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Gebinet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Mikropartikel
mit einer Trägerstruktur
sowie mit einem an die Trägerstruktur gebundenen
monoklonalen Antikörpern
(mAb), Verwendungen solcher Antikörper sowie ein Verfahren zur
Herstellung solcher Mikropartikel.
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Hintergrund der Erfindung
und Stand der Technik.
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Es existieren verschiedene Erkrankungen bei
Warmblütern,
menschlich oder tierisch, wobei die Anzahl verschiedenartiger Blutzellen
gegenüber
dem Gesundzustand verringert oder unzureichend aktiv ist.
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Eine erste solche Gruppe von Erkrankungen ist
eine pathologisch erniedrigte T-Zellzahl, insbesondere CD4-T-Zellzahl
gemeinsam, wie beispielsweise bei AIDS oder leukämischen Erkrankungen in Verfolg von
Chemo- oder Strahlentherapie.
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Eine zweite Gruppe von Erkrankungen,
bei der die Zahl oder die Aktivität einer bestimmten Untergruppe
von T-Zellen, die beim gesunden Menschen die immunologische Toleranz
aufrecht erhalten, verringert oder in ihrer Funktion gestört ist,
umfaßt
autoimmun-inflammatorische Erkrankungen. Beispiele sind rheumatoide
Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen,
Insulin-pflichtiger Diabetes, Multiple Sklerose sowie das Guaillan-Barré-Syndrom.
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Eine dritte Gruppe von Erkrankungen
wird Granulozytopenie (z.B. Neutropenie) bzw. Monozytopenie genannt
und betrifft die Granulozyten. Als Ursachen für diese Erkrankung kommen in
Frage: i) verminderte Granulozytopoese bzw. Monozytopoese (aplastische
Störung)
aufgrund von Knochenmarksschädigung,
beispielsweise durch Chemikalien, wie Benzol, Medikamente, wie Zytostatika,
Immunsupressiva, AZT und/oder Chloramphenicol (dosisabhängig, toxisch)
oder wie Phenylbutazon, Goldverbindungen, selten Chloramphenicol
(dosisunabhängig
durch pharmakokinetische Reaktionen), Strahlen oder Autoantikörper gegen
Stammzellen (bei manchen Fällen
von Immunneutropenie), aufgrund von Knochenmarksinfiltration (Leukämien, Karzinome, maligne
Lymphome) und/oder aufgrund von Osteomyelosklerose, ii) Reifungsstörungen der
Granulozytopoese, beispielsweise durch kongenitale Reifungsstörungen der
Myelopoese, Kostmann-Syndrom (Reifungsstop der Myelopoese im Stadium
des Promyelozyten), zyklische Neutropenie, Myelodysplasie-Syndrom,
Vitamin B12- oder Folsäuremangel
mit ineffektiver Granulo-, Erythro- und/oder Thrombopoese. Übliche Therapien
umfassen die Gabe von Wachstumsfaktoren der Granulozytopoese (beispielsweise
G-CSF und GM-CSF).
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Eine vierte Gruppe wird Thrombozytopenie genannt.
Als Ursachen kommen in Frage: i) verminderte Thrombozytopoese im
Knochenmark (aplastische Störung
bzw. verminderte Megakaryozytenzahl im Knochenmark) aufgrund von
Knochenmarksschädigung,
beispielsweise durch Chemikalien, wie Benzol, Medikamente, wie Zytostatika
und/oder Immunsupressiva, Strahlen Infektionen, wie z.B. HIV, oder Autoantikörper gegen
Megakaryozyten (bei manchen Fällen
von Immunthrombozytopenie), aufgrund von Knochenmarksinfiltration
(Leukämien,
Karzinome, maligne Lymphome) und/oder aufgrund von Osteomyelosklerose,
ii) Reifungsstörungen
der Megakaryozyten (Megakaryozyten im Knochenmark normal oder erhöht) mit
ineffektiver Thrombo- Erythro- und/oder Granulopoese mit Megaloblasten,
Riesenstäben
u.a. aufgrund von Vitamin B12- oder Folsäuremangel. Übliche Therapien umfassen das
Weglassen verdächtiger
Medikamente, Thrombozytensubstitution (bei Bildungsstörungen im
Knochenmark: Thrombopoetin) sowie MGDF (Stimulation der Proliferation
und Ausreifung von Megakaryozyten.
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Eine fünfte Gruppe bilden die aplastischen Anämien bzw.
Knochenmarksversagen mit Aplasie/Hypoplaie des Knochenmarks und
Panzytopenie (Stammzellenerkrankung). Eine angeborene aplastische
Anämie
ist beispielsweise die Fanconi-Anämie. Häufiger sind die erworbenen
aplastischen Anämien, wie
idiopatische aplastische Anämie
(Ursache unbekannt) und sekundäre
aplastische Anämien
durch Medikamente, toxische Stoffe, ionisierende Strahlungen und
Virusinfekte (s.o.). Supportive Therapieansätze umfassen die Substitution
von Erythrozyten/Thrombozyten. Kausale Therapieansätze umfassen
die Knochenmarkstransplantation oder Stammzellentransplantation,
Immunsuppressive Therapien (z.B. ATG) und andere Therapiemaßnahmen,
wie Gabe von Zytokinen (GM-CSF, G-CSF, MGDF, und/oder Thrombopoetin).
