DE102021213181A1 - Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung - Google Patents

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Jan Eric Neuburger
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Abstract

Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung umfassend (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor; (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen; (iii) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i), wobei ein Feststoff erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist. In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ebenfalls einen Cofaktor, erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren des ersten Aspektes.

Description

  • Die Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung umfassend (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor; (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen; (iii) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i), wobei ein Feststoff erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist. In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung ebenfalls einen Cofaktor, erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren des ersten Aspektes.
  • Cofaktoren sind chemische Stoffe, die für die Funktion vieler Enzyme und damit im Zellstoffwechsel wichtig sind. In der Gruppe der Cofaktoren wird üblicherweise zwischen anorganischen Metallionen und relativ komplexen organischen Molekülen unterschieden. Die Cofaktoren können dabei temporär als auch permanent an das Protein gebunden werden. Viele chemisch-synthetisch relevante Cofaktoren enthalten Phosphatgruppen und werden als organische Phosphate bzw. als phosphatbasierte Cofaktoren bezeichnet, beispielsweise Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADP+, oxidierte Form), für Redoxreaktionen. Eine Auswahl relevanter Vertreter umfassend NADP+, Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+, oxidierte Form), Adenosintriphosphat (ATP) und Pyridoxalphosphat (PLP), ist in Schema 1 aufgeführt. Hervorgehoben (Umrahmung) ist jeweils der Phosphat-Teil. Im Folgenden werden als Cofaktoren die oben beschriebenen organischen Phosphate (phosphatbasierten Cofaktoren) verstanden.
  • Cofaktoren sind wichtige Bestandteile des Zellstoffwechsels, aber werden auch für synthetische Zwecke eingesetzt. Ein klassisches Beispiel in der Synthese ist die Alkoholdehydrogenasekatalysierte, asymmetrische Synthese von enantiomerenreinen Alkoholen aus prochiralen Ketonen mit dem Einsatz von NADPH (reduzierte Form), welches im Zuge der Redoxreaktion zu NADP+ (oxidierte Form) umgesetzt wird. Die Cofaktoren sind in der Regel sehr kostenintensiv und können definitiv nicht equimolar (Verhältnis 1:1) eingesetzt werden.
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  • Stattdessen werden Regenerationskonzepte implementiert, welche die Cofaktoren in situ regenerieren und somit den wiedergewonnen Cofaktor der Reaktion wieder zur Verfügung stellen. Beispielsweise erfolgt dies über ein weiteres Enzym, beispielsweise eine Glucosedehydrogenase, und ein zusätzliches Co-Substrat, beispielsweise Glucose. Die finale Gleichgewichtsverschiebung zur Produktseite erfolgt beispielsweise durch einen nicht-katalytischen finalen Teilschritt in Form der spontanen Hydrolyse eines Gluconolactons.
  • Trotz der oben beschriebenen Cofaktorregenerierung und trotz der geringen Konzentrationen, in welchen die Cofaktoren eingesetzt werden, stellen diese üblicherweise einen kostenintensiven Bestandteil dar, werden aber in der Regel nach der Produktisolierung ungenutzt entsorgt. Eine potentielle Abtrennung wird dadurch erschwert, dass die eingesetzten Cofaktoren nur in geringen Konzentrationen vorliegen und dementsprechend eine sehr effiziente Isolierung notwendig ist. Eine Aufreinigung wurde bis jetzt nicht ernsthaft in Betracht gezogen und erfordert höchstwahrscheinlich mehrere Aufkonzentrationsvorgänge und chromatische Verfahren mit entsprechend extrem hohen Kosten. Ein großes ökonomisches Potential mit der Wiedergewinnung der Cofaktoren geht daher verloren.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Wiedergewinnung von Cofaktoren, mit welchem die oben genannten Nachteile überwunden werden können.
