DE10226311A1

DE10226311A1 - Antiartisch wirksame Steroidverbindungen

Info

Publication number: DE10226311A1
Application number: DE10226311A
Authority: DE
Inventors: Ralf Wyrwa; Albert Haertl; Rolf Braeuer
Original assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Current assignee: Friedrich Schiller Universtaet Jena FSU; Hans Knoell Institut fuer Naturstoffforschung
Priority date: 2002-04-20
Filing date: 2002-06-11
Publication date: 2003-10-30

Abstract

Dehydroandrostenolon (DHEA)-Derivaten der allgemeinen Formel 1 DOLLAR F1 worin DOLLAR A n eine ganze Zahl von 1 bis 3, DOLLAR A b eine ganze Zahl von 1 bis 2 und DOLLAR A X vorzugsweise Halogen, wie Fluor, Chlor oder Brom, C¶1¶-C¶4¶-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C¶1¶-C¶4¶-alkanoyloxy darstellen, DOLLAR A besitzen eine starke antioxidative Wirkung und bei geringer Toxizität eine antiarthritische Wirkung. Diese Verbindungen können als Therapeutika zur Behandlung von arthritischen Erkrankungen bei Säugetieren, insbesondere beim Menschen, genutzt werden.

Description

Die Erfindung betrifft neue Steroid-Derivate und pharmakologisch verträgliche Salze davon, welche die Regeneration durch rheumatische Arthritis geschädigter Gewebe (Knorpel, Knochen) bei Säugetieren beeinflussen, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die solche Verbindungen enthalten. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung der vorgenannten Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung rheumatischer Arthritis.
Um antiarthritisch wirksame Verbindungen zu finden, besteht eine Strategie darin, die Prozesse zu beschreiben, die während der arthritischen Erkrankung ablaufen. Insbesondere wird versucht, die involvierten Stoffe (Faktoren, Radikale) molekular zu charakterisieren. In den von Entzündungen betroffenen Gelenken wurde eine hohe Anzahl an neutrophilen Leukozyten in der synovialen Flüssigkeit gefunden, wohingegen in der Synovialmembran hauptsächlich mononukleäre Leukozyten enthalten sind, die aus peripheren Blutmonocyten und Leukocyten gebildet werden [1(Harns, E. D. Jr. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N. Engl. J. Med., 1990; 322, 1277-89.)]. Außer immunoregulatorisch zu wirken können Monocyten/Macrophagen aber auch eine Gewebeentartung und Knochenresorption u. a. unter Beteiligung von Sauerstoffradikalen fördern [1, 2 (Weiss, S, J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med., 1989, 320, 365-76), 3 (Repo, H. et al., Scand. J. Rheumatol, 1996, 25, 92-6.)].
Die Entdeckung der Beteiligung von Sauerstoffradikalen an rheumatischer Arthritis führte zu einem neuen Ansatz auf der Suche nach antiarthritisch wirksamen Verbindungen. Da die Konzentration an Sauerstoffradikalen im geschädigten Gewebe sehr hoch ist, sollte die Radikalkonzentration durch antioxidativ wirkende Substanzen gesenkt und der Entzündungsprozess gehemmt werden. Eine Übersicht über solche bekannten antioxidativ wirksamen Verbindungen ist z. B. in [4 (Kawada, N. et al., Hepatology, Vol. 27, 5, 1998, 1265-1274.), 5 (Owen H. et al., Canadian J. Chem., Vol. 47, 1969, 160-163.)] zusammenfassend dargestellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, Verbindungen zur Verfügung zu stellen, die für die Therapie von rheumatischer Arthritis verwendet werden können, ohne dass toxische Nebenwirkungen in Zellen, insbesondere beim Menschen verursacht werden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch Bereitstellung von Dehydroandrostenolon (DHEA)-Derivaten der allgemeinen Formel 1:

worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 3,
b eine ganze Zahl von 1 bis 2 und
X vorzugsweise Halogen, wie Fluror, Chlor oder Brom, C₁-C₄-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C₁-C₄-alkanoyloxy darstellen,
sowie den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen gelöst.
Bevorzugt bedeuten in den Verbindungen der Formel I n = 1; b = 2 und X = Halogen, C₁- C₄-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C₁-C₄-alkanoyloxy.
Bevorzugt bedeuten in den Verbindungen der Formel I n = 2; b = 1.
Bevorzugt bedeuten in den Verbindungen der Formel I n = 2; b = 2 und X = Halogen, C₁- C₄-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C₁-C₄-alkanoyloxy.
Bevorzugt bedeuten in den Verbindungen der Formel I n = 3; b = 1.
Bevorzugt bedeuten in den Verbindungen der Formel I n = 3; b = 2 und X = Halogen, C₁- C₄-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C₁-C₄-alkanoyloxy.
Ausgenommen ist die Verbindung der Formel I mit n = 1 und b = 1.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, daß die Mercaptoalkylaminderivate des DHEA eine starke antioxidative Wirkung zeigen und auf den überraschenden Befund, daß diese Derivate bei geringer Toxizität eine antiarthritische Wirkung zeigen. Diese Verbindungen können daher als Therapeutika zur Behandlung von arthritischem Rheuma bei Säugetieren, insbesondere beim Menschen, genutzt werden.
In der beiliegenden Abb. 1 wird der Einfluß von Verbindungen der Formel I auf die Gelenkschwellung und die Arthritisdauer bei Mäusen dargestellt.
Dementsprechend betrifft die Erfindung ebenfalls die Verwendung der Verbindungen der Formel I als Therapeutika zur Behandlung von arthritischen Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung von arthritischem Rheuma, bei Säugetieren.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden zum Beispiel hergestellt, indem in bekannter Weise

a) 3β-Hydroxy-17β-aminoandrost-5-en (DHEA-Amin) mit Monothiolcarbonat in einem geeigneten Lösungsmittel wie Toluol umgesetzt wird [5] und das entstandene 3β-Hydroxy-17β-(2-mercaptoethylamino)-androst-5-en mit Säuren, wie zum Beispiel HCl, NH₄Cl Essigsäure oder Trifluoressigsäure in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol zu den Ammoniumsalzen umgesetzt, wobei man Verbindungen der Formel 1 erhält, in denen n = 1; b = 2 und X = Halogen, Acyloxy. bzw. Perfluoracyloxy sind.
b) Ein Mercaptoalkylamin, wobei Alkyl vorwiegend Methylen, Ethylen, Propylen, Butylen bedeuted, auf bekannte Weise an ein Harz (Resin), wie zum Beispiel Chlorotrityl-Harz (Fa. Novablochem) gebunden wird oder ein entsprechendes käufliches Mercaptoalkylamin-beladenes Harz (Fa. Novablochem) mit DHEA in einem geeigneten Lösungsmittel, wie trockenes Methanol zu den entsprechenden Iminen umgesetzt wird und diese mit NaBH₃CN zu den entsprechenden harzgebundenen Aminen umgesetzt werden und diese mit Säuren, wie zum Beispiel Trifluoressigsäure oder HCl zu den ungebundenen Ammoniumsalzen umgesetzt werden, wobei Verbindungen der Formel 1 entstehen, in denen n = 1-3; b = 2 und X = Cl bzw. Perfluoracyloxy sind.
c) die nach b) dargestellten Mercaptoalkylaminderivate des DHEA in einem geeigneten Lösungsmittel wie Methanol mit geeigneten Basen wie zum Beispiel Natronlauge oder Kaliumcarbonat zu den freien Aminen umgesetzt werden, wobei man Verbindungen der Formel 1 erhält, in denen n = 1-3 und b = 1 sind.

