht auf
RA oder OA oder bei Patienten mit gesicherter RA oder OA bestimmen
zu können.
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DNA-Arrays
in verschiedenen Zusammensetzungen (genomweit oder mit einem bestimmten
Schwerpunkt wie beispielsweise Entzündung) sind bereits zuvor beschrieben
und als Werkzeuge zur Diagnostik bezeichnet worden. Kein zuvor beschriebener
DNA-Array oder kein zuvor beschriebenes Werkzeug konnte jedoch bislang
nachweislich für
die Diagnostik der RA oder OA herangezogen werden. Obwohl unter
Verwendung genomweiter DNA-Arrays theoretisch eine Gesamtmenge an
Genexpressionsinformationen zu gewinnen ist, die die reine m-dimensionale
Genexpressionsinformation übersteigt,
die unter Verwendung der hier zum Schutz angemeldeten Gruppen und
Untergruppen von Genen und Gensequenzen zu gewinnen ist, eignet sich
lediglich der letztgenannte Ansatz für die Diagnostik der RA und
OA sowie die weiteren beschriebenen Answendungsgebiete. Die Ursache
hierfür
ist zweifältig:
1.) Zu große
Grundgesamtheiten; DNA-Arrays, die aus einer zu großen Zahl
uninformativer Gene oder Gensequenzen bestehen sowie DNA-Arrays,
die aus zu wenigen der informativen Gene für die beschriebenen Anwendungen
bestehen, führen
in einer Anwendung wie hier zum Schutz angemeldet zu einer entweder
uneindeutigen Aussage oder aber im Falle des genomweiten Ansatzes
zu gar keiner relevanten Aussage. Aufgrund der Heterogenität der Erkrankungen
RA und OA sowie aufgrund der Heterogenität der Menschheit an sich ergibt
sich eine Informationsvielfalt, die mit Software aus dem Stand der
Technik nicht aufzuarbeiten ist, um über das Rauschen (den Hintergrund)
hinaus statistisch sowie inhaltlich relevante Aussagen treffen zu
können.
2.) Der erfindungsgemäße ArthritisChip
weist außer
der besonderen auf die Anwendung zugeschnittene Zusammenstellung
der Gene und Gensequenzen zusätzlich weitere,
qualitativ völlig
andere Information auf als lediglich ein DNA-Array. Diese Mehrinformation
besteht u.a. aus den klinischen Daten, Krankheitsverläufen, Therapieverläufen, die
zusätzlich
in die Erstellung der n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofile
eingehen. Die Herleitung der n-dimensionalen
Referenz-Genexpressionprofile stellt ein wesentliches und überraschendes
Merkmal der Erfindung dar, und aufgrund der Vorerfahrung vieler
Arbeitsgruppen, die auf dem Gebiet der RA und OA forschen, galt
es bislang als unwahrscheinlich, dass eine entsprechende Zusammenstellung
von Genen und Gensequenzen zur Diagnostik und Charakterisierung
der Erkrankung überhaupt
gelingen könnte.
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Eine
weitere Komponente besteht aus einer geeigneten Software (bekannter
Bestandteil), die dadurch charakterisiert ist, dass sie komplexe
m-dimensionale Genexpressionsprofile multiparametrisch miteinander sowie
mit zuvor abgelegten n-dimensionalen
Referenz-Genexpressionsprofilen vergleichen kann. Die Software ist
ferner dadurch charakterisiert, dass sie den Grad der Identität oder Ähnlichkeit
eines getesteten Genexpressionsprofils mit dem eines Referenz-Genexpressionsprofils
mit statistischen Methoden bestimmen kann. Abhängig von der Art der Referenz-Genexpressionsprofile
ist somit durch Anwendung der Software auf ein mit o.g. Array ermitteltes
m-dimensionales Genexpressionsprofil eine Zuordnung desselben zu
definierten Klassen wie z.B. RA, non-RA, OA, non-OA, einer Untergruppe zu
RA oder OA, ein bestimmtes Erkrankungsstadium, ein bestimmtes Therapiestadium,
einer Erfolgsaussicht einer bestimmten Therapie o.a. möglich. Außerdem ist
es vorteilhaft aber nicht zwingend erforderlich, dass die Software
dadurch charakterisiert ist, dass sie selbstlernend ist, d.h. dass
sie aufgrund statistischer Abstandsmessung in der Lage ist, aus
m-dimensionalen Genexpressionsprofilen selbständig Gruppen zu definieren,
deren m-dimensionale Expressionsvektoren eine bestimmte statistische
Nähe zueinander
aufweisen. Die Software ist weiterhin dadurch charakterisiert, dass sie
in der Lage ist, aufgrund zusätzlich
eingegebener Information z.B. über
die Art der Erkrankung (RA, non-RA, OA, non-OA, Erkrankungsstadium,
Therapiestadium etc.) vorgegebene n-dimensionale Referenz-Genexpressionsprofile
ggf. zu ändern
oder stärker
zu gewichten.