  • 1. Aspekt - Verfahren
  • Die Aufgabe wurde gelöst mit einem Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung umfassend:
    • (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor;
    • (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium (3. Nebengruppe des Periodensystems), Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium (Lanthanoide) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen;
    • (iii) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i), wobei ein Feststoff (erster Feststoff) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht eine Wiedergewinnung von Cofaktoren mit Ausbeuten von teilweise mehr als 95%. Das Verfahren lässt sich prinzipiell für alle biokatalytischen Reaktionssysteme mit den entsprechenden Cofaktoren einsetzen. Die Höhe des kommerziellen Potentials ist selbstverständlich an die Kosten des Cofaktors gebunden, welcher wiedergewonnen wird. Hervorzuheben ist an dieser Stelle beispielsweise der Cofaktor NADP+, welcher selbst in der oxidierten Form sehr teuer ist (bis zu 1000 €/g) und gleichzeitig sehr häufig in biokatalytischen Synthesen eingesetzt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet somit einen Weg zur Wiedergewinnung von Cofaktoren, der kostengünstig ist und resourcenschonend, da er die erneute Verwendung des jeweiligen Cofaktors ermöglicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst das Verfahren weiterhin:
    • (iv) Abtrennen des Feststoffes (ersten Feststoffs) von der gemäß (iii) erhaltenen Lösung.
  • Die Abtrennung erfolgt mittels dem Fachmann bekannter Verfahren wie beispielsweise Dekantieren, Filtrieren etc., optional gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten mit einem wässrigen Lösungsmittel. Das hierfür eingesetzte wässrige Lösungsmittel umfasst Wasser und optional im Bereich von 0,1 bis 20 Gewichts-%, bevorzugt im Bereich von 1 bis 10 Gewichts-% ein oder mehrere polare organische Lösungsmittel, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der aliphatischen C1 bis C5 Monoole, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Methanol, Ethanol und Mischungen von Methanol und Ethanol. Ein polares organisches Lösungsmittel weist bevorzugt einen negativen dekadischen Logarithmus des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizientens (logKOW) im Bereich von -1 bis 0 unter Standardbedingungen auf (T: 20-25 °C, p: 1013 mbar). Der gemäß (iii) erhaltene bzw. gemäß (iv) abgetrennte Feststoff umfasst das Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor. Der (erste) Feststoff liegt kristallin, teilkristallin, amorph, teilamorph oder in Mischformen vor. Der (erste) Feststoff kann als reine Salzverbindung (unsolvatisiert, unhydriert) oder als Solvat oder Hydrat oder Gemisch davon vorliegen, wobei Hydrat Hemihydrat, Monohydrat und Polyhydrat und Solvat Hemisolvat, Monosolvat und Polysolvat umfasst. Der in (iii) erhaltene (erste) Feststoff ist nach außen hin neutral geladen. Der Cofaktor weist im (ersten) Feststoff eine der positiven Ladung des Metallkation bzw. der Metallkationen, je nach Kombination und pH-Wert, entsprechende negative Ladung auf.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst das Verfahren weiterhin:
    • (v) Zugabe einer phosphathaltigen Verbindung zum gemäß (iv) abgetrennten (ersten) Feststoff, bevorzugt in wässriger Lösung; unter Erhalt einer Lösung umfassend den Cofaktor und Erhalt eines zweiten Feststoffs, welcher das Metallkation des Salzes gemäß (ii) bzw. (iii) und die phosphathaltige Verbindung umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst das Verfahren weiterhin:
    • (vi) Abtrennen der gemäß (v) erhaltenen Lösung umfassend den Cofaktor vom zweiten Feststoff.
  • Auch in Schritt (vi) erfolgt die Abtrennung mittels dem Fachmann bekannter Verfahren wie Dekantieren, Filtrieren etc., optional gefolgt von dem Fachmann geläufigen weiteren Aufreinigungsschritten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst (iii):
    • (111.1) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) unter Erhalt einer Lösung, welche Cofaktor und Salz enthält:
    • (iii.2)Einstellen des pH-Werts der in (iii. 1) erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert ≥ 7, bevorzugt im pH-Bereich von 7 bis 10, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9,5, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9, wobei ein Feststoff(als Niederschlag) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist.
  • Die pH-Bestimmung in wässriger Lösung erfolgt im Rahmen der vorliegenden Erfindung mittels pH sensitiver Glaselektrode gemäß DIN 19263:2007-05.