Die therapeutische Anwendung der erfindungsgemäßen Mercapto-DHEA- Verbindungen beim Säugetier (Mensch und Tier) erfolgt enteral oder parenteral. Die wiederholt anzuwendenden Dosierungen liegen im Bereich von 10 bis 250 mg pro Mensch (ca. 70 kg) und Tag. Die Dosierungen beim Tier liegen in entsprechender Höhe. Die Anwendung erfolgt in Form von Formulierungen, die den Wirkstoff nebst üblichen Hilfs- und Trägerstoffen enthalten.
Die folgenden Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung exemplarisch erläutern, aber in keiner Weise einschränken

Ausführungsbeispiele

1. Substanz 1

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(2-mercaptoethyl)ammoniumhydrochlorid

1.0 g 3β-Hydroxy-17β-aminoandrost-5-en werden in 30 ml trockenem Toluol unter Argon gelöst. Dazu werden 0.17 g Ethylenmonothiocarbonat gegeben und die Reaktionsmischung 20 h unter Rückfluß erhitzt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und die Substanz aus Aceton umkristallisiert. 0.2 g (0.57 mmol) des erhaltenen DHEA-Derivates (1) werden in 20 ml Methanol gelöst und langsam 1 ml 10%ige HCl zugetropft. Die Reaktionsmischung wird eingeengt. Das erhaltene pulvrige Produkt wird im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₁H₃₆ClNOS, 386.04 g/mol): 0.21 g (95% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 350 (M + H)⁺; Ber.: C, 65.3; H, 9.40; Cl, 9.18; N, 3.63; O, 4.14; S, 8.31%; Gef.: C, 64.5; H, 9.80; Cl, 9.4; N, 3.4; S, 8.0.

2. Substanz 2

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(2-mercaptoethyl)-ammoniumacetat

0.2 g (0.57 mmol) des unter 1. erhaltenen DHEA-Derivates (1) werden in 10 ml Methanol gelöst und langsam 2 ml 20%ige Essigsäure zugetropft. Die Reaktionsmischung wird eingeengt. Das erhaltene Kristallisat wird im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₃H₃₉NO₃S, 409.64 g/mol): 0.22 g (95% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 350 (M + H)⁺; Ber.: C, 67.4; H, 9.60; N, 3.42; O, 11.72; S, 7.83%; Gef.: C, 68.1; H, 9.80; N, 3.2.

3. Substanz 3

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(2-mercaptoethyl)-ammonium- trifluoracetat

10 g 2-Aminoethylmercaptotrityl-Harz (1.0 mmol/g, Fa. Novablochem) werden mit 3.2 g (11.1 mmol) DHEA in 25 ml trockenem Methanol und 25 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 25°C in 24 h umgesetzt. Anschließend wird das Harz 3mal mit je 5 ml CH₂Cl₂, Ether und Methanol gewaschen. Das harzgebungene Steroid wird weiter in 25 ml trockenem Methanol und 25 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 25°C mit 3 g NaBH₃CN in 6 h zu den entsprechenden harzgebundenen Aminen umgesetzt. Das Harz wird 3mal mit je 5 ml CH₂Cl₂, Ether und Methanol gewaschen. Mit 3 ml 10%iger Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂ wird das entsprechende Ammoniumsalz vom Harz abgespalten und nach einengen und trocknen im Vakuum als amorphes Pulver erhalten. Ausbeute (C₂₃H₃₆F₃NO₃S, 463.61 g/mol): 2.9 g (62.5% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 3S0 (M + H)⁺; Ber.: C, 59.59; H, 7.83; N, 3.02; O, 10.35; S, 7.83%; Gef.: C, 58.6; H, 7.6; N, 2.9.