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Eine
weitere – neue – Komponente
des ArthritisChips sind n-dimensionale Referenz-Genexpressionsprofile, die sich zum
einen aus Gensequenzen der gelisteten Gensets ergeben. Wenngleich
die gelisteten Gene und Gensequenzen mehrheitlich bekannt sind,
ist die besondere Zusammenstellung neu, da die Zusammenstellung
einen spezifischen Informationsgewinn bewirkt, der bespielsweise
nicht durch eine zufällige
Zusammenstellung der Gensequenzen ermöglicht würde. Zum anderen bestehen die
n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofile
aus m-dimensionalen Genexpressionsvektoren, die sich u.a. wiederum
aus der Genexpressionshöhe
und -richtung zusammensetzen, sowie aus weiteren Informationen über Klassenzugehörigkeiten
(RA, non-RA, OA, non-OA, Erkrankungsstadium, Therapiestadium etc.). Über den
multiparametrischen Vergleich mit diesen oder ähnlichen oder davon abgeleiteten
n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen ist es möglich, ein
zu analysierendes Genexpressionsprofil entsprechend zu klassifizieren.
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Das
Verfahren zur Diagnostik, Verlaufskontrolle und Therapie-Entscheid
stellt den Ablauf von Probengewinnung und -prozessierung dar, die
Hybridisierung mit einem speziell konzipierten ArthritisArray zur
Generierung eines m-dimensionalen Genexpressionsprofils, sowie der
Vergleich dieses Profils mit n-dimensionalen Referenz-Genexpressionssignalen,
sowie die anschließende
Aussage bzgl. Diagnostik, Verlaufskontrolle und Therapie-Entscheid.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
zur Diagnostik, Verlaufskontrolle, Therapiekontrolle, Therapieentwicklung,
zum Therapieentscheid und zur molekularen Definition der rheumatoiden
Arthritis und der Osteoarthrose, besteht aus folgenden Schritten:
- a) Extrahieren, Amplifizieren und Markieren
von RNA aus geeigneten Gewebeproben
- b) Erstellen eines DNA-Arrays unter Verwendung genspezifischer
Sonden aus einem, mehreren oder allen in den Tabellen 1 bis 14 gelisteten
Genen
- c) Hybridisierung der aufbereiteten Gewebeprobe aus a) mit dem
Array b)
- d) Scannen des hybridisierten Arrays sowie Erstellen eines m-dimensionalen
Genexpressionsprofils aus den Hybridisierungssignalen der Gewebeproben-RNA
mit dem ArthritisArray
- e) Multiparametrischer Vergleich des m-dimensionalen Genexpressionsprofils
mit n-dimensionalen
Referenz-Genexpressionsprofilen, die zuvor als diagnostisch für eine Erkrankung
(RA, OA), für
eine Untergruppe einer Erkrankung (Sub-RA, Sub-OA), für ein bestimmtes
Krankheitsstadium oder für
einen Therapieerfolg oder -misserfolg definiert wurden.
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Für das Erstellen
des DNA-Arrays werden Standardverfahren verwendet. Die durch die
Hybridisierung mit der Patientenprobe erhaltenen Signale werden
normalisiert, vorzugsweise ebenfalls nach Standardverfahren.
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Das
m-dimensionale Genexpressionsprofil wird mittels einer Software
erzeugt. Dieses Profil ist u.a. abhängig von der Anzahl der zugrunde
liegenden Gensequenzen, der Expressionshöhe, der Expressionsrichtung
und den hieraus resultierenden vektoriellen Abständen zu den Expressionsvektoren
der übrigen
Gensequenzen des Arrays. Der Vergleich des m-dimensionalen Genexpressionsprofils
mit n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen,
die zuvor als diagnostisch für
eine Erkrankung (RA, OA), für
eine Untergruppe einer Erkrankung (Sub-RA, Sub-OA), für ein bestimmtes
Krankheitsstadium oder für
einen Therapieerfolg oder -misserfolg definiert wurden, erfolgt
mittels einer weiteren Software, die multiparametrische Analysen
und Vergleiche sowie statistische Berechnungen erstellt. Das Referenzprofil
ist also zusätzlich
zu dem zu testenden abhängig
u.a. von der Diagnose des Spenders eines Referenzgewebes (RA, non-RA,
OA, non-OA, Untergruppe der RA oder OA), eines bestimmten Krankheitsstadiums
oder eines bestimmten Therapiestadiums bzw. eines prospektiven Therapieerfolgs
oder -misserfolgs.
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Als
Gewebeprobe wird z.B. Synovialgewebe, PBMCs oder SFMCs verwendet.
Bei der Hybridisierung handelt es sich um eine (Mikro-)Array-Hybridisierung.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist des weiteren dadurch gekennzeichnet, dass über den Vergleich das Patienten-Genexpressionsprofil
einer bestimmten Diagnose zugeordnet wird (RA, non-RA, OA, non-OA, Untergruppe
von RA oder OA; bestimmtes Krankheitsstadium, bestimmte Reaktion
auf Medikation / Therapie etc.).
