NUEVA COMPOSICION FARMACEU ICA SINERGICA
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para el tratamiento de tuberculosis y con compuestos y combinaciones de compuestos para el uso en tales métodos. La tuberculosis (Mtu) es la enfermedad infecciosa más grande, simple en el mundo que mata a aproximadamente 2 millones de personas cada año. Alguien en el mundo se infecta con Mtu cada segundo y casi el 1% de la población mundial se infecta nuevamente con Mtu cada año. En general, un tercio de la población mundial está infectada con el bacilo de Mtu y de
% a 10% de personas que están infectadas con Mtu llegan a enfermarse o infectarse en algún momento durante su tiempo de vida. Los fármacos en uso actuales se descubrieron hace 40 años y desde entonces no ha habido un esfuerzo de investigación farmacéutica principal para descubrir y desarrollar algún nuevo agente terapéutico. Hay una necesidad médica urgente para combatir esta enfermedad con fármacos que serán rápidamente efectivos contra Mtu resistentes a fármacos asi como sensibles. La terapia de combinación para Mtu incluye cuatro fármacos, Rifampicina, Isoniazida, Pirazinamida y Etambutol, administrados durante una duración mínima de seis meses. El uso de fármacos múltiples ayuda a la prevención de la REF. : 197403
aparición de mutantes resistentes a fármacos y seis meses de tratamiento ayuda a la prevención en la recaída. Por otro lado, la terapia de fármacos múltiples y la duración prolongada de la terapia son impedimentos principales para el cumplimiento terapéutico. Los programas de control ayudaron a implementar el "cumplimiento terapéutico" a través de DOTS (Terapia de corta duración observada directamente) que ejercen una gran carga administrativa a cualquier tratamiento. En el presente, DOTS está disponible en sólo 25% de los pacientes TB. Entre los cuatro fármacos anti TB, la rifampicina juega un papel primordial en el acortamiento de la duración de la terapia a seis meses y la duración aumenta a 18 meses en el caso de Mtu resistente a rifampicina. Ver, por ejemplo, N.K. Jain, K.K. Chopra and Govind Prasad. Initial and acquired isoniazid and rifampicin Resistance to M. tuberculosis and its Implications for treatment Ind. L Tub., 1992, 39, 121. También Iseman M D, MDR-TB and the developing world—a problem no longer to be ignored: the WHO announces DOTS Plus' strategy, International Journal' of Tuberculosis & Lung Disease, 1998, 2, and Global Alliance for TB drug development. Scientific blueprint for tuberculosis drug development Tuberculosis 2001 81 (1): 1-52. Una reducción en la duración de la terapia es claramente deseable . La presente invención se basa en el descubrimiento de
que la rifampicina puede co-administrarse con un inhibidor de la enzima de Mtu acetolactato sintasa (ALS) y producir efectos terapéuticos sinérgicos. Por lo tanto, en un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para matar o controlar el crecimiento de una bacteria, en donde el método comprende aplicar a la bacteria o al ambiente de la misma, cantidades sinérgicamente efectivas de (i) un inhibidor de ARN polimerasa y (ii) un inhibidor de la enzima ALS, por lo que la bacteria se muere o se controla su crecimiento. Por "cantidades sinérgicamente efectivas" se entiende que (i) y (ii) se administran en cantidades que, cuando se aplican a la bacteria o al ambiente de la misma de acuerdo con un régimen de tratamiento definido, matan o controlan el crecimiento de la bacteria. Puede usarse cualquier bacteria conveniente, éstas incluyen micobacterias y es convenientemente M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare o M. leprae, especialmente M. tuberculosis y las cepas resistentes a fármacos de las mismas, tales como Mtu resistente a multi-fármacos y específicamente Mtu resistente a rifampicina. Se apreciará que el inhibidor de ARN polimerasa y el inhibidor de. la enzima ALS se seleccionan para sus propiedades como inhibidores de la bacteria particular. Se apreciará que (i) y (ii) pueden administrarse al