4. Substanz 4

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammonium-trifluoracetat

10 g 3-Aminopropylmercaptotrityl-Harz (1.0 mmol/g, Fa. Novablochem) werden mit 3.15 g (11 mmol) DHEA in 35 ml trockenem Methanol und 25 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 25°C in 24 h umgesetzt. Anschließend wird das Harz 3mal mit je 5 ml CH₂Cl₂, Ether und Methanol gewaschen. Das harzgebundene Steroid wird weiter in 25 ml trockenem Methanol und 25 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 25°C mit 3 g NaBH₃CN in 6 h zu den entsprechenden harzgebundenen Aminen umgesetzt. Das Harz wird 3mal mit je 5 ml CH₂Cl₂, Ether und Methanol gewaschen. Mit 3 ml 10%iger Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂ wird das entsprechende Ammoniumsalz vom Harz abgespalten und nach einengen und trocknen im Vakuum als amorphes Pulver erhalten. Ausbeute (C₂₄H₃₈F₃NO₃S, 477.64 g/mol): 2.7 g (56.5 % d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 364 (M + H)⁺; Ber.: C, 60.35; H, 8.02; N, 2.93; O, 10.0; S, 6.71%; Gef.: C, 59.6; H, 7.5; N, 2.8.

5. Substanz 5

17β-(3-mercaptopropyl)-androst-5-en-3β-ol

0.5 g (1.05 mmol) 3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammonium- trifluoracetat werden in 15 ml trockenem Methanol bei 25°C gelöst. Anschließend werden 45 mg (1.12 mmol) NaOH in 5 ml Methanol zugegeben. Nach 30 min wird zur Trockene eingeengt und das amorphe Pulver mehrmals mit Wasser gewaschen. Anschließend wird im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₂H₃₇NOS, 363.61 g/mol): 267 mg (70% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 364 (M + H)⁺; Ber.: C, 72.67; H, 10.26; N, 3.85; O, 4.40; S, 8.82%; Gef.: C, 71.8; H, 10.8; N, 3.7.

6. Substanz 6

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammoniumchlorid

0.2 g (0.55 mmol) 17β-(3-mercaptopropyl)-androst-5-en-3β-ol werden in 15 ml trockenem Methanol bei 25°C gelöst und langsam 1 ml 10%ige HCl zugetropft. Die Reaktionsmischung wird eingeengt und das erhaltene pulvrige Produkt im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₂H₃₈ClNOS, 400.07 g/mol): 204 mg (93% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 364 (M + H)⁺; Ber.: C, 66.05; H, 9.57; Cl, 8.86; N, 3.50; O, 4.00; S, 8.02%; Gef.: C, 65.5; H, 9.80; N, 3.4.

7. Substanz 7

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammoniumacetat

0.2 g (0.55 mmol) 17β-(3-mercaptopropyl)-androst-5-en-3β-ol werden in 15 ml trockenem Methanol bei 25°C gelöst und langsam 1 ml 10%ige Essigsäure zugetropft. Die Reaktionsmischung wird eingeengt und das erhaltene pulvrige Produkt im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₂H₄₁NO₃S, 423.66 g/mol): 220 mg (94.4% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 364 (M + H)⁺; Ber.: C, 68.04; H, 9.75; N, 3.31; O, 11.33; S, 7.57%; Gef.: C, 66.5; H, 9.80; N, 3.2.

8. Substanz 8

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(4-mercaptobutyl)-ammonium-trifluoracetat

10 g 4-Aminobutylmercaptotrityl-Harz (1.0 mmol/g, Fa. Novablochem) werden mit 3.15 g (11 mmol) DHEA in 35 ml trockenem Methanol und 25 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 25°C in 24 h umgesetzt. Anschließend wird das Harz 3mal mit je 5 ml CH₂Cl₂, Ether und Methanol gewaschen. Das harzgebundene Steroid wird weiter in 25 ml trockenem Methanol und 25 ml trockenem CH₂Cl₂ bei 25°C mit 3 g NaBH₃CN in 6 h zu den entsprechenden harzgebundenen Aminen umgesetzt. Das Harz wird 3mal mit je 5 ml CH₂Cl₂, Ether und Methanol gewaschen. Mit 3 ml 10%iger Trifluoressigsäure in CH₂Cl₂ wird das entsprechende Ammoniumsalz vom Harz abgespalten und nach einengen und trocknen im Vakuum als amorphes Pulver erhalten. Ausbeute (C₂₅H₄₀F₃NO₃S, 491.65 g/mol): 2.6 g (53% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 378 (M + H)⁺; Ber.: C, 61.07; H, 8.20; N, 2.85%; Gef.: C, 59.9; H, 7.9; N, 2.6.