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Schließlich kommt in Begleitung der
akuten Leukämie
oft Anämie,
Thrombozytopenie und/oder Granulozytopenie, vor. Therapien umfassen
die Substitution von Erythrozyten und Thrombozyten nach Bedarf bzw.
die Anregung der Granulopoese durch G-CSF und/oder GM-CSF, die Chemotherapie
und Knochenmarks- und/oder Stammzellentransplantation.
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Den vorstehenden Erkrankungen der
ersten und zweiten Gruppe ist gemeinsam, daß die betroffenen Blutzellen
solche sind, die CD28 auf ihrer Oberfläche tragen. Der dritten bis
sechsten Gruppe ist gemeinsam, daß die betroffenen Blutzellen
solche sind, die demgegenüber
kein CD28 auf ihrer Oberfläche tragen.
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Zum Verständnis der Erfindung ist weiterhin folgender
technologischer Hintergrund wichtig. Die Aktivierung ruhender T-Zellen
zur Proliferation und funktionellen Differenzierung erfordert zunächst die Besetzung
zweier Oberflächenstrukturen,
sogenannter Rezeptoren: 1. des Antigenrezeptors, der von Zelle zu
Zelle eine unterschiedliche Spezifität besitzt und für die Erkennung
von Antigenen, z. B. viralen Spaltprodukten, notwendig ist; sowie
des auf allen ruhenden T-Zellen mit Ausnahme einer Untergruppe der CD8
T-Zellen des Menschen gleichermaßen exprimierten CD28 Moleküls, welches
natürlicherweise
an Liganden auf der Oberfläche
anderer Zellen des Immunsystems bindet. Man spricht von der Costimulation
der antigenspezifischen Immunreaktion durch CD28. In Zellkultur
können
diese Vorgänge
nachgestellt werden durch Besetzung des Antigenrezeptors sowie des
CD28-Moleküls
mit geeigneten mAbs. Im klassischen System der Costimulation führt weder die
Besetzung des Antigenrezeptors noch die des CD28-Moleküls allein
zur T-Zellproliferation, die Besetzung beider Rezeptoren ist jedoch
effektiv. Diese Beobachtung wurde an T-Zellen des Menschen, der Maus
und der Ratte gemacht.
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Dagegen sind auch CD28-spezifische
mAbs bekannt, die allein die T-Zellproliferation einleiten können. Eine
solche superagonistische, d. h. von der Besetzung des Antigenrezeptors
unabhängige
Aktivierung ruhender T-Lymphozyten durch CD28-spezifische mAb, wurde
in folgenden Systemen beobachtet: in der Literaturstelle Brinkmann
et al., J. Immunology, 1996, 156: 4100–4106 wurde gezeigt, daß ein sehr
kleiner Anteil (5 %) menschlicher T-Lymphozyten, die durch das Fehlen
des Oberflächenmarkers CD45
RO der Gruppe der ruhenden T-Lymphozyten zugeordnet werden können, durch
den normalerweise Costimulation erfordernden CD28-spezifischen mAb
9.3 bei Zusatz des Wachstumsfaktors Interleukin-2 (IL-2) ohne Besetzung
des Antigenrezeptors aktiviert wird. In der Arbeit von Siefken et
al., Cellular Immunology, 1997, 176: 59–65, wurde gezeigt, daß ein auf
konventionellem Wege, d.h. durch Immunisierung von Mäusen mit
menschlichen T-Zellen, hergestellter CD28-spezifischer mAb in Zellkultur
eine Untergruppe menschlicher T-Zellen ohne Besetzung des Antigenrezeptors
zur Proliferation aktivieren kann, wenn CD28 durch diesen mAb besetzt
wird und die zellgebundenen mAb zusätzlich durch weitere Antikörper miteinander
vernetzt werden. Den insofern bekannten Antikörpern ist gemeinsam, daß nur ein
kleiner Anteil der T-Zellen aktivierbar ist.
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In der Arbeit von Tacke et al., Eur.
J. Immunol., 1997, 27: 239–247
wurden zwei Arten von CD28-spezifischen monoklonalen Antikörpern mit unterschiedlichen
funktionellen Eigenschaften beschrieben: costimulatorische mAb,
die die Aktivierung ruhender T-Zellen nur bei gleichzeitiger Besetzung
des Antigenrezeptors costimulieren; und superagonistische mAb, die
ohne Besetzung des Antigenrezeptors T-Lymphozyten aller Klassen
in vitro und im Versuchstier zur Proliferation aktivieren können. Beide
insofern bekannte mAb rühren
aus einer Immunisierung mit Zellen, auf denen Ratten-CD28 exprimiert
ist und sind durch auf ihre jeweiligen beschriebenen Eigenschaften
gerichtete unterschiedlichen Selektionen erhältlich. Schließlich ist
aus der Literaturstelle
WO 98/54225 ein
weiterer human CD28 spezifischer superagonistischer mAb bekannt,
nämlich
CMY-2.
