DE10216719B4

DE10216719B4 - N-(3-Rifamycinyl)carbamate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Behandlung und Verhütung von Tuberkulose

Info

Publication number: DE10216719B4
Application number: DE10216719A
Authority: DE
Inventors: Gerrit Prof. Dr. Schüürmann; Ralph Dr. Kühne; Ovanes Prof. Mekenyan; Zoya Andonova Nedeyalkova; Peter William Prof. Andrew; Jamila Shafi; Jason Anthony Sharpe; Dimcho Ivanov Dimov; Nely Tzoneva Angelova; Georgy Asenov Grozdanov; Pavel Nenov Penev; Svetlana Tzvetkova Haladgova; Desislava Todorova Mincheva; Stevka Tzvetkova Paraskevova; Sashko Ivanov Dekin; Iskra Todorova Atanasova
Original assignee: Bourgas "profaszlatarov" University; BOURGAS PROF AS ZLATAROV UNIVE; BalkanPharma Razgrad AD; Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ; University of Leicester
Current assignee: Bourgas "profaszlatarov" University Bourgas Bg; LEICESTER LEICESTER GB, University of; BalkanPharma Razgrad AD; Helmholtz Zentrum fuer Umweltforschung GmbH UFZ
Priority date: 2002-04-10
Filing date: 2002-04-10
Publication date: 2007-09-20
Anticipated expiration: 2022-04-11
Also published as: AU2003216922A1; US20060009463A1; DE10216719A1; EP1492798A1; AU2003216922A8; WO2003084965A1; WO2003084965A8

Abstract

N-(3-Rifamycinyl)carbamate der Formel I

und ihre entsprechenden Hydrochinone,
worin R C₁-C₄-Alkyl, mono- oder polyhalogeniertes C₁-C₄-Alkyl oder 4-Nitrobenzyl ist, oder Salze derselben.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige N-(3-Rifamycinyl)-Derivate, nämlich N-(3-Rifamycinyl)carbamate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Herstellung pharmazeutischer Präparate. Die Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung bzw. Verhütung von mykobakteriellen Infektionen, insbesondere Tuberkulose.
Hintergrund der Erfindung
Die Derivate von Rifamycin S oder ihre entsprechenden Hydrochinon-Formen Rifamycin SV sind dafür bekannt, daß sie antibiotische Wirkung gegen verschiedene Bakterien aufweisen, indem sie die RNA-Polymerase hemmen und damit die Synthese von mRNA hemmen.
US 4 005 077 , US 4 261 891 , US 4 353 826 offenbaren von Rifamycin S abgeleitete 3-Amino-Derivate und ihre entsprechenden Hydrochinon-Derivate, die sich von Rifamycin SV ableiten. Die Verbindungen können in der Rifamycin-Seitenkette teilweise oder vollständig hydriert sein. Nach US 4 353 826 kann die 3-Amino-Gruppe eine primäre, sekundäre oder tertiäre Amino-Gruppe sein, die über Kohlenwasserstoffketten aliphatisch verknüpft ist, die durch Heteroatome unterbrochen und/oder mit verschiedenen funktionellen Gruppen substituiert sein können. US 4 261 891 zeigt Rifamycin-Derivate, die an Position 3 eine Azacycloalkyl-Gruppe enthalten, die 2-11 Kohlenstoff-Atome im Azacycloalkyl-Ring und bis zu 20 Kohlenstoff-Atome insgesamt aufweist. In US 4 005 077 besitzen die Rifamycin S- oder Rifamycin SV-Derivate eine 1-Piperazinyl-Gruppe an Position 3 der Rifamycin-Einheit. Die Piperazinyl-Gruppe kann an ihrer N'-Position mit verschiedenen Gruppen substituiert sein. Es wurde gezeigt, daß die 3-Aminorifamycin-Derivate antibiotische Wirkung gegen grampositive Bakterien, insbesondere gegen Mykobakterien aufweisen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung macht neue Verbindungen mit antimykobakterieller Wirkung verfügbar, die sich aus im Handel erhältlichen Substanzen problemlos synthetisieren lassen und in guten Ausbeuten erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen stärkere antimykobakterielle Wirkung als die bekannten Tuberkulosemittel, insbesondere Rifampicin. Zudem zeigen sie antimikrobielle Wirkung gegen gewöhnliche Bakterien.