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Erfindungsgemäßes Verfahren
sowie erfindungsgemäßer ArthritisChip
sind prinzipiell analog anwendbar auf Tier-Modelle für die RA,
OA oder Untergruppen der RA oder OA unter Verwendung derselben Gensequenzen
und Genexpressionsprofile wie in den Tabellen 1–14 gelistet, oder aber unter
Verwendung der homologen Sequenzen der betreffenden Spezies, in
der das Tiermodell etabliert ist.
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Die Neuheit
des Ansatzes ArthritisChip
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Die
Erfindung trägt
den Tatsachen Rechnung, dass rheumatische Erkrankungen im Allgemeinen,
und RA und OA im Besonderen, multifaktorielle und sehr heterogene
Erkrankungsformen darstellen und dass deren Ursachen nach wie vor
ungeklärt
sind. Während
sich herkömmliche
Herangehensweisen auf einen oder wenige Faktoren konzentrieren,
als handele es sich bei dem genannten Formenkreis eben doch um mono- oder oligokausale
Erkrankungen, so bedient sich der erfindungsgemäße ArthritisChip einer Vielzahl
von Genen, die parallel analysiert und bewertet werden. Das Werkzeug
ArthritisChip geht jedoch über
die Parallelbetrachtung noch maßgeblich
hinaus, indem es neuheitlich n-dimensionale
Genexpressionsprofile nutzt und/oder generiert, die spezifisch für eine Erkrankung
sind und diese Erkrankung damit von Nicht-Erkrankung eindeutig abgrenzen.
Bedeutsam, weiterhin neuheitlich und überraschend ist, dass es sich
nicht um ein einziges Genexpressionsprofil handelt, das die Abgrenzung
gewährleisten
soll, sondern auch hier um eine Vielzahl von Profilen. Bestimmte
Genexpressionsprofile kommen ausschließlich bei Patienten mit einer
der genannten Erkrankungen vor und sind somit diagnostisch für diese.
Ein einzelnes Profil ist aber typischerweise nicht bei allen Patienten
derselben Erkrankung exprimiert, da es auch gleichzeitig ein Abbild
des Erkrankungszustandes des Patienten darstellt. Dieser unterscheidet
sich aufgrund der Heterogenität
der Erkrankung oftmals von dem eines anderen Patienten derselben
Erkrankung, in einem stärkeren
Ausmaße
allerdings unterscheiden sich zwei Patienten derselben Erkrankung
RA von einem Patienten mit OA oder einer anderen rheumatischen Erkrankung,
so dass eine Abgrenzung der Krankheitsbilder ermöglicht wird.
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Der
erfindungsgemäße ArthritisChip
wird erst möglich
durch den Einsatz von High-Throughput-Technologien
wie DNA-Arrays, die die parallele Bestimmung extrem vieler Parameter
(Gene und deren Expressionslevel) erlaubt (2, 3). So wurde in den
Vorarbeiten für
das Design der ArthritisChips eine nahezu genomweite Genexpressionsanalyse
u.a. von RA- und OA-Patienten durchgeführt. Die bei diesen Analysen
als informativ identifizierten Gene sind in Tabellen 1–14 aufgelistet.
Informativ bedeutet in diesem Zusammenhang, dass ihr Genexpressionslevel
im Zusammenhang mit den anderen Genexpressionslevels einer Gruppe
(Tabelle) und in Zusammenarbeit mit einer geeigneten Auswertungssoftware geeignet
ist, eine eindeutige Diagnoseentscheidung bzgl. RA oder OA zu leisten.
Für die
alleinige Fragestellung nach eindeutiger Diagnostik weist insbesondere
die Tabelle 1 starke Redundanz auf. Daher erstrecken sich die Ansprüche sowohl
auf die Gesamtheit der gelisteten Gene oder davon abgeleiteten Gensequenzen,
als auch auf geeignete Untergruppen von Genen oder davon abgeleiteten
Gensequenzen, die immer noch in der Lage sind, die diagnostische
Diskriminierung der Expressionsprofile zu ermöglichen.
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Die
Redundanz der in den Tabelle 1–14
gelisteten Gene ist beabsichtigt und ergibt sich aus der Tatsache,
dass nicht ausschließlich
die Diagnostik der RA, sondern auch die der OA gewährleistet
wird. Schließlich ermöglichen
die gelisteten Gensets auch die Subklassifizierung der Erkrankungen,
sowie das Monitoring des Krankheitsverlaufs, einschließlich des
Monitorings von Therapieverläufen.
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Der
erfindungsgemäße ArthritisChip
wird ferner erst möglich
durch den Einsatz von Software, die in der Lage ist, Multiparameter-Analysen
durchzuführen
und Gruppenzugehörigkeit
eigenständig
oder aufgrund erlernter Gruppencharakteristika zu determinieren.