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Überraschenderweise
lassen sich gemäß der Literaturstelle
DE-100 50 935 A1 mit
superagonistischen CD28-spezifischen mAb bei in vivo Applikation
aber auch Blutzellen stimulieren, welche kein CD28 tragen.
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Die insofern bekannten superagonistischen mAb
genügen
in ihrer stimulatorischen Wirkung zwar allen Anforderungen, es wäre jedoch
wünschenswert,
weniger mAb für
einen definierten stimulatorischen Effekt zu benötigen. Darüber hinaus ist die Stimulation
von T-Lymphozyten durch superagonistische CD28-spezifische mAb bisher
auf zwei Systeme beschränkt,
die jeweils mit Nachteilen behaftet sind: Isolierte T-Lymphozyten
können
in Zellkultur oft nur dann durch solche mAb stimuliert werden, wenn zuvor
die Kulturschalen mit Antikörpern
beschichtet wurden, die mit den eingesetzten superagonistischen mAb
reagieren und die sekundär
quervernetzen. Bei Verwendung ungetrennter Präparationen peripherer Blutzellen,
die auch T-Lymphozyten enthalten, sowie bei in vivo Applikation
können
die superagonistischen mAb auch als lösliche Substanz eingesetzt werden;
dies liegt vermutlich daran, daß die
sekundäre
Quervernetzung durch sog. Fc-Rezeptoren auf den nicht-T-Lymphozyten
erfolgt, die mit dem konstanten Teil der superagonsitischen mAb,
dem sog. Fc-Teil, reagieren. Diese Abhängigkeit von Fc-Rezeptoren
ist u.U. wegen des variablen Anteils Fc-Rezeptor-positiver Zellen
in Präparationen
peripherer Blutzellen sowie wegen der durch verschiedene Fc-Rezeptor-Allele
bedingten Variabilität
der Antikörperbindungsfähigkeit
problematisch. Darüber
hinaus ist für
eine wiederholte in vitro Stimulation von T-Lymphozyten durch lösliche superagonistische
mAb der wiederholte Zusatz Fc-Rezeptor-exprimierender nicht-T-Zellen
erforderlich. Für
den Einsatz beim Menschen erfordert dies zusätzliche logistische und sicherheitstechnische
Maßnahmen.
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Bekannt ist es T-Zellen in Kultur
dadurch zu vermehren, daß Kügelchen
eingesetzt werden, an welchen sowohl CD28-spezifische costimulatorische mAb
als auch TCR (CD3) spezifische mAb gebunden sind. Hierbei ist zunächst von
Nachteil, daß zwei
verschiedene Substanzen benötigt
werden. Dies erfordert einen beachtlichen Aufwand bei der Herstellung unter
GMP Bedingungen, welche für
zur Therapie bestimmte Präparate
gesetzlich vorgeschrieben sind. Weiterhin ist von Nachteil, daß jede dieser
Substanzen in relativ hoher Konzentration eingesetzt werden muß, da aufgrund
der gemeinsamen Immobilisierung auf einem Kügelchen nicht alle Moleküle für die notwendigerweise
simultane Bindung Zielzellen allein schon aus sterischen Gründen zur
Verfügung
stehen.
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Technisches Problem der
Erfindung.
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Der Erfindung liegt daher das technische Problem
zu Grunde, Mittel zur Verfügung
zu stellen, mit welchen sich Blutzellen stimulieren lassen, wobei die
Menge an benötigten
mAbs niedriger ist als bei Einsatz der gleichen mAbs in Lösung, welche
die Stimulation von der Anwesenheit bzw. der Qualität Fc-Rezeptor
tragender nicht-T-Zellen unabhängig macht,
und welche unter GMP Bedingungen einfacher herstellbar sind.
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Grundzüge der Erfindung und bevorzugte
Ausführungsbeispiele.
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Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt
die Erfindung Mikropartikel mit einer Trägerstruktur sowie mit an die
Trägerstruktur
gebundenen CD28-spezifischen superagonistischen monoklonalen Antikörpern (mAb)
oder einer Mimikryverbindung hierzu. Überraschenderweise wird für einen
definierten stimulatorischen Effekt mittels solchermaßen immobilisierter
mAb eine geringere Menge an mAbs benötigt bzw. wird bei gleicher
Menge ein stärkerer
stimulatorischer Effekt erreicht. Dies wird zudem erreicht, ohne
daß ein
TCR Signal benötigt
wird. Die Bindung von TCR spezifischen Antikörpern oder anderen costimulatorischen
Komponenten an der Trägerstruktur
ist nicht erforderlich, wodurch auch sterische Probleme einer Costimulation
durch immobilisierte Substanzen vermieden werden. Bei einer in vitro
Stimulation von T-Zellen werden in der Zellkultur (neben dem Medium)
nur zwei Komponenten benötigt,
die T-Zellen und
die erfindungsgemäßen Mikropartikel.