  • Bezüglich der Schritte (i) bis (iii), sowie optional (iv), (v), (vi) ist anzumerken, dass diese in der genannten Reihenfolge ausgeführt werden, wobei bevorzugt zwischen den in der Nummerierung aufeinanderfolgenden Schritten keine Zwischenschritte erfolgen, d.h. beispielsweise folgt (ii) direkt auf (i) etc..
  • Für in (iii. 1) erhaltene Lösungen, in welchen der Cofactor ATP oder NAD ist, wird der pH-Wert weiter bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 7 bis 7,5 eingestellt. Für in (iii. 1) erhaltene Lösungen, in welchen der Cofactor NADP, PLP oder TPP ist, wird der pH-Wert weiter bevorzugt auf einen Wert im Bereich von 7,5 bis 9 eingestellt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors ist der Cofaktor ein phosphatbasierter Cofaktor in seiner reduzierten und/oder oxidierten Form, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP: NADP+ für die oxidierte Form, NADPH für die reduzierte Form), Pyridoxalphosphat (PLP), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD: NAD+ für die oxidierte Form, NADH+H+ für die reduzierte Form), Adenosinpyrophosphat (ATP), Thiaminpyrophosphat (TPP) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Cofaktoren, wobei der Cofaktor bevorzugt mindestens NADP ist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors ist die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung umfassend den Cofaktor, welche bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von < 7, bevorzugt im Bereich von 4-6,5, weiter bevorzugt im Bereich von 4,5-5,5, aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors ist die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung, welche den Cofaktor in einer Konzentration von ≥ 0,25 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentration im Bereich von 0,25 bis 10 mmol/l, weiter bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 mmol/l, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 5 mmol/l, aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors ist die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung umfassend den Cofaktor eine Lösung, welche nach einer Reaktion von Reaktanden unter Beteiligung des Cofaktors, optional nach Abtrennung eines oder mehrerer Produkte, verblieben ist (Rückgewinnung des Cofaktors).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors ist das gemäß (ii) bereitgestellte Salz ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Yttrium, Lanthan und Mischungen dieser Metallkationen, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz mindestens Y3+ enthält.
  • In Bezug auf die Kombination aus Cofakor und Metallkation ist bevorzugt eine Kombination ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus PLP mit Y3+, NAD mit Sc3+, NADP mit Y3+, ATP mit La3+ und TPP mit La3+, besonders bevorzugt die Kombination aus NADP und Y3+.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst das gemäß (ii) bereitgestellte Salz ein Anion mit Ausnahme von Phosphat(tri)anion, Hydrogenphosphat(di)anion und Dihydrogenphosphat(mono)anion, bevorzugt mit Ausnahme phosphathaltiger Anionen, und umfasst bevorzugt ein Anion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenid (Fluorid, Chlorid, Bromid, Iodid), Carbonat, Nitrat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Anionen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Bromid, Nitrat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Anionen, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Nitrat und Mischungen von Chlorid und Nitrat.
  • Das „gemäß (ii) bereitgestellte Salz“ ist nach außen hin neutral geladen, d.h. die Ladung des Metallkations und des Anions kompensieren sich. Der Ausdruck „phosphathaltiges Anion“ umfasst organische und anorganische Phosphate.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors wird das gemäß (ii) bereitgestellte Salz in Form einer wässrigen Lösung eingesetzt, welche bevorzugt einen H-Wert im Bereich von < 7, bevorzugt im Bereich von 4-6,5, weiter bevorzugt im Bereich von 4,5-5,5, aufweist.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors erfolgt die Zugabe des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) in einem molaren Verhältnis Metallkation : Cofaktor im Bereich von 0,1:10 bis 10:0,1, bevorzugt im Bereich von 5:1 bis 1:1.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors ist die gemäß (v) zugesetzte phosphathaltige Verbindung ausgewählt aus der Gruppe der phosphathaltigen Verbindungen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anorganischem Phosphaten und organischen Phosphaten, weiter bevorzugt aus der Gruppe der anorganischen Phosphate, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat und Mischungen von zwei oder mehr dieser phosphathaltigen Verbindungen, wobei die phosphathaltige Verbindung weiter bevorzugt als wässrige Lösung eingesetzt wird.