Die vorliegende Erfindung betrifft N-(3-Rifamycinyl)carbamate der allgemeinen Formel I
und ihre entsprechenden Hydrochinone,
worin R C₁-C₄-Alkyl, mono- oder polyhalogeniertes C₁-C₄-Alkyl oder 4-Nitrobenzyl ist,
oder Salze derselben.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung Verbindungen gemäß Formel I, worin R Methyl, Ethyl, Butyl oder Isobutyl ist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R Chlormethyl, 2-Chlorethyl, 2-Bromethyl, 2,2,2-Trichlorethyl oder 2,2,2-Trichlor-tert-butyl.
Besondere Erwähnung verdienen 3-Rifamycinyl S-methylcarbamat und 3-Rifamycinyl S-ethylcarbamat. Diese Verbindungen zeigen eine in vitro- und ex vivo-Wirkung gegen Mycobacterium tuberculosis sowie gegen verschiedene andere Bakterien (andere als Mykobakterien), die wenigstens genauso stark oder sogar stärker ist als die Wirkung von Rifampicin.
Die neuartigen N-(3-Rifamycinyl)carbamate können in der Chinon-Form (Rifamycin S-Derivate) und in der Hydrochinon-Form (Rifamycin SV-Derivate) vorlie liegen. Beide Formen lassen sich ohne weiteres ineinander überführen. Die Verbindungen können auch in Form irgendeines ihrer Tautomere vorliegen.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die pharmazeutisch annehmbaren Salze der vorliegenden Verbindungen. Zu diesen Salzen zählen Säureadditionssalze, Metallsalze, Ammonium- und Alkylammonium-Salze. Zu den Säureadditionssalzen zählen Salze anorganischer Säuren wie auch die organischer Säuren.
Zu den repräsentativen Beispielen für geeignete anorganische Säuren gehören Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Schwefelsäure und dergleichen. Zu den repräsentativen Beispielen für geeignete organische Säuren zählen Ameisensäure, Essigsäure, Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure, Propionsäure, Benzoesäure, Citronensäure, Fumarsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Maleinsäure, Äpfelsäure, Malonsäure, Mandelsäure, Oxasäure, Pikrinsäure, Brenztraubensäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Weinsäure und dergleichen. Zu den Beispielen für Metallsalze zählen Lithium-, Natrium-, Kalium-, Magnesiumsalze und dergleichen. Zu den Beispielen für Ammonium- und Alkylammonium-Salze gehören Ammonium, Methyl-, Dimethyl-, Trimethyl- und Tetramethylammonium, Ethyl- und Diethylammonium, Hydroxyethylammonium, Butylammonium-Salze und dergleichen.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I, wobei R die obengenannten Bedeutungen hat, lassen sich auf verschiedenen Wegen problemlos herstellen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung können die N-(3-Rifamycinyl)carbamate hergestellt werden durch Umsetzung von 3-Aminorifamycin S der Formel II
mit einem Chlorformiat der Formel III
worin R die obigen Bedeutungen hat,
in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer starken Base, um die Verbindung der Formel I zu ergeben. Will man zum Hydrochinon kommen, so wird das erhaltene Chinon anschließend reduziert, um das entsprechende Hydrochinon zu ergeben.
Die Base wird zur Abstraktion eines Protons von der Amino-Gruppe des 3-Aminorifamycin S benötigt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein tertiäres Amin, vorzugsweise Triethylamin oder dergleichen als starke Base eingesetzt. Es kann aber auch wasserfreies Natriumcarbonat verwendet werden.
Für die obige Reaktion können die üblichen organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel Dichlormethan, Ethylacetat oder Tetrahydrofuran verwendet werden. Erfindungsgemäß ist die Verwendung von Dichlormethan bevorzugt.
Die Reduktion des Chinon-Produkts zum entsprechenden Hydrochinon kann mit Reduktionsmitteln wie etwa Hydrogensulfit, Dithionit oder Ascorbinsäure oder den Salzen derselben erfolgen.
Dieser Weg ergibt überraschend hohe Ausbeuten.
Ein alternativer Syntheseweg für die vorliegenden Verbindungen geht aus von 3-Formylrifamycin S gemäß Formel IV
und verläuft über 3-Carboxyrifamycin S, über das 3-Carboxyrifamycin S-azid, über das entsprechende 3-Isocyanatorifamycin, das gebildet wird durch Umsetzung des 3-Carboxyrifamycin S-azids mit einem Alkohol R-OH, worin R die obige Bedeutung hat, um schließlich die Chinon-Form der allgemeinen Formel I zu ergeben. Wiederum kann die Chinon-Form anschließend in die Hydrochinon-Form überführt werden, falls gewünscht.