Es entfällt
die Notwendigkeit für "Feeder" Zellen oder die Beschichtung
von Plastikoberflächen
mit Antikörperpräparaten,
die die mAbs quervernetzen.
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In diesem Zusammenhang ist als weiterer Vorteil
von besonderer Bedeutung, daß zur
Herstellung erfindungsgemäßer Mikropartikel
nur ein einziger Antikörper
erforderlich ist, was die Herstellung unter GMP Bedingungen erheblich
vereinfacht.
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Im Einzelnen kann die Bindung der
mAb an die Trägerstruktur
auf die unterschiedlichste Weise erfolgen. So ist es möglich, daß die mAb
direkt und über
elektrostatische Kräfte,
van der Waals Kräfte, hydrophobe
Wechselwirkungen, vorzugsweise jedoch kovalent, an die Oberfläche der
Trägerstruktur gebunden
sind. Die mAb können
aber auch indirekt über
eine vorzugsweise kovalent mit der Oberfläche der Trägerstruktur verbundenen Spacerverbindung an
die Oberfläche
der Trägerstruktur
gebunden sein.
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Als Spacerverbindung kommen grundsätzlich alle
organischen Moleküle
in Frage, welche einerseits eine mit reaktiven Gruppen der Oberfläche der
Trägerstruktur
reaktive Gruppe aufweisen und andererseits in der Lage sind, mAbs
zu binden. Dabei kann die Bindung der mAbs über elektrostatische Kräfte, van
der Waals Kräfte,
hydrophobe Wechselwirkungen oder kovalent erfolgen. Die Spacerverbindung
kann insbesondere ausgewählt
sein aus der Gruppe bestehend aus "organische Polymere, Peptide, Proteine,
Immunglobuline, und Kombinationen solcher Substanzen". Die Spacerverbindung
sollte physiologisch verträglich
sein.
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Hinsichtlich der Trägerstruktur
ist deren Zusammensetzung unkritisch, solange eine Bindung der mAb
oder einer Spacerverbindung an der Oberfläche einrichtbar ist. Es versteht
sich, daß die
Materialien der Trägerstruktur,
jedenfalls soweit diese mit Zellen oder einer Lösung in Kontakt treten können, physiologisch
verträglich
sein sollten. Zweckmäßigerweise
wird die Oberfläche
der Trägerstruktur durch
ein organisches Polymer gebildet, welches vorzugsweise ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus "Polystyrol,
Polyurethan, Polyester, Polyvinylpyridin, Poyvinylamin, Polyethylenimin,
Chitosane, und Mischungen solcher Polymere". Das organische Polymer kann zum Zwecke
der kovalenten Bindung von mAbs oder Spacerverbindungen reaktive Gruppen
aufweist, welche vorzugsweise Glycidylether ist. Im Falle der Glycidylethergruppe
erfolgt eine kovalente Bindung eines Proteins oder Peptids durch Reaktion
primärer
Amingruppen des Proteins oder Peptids mit dieser Gruppe.
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Je nach eingesetztem Polymer kann
es sich empfehlen, daß das
organische Polymer oberflächenaktiviert
ist durch Behandlung mit einem Aktivierungsreagenz, welches vorzugsweise
p-Toluensulphonylchlorid ist.
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Der Durchmesser der Trägerstruktur
liegt zweckmäßigerweise
im Bereich von 0,1 μm
bis 100 μm,
vorzugsweise im Bereich von 1 μm
bis 20 μm, insbesondere
im Bereich von 1 μm
bis 10 μm.
Die Partikelgröße kann
beispielsweise mittels der Laserdiffraktometrie (Mastersizer x,
Malvern Instruments, Herrsching) oder der Photonen Korrelations
Spektroskopie (Zetasizer 4, Malvern Instruments, Herrsching) bestimmt
werden. Die Oberfläche
der Trägerstruktur
kann das 1- bis 10-fache, vorzugsweise das 1- bis 4-fache, der geometrischen
Oberfläche,
angenommen als eine glatte Kugeloberfläche, betragen.
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Geeignete Trägerstrukturen sind beispielsweise
magnetische Beads, wie sie für
die Zellseparation mittels Magneten verwendet werden, beispielsweise
Dynabeads der Firma Dynal, oder auch SiO2 Partikel.
Weiterhin ist es möglich,
Trägerstrukturen zu
verwenden, welche vorzugsweise biologisch abbaubar sind, wodurch
die Mikropartikel einem Patienten bedenkenlos verabreicht werden
können.
Geeignete Polymere für
solche Trägerstrukturen
sind beispielsweise in den Literaturstellen WO 01/05875, Kissel
et al., Advanced Drug Delivery Reviews 54: 99–134 (2002), beschrieben. Bei
ersteren handelt es sich im Kern um Polyethylenimine (PEI) und Derivate hiervon.
Biologisch abbaubare Polymere können auch
ladungsmodifizierte Polyester, Polyvinylpyridine oder Polyvinylamine
sein.