  • Die phosphathaltige Verbindung wird bevorzugt als Salz eingesetzt, in welchem die negative Ladung durch ein oder mehr Kationen ausgeglichen sind, wobei die Kationen bevorzugt Alkalimetallkationen, weiter bevorzugt Natriumkationen, sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst die phosphathaltige Verbindung eine Mischung aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat, welche in wässriger Lösung eingesetzt wird, welche bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6-8 aufweist (Phosphatpuffer).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens zur Abtrennung eines Cofaktors umfasst das Verfahren weiterhin:
    • (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor;
    • (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium (3. Nebengruppe des Periodensystems), Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium (Lanthanoide) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen;
    • (iii.1) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) unter Erhalt einer Lösung, welche Cofaktor und Salz enthält:
    • (iii.2)Einstellen des pH-Werts der in (iii. 1) erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert >7, bevorzugt im pH-Bereich von 7,1 bis 10, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9,5, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9, wobei ein Feststoff (als Niederschlag) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst, und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist;
    • (iv) Abtrennen des Feststoffes von der gemäß (iii.2) erhaltenen Lösung;
    • (v) Zugabe einer phosphathaltigen Verbindung zum gemäß (iv) abgetrennten Feststoff, bevorzugt in wässriger Lösung, wobei die wässrige Lösung bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6-8 aufweist, unter Erhalt einer Lösung umfassend den Cofaktor und Erhalt eines zweiten Feststoffs, welcher das Metallkation des Salzes gemäß (ii) und die phosphathaltige Verbindung umfasst;
    • (vi) Abtrennen der gemäß (v) erhaltenen Lösung umfassend den Cofaktor vom zweiten Feststoff.
  • 2. Aspekt - Cofaktor
  • In einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Cofaktor, erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren des ersten Aspektes. Alle Detailangaben, welche oben zum ersten Aspekt offenbart sind, gelten entsprechend auch für den zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Ausführungsformen und Kombinationen von Ausführungsformen, die sich aus den angegebenen Abhängigkeiten und Rückbezügen ergeben, näher erläutert. Insbesondere wird darauf hingewiesen, dass in jedem Fall, in dem ein Bereich von Ausführungsformen erwähnt wird, beispielsweise im Zusammenhang mit einem Begriff wie „eine der Ausführungsformen (1) bis (4)“, jede Ausführungsform in diesem Bereich für den Fachmann ausdrücklich offenbart werden soll, d. h. der Wortlaut dieses Begriffs ist für den Fachmann als Synonym für „eine der Ausführungsformen (1), (2), (3) und (4)“ zu verstehen. Ferner wird ausdrücklich darauf hingewiesen, dass die folgende Reihe von Ausführungsbeispielen nicht die den Schutzumfang bestimmenden Ansprüche darstellt, sondern einen geeignet strukturierten Teil der auf allgemeine und bevorzugte Aspekte der vorliegenden Erfindung gerichteten Beschreibung bildet.
    1. 1. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung umfassend
      • (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor;
      • (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium (3. Nebengruppe des Periodensystems), Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium (Lanthanoide) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen;
      • (iii) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i), wobei ein Feststoff (erster Feststoff) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist.
    2. 2. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach Ausführungsform 1, umfassend
      • (iv) Abtrennen des Feststoffes (ersten Feststoffs) von der gemäß (iii) erhaltenen Lösung.
    3. 3. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach Ausführungsform 1 oder 2, umfassend
      • (v) Zugabe einer phosphathaltigen Verbindung zum gemäß (iv) abgetrennten (ersten) Feststoff, bevorzugt in wässriger Lösung; unter Erhalt einer Lösung umfassend den Cofaktor und Erhalt eines zweiten Feststoffs, welcher das Metallkation des Salzes gemäß (ii) bzw. (iii) und die phosphathaltige Verbindung umfasst.