mismo tiempo, es decir, simultáneamente o a tiempos diferentes (consecutivamente) en cualquier orden conveniente; con la condición de que la administración sea de acuerdo con un régimen de tratamiento definido . Se apreciará que un régimen de tratamiento definido dependerá de la micobacteria particular y será designado para relacionar factores, tales como la resistencia de fármacos y, en particular, la resistencia de fármacos múltiples. Por lo tanto, el régimen puede incluir el uso de uno o más agentes terapéuticos adicionales. El régimen de tratamiento definido puede comprender convenientemente una o más fases iniciales y una o más fases de continuación. Con respecto a Mtu, cada fase inicial, a manera de ejemplo no limitante, puede comprender hasta cuatro agentes, tales como inhibidor de rifampicina (como inhibidor de ARN polimerasa) , Isoniazida, Pirazinamida y ALS . Cada fase inicial puede ser de aproximadamente 8 semanas de duración y involucrar una dosificación diaria (por ejemplo, aproximadamente 56 dosis en total) o una dosificación de cinco veces por semana (por ejemplo, aproximadamente 40 dosis). De manera conveniente, sólo se usa la fase inicial. Cada fase de continuación puede involucrar sólo dos agentes, tales como rifampicina y el inhibidor de ALS y ser entre aproximadamente 18-31 semanas de duración. El número
total de dosis (por agente) dependerá de los agentes usados. De manera conveniente, sólo se usa una fase de continuación.
Con referencia al Ejemplo de referencia 1, se establecen a continuación los regímenes de fármacos para la tuberculosis pulmonar de cultivo positivo causados por organismos susceptibles a fármacos. Puede usarse cualquier inhibidor de ARN polimerasa conveniente. Este es convenientemente rifampicina o un derivado del mismo, tal como rifampicina y sus derivados como Rifapentina, Rifabutina y otros inhibidores. Ver, por ejemplo: WO-03/084965, WO-04/005298 y Lounis N & Roscigno G. "In vitro and In vivo activities of rifamycin derivatives against mycobacterial infections" en Curr. Pharm. Design, 2004, (10) 3229-3238. Puede usarse cualquier inhibidor de ALS conveniente.
Éste se selecciona convenientemente de sulfonilureas, imidazolinonas , triazolopirimidinas , pirimidil-oxi-benzoatos , pirimidil-tio-bencenos, 4, 6-dimetoxipirimidinas, indol acil sulfonamidas, ácidos pirimidil salicílicos y sulfonil carboxamidas . Los inhibidores de ALS convenientes se establecen, por ejemplo, como se indica en la patente US No. 5998420 (Grandoni) o las referencias "Herbicides inhibiting branched chain amino acid biosynthesis" - Stetter, J. (ed) Springer-Verlag, Alemania y las referencias en la presente, y "Synthesis and Chemistry of Agrochemicals III", 1992
editado por Don R. Baker, Joseph G. Fenyes and James J.
Steffens y las referencias en la misma. Los compuestos de sulfonilurea son compuestos particulares para el uso en la presente invención. Los compuestos de triazolopirimidina son compuestos particulares para el uso en la presente invención. Se entenderá que la combinación sinérgica proporcionada por esta invención puede permitir el uso de concentraciones sub-MIC de uno o ambos agentes, que pueden producir el mismo efecto similar a cuando el compuesto se usa en su MIC individual. Este puede ser MIC 2 a 4 veces menor para cualquiera o ambos de los compuestos en la combinación usada.