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Die Erfindung lehrt weiterhin die
Verwendung von erfindungsgemäßen Mikropartikeln
zur Stimulation von Blutzellen, insbesondere T-Lymphozyten, B-Lymphozyten,
Granulozyten, Monozyten und/oder Thrombozyten. Dabei kann die Stimulation in
vitro oder in vivo (letzteres insbesondere im Falle der CD28-negativen
Zellen) erfolgen. Im Falle der T-Lymphozyten werden zumindest mehrere
Untergruppen stimuliert. Daher ist auch die Verwendung zur Herstellung
einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Erkrankungen
mit reduzierten Blutzellzahlen, insbesondere reduzierten T-Lymphozytenzahlen,
von immunpathologischen Erkrankungen (Beispiele s.u.) oder zur Potenzierung der
Immunreaktion bei Impfungen umfaßt, wobei einem Patienten eine
Blutprobe entnommen wird, wobei optional aus der Blutprobe die Blutzellen
isoliert werden, wobei die Blutzellen in vitro unter Zugabe einer
physiologisch wirksamen Dosis an Mikropartikeln kultiviert werden,
und wobei die so erhaltenen Blutzellen optional galenisch zur Injektion
oder Infusion hergerichtet werden. Ebenso ist die Verwendung erfindungsgemäßer Mikropartikel
zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung
von Erkrankungen mit reduzierten Blutzellzahlen, von immunpathologischen
Erkrankungen (beispielsweise rheumatoide Arthritis, entzündliche Darmerkrankungen,
Insulin-pflichtiger Diabetes, Multiple Sklerose oder das Guillain-Barré-Syndrom)
oder zur Potenzierung der Immunreaktion bei Impfungen umfaßt, wobei
die Mikropartikel zur Injektion oder Infusion galenisch hergerichtet
sind. Die galenische Herrichtung zur Injektion kann für die i.m.,
i.p. oder i.v. Injektion sein.
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Die Erfindung betrifft schließlich ein
Verfahren zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mikropartikeln mit den
folgenden Verfahrensschritten: a) es werden Mikropartikel mit einer
aus einem oder mehreren verschiedenen organischen Polymeren gebildeten
Oberfläche
hergestellt, b) optional wird die Oberfläche aktiviert, c) die so erhaltenen
Mikropartikel werden mit einer Lösung
enthaltend CD28-spezifische superagonistische mAb inkubiert, wobei
die mAb vorzugsweise kovalent an die Oberfläche gebunden werden, oder c') die so erhaltenen
Mikropartikel werden zunächst
mit einer Lösung
enthaltend eine Spacerverbindung inkubiert, wobei die Spacerverbindung
vorzugsweise kovalent an die Oberfläche gebunden wird, optional
erfolgt danach eine Waschverfahrensstufe, und anschließend werden
die Mikropartikel mit der gebundenen Spacerverbindung mit einer
Lösung
enthaltend CD28-spezifische superagonistische mAb inkubiert, wobei
die mAb an die Spacerverbindung kovalent oder nicht-kovalent gebunden
werden, und e) die so erhaltenen CD28-spezifische superagonistische
mAb tragenden Mikropartikel werden aus der Lösung abgetrennt und optional einer
Waschverfahrensstufe unterworfen.
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Die Erfindung betrifft schließlich auch
Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung der beschriebenen Erkrankungen,
wobei einem Patienten entweder die erfindungsgemäßen Mikropartikel, galenisch
geeignet hergerichtet, verabreicht werden, oder wobei vorzugsweise
autotoge Zellen in vitro mittels erfindungsgemäßer Mikropartikel stimuliert
und nach der Stimulation ohne oder mit den Mikropartikeln, galenisch
geeignet hergerichtet, implantiert werden.
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Erläuterungen zu den Mikropartikeln
gelten sinngemäß auch für die erfindungsgemäßen Verwendungen
und Verfahren.
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Definitionen.
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Die Aminosäuresequenz von Human CD28 ist
unter der Accession No. NM_006139 bekannt.
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Superagonistische CD28 spezifische
mAb sind beispielsweise aus Hybridomzellen erhältlich, die unter den Hinterlegungsnummern
DSM ACC2530 und DSM RCC2531 hinterlegt sind. Humanisierte mAb entsprechend
DSM ACC2530 weisen Sequenzen der leichten Kette sowie der schweren Kette
gemäß den SEQ.-ID
1 und 2 auf.
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Mit Stimulierung bzw. Aktivierung
von Blutzellen, insbesondere T-Lymphozyten, ist die Vermehrung der
Stoffwechsetaktivität,
Vergrößerung des Zellvolumens,
Synthese immunologisch wichtiger Moleküle und Eintritt in die Zellteilung
(Proliferation) auf einen äußeren Reiz
hin bezeichnet.