Eine derartige Software ist aufgrund n-dimensionaler Referenz-Genexpressionsprofile,
die sich auf Gensequenzen der in den Tabellen 1–14 gelisteten Gene bezieht, in
der Lage, sehr robust Therapie- und Krankheitsverlaufs- sowie Diagnostik-Prädiktion
zu leisten. Die Prädiktion
ist derart robust, dass eine Verwässerung der Referenz-Genexpressionsprofile
bis zu einem gewissen Grad die Prädiktionsfähigkeit nicht beeinflusst.
Daher wird u.a. der Anspruch erhoben, eine Verwässerung der Referenzprofile
um bis zu 20% der in einem Set (Tabelle) gelisteten Gensequenzen
zu erlauben.
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Die
Neuheit des dargestellten Ansatzes ergibt sich 1.) aus der Erstmaligkeit
einer eindeutigen Diagnostik der RA, 2.) aus der Erstmaligkeit einer
eindeutigen Diagnostik der OA, 3.) aus der Erstmaligkeit einer eindeutigen
Subklassifizierung von RA und OA, 4.) aus der spezifischen Zusammenstellung
von Gensequenzen für
die benannten Zwecke [erst die Zusammenstellung in diesen oder davon
abgeleiteten Formen ermöglicht
einen Informationsgewinn, der durch eine zufällige oder beliebige Zusammenstellung
von Genen nicht ermöglicht
würde],
5.) aus der Definition n-dimensionaler Referenz-Genexpressionsprofile, 6.) aus dem multiparametrischen
Vergleich zwischen zu testenden m-dimensionalen Genexpressionsprofilen
mit den benannten oder künftig
generierten n-dimensionalen
Referenz-Genexpressionsprofilen zu den benannten Zwecken, 7.) aus
der Kombination eines DNA-Arrays zur Bestimmung m-dimensionaler
Genexpressionsprofile und einer Software zum multiparametrischen
Vergleich zu testender m-dimensionaler Genexpressionsprofile mit
n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen zu den benannten
Zwecken.
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Für die ArthritisChip-Analyse
wird Patientengewebe (betroffene Synovialmembran, PBMCs [Peripheral
Blood Mononuclear Cells] der SFMCs [Synovial Fluid Mononuclear Cells])
benötigt.
Aus dem Gewebe wird RNA nach Standardprotokollen extrahiert, amplifiziert
(4), geeignet markiert (5) und für
die Hybridisierung auf dem Arthritischip verwendet. Die in den Tabellen
1–14 gelisteten
Gene (Accession-Nummer GeneBank – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)
dienen als Vorlage, genspezifische Sequenzen oder Sonden abzuleiten.
Diese Sonden werden für
die Erstellung eines Array verwendet, z.B. durch die Anwendung von
Standardverfahren (6, 7, 8). Die nach der Hybridisierung mit der
Patientenprobe erhaltenen Signale werden z.B. nach standardisierten
Verfahren mittels einer dafür
geeigneten Software normalisiert. Aus einer Probe oder Patientenprobe wird
dann schließlich
ein m-dimensionales Genexpressionsprofil erzeugt, das mit n-dimensionalen
Referenz-Genexpressionsprofilen abgeglichen werden kann, die zuvor
als diagnostisch für
eine Erkrankung (RA, OA), für
eine Untergruppe einer Erkrankung (Sub-RA, Sub-OA), für ein bestimmtes
Krankheitsstadium oder für einen
Therapieerfolg oder -misserfolg definiert wurden.
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Für die Definition
der diagnostisch bedeutsamen n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofile wurden
Microarrays der Fa. Affymetrix verwendet (U.S. Patente No 5,445,934;
5,744,305; 5,700,637; 5,945,334;
EP
619321 ;
EP 373203 ),
die eine nahezu genomweite Analyse ermöglichen. Die genomweite Analyse
des Transkriptoms eines gegebenen Gewebes eines bestimmten Patienten
resultierte typischerweise in einer Vielzahl nicht-regulierter Gene,
sowohl im Vergleich zu anderen Patienten wie auch im Vergleich zu
bestimmten sog. Haushaltsgenen. Andere Gene konnten hingegen – insbesondere
im Vergleich mit anderen Patienten oder mit Kontrollgruppen – als in
die eine oder andere Richtung und mit unterschiedlichem Grad reguliert
identifiziert werden. Hierunter fallen sowohl Gene, die aus der
Einzelbetrachtung bereits als Kandidatengene für die RA oder OA bekannt waren,
als auch solche Gene, die bisher nicht mit der einen oder anderen Erkrankung
in Verbindung gebracht wurden, oder gar solche Sequenzen, deren
Funktion bislang völlig
unbekannt ist.