En otras palabras, puede ser a una concentración de hasta 50% o hasta 25% del valor de MIC real. Por lo tanto, en un aspecto particular de la invención, las cantidades sinérgicamente efectivas de (i) un inhibidor de ARN polimerasa y (ii) un inhibidor de la enzima ALS comprenderá una concentración sub-MIC de uno o ambos de (i) y
(ü) · En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un agente terapéutico para la administración a una bacteria o al ambiente de la misma, en donde el agente comprende cantidades sinérgicamente efectivas de (i) un inhibidor de ARN polimerasa y (ii) un inhibidor de la enzima ALS. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona
un agente terapéutico como se definió anteriormente para el uso en el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, tal como un humano o animal. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un humano o animal que comprende administrar al humano o animal, una cantidad sinérgicamente efectiva de (i) un inhibidor de ARN polimerasa y (ii) un inhibidor de la enzima ALS. Una ventaja particular de la presente invención es que puede usarse para enfrentar el problema de Mtu resistente a rifampicina. La rifampicina se introdujo primero en 1972 como un fármaco antí-tubercular y es extremadamente efectiva contra M. tuberculosis. Debido a su alta acción bactericida, junto con la isoniazida, es el fundamento de la quimioterapia de corta duración. La resistencia a la rifampicina está en aumento debido a la amplia aplicación y los resultados en la selección de los mutantes resistentes a otros componentes de la quimioterapia de corta duración que conducen a MDR-TB. Las cepas resistentes a fármacos simples a todos los otros agentes usados en la quimioterapia de corta duración se han documentado en todos los países inspeccionados. De acuerdo con WHO, VIH y TB forman una combinación letal que representa 13% de las muertes por SIDA en el mundo. Ya que ALS puede ser esencial en las bacterias Gram
negativas, como B. mallei etc., la invención también puede usarse para proporcionar una actividad de espectro más amplio. Ejemplos de' los organismos Gram negativos incluyen Burkoldaria sp. tales como B. mallei; Brucella sp. tales como JB. suis; Pseudomonas sp. tales como P. aeruginosa; Neisseria sp. tales como N. gonorrhoeae, N. meningitidis, etc. Mientras que no se desea ser limitado por consideraciones teóricas, se cree que hay un mecanismo biológico fundamental para los síntomas observados entre los inhibidores de ARN polimerasa y ALS . Esto puede ser debido a los niveles mejorados del metabolito celular ppGpp, resultando tal mejoramiento de la inhibición de ALS y la consecuente privación del aminoácido. El metabolito celular ppGpp se reporta que es un regulador de la actividad de ARN polimerasa. Con base en lo anterior, se ha visualizado un método para la identificación de nuevos inhibidores de ARN polimerasa o ALS. Por lo tanto, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la identificación de un inhibidor de ALS en donde el método comprende poner en contacto una bacteria con (i) un inhibidor de ARN polimerasa bacteriano a una concentración menor que su concentración inhibidora mínima (MIC, por sus siglas en inglés) y (ii) un inhibidor de ALS putativo, determinando la actividad
inhibidora combinada de (i) y (ii) y establecer si el compuesto de prueba es un inhibidor con referencia a cualquier inhibición de la bacteria. Se apreciará que (i) y (ii) pueden ponerse en contacto con la bacteria al mismo tiempo o en cualquier orden. De manera conveniente, la bacteria se pone en contacto con (i) y (ii) al mismo tiempo. Cualquier bacteria conveniente puede usarse en el método anterior, tales como las mencionadas anteriormente. Una cepa particular para el uso en el método es Mycobacterium tuberculosis H37Rv. La MIC del inhibidor de ARN polimerasa puede establecerse ya sea de los datos disponibles o mediante la experimentación de rutina. La concentración del inhibidor de ALS putativo a usarse se selecciona convenientemente para dar una indicación significativa de su actividad, por ejemplo, cuando se compara con el inhibidor de ARN polimerasa bacteriano. Las concentraciones convenientes usadas incluyen las usadas ahora de manera rutinaria en los protocoles de selección de fármacos, tales como aproximadamente 10 µ?a?? a 100 uM. El método de identificación es útil en las áreas farmacéuticas y agroquimicas . Puede usarse cualquier concentración conveniente menor de MIC, con la condición de que cualquier contribución sinérgica del compuesto de prueba pueda distinguirse de la
actividad del inhibidor de ARN polimerasa sólo. En la práctica la concentración usada es probablemente menor que 80% ó 75% de la MIC, tal como menor de 60%, 50%, 40%, 30% ó 20%. Son valores particulares menor de 50% o menor de 25%, tal como menor de 25%. Se apreciará que cualquier efecto inhibidor puede ser debido a un mecanismo además de la inhibición de ALS. La investigación adicional seria requerida para establecer el mecanismo real. Tales investigaciones podrían involucrar la acción de (MOA) o los estudios de inhibición de enzimas. También se apreciará que cualquier efecto inhibidor puede ser debido sólo al inhibidor de ALS putativo. Esto se monitorea convenientemente realizando una versión paralela del método de identificación, pero sin el inhibidor de ARN polimerasa. Además, una versión paralela del método de identificación se realiza convenientemente sin el inhibidor de ALS putativo. Tales métodos paralelos actúan como controles convenientes. El método anterior puede usarse de una manera análoga para identificar los nuevos inhibidores de ARN polimerasa. Por lo tanto, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la identificación de un inhibidor de ARN polimerasa bacteriano, en donde el método comprende poner en contacto una bacteria con (i) un inhibidor de ALS a una concentración menor que su concentración
inhibidora mínima (MIC) y (ii) un inhibidor de ARN polimerasa bacteriano putativo, determinando la actividad inhibidora de (i) y (ii) y establecer si el compuesto de prueba es un inhibidor de ARN polimerasa bacteriano con referencia a cualquier inhibición de la bacteria. Los detalles se dan a continuación con relación al método para identificar los inhibidores de ALS que aplican por analogía al método de identificación de los inhibidores de ARN polimerasa. La invención se ilustrará ahora con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos.