Die mit Hilfe der beiden Verfahren synthetisierten Produkte sind nach den HPLC-Retentionszeiten und UV-Spektren identisch. Allerdings ist der erste Weg einfacher und ergibt höhere Ausbeuten. Daher ist der von 3-Aminorifamycin S der Formel II ausgehende Weg zur Herstellung der vorliegenden Verbindungen bevorzugt.
Es wurde gezeigt, daß die vorliegenden Verbindungen starke antibiotische Wirkung gegen eine Vielzahl von Bakterien aufweisen, insbesondere gegen Mycbacterium tuberculosis und Mycobacterium aurum. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der N-(3-Rifamycinyl)carbamate der Formel I zur Behandlung bzw. Verhütung von mykobakteriellen Infektionen, insbesondere zur Behandlung bzw. Verhütung von Tuberkulose.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von N-(3-Rifamycinyl)carbamaten der Formel I zur Behandlung bzw. Verhütung mikrobieller Infektionen mit gewöhnlichen Bakterien, vorzugsweise Bacillus subtilis, Escherichia coli, Bacillus mycoides, Klebsiella pneumoniae und/oder Pseudomonas aeruginosa. In diesem Zusammenhang bezieht sich der Begriff "gewöhnliche Bakterien" auf andere als mykobakterielle Mikroorganismen.
Zusammensetzungen zur Behandlung bzw. Verhütung von mykobakteriellen und/oder anderen bakteriellen Infektionen, umfassend eine antimykobakteriell und/oder antibakteriell wirksame Menge wenigstens einer Verbindung der Formel I oder des entsprechenden Hydrochinons derselben, wobei R die obige Bedeutung hat, oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes derselben zusammen einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern, können hergestellt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln sowie anderen bekannten Zusätzen und Hilfsstoffen nach den üblichen Techniken formuliert werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können speziell formuliert werden zur Verabreichung auf irgendeine geeignete Weise, etwa auf oralem, rektalem, nasalem, pulmonalem, topischem (darunter buccal und sublingual), transdermalem, intracisternalem, intraperitonealem, vaginalem und parenteralem Wege (darunter subkutan, intramuskulär, intrathekal, intravenös und intradermal). Natürlich richtet sich der bevorzugte Weg nach dem Allgemeinzustand und dem Alter des zu behandelnden Patienten, der Art der zu behandelnden Störung und dem gewählten Wirkstoff.
Zu den pharmazeutischen Zusammensetzungen für die orale Verabreichung zählen feste Dosierformen wie etwa Kapseln, Tabletten, Dragees, Pillen, Pastillen, Pulver und Granalien. Im Bedarfsfall können sie nach bekannten Verfahren mit Überzügen wie z.B. magensaftresistenten Überzügen hergestellt oder so formuliert werden, daß sie kontrollierte Freisetzung des Wirkstoffs, zum Beispiel längere Freisetzung ergeben.
Zu den flüssigen Dosierformen zur oralen Verabreichung gehören Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere.
Zu den pharmazeutischen Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung gehören sterile wäßrige und nichtwäßrige injizierbare Lösungen, Dispersionen, Suspensionen oder Emulsionen sowie sterile Pulver, die vor dem Gebrauch wieder in sterile injizierbare Lösungen oder Dispersionen zu überführen sind.
Zu den weiteren geeigneten Verabreichungsformen zählen Suppositorien, Sprays, Salben, Cremes, Gele, Inhaliermittel, Hautpflaster und dergleichen.
Eine typische orale Dosierung liegt im Bereich von etwa 0,001 bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag, vorzugsweise etwa 0,01 bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht, und besonders bevorzugt etwa 0,05 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, verabreicht in einer oder mehreren Dosierungen wie z.B. 1 bis 3 Dosierungen. Natürlich richtet sich die genaue Dosierung nach der Häufigkeit und Art der Verabreichung, nach Geschlecht, Alter, Gewicht und Allgemeinzustand des zu behandelnden Patienten, nach Art und Schwere des zu behandelnden Zustands, den zu behandelnden Begleiterscheinungen und anderen Faktoren, die für den Fachmann offenbar sind.