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Nach
vorheriger Eliminierung der Signale nicht-regulierter Gene war es über etablierte
Software (GeneSpring, Eisen Software u.a.) möglich, z.B. über k-means
oder hierarchisches Clustern eine eindeutige Diskriminierung der
RA von non-RA sowie OA von non-OA zu erzielen. Ferner war es möglich, RA
und OA in Sub-Gruppen aufzuspalten. Die ermittelten Genexpressionsprofile
wurden stichprobenartig auf der Ebene einzelner Gene mittels RT-PCR
(real-time Polymerase Chain Reaction), in situ-Hybridisierung und/oder
Immunhistochemie bestätigt.
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Material und
Methoden
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Patienten
und Gewebeasservierung
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Patienten
wurden nach den ACR-Kriterien für
RA (1) und OA (9) ausgewählt.
Synovialgewebe wurde in RPMI 1640-Medium (handelsübliches
Zellkulturmedium; Moore, G. E. et al., J. Am. Assoc. 199, 519–524, 1967)
unter Zusatz von Penicillin und Streptomycin (je 1000/ml) vom Operationssaal
direkt ins Labor gebracht, freipräpariert und in flüssigem Stickstoff
schockgefroren. Langzeitlagerung erfolgte bei –80°C. Es wurden für die Hybridisierung
auf Affymetrix Arrays Normalspender-, OA- und RA-Synovialgewebeproben
verwendet.
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RNA-Isolation
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Zur
RNA-Gewinnung wurden die Gewebeproben homogenisiert: Gewebemengen <50mg Feuchtgewicht
wurden mit Mörser
und Pistill unter Kühlung
mit flüssigem
Stickstoff zu Pulver zerrieben und in (RLT-Puffer, Firma Qiagen,
Hilden, Deutschland – www.qiagen.com/literature/handbooks/rna/rny96/1019545_PREHB_RNY96_prot2.pdf)
lysiert. Größere Gewebemengen
wurden mit einem Gewebe-Homogenisator; IKA-Ultra-Turrax T 25 (Jahnke & Kunkel, Staufen) in eiskalter Guanidinium-Isothiocynat-haltiger
Lösung
(RLT-Puffer) zerkleinert. Die RNA-Isolierung erfolgte nach einem
Standardprotokoll (10) mit anschließender RNA-Extraktion aus der
wässrigen
Phase (QIAGEN-RNaesy-Kit, httpa/www.qiagen.com/literature/rnalit.asp#mini).
Die RNA wurde in 30–100μl RNAse-freiem
Wasser eluiert.
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Zur
Qualitätskontrolle
wurde die optische Dichte (OD) bei 260 nm (OD260) gemessen, das
Verhältnis OD260/OD280nm
bestimmt und eine Gelelektrophorese in 1%iger Agarose durchgeführt. DNA-Kontaminationen
konnten gegebenenfalls entweder im Gel detektiert oder nach Erststrangsynthese
in einer PCR mit einem Intron-Primer für Glycerinaldehyd-3-Phosphat
Dehydrogenase (GAPDH) nachgewiesen werden. In diesen Ausnahmefällen wurde
zusätzlich
mit DNAse verdaut, entsprechend dem Protokoll von QIAGEN.
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Erststrangsynthese
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Für die cDNA-Synthese
wurde Superscript II Reverse Transcriptase (RT), einschließlich des 5-fach-Reaktionspuffers
(Invitrogen/Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland; http://www.invitrogen.com) verwendet.
Die eingesetzten RNA-Mengen betrugen 3-5μg für die semiquantitative PCR
sowie 10–20μg für die Array-Hybridisierungen
in einem Endvolumen von 20μl.
Der Reaktionsansatz für
die Umschreibung in cDNA enthielt folgende Komponenten: 500ng des
jeweiligen Oligonukleotids (Oligo(dT)12-18;
T7-Oligo (dT24)) als Primer, 50mM Tris,
pH 8.3, 75mM KCl, 3mM MgCl2, 10mM Dithiothreitol,
deoxy-Nukleosid-Triphosphat
(dNTP) als Mischung der Nukleosidtriphosphate ATP, GTP, TTP, CTP
in 1mM Endkonzentration, 40U RNase-Inhibitor and 20U Superscript TMII RT. Die Inkubationsdauer betrug 90min,
gefolgt von der Inaktivierung der Enzyme durch Erhitzen auf 72°C.
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Zweitstrangsynthese
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Zur
cDNA wurden 90μl
Aqua dest. pipettiert, 30μl
5-fach-Zweitstrangpuffer (500mM KCl, 50mM Ammoniumacetat, 25mM MgCl2, 0,75mM beta-Nikotinamid-Adenin Dinukleotid
(β-NAD)
und 0,25mg/ml bovinem Serumalbumin sowie 3μl einer 10mM dNTP-Lösung und
Enzymlösung
(1μl E.coli
Ligase (10U/μl),
4μl DNA
Polymerase I (10U/μl)
und 1 μl
RNAse H (2U/μl);
Invitrogen/Life Technologies, Karlsruhe, Deutschland). Die Inkubation
betrug 2 Stunden bei 16°C.