Ejemplo 1 Un inhibidor de ALS de sulfonilurea y un inhibidor de ALS de triazolopirimidina se probaron solos y en combinación con rifampicina . Los controles positivos usados fueron Isoniazida y estreptomicina en donde se encuentra una acción sinérgica. Las MICs individuales de la Isoniazida (INH) y estreptomicina (Strep) son 0.03 y 1.0 g/ml respectivamente. Cuando se usan en combinación, estos valores caen a 0.0075 y 0.12 g/ml respectivamente (cf . Figura 1) . Esto es 4 veces y 8 veces menor. El control negativo usado fue una combinación de Etambutol (Etham) e Isoniazida (Inh) en donde no hay una actividad sinérgica. Las MICs individuales de 0.5 & 0.03 no
caen significativamente cuando se prueban juntas (Figura 2) cf. In. Clinical Microbiology Procedures Handbook; Vol . 1-2 por Isenberg, Henry. D. Ed Washington D.C.; American Society for Microbiology/1992; Páginas 5.18.1 a 5.18.28). Los resultados muestran una sinergia clara; la Figura 3 muestra las MICs individuales de Rifampicina y un compuesto de sulfonilurea (SU) que tiene actividad inhibidora de ALS son 0.03 y 0.25 g/ml . Cuando se usan en combinación, estas MICs caen 0.0038 y 0.03 ug/ml respectivamente, lo que es 8 veces menor para ambos fármacos. La Figura 4 muestra las MICs individuales de Rifampicina y un compuesto de triazolopirimidina (TP) que tienen actividad inhibidora de ALS de 0.015 & 0.5 ug/ml respectivamente. Cuando se usan en combinación, estas MICs caen a 0.0038 & 0.03 ug/ml lo que es 4 & 8 veces menor para ambos fármacos .
Ejemplo 2 Método para la identificación de AR polimerasa micobacteriano o inhibidores de ALS . La selección microbiologica se realiza en un formato de placa de microtitulación para seleccionar 20-25 compuestos por placa. La selección se realiza usando la prueba de azul alamar (Franzblau, S.G. et al. 1998. J. Clin. Microbiol. 36: 362-366) que proporciona resultados después de 7 días. Un inhibidor de ALS conocido se selecciona y usa para la
selección con inhibidores de ARN polimerasa putativos. El inhibidor de ALS conocido se usa a una concentración fija de 0.5 & ó 0.25x MIC. Los inhibidores de ARN polimerasa putativos se seleccionan a 2 " concentraciones, es decir 10 & 100 uM. Se corren tres grupos de prueba: 1) Sólo con el inhibidor de ALS a concentraciones MIC y sub-MIC que también constituirán el control positivo. 2) Los compuestos desconocidos a 10 & 100 um solo para verificar la actividad inhibidora inherente, si existiera. 3) Los inhibidores de ARN polimerasa putativos a concentraciones de 10 & 100 um junto con el inhibidor de ALS a concentraciones MIC de 0.5 y 0.25x. Los compuestos que muestran una inhibición en la combinación con el inhibidor de ALS usado a una concentración sub-MIC o una inhibición mejorada cuando se combinan con el inhibidor de ALS, se seleccionan para el análisis adicional. El mismo método se repite usando un inhibidor de ARN polimerasa conocido, tal como inhibidores de rifampicina y ALS putativo.