Demgemäß umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen zur ein- oder mehrmaligen oralen Verabreichung pro Tag wenigstens eine der Verbindungen gemäß Formel I mit etwa 0,05 mg bis etwa 1000 mg, vorzugsweise etwa 0,1 mg bis etwa 500 mg, besonders bevorzugt etwa 1 mg bis etwa 200 mg der Verbindung. Für den parenteralen Weg, etwa intravenös, intrathekal, intramuskulär und dergleichen, liegen die typischen Dosen in der Größenordnung von etwa der Hälfte der zur oralen Verabreichung eingesetzten Dosis.
Zu den geeigneten pharmazeutischen Trägern gehören inerte feste Verdünnungsmittel oder Füllmittel, sterile wäßrige Lösungen und verschiedene organische Lösungsmittel. Beispiele für feste Träger sind Lactose, Terra alba, Sucrose, Cyclodextrin, Talk, Gelatine, Agar, Pektin, Akazin, Magnesiumstearat, Stearinsäure oder Niederalkylether von Cellulose. Beispiele für flüssige Träger sind Si rup, Erdnußöl, Phospholipide, Fettsäuren, Fettsäureamine, Polyoxyethylen oder Wasser. Der Träger bzw. das Verdünnungsmittel kann auch irgendein in der Fachwelt bekanntes Material zur Langzeitfreisetzung, etwa Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat, allein oder gemischt mit Wachs enthalten.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden repräsentativen Beispiele näher erläutert, die jedoch den Umfang der Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.
Beispiel 1
N-(Ethyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S
Eine Lösung von 10 g 3-Aminorifamycin S und 3 ml Triethylamin in 100 ml Dichlormethan wurde auf -5°C abgekühlt, und es wurden 1,5 ml Ethylchlorformiat zugesetzt. Die Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt, und es wurden 2 ml Triethylamin und 1 ml Ethylchlorformiat zugegeben.
Nach Aufbewahren über weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft, um einen öligen Rückstand zu ergeben. Es wurden 150 ml Tetrachlormethan und 100 ml einer 10% Ammoniumchlorid/Wasser-Lösung zugesetzt, und die Mischung wurde eine Stunde lang gerührt. Die Emulsion wurde abfiltriert, der Kuchen wurde mit 60 ml Tetrachlormethan und 150 ml Wasser gewaschen, und das Filtrat wurde mit 150 ml Hexan versetzt. Nach 15minütigem Rühren wurde das Produkt abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 6 g rosafarbener Kristalle erhalten.
Die Strukturanalyse des Produkts erfolgte mittels HPLC, DC, UV-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und NMR-Spektroskopie (¹H, ¹³C und DEPT). Die ¹H-NMR- Spektroskopie auf einem Bruker drx250 in einer Lösung von CDCl₃ und (CD₃)₂SO ergab das folgende Spektrum:
8,26 ppm, 1H, NH-CO; 6,4-6,05 ppm, m, 7H; 6,45 ppm, dd, 1H, J=15,8; 10,4, H-18; 6,25 ppm, d, 1H, J=9,6, H-17; 6,14 ppm, dd, 1H, J=17,3; 6,8, H-19; 6,07 ppm, d, 1H, J=13,2, H-29; 6,05 ppm, brs, 1H; 5,1 ppm, dd, 1H, J=12,4; 5,5, H-28; 4,97 ppm, d, 1H, J=10,4, H-25; 4,40 q, 2H, J=7,1, CH₂CH₃; 3,91 ppm, d, 1H, J=5,1, OH-21; 3,75 ppm, d, 1H, J=9,5, H-21; 3,09 ppm, m, 1H, H-23; 3,07 ppm, s, 3H, H-37; 2,35 ppm, s, 3H, H-36; 2,3 ppm, 1H, H-22; 2,0-1,9 ppm, 7H, H-14, H-30, NH oder OH; 1,78 ppm, s, 3H, H-13; 1,7-1,5, m, 1H, H-24; 1,43 ppm, t, 3H, J=7,1, CH₂CH₃; 1,03 ppm, d, 3H, J=7,0, H-31; 0,85 ppm, d, 3H, J=6,9, H-32; 0,66 ppm, d, 3H, J=6,8, H-33; 0,1 ppm, d, 3H, J=6,9, H-34.