Nach Zusatz von 2μl
einer T4-DNA-Polymerase (5U/μl)
wurde für
weitere 30 min. bei 16°C
inkubiert.
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Microarray-Hybridisierung
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Es
erfolgten Hybridisierungen mit MicroArrays (HU95A; HU95B, HU95C,
HU95D und HU95E) der Firma Affymetrix (Affymetrix Inc., Santa Clara,
USA http://www.affymetrix.com). Die Synthese der markierten Proben
erfolgte nach Herstellers-Angaben. Die fluoreszenzmarkierte Probe
wurde nach Umschreibung mit einem Oligo-dT24-Primer
synthetisiert, der eine T7-Polymerase-Bindungsstelle besitzt. Die
Markierungsreaktion erfolgte mit T7-RNA-Polymerase und biotinylierten dNTPs
entsprechend dem Hersteller-Protokoll (ENZO-Biochem, New York, USA, http://www.enzo.com/entrance.html).
Proben und Referenzproben wurden auf separaten Arrays hybridisiert.
Der Vergleich der Signal-Intensitäten erfolgte nach Normalisierung.
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Auswertung
der Chipergebnisse- Entscheidungsmatrix
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Die
Roh-Genexpressionsdaten wurden global normalisiert unter Nutzung
der GeneChip-Software MAS 5.0 (Affymetrix). Die Daten wurden auf
Gene analysiert, die durchgängig
entweder höher
oder niedriger reguliert waren, um Listen von Kandidatengenen zu
erhalten und diese auf Expressionsklassen zu testen (MicroDB 2.0;
DMT 3.0 (httpa/www.affymetrix.com/products/software/specific/dmt.affx)).
Regulation wurde bei einem Cut-Off von 2-facher Regulation bei einer
Signifikanz von p<0.05
(Whitney U test) definiert bei den Vergleichen von RA mit non-RA
und OA mit non-OA.
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Cluster analysis – hierarchical
and k means
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Für die Cluster-Analyse
wurden u.a. die Software von M. Eisen (httpa/rana.lbl.gov./EisenSoftware.htm)
sowie für
die nicht-hierarchischen Ansätze
GeneSpring 4.2.1 (Silicon Genetics) verwendet. Um nicht-informative
Gene, die nicht wesentlich reguliert sind, zu eliminieren, wurden
für Berechnungen
nur die Gene berücksichtigt
herausgefiltert, die 1. present calls in allen Proben einer Krankheits-
oder Kontrollgruppe aufwiesen und die 2. eine mindestens 2-fache
Regulation in mindestens 10% der Vergleiche aufwiesen.
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RA-
und OA-regulierte Gene wurden sowohl nach ihrer linearen Genexpression
klassifiziert wie auch nach ihrem n-dimensionalen Genexpressionsprofil über die
Erkrankungs- und Kontrollgruppen. Hierfür wurde die regulierte Gesamtheit
der Gene einem k-means-Clustering unterworfen, das auf die Erzeugung
von 6 Clustern eingestellt wurde.
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Durch
beide Technologien konnte bereits auf der Basis der gefilterten
Gene eine eindeutige Diskriminierung der jeweiligen Krankheits-
und Kontrollgruppen erzielt werden. Es wurden hierarchische Bäume in Kombination
mit k-means Clustering und Korrelationsmessung (Pearson) verwendet.
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Semiquantitative
PCR
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Für Gene,
die über
RT-PCR stichprobenartig überprüft werden
sollten, wurden geeignete Primer designed (DNASTAR Primer Select
Software, DNASTAR Inc., Madison, USA http://www.dnastar.com/) und
synthetisiert (Gibco-Life Technologies, Karslruhe, Deutschland).
Semiquantifizierung der PCR-Produkte erfolgte am GeneAmp 5700 unter
Verwendung des Sybr-Green-PCR-Core Kit (Applied Biosystem, Weiterstedt,
Germany; http://europe.appliedbiosystems.com/). Quantifizierung
erfolgte über
GAPDH und β-Actin
als Standard.
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Immunhistochemie
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Eine
Probe der Synovialmembran wurde für die histopathologische Beurteilung
verwendet. Dazu wurden Kryoschnitte in einer Dicke von 6μm angefertigt,
luftgetrocknet und anschließend
in einem 1:1 Gemisch aus Aceton und Methanol fixiert. Die Hämatoxilinfärbung wurde
nach Standardprotokollen durchgeführt und nach histopathologischen
Beurteilungskriterien unterteilt (11).
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Merkmale der
Erfindung
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Die
Merkmale der Erfindung gehen aus den Ansprüche und aus der Beschreibung
hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form
von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit
dieser Schrift Schutz beantragt wird. Diese Merkmale setzen sich
aus bekannten Elementen – den in
den Tabellen benannten Genen oder ihren Teilsequenzen – und neuen
Elementen – dem
neuen ArthritisChip mit den dazugehörenden n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen
und der geeigneten Software, die in ihrer Kombination zu den erfindungsgemäßen Werkzeugen
führen
und eine neue Diagnostik und Therapie-Entwicklung bei entzündlichen
Gelenkerkrankungen ermöglichen.