Ejemplo de referencia 1 Regimenes de fármacos y tuberculosis pulmonar de cultivo positivo causada por organismos susceptibles a fármacos Régimen 1 (fase inicial) Fármacos: Isoniazida (INH) ; Rifampina (RTF);
Pirazinamida (PZA) ; Etambutol (EMB) Intervalo y dosis (duración mínima) : Siete días por semana (wk) para 56 dosis (8 wk) ó 5 días/semana (d/wk) para 40 dosis (8 wk)
Régimen la (Fase de continuación) Fármacos: INH/RIF Intervalo y dosis (duración mínima) : Siete días por semana para 126 dosis (18 wk) ó 5 d/wk para 90 dosis (18 wk) Intervalos de dosis totales (duración mínima) : 182-130
(26 wk) Clasificación (evidencia): HTV-: A (I); VIH+: A (II)
Régimen Ib (Fase de continuación) Fármacos: INH/RIF Intervalo y dosis (duración mínima) : Dos veces por semana durante 36 dosis (18 wk) Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 92-76 (26 wk) Clasificación (evidencia): VIH- : A (I); VIH+: A (II)
Régimen le (Fase de continuación) Fármacos : INH/RPT Intervalo y dosis (duración mínima) : Una vez por semana durante 18 dosis (18 wk)
Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 74-58 (26 wk) Clasificación (evidencia): VIH-: B (I); VIH+: E (I)
Régimen 2 (Fase inicial) Fármacos: INH, RIF, PZA, EMB Intervalo y dosis (duración mínima) : Siete días por semana durante 14 dosis (2 wk) , luego dos veces por semana durante 12 dosis (6 wk) ó 5 d/wk durante 10 dosis (2 wk) , luego dos veces por semana durante 12 dosis (6 wk)
Régimen 2a (Fase de continuación) Fármacos: INH/RIF Intervalo y dosis (duración mínima) : Dos veces por semana durante 36 dosis (18 wk) Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 62-58 (26 wk) Clasificación (evidencia): VIH- : ? (II); VIH+: B (II)
Régimen 2b (Fase de continuación) Fármacos: INH/RPT Intervalo y dosis (duración mínima) : Una vez por semana durante 18 dosis (18 wk) Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 44-40 (26 wk)
Clasificación (evidencia): VIH-: B (I); VIH+: E (I)
Régimen 3 (Fase inicial) Fármacos: INH, RIF, PZA, EMB Intervalo y dosis (duración mínima) : Tres veces por semana durante 24 dosis (8 wk)
Régimen 3a (Fase de continuación) Fármacos: INH/RIF Intervalo y dosis (duración mínima) : Tres veces por semana durante 54 dosis (18 wk) Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 78 (26 wk) Clasificación (evidencia): VIH- : B (I); VIH+: B (II)
Régimen 4 (Fase inicial) Fármacos: INH, RIF, EMB Intervalo y dosis (duración mínima) : Siete días por semana durante 56 dosis (8 wk) ó 5 d/wk durante 40 dosis (8 wk)
Régimen 4a (Fase de continuación) Fármacos: INH/RIF Intervalo y dosis (duración mínima) : Siete días por semana durante 217 dosis (31 wk) ó 5 d/wk durante 155 dosis (31 wk)
Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 273-195 (39 wk) .Clasificación (evidencia): VIH- : C (I); VIH+: C (II)
Régimen 4b (Fase de continuación) Fármacos: INH/RIF Intervalo y dosis (duración mínima) : Dos veces por semana durante 62 dosis (31 wk) Intervalo y dosis totales (duración mínima) : 118-102 (39 wk) Clasificación (evidencia): VIH- : C (I); VIH+: C (II). Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.