Beispiel 2
N-(Ethyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S
Eine Lösung von 12 g 3-Formylrifamycin S in 100 ml Tetrahydrofuran wurde mit 4 ml Triethylamin und 8 g Silber(I)-oxid versetzt. Die Mischung wurde 18 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt, und es wurden 250 ml Dichlormethan und 500 ml einer 4% Ammoniumchlorid/Wasser-Lösung zugegeben. Nach 15minütigem Rühren wurde die Mischung filtriert, die Dichlormethan-Schicht wurde abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst, die Lösung wurde auf 0°C abgekühlt, und es wurden 5 ml Diphenylphosphorylazid zugesetzt. Die Lösung wurde 8 Stunden lang bei 0°C aufbewahrt und mit 5 ml absolutem Ethanol versetzt. Die Lösung wurde 5 Stunden lang auf 60°C erwärmt und zu einem öligen Rückstand eingedampft. Nach Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (70-230 mesh) mit der mobilen Phase Chloroform/Aceton 5:1 wurde die violette Fraktion eingedampft, und das Produkt wurde in Tetrachlormethan/Hexan kristallisiert, filtriert und getrocknet. es wurden 1,8 g rosafarbener Kristalle erhalten.
Wie anhand der Retentionszeiten gemäß verschiedener HPLC- und DC-Verfahren und durch UV-Spektren (HPLC) belegt, ist das Produkt identisch mit dem von Beispiel 1.
Beispiel 3
N-(Methyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S
Eine Lösung von 10 g 3-Aminorifamycin S und 4 ml Triethylamin in 100 ml Dichlormethan wurde auf -5°C abgekühlt und mit 1,5 ml Methylchlorformiat versetzt. Die Lösung wurde 40 Stunden lang bei Raumtemperatur aufbewahrt und mit 2 ml Triethylamin und 1 ml Methylchlorformiat versetzt. Nach weiteren 5 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft. Es wurden 450 ml Tetrachlormethan und 100 ml einer 10% Ammoniumchlorid/Wasser-Lösung zugesetzt, und nach einstündigem Rühren wurde die Mischung abfiltriert und der Kuchen mit Tetrachlormethan und Wasser gewaschen. Es wurden 450 ml Hexan zugegeben, und nach 15minütigem Rühren wurde das Produkt filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 7 g violetter Kristalle erhalten. Die Strukturanalyse des Produkts erfolgte mittels HPLC, DC, UV-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und NMR-Spektroskopie (¹H, ¹³C und DEPT).
Beispiel 4
N-(4-Nitrobenzyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S
Eine auf -20°C gekühlte Lösung von 10 g 3-Aminorifamycin S und 7 ml Triethylamin in 100 ml Dichlormethan wurde mit 6 g 4-Nitrobenzylchlorformiat versetzt. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei 0°C aufbewahrt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde mit 250 ml Tetrachlormethan und einer 5% Ammoniumchlorid/Wasser-Lösung versetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Nach Filtration und Waschen des Kuchens mit Tetrachlormethan wurde das Filtrat mit 300 ml Hexan versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei 0°C aufbewahrt, und das Produkt wurde filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 6 g dunkelrosafarbener Kristalle erhalten. Die Strukturanalyse des Produkts erfolgte mittels HPLC, DC, UV-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und NMR-Spektroskopie (+H, ¹³C und DEPT).
Beispiel 5
N-(2-Bromethyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S
Eine auf -20°C gekühlte Lösung von 10 g 3-Aminorifamycin S und 6,8 ml Triethylamin in 100 ml Dichlormethan wurde mit 2,6 ml 2-Bromethylchlorformiat versetzt. Die Lösung wurde 1,5 Stunden lang bei -5°C aufbewahrt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde mit 350 ml Tetrachlormethan und einer 15% Ammoniumchlorid/Wasser-Lösung versetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Die Suspension wurde abfiltriert, das Filtrat mit 500 ml Hexan versetzt, und nach Aufbewahren der Mischung bei -5°C über Nacht wurde das Produkt filtriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es wurden 6,5 g dunkelrosafarbener Kristalle erhalten. Die Strukturanalyse des Produkts erfolgte mittels HPLC, DC, UV-Spektroskopie, IR-Spektroskopie und NMR-Spektroskopie (¹H, ¹³C und DEPT).
Beispiel 6
In vitro-Prüfung auf antimikrobielle Wirkung (andere Bakterien als Mykobakterien).
Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung mit R = Methyl, Ethyl, 2-Bromethyl und 4-Nitrobenzyl wurden in vitro gegen einige repräsentative Stämme gewöhnlicher Bakterien (keine Mykobakterien) im Vergleich zu Rifampicin (3-[4-Methyl-1-piperazinylimino)methyl]rifamycin) unter Anwendung eines Doppeldosier-Diffusionsverfahrens in Agar getestet. Dieser Test beruht auf der logarithmischen Abhängigkeit der Größe des Hemmungsbereichs, der mit dem bakteriel len Wachstum in einer Schicht Agar (Ansprechen) verbunden ist, von der Menge des aufgetragenen Antibiotikums.
Die Bezugssubstanz (Rifampicin) und die geprüften Verbindungen wurden in Methanol gelöst, um Konzentrationen von 1 mg/ml zu ergeben. Aus diesen Lösungen wurden gepufferte Lösungen in Phosphat-Puffer, pH 7,4, mit Konzentrationen von 5 und 10 μg/ml hergestellt.
Es wurde eine Ausgangssuspension des Test-Mikroorganismus (Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli, Bacillus mycoides, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa) mit einer UV-Lichtdurchlässigkeit von etwa 25% hergestellt. Ein geeignetes Diffusionsmedium (zum Beispiel für Bacillus subtilis: 1 g Pepton, 3 g Hefeextrakt, 15-18 g Agar in 1 l Wasser, pH 7,8-8,0 nach Sterilisierung) wurde mit 0,5 ml der Ausgangssuspension pro 100 ml Medium bei einer Temperatur von 60-65°C geimpft. Jeweils 20 ml der Mischung wurden in Petri-Schalen gefüllt (Durchmesser 100 mm). Nach Härten des Mediums wurden vier Mulden (Durchmesser 5 mm) in jede Schale eingebracht, und in jede Mulde wurden 90 μl der Lösungen der Bezugs- und Testverbindungen gegeben. Die Schalen wurden wenigstens 15 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Die Größe (Durchmesser) der Hemmungsbereiche wurde dann mit einer Genauigkeit von 0,1 mm gemessen.
Die Wirkung A wurde berechnet gemäß IgA = (I·v/w)mit

I: = Ig(hohe Konzentration/niedrige Konzentration),
v: = (ΣX₁ + ΣX₂) – (ΣP₁ + ΣP₂), und
w: = (ΣX₂ + ΣP₂) – (ΣX₁ + ΣP₁), mit
X₁:: Größe des Bereichs in mm mit niedriger Probenkonzentration,
X₂:: Größe des Bereichs in mm mit hoher Probenkonzentration,
P₁:: Größe des Bereichs in mm mit niedriger Konzentration an Bezugssubstanz,
P₂:: Größe des Bereichs in mm mit niedriger Konzentration an Bezugssubstanz.

Die relativen Wirkungen sind in Tabelle 1 gezeigt (die Wirkung von Rifampicin wird auf 1000 gesetzt). Gegen Bacillus subtilis zeigten alle vier geprüften Verbindungen höhere antibiotische Wirkung als die Bezugssubstanz Rifampicin. Besonders die Substanzen mit R = Methyl, 2-Bromethyl und 4-Nitrobenzyl zeigten etwa sechsmal stärkere Wirkung als Rifampicin.
Die Verbindungen mit R = Methyl und Ethyl wurden gegen E. coli, B. subtilis, K. pneumoniae und P. aeruginosa geprüft. Gegen diese Stämme zeigte N-(Methyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S eine zweimal so starke Wirkung wie Rifampicin, wohingegen N-(Ethyloxycarbonyl)-3-aminorifamycin S ähnliche Wirkung wie die Bezugssubstanz aufwies. Tabelle 1
Beispiel 7
Ex vivo-Prüfung auf antimykobakterielle Wirkung – Wachstum in Maus-Makrophagen
Wegen der Möglichkeit, daß sich die Verbindungen in Makrophagen konzentrieren, und weil Mykobakterien intrazelluläre Pathogene sind, wurde die intrazelluläre Wirkung der Verbindungen bestimmt. Dies wurde erreicht durch Zugabe der Verbindungen zur Maus-Makrophagenzellinie J774, die mit M. tuberculosis H37Rv infiziert worden war. Die Wirkung der Verbindungen wurde dann gemessen durch Bestimmen der Anzahl der koloniebildenden Einheiten, die in der jeweiligen Monoschicht und dem jeweiligen Kulturmedium vorhanden waren.