9. Substanz 9

17β-(4-mercaptobutyl)-androst-5-en-3β-ol

0.5 g (1.02 mmol) 3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(4-mercaptobutyl)-ammonium- trifluoracetat werden in 15 ml trockenem Methanol bei 25°C gelöst. Anschließend werden 43 mg (1.07 mmol) NaOH in 5 ml Methanol zugegeben. Nach 30 min wird zur Trockene eingeengt und das amorphe Pulver mehrmals mit Wasser gewaschen. Anschließend wird im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₃H₃₉NOS, 377.62 g/mol): 320 mg (83% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 378 (M + H)⁺; Ber.: C, 73.15; H, 10.41; N, 3.71; O, 4.24; 5, 8.49%; Gef.: C, 72.3; H, 10.7; N, 3.6.

10. Substanz 10

3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(4-mercaptobutyl)-ammoniumacetat

0.2 g (0.53 mmol) 17β-(4-mercaptobutyl)-androst-5-en-3β-ol werden in 15 ml trockenem Methanol bei 25°C gelöst und langsam 1 ml 10%ige Essigsäure zugetropft. Die Reaktionsmischung wird eingeengt und das erhaltene pulvrige Produkt im Vakuum getrocknet. Ausbeute (C₂₃H₄₃NO₃S, 437.67 g/mol): 225 mg (97% d. Th.). MALDI-TOF: m/e = 378 (M + H)⁺; Ber.: C, 63.12; H, 9.90; N, 3.20%; Gef.: C, 66.5; H, 9.80; N, 3.2.

Biologische Analyse

I) Einfluß von 3β-Hydroxy-17β-(2-mercavtoethylamino)-androst-5-en*CF₃COOH (Mercapto-DHEA) auf den Horse-radish peroxidase-assay (OH^--Radikal-Scavenger- oder Enzymhemmtest im zellfreien System)

1. Testprinzip

Wasserstoffperoxid (H₂O₂) wird durch Horse-radish Peroxidase (HRP) unter Freisetzung von OH^--Radikalen zu H₂O abgebaut. Die Hydroxyl-Radikale oxidieren Luminol, das relative Lichteinheiten (RLU's) freisetzt, die mit der Chemilumineszenztechnik detektiert werden.
Der Screening-Test prüft Stoffe oder Verbindungen auf OH^--Radikal-Scavenger- oder Peroxidase-hemmende Eigenschaft in einem zellfreien Testsystem. Der Test läuft im Mikrotiterplatten-Format.
Als Standardsubstanz wird N-Acetyl-L-Cystein (NAC) eingesetzt, dessen antioxidativen Eigenschaft literaturbekannt ist.
Der Test erlaubt zwischen OH^--Radikal-Scavengereigenschaft und Enzymhemmung zu unterscheiden. Tritt anfangs der Chemilumineszenzmessung eine lag-Phase auf, ist die Chemilumineszenz-Hemmung auf antioxidative Wirkung der Prüfsubstanz zurückzuführen. Fehlt eine lag-Phase und ist die Chemilumineszenz während der gesamten Messzeit verringert, handelt es sich um eine Enzym-hemmende Wirkung.