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Mehrere Untergruppen der T-Zellen
meint zumindest die Untergruppen der CD4 und CD8 T-Zellen. Zu den
CD4 T-Zellen zählen neben
den "normalen" CD25-negativen T-Zellen auch die CD4+CD25+-Zellen, welche
auch als regulatorische T-Zellen bekannt sind. Nach Befunden in
Tiermodellen geht der derzeitige Stand der Technik davon aus, daß letztere
bei zahlreichen autoimmunen und inflammatorischen Erkrankungen,
wie beispielsweise der Multiplen Sklerose, Guillian-Barré-Syndrom,
demyelinisierender Polyneuropathie, etc, eine Rolle spielen. Ein
nützlicher
Marker für
regulatorische T-Zellen ist die starke Expression von CTLA-4 (CD152),
das von nicht-regulatorischen T-Zellen nur nach Aktivierung und
dann auch nur in geringem Maße
exprimiert wird.
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Der Begriff der mAb umfaßt neben
Strukturen des üblichen
Fab/Fc Aufbaus auch Strukturen, die ausschließlich aus dem Fab-Fragment
bestehen. Es ist auch möglich,
lediglich die variable Region zu nutzen, wobei das Fragment der
schweren Ketten mit dem Fragment der leichten Kette auf geeignete
Weise, beispielsweise auch mittels synthetischer Brückenmoleküle, so verbunden
ist, daß die
Bindungsregionen der Ketten die Antikörperbindungsstelle bilden.
Der Begriff der Antikörper
umfaßt
auch (vollständige)
chimäre
sowie humanisierte Antikörper.
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Der Begriff der mAb umfaßt weiterhin
zu den eigentlichen mAbs analoge Peptide oder Proteine. Ein analoges
Peptid oder Protein ist ein Peptid oder Protein, dessen Aminosäuresequenz
von jener des Peptids oder Proteins, zu welchem es analog ist, abweicht,
jedoch einen definierten Bindungspartner des eigentlichen mAb mit
zumindest gleicher Affinität
bindet. Abweichungen in der Sequenz können Deletionen, Substitutionen,
Insertionen und Elongationen sein. Ein analoges Peptid oder Protein
wird in der Regel eine dem Peptid oder Protein sehr ähnliche
Tertiär(teil)struktur
und/oder Exposition im Rahmen eines (Zelloberflächen-) Proteins aufweisen und
braucht ansonsten nur in dem dem unmittelbaren Bindungsbereich des
Peptids oder Proteins analogen Bereich eine Bindungsstelle für den definierten
Bindungspartner aufzuweisen bzw. diese bilden.
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Eine Mimikryverbindung eines mAb
ist eine natürliche
oder synthetische chemische Struktur, die sich in einem Bindungsassay
wie ein definierter mAb verhält,
welchen die Mimikryverbindung mimikriert.
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Superagonistische Modulation der
Proliferation von Blutzellen, insbesondere T-Zellen meint, daß keine
Costimulation, i.e. kein weiteres Bindungsereignis neben einer (initialen)
Bindung eines mAb oder einer Mimikryverbindung an CD28 zur Stimulation
oder Inhibierung der Proliferation erforderlich ist.
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Der Begriff der Behandlung umfaßt auch
den Begriff der Prophylaxe.
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Im Folgenden wird die Erfindung anhand
von lediglich Ausführungsformen
darstellenden Beispielen näher
erläutert.
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Beispiel 1: direkte Koppelung
von mAb an magnetische Beads.
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Eingesetzt werden oberflächenaktivierte
magnetische Beads des Firma Dynal (Dynabeads). Die Oberfläche der
Beads ist hydrophob und trägt
Glycidylethergruppen. Eine kovalente Bindung von Antikörpern erfolgt
durch Reaktion primärer
Amingruppen der Antikörper
mit den Glycidylgruppen. Die Beads sind einheitlich geformte, superparamagnetische Kügelchen
mit einem Kern aus γFe2O3 und Fe3O4, welcher mit
einer Polystyrolhülle überzogen
ist. Der mittlere Durchmesser beträgt 4,5 μm. Die Dichte beträgt ca. 1,5
g/cm3. Die Oberfläche beträgt 1 bis 4 m2/g
Beads. Die geometrische Oberfläche
beträgt
6 × 10–4m2/107 Dynabeads (ca.
0,9 m2/g). Die magnetischen Eigenschaften
sind im Rahmen der Erfindung irrelevant, helfen allerdings bei der
Handhabung im Rahmen der Präparation.
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Die gewünschte Anzahl Beads wird der
gelieferten Suspension nach gründlicher
Mischung der Suspension (Vortex, 5 min.) entnommen. Das Gefäß mit den
Beads wird in eine magnetische Halterung eingesetzt (30–60 s),
wodurch die Beads pelletiert werden. Der Überstand wird abgenommen und Kopplungspuffer,
in welchem die Bindung der Antikörper
an die Beads erfolgen soll (0,1 M H3BO4, pH 8,5, eingestellt mit NaOH), wird zugesetzt.
Die Beads werden gründlich
resuspendiert (Vortex, mindestens 2 min.) und auf diese Weise gewaschen.
Dieser Waschschritt wird insgesamt dreimal durchgeführt.
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Für
die Kopplung des Antikörpers
werden die Beads in frischem Kopplungspuffer zusammen mit dem CD28
spezifischen superagonistischen Antikörper (huIgG-5.11, voll humanisierter
mAb des IgG 4 Isotyps, gentechnologisch abgeleitet von einem mAb aus
DSM ACC2530) sorgfältig
resuspendiert (Vortex, 30–60
s). Die Konzentration der Beads beträgt 4 × 108/ml.