Im einzelnen wurde die Maus-Makrophagenzellinie J774 von der European Collection of Animal Cell Culture erhalten und in flüssigem Stickstoff aufbewahrt. Die J774-Zellen wurden in einem mit 1 mM L-Glutamin und 10% (Vol./Vol.) wärmeinaktiviertem Rinderfötenserum [HIFBS] ergänzten RPMI 1640-Medium bei 37°C und 5% (Vol./Vol.) CO₂ vermehrt. Nach Bildung einer confluenten Monoschicht auf der Oberfläche des Gewebekulturkolbens wurden die Zellen unterkultiviert. Das Medium wurde entfernt; die Zellen wurden zweimal in 10 ml HBSS/HEPES gewaschen, und die Monoschicht wurde mit 2 ml Trypsin/EDTA-Lösung versetzt. Nach Inkubieren der Monoschicht bei 37°C und 5% (Vol./Vol.) CO₂ wurden die Zellen durch energisches Klopfen am Kolben von der Oberfläche entfernt. 20 ml frisches RPMI 1640-Medium plus HIFBS wurden in den Kolben gegeben, und es wurde in ein Zentrifugenröhrchen umgefüllt und 5 Minuten lang bei 1000 U/min in einer Centaur 2 MSE-Zentrifuge zentrifugiert, um Spuren von Trypsin/EDTA zu entfernen. Das Medium wurde entfernt, frisches RPMI 1640-Medium plus HIFBS wurden zugesetzt, und die Zellen wurden vorsichtig zu getrennten Klümpchen pipettiert. 300 μl der Zellsuspension wurden zu 10 ml RPMI 1640-Medium plus HIFBS in einem neuen Gewebekulturkolben gegeben, und die Zellen wurden bei 37°C und 5% (Vol./Vol.) CO₂ inkubiert. Zur Zählung der Zahl lebensfähiger Makrophagen wurden 20 μl der Zellsuspension zu 40 μl 0,2% (Vol./Vol.) Trypanblau in ausgewogener Hanks-Salzlösung (frei von Calcium und Magnesium, ohne Phenolrot) gegeben. 20 μl dieser Lösung wurden dann in die Kammer eines Hämozytometers überführt, und die Zellen wurden gezählt. Lebensfähige Zellen blieben ungefärbt und von weißer Farbe, und die toten Zellen waren blau gefärbt.
Stammkulturen von Mycobacterium tuberculosis H37Rv wurden auf Middlebrook 7H11-Agar + OADC-Platten oder auf Lowenstein-Jensen[LJ]-Agargefällen bis zu einem Monat bei 4°C [7H11-Platten] oder bis zu 6 Monaten bei -20°C [LJ-Gefälle] gehalten. Die Expositionsdosis war eine Kultur in mit ADC ergänztem Middlebrook 7119-Nährmedium, das 7 Tage lang bei 37°C inkubiert worden war. Die Bakterien wurden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 1000 g geerntet und dann zweimal in HBSS/HEPES, pH 7,4, gewaschen. Die Zellpellets wurden in 1 ml HBSS/HEPES resuspendiert und auf Eis mit drei 5 s-Stößen mit 40 W beschallt, um die Bakterienklümpchen auseinanderzureißen. Die Mykobakterien wurden mit dem Hämozytometer mikroskopisch gezählt und dann in RPMI 1640-Medium plus 1% (Vol./Vol.) HIFBS verdünnt.
Zur Herstellung der Monoschichten für die Infektion wurden die J774-Zellen aus dem Gewebekulturkolben genommen und mit dem Hämozytometer gezählt. Wie vorstehend beschrieben wurde die Trypanblau-Ausschlußprobe zur Bestimmung der Lebensfähigkeit herangezogen, und es wurden 3·10⁷ Zellen in einem Volumen von 350 μl RPMI 1640-Medium plus 10% (Vol./Vol.) HIFBS in jede Mulde einer 24er Gewebekulturplatte pipettiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 37°C und 5% (Vol./Vol.) CO₂ inkubiert, um Anhaften der Zellen an der Oberfläche der Mulden zu ermöglichen. Nach 24 Stunden wurden nichtanhaftende Zellen durch eine Einmalwäsche mit HBSS/HEPES entfernt. Die resultierende Makrophagen-Monoschicht wurde zur Verringerung der Zellproliferation in RPMI 1640-Medium plus 1% (Vol./Vol.) HIFBS kultiviert.