2. Methode

2.1 Chemikalien, Reagenzien und Prüfsubstanzen

- PBS-Puffer, pH 7,4
- Aqua dest.
- Luminol (SIGMA CHEMICAL CO.)
- N-Acetyl-L-Cystein (MERCK)
- Peroxidase [Donor: hydrogen-peroxidase oxidoreductase EC 1.11.1.7 Type VI-A, from horseradish (SIGMA CHEMICAL CO.)]
- H₂O₂ (30%) 34,01 g/mol (MERCK)
- Mercaopto-DHEA

2.1.2 Herstellung der Arbeitslösungen

Luminol: 4 mg + 100 µl DMSO/10 ml PBS-Puffer
04 mg/ml
HRP: Stammlösung: 1 mg/10 ml Aqua dest., portionieren a 10 µl und - 20°C lagern
Gebrauchslösung: 10 µl/10 ml PBS-Puffer
0,066 U/ml
Substrat (H₂O₂):
Stammlösung: 30 µl Original/1 ml PBS-Puffer
Gebrauchslösung: 60 µl/10 ml PBS-Puffer
352 µM
Mercapto-DHEA und NAC:
2,20 und 200 µg/ml PBS

2.1.3 Mikrotiterplattenbelegung

Gesamtvolumen/VT:	250 µl
Luminol/VT:	50 µl
HRPNT:	50 µl
Prüfsubstanz oder Standard/VT:	50 µl = 0,1, 1 oder 10 µg
PBS-Pufferlösung/VT:	Auffüllmenge bis 250 µl
H₂O₂/VT:	50 µl = 0,08 µmol

2.1.4 Meßgerät

Labsystems Luminoskan RS, computergesteuert
Software: SeroCalc für Windows, Version 4.00
Mikrotiterplatten: 96 Vertiefungen (VT), White Combiplate 8 (Radius Edge, Polystyrene, Cat. No. 95029510, Lot. No. 144500, {Labsystems Finnland])

2.1.5 Meßablauf

Per Hand werden Luminol, HRP, Mercapto-DHEA oder NAC und PBS-Lösung in die VT pipettiert. Nach ca. 1 Minute Wartezeit und Inkubation bei 37,0°C wird 1x gemessen. Anschließend wird mit der Mehrkanalpipette das Substrat (H₂O₂) in die Vertiefringen pipettiert. Es folgen sofort weitere 19 Messungen mit je 1 sec Meßzeit pro VT.

2.2 Auswertung

Mittels Computer können RLU's als Einzelwerte, Mittelwerte, Maximalwerte und graphische Kurvenverläufe ausgewertet werden. Der RLU-Mittelwert ohne Substanzzugabe wird gleich 100% gesetzt (Luminol, HRP, H₂O₂ und PBS-Puffer), und die RLU- Mittelwerte der Ansätze mit den unterschiedlichen NAC- oder den Mercapto-DHEA-Konzentrationen werden auf den 100%-Wert relativiert.
Die Bewertung der OH^--Radikal-Scavenger-Aktivität oder HRP- Hemmaktivität erfolgt in Abhängigkeit von der NAC-Wirkung, dessen IC50-Wert im Konzentrationsbereich von 2,5 bis 5 µg/ml liegt.

3. Ergebnis und Bewertung

Für die Mercapto-DHEA-Substanz liess sich im HRP-Test überraschend eine antioxidative Wirkung nachweisen. Im Vergleich zu dem mitgeprüften Standard NAC ist die antioxidative Aktivität gleich stark oder geringfügig stärker (Tab.: 1). Daß es sich bei Mercapto-DHEA um einen echten OH^--Radikal-Scavenger-Effekt handelt, zeigt die anfänglich auftretende lag-Phase. Sie trat sowohl bei Mercapto-DHEA als auch bei NAC auf.
Die neu synthetisierte Mercapto-DHEA-Verbindungen besitzt die gewünschte OH^-- Radikal-Scavenger-Aktivität im HRP-Test. Tab. 1 OH^--Radikal-inhibierender Effekt von Mercapto-DHEA und NAC im HRP-Test