Je 107 Beads werden 5 μg gereinigter mAb eingesetzt.
Das Inkubationsgefäß mit dem
Ansatz wird an einem Rotator befestigt, durch langsame Rotation
des Inkubationsgefäßes wird
die Sedimentation der Beads und damit eine Entmischung des Reaktionsansatzes
verhindert. Die Inkubation erfolgt 20–24 h zwischen 4°C und 37°C, beispielsweise 20°C.
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Nach der Inkubation werden die Beads
mit Hilfe der magnetischen Halterung pelletiert, der Überstand
wird abgenommen und für
eine Proteingehaltmessung aufbewahrt. Die Beads werden in Waschpuffer
(PBS ohne Ca2+ und Mg2+,
0,1% BSA) resuspendiert. Die Suspension wird auf dem Rotator bei
langsamer Drehung 5 min. bei 4°C
gewaschen. Dieser Waschschritt wird insgesamt dreimal mit jeweils
frischem Waschpuffer durchgeführt.
Nach Abschluß der
Waschschritte werden die Beads in Waschpuffer resuspendiert und
sind verwendungsfähig.
Die Lagerung erfolgt bei 4°C.
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Eine Messung des Proteingehaltes
der Überstandes
aus der Koppelung ergibt einen Anteil von ca. 50% der eingesetzten
Menge, so daß maximal 50%
der eingesetzten Menge als gekoppelt angenommen werden können. Hieraus
errechnet sich eine Mindestanzahl Beads von 4 × 106/μg gekoppelter
mAb, oder 2, 5 μg
mAb/107 Beads.
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Beispiel 2: indirekte
Koppelung von mAb an magnetische Beads.
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Es wird grundsätzlich analog dem Beispiel
1 vorgegangen, nur daß anti-Maus
Ig Dynabeads verwendet werden. Hierbei handelt es sich um Beads, an
deren Oberfläche
Schaf-anti-Maus Immunglobulin kovalent gekoppelt ist. Als Kopplungspuffer
wird Phosphat-gepufferte physiologische Kochsalzlösung (PBS)eingesetzt.
Als mAb wurden Maus anti-human CD28 spezifische superagonistische
mAb eingesetzt, welche erhältlich
sind aus DSM ACC 2530. Deren Spezifität entspricht vollumfänglich jener
der in Beispiel 1 eingesetzten mAb, da Übereinstimmung in den Antigen-Bindungsbereichen
besteht. An das Immunglobulin bindet der eingesetzte mAb nicht-kovalent
gemäß der 1.
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Beispiel 3: in vitro Stimulation
in einem PBMC System.
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Pro Napf einer 96 Lochplatte wurden
2 × 105 PBMC (periphere Blut mononukleäre Zellen,
i.e. T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und Monozyten) in 0,2 ml RPMI
1640 Kulturmedium mit 10% autologem Serum kultiviert. Von Tag 2
auf Tag 3 wurde ein 16-stündiger
Puls mit 1 μCi 3H-Thymidin durchgeführt, worauf das in die DNA
eingebaute Thymidin als Nachweis der Proliferation gemessen wurde.
Die Ergebnisse der 2 vergleichen
die Fähigkeit
des humanisierten superagonistischen mAb hN4 5.11A1, ungetrennte
menschliche PBMC (also eine Mischung aus T-Lymphozyten und Fc Rezeptor
tragenden nicht-T-Lymphozyten) in löslicher gegenüber bead-gekoppelter
Form zu stimulieren. Dabei ist auf der Abszisse die jeweils tatsächlich in
das System eingebrachte Antikörpermenge
(in löslicher
Form oder gebunden an Beads) angegeben. Die Ordinate zeigt die eingebaute
Radioaktivität
als Maß der
Proliferation. Dieses repräsentative
Experiment zeigt eindeutig, daß der
an Beads gekoppelte Antikörper
erstens im Optimum eine weitaus stärkere Proliferation induziert als
der nur löslich
zugegebene, und zweitens, daß die
spezifische Aktivität
des Antikörpers
im Sinne der Proliferationsinduktion bei Bindung an Beads etwa 10-fach
höher liegt
als bei Zugabe des isolierten Antikörpers.
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Beispiel 4: in vitro Stimulation
von isolierten T-Lymphozyten.
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Unter ansonsten gleichen Kultivierungs-
und Messbedingungen wie in Beispiel 3 wurden pro Napf 2 × 105 gereinigte T-Lymphozyten eingesetzt (gewonnen
mittels Nylonwollfiltration). In 3 ist
ein Vergleich bei Einsatz von Mikropartikeln aus Beispiel 1 mit
einem Einsatz der in Beispiel 1 eingesetzten, jedoch nicht mit mAb
gekoppelten Mikropartikeln dargestellt. Zusätzlich wird der stimulierende
Effekt mit lösliche
zugesetzten mAbs in An- und Abwesenheit eines an die Plastikoberfläche gekoppelten
Sekundärantikörpers (Esel
anti-human Ig) verglichen. Man erkennt, dass unkonjugierte Mikropartikel
keine Proliferation auslösen,
während
die mAb tragenden Mikropartikel eine sehr starke Aktivität zeigen.