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Die
erfindungsgemäße Verwendung
des neuen ArthritisChips liegt
- – in der
Untersuchung von Blutproben oder Gewebeproben in der medizinischen
Diagnostik, Verlaufskontrolle, Therapiekontrolle, Therapieentwicklung,
im Therapieentscheid und in der molekularen Definition der rheumatoiden
Arthritis und der Osteoarthrose sowie darin,
- – dass
der ArthritisChip als molekulares Werkzeug zur Entwicklung von Therapiekonzepten,
die eine direkte oder indirekte Beeinflussung der Expression der
in Anspruch 1 und 2 benannten Gene oder Gensequenzen oder der abgeleiteten
Proteine beinhaltet, eingesetzt wird.
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Die
Erfindung wird an Ausführungsbeispielen
näher erklärt, ohne
sie auf diese Beispiele zu beschränken.
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Ausführungsbeispiele
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Beispiel 1: Design ArthritisChip
und klinische Anwendung
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Ein
ArthritisChip wird synthetisiert nach der Genliste aus Tabelle 1
(alternativ nach einer Genliste aus Tabelle 2–14).
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Typischerweise
wird ein korrespondierendes Set von Oligonukleotiden synthetisiert,
das die Gene eindeutig repräsentiert.
Es kann dabei die Gesamtheit der in Tabelle 1 gelisteten Gene zu
Grunde gelegt werden, oder aber eine Teilmenge; ferner können auch
weitere Gene zusätzlich
zu den gelisteten repräsentiert
werden. Der so konzipierte ArthritisArray stellt den Teil des Werkzeuges
ArthritisChip dar, der der Patientenproben-Testung dient.
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Ferner
wird eine geeignete Software ausgesucht, die dadurch charakterisiert
ist, dass sie multiparametrische Analysen und Vergleiche, statistische
Berechnungen leisten kann. Optimal ist die Software auch dadurch
charaktersiert, dass sie selbstlernend ist, d.h. im Falle des ArthritisChips,
dass sie aus m-dimensionalen Genexpressionsprofilen automatisch
Gruppenbildung leisten kann bzw. anhand von vor-diagnostizierten
n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen Diagnostik bei undiagnostizierten
Proben leisten kann. Dies kann z.B. die von M. Eisen entwickelte
Software sein, oder aber die von Silicon Genetics entwickelte GeneSpring-Software.
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Schließlich wird
ein n-dimensionales Referenz-Genexpressionsprofil erstellt. Dies
kann z.B. durch Vorgabe eines Genexpressionsprofils geschehen, wie
es sich aus Tabelle 1 und/oder Tabellen 1–14 ableitet. Wiederum ist
es möglich,
das gesamte Profil zu verwenden oder eine Teilmenge oder aber die
Gesamtheit durch Hinzufügen
weiterer Dimensionen (Gene, Genexpressionslevel, Diagnose, Subdiagnose,
Medikation/Therapie) zu erweitern. Das Referenzprofil kann jedoch
auch entweder ausschließlich
oder aber zusätzlich
zu exakt definierten Referenzpunkten "erlernt", also automatisch abgeleitet, modifiziert
und gewichtet werden.
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Eine
geeignete Patientenprobe – typischerweise
Blut, Synovialflüssigkeit
oder Synovialmembran als Biopsie, Mini- oder Mikrobiopsie – wird auf
RNA aufbereitet und für
die Hybridisierung vorbereitet. Es erfolgt eine Hybridisierung unter
standardisierten Bedingungen mit dem wie oben konzipierten ArthritisArray.
Durch die weiteren Prozeduren mit dem ArthritisArray (Waschen, Scannen,
Normalisierung) wird ein m-dimensionales Genexpressionsprofil des
Patienten / der Patientenprobe gewonnen. Dieses Genexpressionsprofil
wird durch Einsatz der o.g. Software und des o.g. n-dimensionalen
Referenz-Genexpressionsprofil-Sets multiparametrisch verglichen. Über diesen
Vergleich wird das Patienten-Genexpressionsprofil einer bestimmten
Diagnose zugeordnet (RA, non-RA,
OA, non-OA, Untergruppe von RA oder OA; bestimmtes Krankheitsstadium, bestimmte
Reaktion auf Medikation / Therapie etc.).