II) Antiarthritische Wirkung im Mausmodell

50 weibliche C57B1/6-Mäuse mit Antigen-induzierter Arthritis (AIA) wurden täglich (außer Sa und So) i. p. mit 3β-Hydroxy-17β-(2-mercaptoethylamino)-androst-5- en*CF₃COOH (Mercapto-DHEA), DHEA, N-Acetyl-L-Cystein (NAC) oder einem Gemisch der beiden letzten Substanzen behandelt. Die Stärke der Arthritis (Gelenkschwellung und Histologie), und das Körper-, Thymus-, Leber- und Milzgewicht, die Antikörper und die Immunglobuline im Serum wurden bestimmt.
Die AIA wurde in der üblichen Weise ausgelöst:

1. Immunisierung: (Tag d -21) mit 100 ug mBSA in CFA s. c. in die Flanke re, 50 µl Bordetella pertussis i. p.
2. Immunisierung: (d -14) gleiche Dosis s. c. in den Schwanz, Bordetellen wie vorher.

Auslösung an d0 mit 100 µg mBSA in 25 µl Saline in das rechte Kniegelenk.
Die tägliche Behandlung (ohne Wochenenden) mit der in Tab. 1 angeführten Substanzen erfolgte von d0 bis einen Tag vor der Tötung (d18), also an den Tagen 0 bis 4,7 bis 11 und 14 bis 17. Die Substanzen waren in je 0,3 ml Vehikel (Polyoxoethylen-50-Stearat, 0.085% in Saline mit 5% Ethanol) gelöst und wurden i. p. verabreicht. Die Kontrollgruppe erhielt nur das Vehikel. Tabelle 1 Gruppeneinteilung
3 Tiere verstarben vor Auslösung der Arthritis, 2 wurden wegen fehlender Gelenkschwellung ausgeschlossen.
Bestimmung der Antikörper (Ak) mittels ELISA: Es wurden die Ak gegen das spezifische Antigen mBSA und gegen die Matrixbestandteile Kollagen II (CII), Kollagen I (CI) und Proteoglykane (PG) bestimmt.
CI, CII und PG sind selbst hergestellte Präparationen:
CI: aus Rattenschwanzsehnen durch Extraktion mit 0,1 m Essigsäure und Fällung mit NaCl (Endkonzentration 15%), Reinigung durch mehrfaches Umfällen.
CII: aus Gelenkknorpel vom Kalb nach Entfernung der PG mittels Extraktion durch 4 m Guanidinhydrochlorid, Verdauung des Rückstandes mittels Pepsin in 0.5 m Essigsäure, Fällung von CII mittels 0.9 m NaCl, Reinigung durch mehrfaches Umfällen.
PG: aus Kalbsgelenk, Extraktion mit 4 m Guanidinhydrochlorid, Dialyse gegen Wasser und Lyophilisation. Die Platten wurden mit den jeweiligen Antigenen in einer Konzentration von 10 µg/ml über Nacht beladen. Nach der Spülung der Platten 2 h Inkubation mit den 1 : 70 verd. Mausseren (bei mBSA-Ak 1 : 500), Spülung, 1 h Anti-Maus-1gGPeroxidase-Konjugat 1 : 5000, Spülung, Substratreaktion mit o-Phenylendiamin/H₂O₂ 20 Min., Abstoppen mit 2n Schwefelsäure, Messung der optischen Dichte (OD) im ELISA- Reader bei 492 nm (Referenz 620 nm). Jedes Serum wurde als Duplikat aufgetragen.
Die statistischen Berechnungen zur Prüfung der Gruppenunterschiede erfolgten nach dem U-Test von Mann und Whitney mittels Computer ("SPSS"), die Signifikonzen sind einseitig angegeben, wobei folgende Abkürzungen verwendet werden:

es (extrem signifikant) p < 0,001***

ss (sehr signifikant) p < 0,01**

s (signifikant) p < 0,05*

ms (begrenzt signifikant) p < 0,10 (*)

ns (nicht signifikant) p > 0,10
Die in der Abb. 1 eingezeichneten Signifikonzen beziehen sich stets auf den Unterschied zur Vehikel-Kontrolle.