Diese ist um ein Vielfaches höher
als die Aktivität,
welche durch lösliche
mAb in An- oder Abwesenheit des immobiliiserten Sekundärantikörpers erreicht
wird. Die im Vergleich zu ungetrennten PBMC (2) sehr geringe Stimulation durch löslich zugesetzten
Antikörper
ist erwartet, da Zellen mit Rezeptoren für das Fc Stück des Antikörpers (FcR)
fehlen. Die Anwesenheit des immobilisierten Sekundärreagenzes
führt zu
einer leichten Steigerung der Reaktivität auf löslich zugesetzten Antikörper. Die
Beads übernehmen
die Funktion Fc Rezeptor positiver Zellen jedoch um ein Vielfaches
effizienter.
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Beispiel 5: Stimulierbare
T-Zell Untergruppen.
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Gereinigte T-Lymphozyten wurden entsprechend
dem Beispiel 4 kultiviert, wobei Mikropartikel gemäß Beispiel
2 eingesetzt wurden. Nach 3-tägiger Kultur
wurden die Zellen im FACS auf die Expression des nukleären Proliferationsmarkers
Ki67 nach intrazellulärer
Färbung
untersucht. Dabei wurden selektiv die CD4 bzw. die CD8 T-Zellen
durch elektronisches Gating nach gleichzeitiger Anfärbung mit
einem CD4 oder CD8 spezifischen Antikörper analysiert. Die gesetzten
Fenster sind in den 4a (CD4+-Zellen) und 4b (CD8+-Zellen) dargestellt. PE steht für den Fluoreszenzfarbstoff
Phycoerythrin. In die Histogramme der 4c bis 4f gingen jeweils nur die
Zellen aus dem jeweils eingekastelten Bereich ein ( 4c und 4e:
CD4+-Zellen; 4d und 4f: CD8+-Zellen).
In den Histogrammen erfolgte eine Kontrollfärbung mit einem irrelevanten
Antikörper
(offene Kurven) sowie die Ki67 Färbung.
FITC steht für den
Fluoreszenzfarbstoff Fluorescein Isothiozyanat. Eine vergleichende
Betrachtung der 4c und 4d einerseits sowie der 4e und 4f andererseits zeigt, daß ohne Stimulation
Kontroll- und Ki67 Histogramme sich kaum voneinander absetzen. Dagegen sind
bei Stimulation mit den erfindungsgemäßen Mikropartikeln praktisch
alle CD4 T-Zellen und die Mehrheit der CD8 T-Zellen Ki67-positiv
und proliferieren folglich. Die Histogramme der 4d und 4f sind flacher
als jene der 4c und 4e, weil weniger CD8 als
CD4 T-Zellen vorhanden sind.
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Beispiel 6: Stimulation
regulatorischer T-Zellen.
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Es wurden menschliche CD4 T-Zellen
durch Nylonwoll-Filtration und immun-magnetische Depletion aller
anderen PBMC-Populationen gereinigt. Hierauf wurden die erhaltenen
CD4 T-Zellen in CD25 positive und CD25 negative Fraktionen aufgetrennt
mittels der magnetischen Zellsortierung (System MACS, Miltenyi Biotech,
Bergisch Gladbach, Deutschland). In 5a ist
die Histogrammform die CD25 Expression der beiden gereinigten Populationen
von CD4 T-Zellen dargestellt. Die CD25 Expression wird durch die
Rechtsverschiebung der ausgefüllten
Verteilungskurve der Fluoreszenz (CyChrome-gekoppelte CD25 spezifische
mAb) gegenüber
der leeren Kurve für
CD25-negative Zellen ersichtlich.
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Die wie vorstehend erhaltenen CD4
T-Zellen wurden 3 Tage mit Mikropartikeln gemäß Beispiel 2 stimuliert. Dann
wurde durch intrazelluläre
Färbung die
Expression von Ki67 (Proliferation) und CTLA-4 (starke Expression
ist indikativ für
regulatorische T-Zellen) analysiert. Die 5b und 5d zeigen
die Ergebnisse für
CD25-negative T-Zellen, wobei die offenen Kurven wiederum mit einem
irrelevanten mAb zu Kontrollzwecken erhalten wurden. 5b belegt, daß die CD25-
Zellen proliferieren. Nur ein kleiner Teil der CD25- Zellen exprimieren
CTLA-4, wie aus der 5d ersichtlich. 5c zeigt, daß auch die CD25+ Zellen proliferieren. 5e belegt, daß die Mehrheit der CD25+ Zellen stark CTLA-4 exprimiert. Im Ergebnis
ist gezeigt, daß nicht
nur CD25- T-Zellen, sondern insbesondere auch CD25+ T-Zellen
mit den erfindungsgemäßen Mikropartikeln
stimulierbar sind.