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Der
ArthritisChip stellt somit ein Kombinationswerkzeug aus DNA-Array,
Software zur Multiparameteranalyse sowie n-dimensionalen Referenz-Genexpressionsprofilen
dar. Die Auswahl der Gene oder Gensequenzen des ArthritisChip kann
variieren und richtet sich z.B. nach den in Voruntersuchungen ermittelten
Ergebnissen. Sie richtet sich nach dem Informationsgehalt, den ein
bestimmtes Gen für
die Diagnostik, die Verlaufskontrolle oder insbesondere die Medikamentenkontrolle
für die
RA und/oder die OA aufweist. Für
die einzusetzende Software ist zu fordern, dass diese multiprarametrische
Analysen und Vergleiche sowie statistische Wertungen zu leisten
in der Lage ist; optimalerweise kann diese auch aufgrund von im
Verlauf der Nutzung zugeführter – gesicherter – Daten
weitere Zuordnungen bzw. Veränderungen
in den Zuordnungs-/Klassifikationskriterien erlernen. Die n-dimensionalen
Genexpressionsprofile richten sich z.B. zunächst nach den aus den Vorversuchen
beschriebenen; deren Zusammensetzung ist variabel insbesondere im
Hinblick auf Therapiekonzepte, die in der Zukunft entwickelt werden.
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Beispiel 2: Anwendung
in der klinischen Diagnostik
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Ein
Patient weist Gelenkbeschwerden auf, die in ihrer Gesamtheit auf
eine frühe
RA hindeuten, obwohl die erforderlichen derzeitigen Kriterien hierfür noch nicht
erfüllt
sind (z.B. die Beschwerden dauern seit 4 Monaten an; insgesamt sind
vier Gelenke entzündliche
geschwollen (Arthritis); dabei sind die betroffenen Gelenke nicht
symmetrisch befallen; die morgendliche Gelenksteife dauert etwa
eine halbe Stunde an; ein Gelenk weist bereits radiologische Veränderungen
auf; der Rheumafaktor ist negativ; keine familiäre oder genetische (Shared
Epitope) Prädisposition
liegt vor).
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Zur
abschließenden
Diagnostik wird Gewebe (Blut [zur Gewinnung von PBMCs], Synovialflüssigkeit [zur
Gewinnung von SFMCs] oder Synovialmembran) entnommen. Das Gewebe
wird wie in Beispiel 1 ausgeführt
auf RNA aufgearbeitet, um eine Hybridisierung auf einem ArthritisArray
durchzuführen
und über
den Abgleich mit den relevanten n-dimensionalen Genexpressionsprofilen
mittels Software eine eindeutige Diagnose stellen zu können. Ferner
erlaubt der Abgleich festzustellen, welche verfügbare Therapie / Kombinationstherapie
die bestgeeignete für
diesen Patienten ist.
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Beispiel 3: Anwendung
für Therapiebeurteilung
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Ein
RA-Patient weist fortschreitende entzündungsbedingte Zerstörungen in
mehreren Fingergelenken auf, begleitet von Schmerzen und Schwellungen.
Der Patient erhält
eine sog. Basistherapie von wöchentlich 20mg
Methotrexat. Zum Therapie-Entscheid wird Gewebe (Blut [zur Gewinnung
von PBMCs], Synovialflüssigkeit
[zur Gewinnung von SFMCs] oder Synovialmembran) entnommen. Die Aufarbeitung
erfolgt wie in Beispielen 1 und 2 beschrieben. Als ArthritisArray
kommt entweder der dort ausgeführte
Standard zum Einsatz, oder aber ein solcher, der aufgrund seiner
Genauswahl sowie des dazugehörigen
n-dimensionalen
Genexpressionsprofils besonders geeignet für den Therapie-Entscheid bei
Therapieversagern ist. Das Ergebnis könnte z.B. den Therapieentscheid
für einen
Wechsel auf eine bestimmte anti-TNFa-Therapie sein.
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Abkürzungsverzeichnis
- ACR
- American College of
Rheumatologie
- Affy
- ID Affymetrix Identifier,
Identifikationsnummer der benannten GeneChips
- cDNA
- complementary DNA,
copy DNA
- DNA
- Desoxyribonucleinsäure (desoxyribonucleic
acid)
- DpnII
- von Diplococcus pneumoniae
- dNTP
- Desoxynukleotidtriphospate
(equimolare Mischung aus dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
- GAPDH
- Glycerinaldehydphosphatdehydrogenase
- HLA-System
- Histokompatibilitäts-Antigene
(HLA – human
leucocyte antigen)
- mRNA
- Messenger-Ribonucleinsäure
- NAD
- Nikotinamidadenindinukleotid
- NCBI
- National Center for
Biotechnology Information
- ND
- Normal Donor (Normalspender)
- OA
- Osteoarthrose
- PCR
- Polymerase-Kettenreaktion
- RA
- Rheumatoide Arthritis
- RNA
- Ribonucleinsäure
- RF
- RF regulation factor,
Regulationsfaktor
- RPMI
- handelsübliches
Zellkulturmedium, Verdünnungsmedium
RPMI 1640; Moore, G. E. et al., J. Am. Assoc. 199, 519–524, 1967)
- Rsal
- DNA-Restriktionsenzym
Rsal von Rhodopseudomonas sphaeroides
- RT
- Reverse Transcriptase
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