Mycobacterium tuberculosis wurde in RPMI 1640-Medium plus 1% (Vol./Vol.) HIFBS verdünnt, um ein Mykobakterien/Makrophagen-Verhältnis von 1:1 zu ergeben. 350 μl Medium, enthaltend 3·10⁷ Bakterien, wurden vorsichtig in die die anhaftenden J774 enthaltenden Mulden der 24er Gewebekulturplatte gegeben und 4 Stunden lang bei 37°C und 5% (Vol./Vol.) CO₂ inkubiert, um so die Phagozytose zu ermöglichen. Der Überstand wurde abgesaugt, und die Monoschicht wurde zur Abtrennung nicht phagozytierter Mykobakterien viermal in HBSS/HEPES gewaschen. Die Makrophagen wurden mit frischem RPMI 1640-Medium plus 1% (Vol./Vol.) HIFBS mit oder ohne Testverbindung versetzt. Die Makrophagen wurden 24 Stunden lang bei 37°C und 5% (Vol./Vol.) CO₂ inkubiert.
Die Überstände aus jeder Mulde der 24er Gewebekulturplatte wurden dann entfernt und beiseite gestellt. Die Makrophagen wurden durch Zugabe von 350 μl 1% (Gew./Vol.) Saponin in HBSS/HEPES aus den Mulden entfernt. Die Überstände wurden mit 35 μl 10% (Gew./Vol.) Saponin in HBSS/HEPES versetzt. Die 24er Gewebekulturplatte und die Überstände wurden bei 37°C 20 Minuten bzw. solange inkubiert, bis die Makrophagen vollständig lysiert waren, und dann durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Die Zellyse wurde mit einem Nikon-Umkehrmikroskop mikroskopisch überprüft. Die Zellysate und Überstände wurden auf Eis mit drei 5 s-Stößen mit 40 W kurz beschallt, um vollständige Zellyse und Auseinanderreißen etwaiger Bakterienklümpchen sicherzustellen. Wie in Beispiel 8 beschrieben, wurden Lebensfähigkeitszählungen durchgeführt, um die Zahl extrazellulärer und intrazellulärer Bakterien abzuschätzen.
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich ist, hatten beide getestete Verbindungen bei dieser Probe bemerkenswerte Wirksamkeit. Insbesondere zeigten sie 8mal stärkere Wirkung als Rifampicin. Tabelle 2

Claims

N-(3-Rifamycinyl)carbamate der Formel I
und ihre entsprechenden Hydrochinone, worin R C₁-C₄-Alkyl, mono- oder polyhalogeniertes C₁-C₄-Alkyl oder 4-Nitrobenzyl ist, oder Salze derselben.
Carbamate nach Anspruch 1, worin R Methyl, Ethyl, Butyl oder Isobutyl ist.
Carbamate nach Anspruch 1, worin R Chlormethyl, 2-Chlorethyl, 2-Bromethyl, 2,2,2-Trichlorethyl oder 2,2,2-Trichlor-tert-butyl ist.
Verfahren zur Herstellung eines N-(3-Rifamycinyl)carbamats der Formel I
und des entsprechenden Hydrochinons desselben, worin R C₁-C₄-Alkyl, mono- oder polyhalogeniertes C₁-C₄-Alkyl oder 4-Nitrobenzyl ist, dadurch gekennzeichnet, daß 3-Aminorifamycin S der Formel II
mit einem Chlorformiat der Formel III
worin R die obigen Bedeutungen hat, in einem organischen Lösungsmittel in Gegenwart einer starken Base umgesetzt wird, und die erhaltene Chinon-Verbindung der Formel I gegebenenfalls reduziert wird, um das entsprechende Hydrochinon zu ergeben.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein tertiäres Amin, vorzugsweise Triethylamin als starke Base eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Dichlormethan, Ethylacetat oder Tetrahydrofuran verwendet wird.
Verwendung von N-(3-Rifamycinyl)carbamaten der Formel I nach Anspruch 1 zur Behandlung oder Verhütung einer mykobakteriellen Infektion.
Verwendung von Verbindungen nach Anspruch 7 zur Behandlung oder Verhütung von Tuberkulose.
Verwendung von N-(3-Rifamycinyl)carbamaten der Formel I nach Anspruch 1 zur Behandlung oder Verhütung einer mikrobiellen Infektion mit gewöhnlichen Bakterien (keine Mykobakterien), vorzugsweise Bacillus subtilis, Escherichia coli, Bacillus mycoides, Klebsiella pneumoniae und/oder Pseudomonas aeruginosa.