Ergebnisse

Gelenkschwellung

Der Verlauf der Gelenkschwellung wurde in einer Abbildung in mm (Differenz re/li) dargestellt. Eine deutliche Reduktion der Schwellung wurde nur durch Mercapto-DHEA erreicht. Zu allen Meßzeitpunkten lag die Mercaptogruppe unter der Kontrolle und den übrigen 3 behandelten Gruppen, bis auf d7 waren die Unterschiede signifikant. Die Gruppenunterschiede waren zu diesem Zeitpunkt am deutlichsten (es).

Körpergewicht

Die Entwicklung der Körpergewichte wurde durch die Behandlung im Vergleich zur Kontrolle nicht signifikant beeinflußt.

Organgewichte

wischen absoluten und relativen Organgewichten bestanden kaum Unterschiede hinsichtlich der Gruppenverteilung. Beim Thymusgewicht lag nur die DHEA-Gruppe signifikant unter der Kontrolle. Die Leber- und Milzgewichte der Mercapto-DHEA-Gruppe waren signifikant höher als die der übrigen Behandlungsgruppen. Beim Milzgewicht war auch die DHEA + NAC-Gruppe signifikant erhöht im Vergleich zu der Kontrollgruppe.

Alle signifikanten Gruppenunterschiede

a) absolut	b) relativ
ThyG: 1 < 5(ms)	1 < 5(s)
LeG: 3 > 1(es), 2(ss), 4, 5(es)	3 > 1(es), 2(ss), 4, 5(es)
MiG: 3 > 1(es), 2(ss), 4, 5(es);	3 > 1 (es), 2 (ss), 4, 5(es)
2 > 1(s). 4(ms)	2 > 1 (ss), 5(s); 5 > 1(ms)

Antikörper

Die Bestimmung der Antikörper brachte nur relativ geringe Gruppenunterschiede.

Claims

1. Verwendung von Verbindungen der Formel I

worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 3,
b eine ganze Zahl von 1 bis 2 und
X Halogen, C₁-C₄-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C₁-C₄-alkanoyloxy darstellen, als Therapeutika zur Behandlung von arthritischen Erkrankungen, insbesondere zur Behandlung von arthritischem Rheuma, bei Säugetieren.

2. Verwendung von 17β-(2-mercaptoethyl)-androst-5-en-3β-ol gemäß Anspruch 1.

3. Verbindungen der Formel I

worin
n eine ganze Zahl von 1 bis 3,
b eine ganze Zahl von 1 bis 2 und
X Halogen, C₁-C₄-Alkanoyloxy oder Perfluoro-C₁-C₄-alkanoyloxy darstellen, mit Ausnahme von 17β-(2-mercaptoethyl)-androst-5-en-3β-ol.

4. Eine Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 3, ausgewählt aus der Gruppe
17β-(3-mercaptopropyl)-androst-5-en-3β-ol und Salzen davon,
17β-(4-mercaptobutyl)-androst-5-en-3β-ol und Salzen davon, und
Salzen von 17β-(2-mercaptoethyl)-androst-5-en-3β-ol.

5. Eine Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 4, ausgewählt aus der Gruppe
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(2-mercaptoethyl)ammoniumhydrochlorid
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(2-mercaptoethyl)-ammoniumacetat
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(2-mercaptoethyl)-ammonium-trifluoracetat
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammonium-trifluoracetat
17β-(3-mercaptopropyl)-androst-5-en-3β-ol
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammoniumchlorid
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(3-mercaptopropyl)-ammoniumacetat
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(4-mercaptobutyl)-ammonium-trifluoracetat
17β-(4-mercaptobutyl)-androst-5-en-3β-ol
3β-Hydroxyandrost-5-en-17β-yl-(4-mercaptobutyl)-ammoniumacetat.

6. Pharmazeutische Formulierung enthaltend eine Verbindung der Formel I gemäß Anspruch 3 nebst üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.