    4. 4. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 3 umfassend
      • (vi) Abtrennen der gemäß (v) erhaltenen Lösung umfassend den Cofaktor vom zweiten Feststoff.
    5. 5. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 4, wobei (iii) umfasst:
      • (iii.1) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) unter Erhalt einer Lösung, welche Cofaktor und Salz enthält:
      • (iii.2) Einstellen des pH-Werts der in (iii.1) erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert ≥ 7, bevorzugt im pH-Bereich von 7 bis 10, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9,5, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9, wobei ein Feststoff(als Niederschlag) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist.
    6. 6. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 5, wobei der Cofaktor ein phosphatbasierter Cofaktor in seiner reduzierten und/oder oxidierten Form ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP: NADP+ für die oxidierte Form, NADPH für die reduzierte Form), Pyridoxalphosphat (PLP), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD: NAD+ für die oxidierte Form, NADH+H+ für die reduzierte Form), Adenosinpyrophosphat (ATP), Thiaminpyrophosphat (TPP) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Cofaktoren, wobei der Cofaktor bevorzugt mindestens NADP ist.
    7. 7. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 6, wobei die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung umfassend den Cofaktor ist, welche bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von < 7, bevorzugt im Bereich von 4-6,5, weiter bevorzugt im Bereich von 4,5-5,5, aufweist.
    8. 8. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 7, wobei die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung ist, welche den Cofaktor in einer Konzentration von ≥ 0,25 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentration im Bereich von 0,25 bis 10 mmol/l, weiter bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 mmol/l, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 5 mmol/l, aufweist.
    9. 9. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 8, wobei die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung umfassend den Cofaktor eine Lösung ist, welche nach einer Reaktion von Reaktanden unter Beteiligung des Cofaktors, optional nach Abtrennung eines oder mehrerer Produkte, verblieben ist (Rückgewinnung des Cofaktors).
    10. 10. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 9, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz ein Metallkation eines Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Yttrium, Lanthan und Mischungen dieser Metallkationen, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz mindestens Y3+ enthält.
    11. 11. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 10, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz ein Anion mit Ausnahme von Phosphat(tri)anion, Hydrogenphosphat(di)anion und Dihydrogenphosphat(mono)anion, bevorzugt mit Ausnahme phosphathaltiger Anionen, umfasst, und bevorzugt ein Anion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenid (Fluorid, Chlorid, Bromid, Iodid), Carbonat, Nitrat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Anionen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Bromid, Nitrat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Anionen, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Nitrat und Mischungen von Chlorid und Nitrat, umfasst.
    12. 12. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 11, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz in Form einer wässrigen Lösung eingesetzt wird, welche bevorzugt einen H-Wert im Bereich von < 7, bevorzugt im Bereich von 4-6,5, weiter bevorzugt im Bereich von 4,5-5,5, aufweist.
    13. 13. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 1 bis 12, wobei die Zugabe des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) in einem molaren Verhältnis Metallkation : Cofaktor im Bereich von 0,1:10 bis 10:0,1, bevorzugt im Bereich von 5:1 bis 1:1, erfolgt.
    14. 14. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsformen 3 bis 13, wobei die gemäß (v) zugesetzte phosphathaltige Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der phosphathaltigen Verbindungen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anorganischem Phosphaten und organischen Phosphaten, weiter bevorzugt aus der Gruppe der anorganischen Phosphate, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat und Mischungen von zwei oder mehr dieser phosphathaltigen Verbindungen, wobei die phosphathaltige Verbindung weiter bevorzugt als wässrige Lösung eingesetzt wird.
    15. 15. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ausführungsform 14, wobei die phosphathaltige Verbindung eine Mischung aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat umfasst, welche in wässriger Lösung eingesetzt wird, welche bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6-8 aufweist (Phosphatpuffer).
    16. 16. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung umfassend
      • (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor;
      • (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium (3. Nebengruppe des Periodensystems), Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium (Lanthanoide) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen;
      • (iii.1) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) unter Erhalt einer Lösung, welche Cofaktor und Salz enthält:
      • (iii.2) Einstellen des pH-Werts der in (iii. 1) erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert >7, bevorzugt im pH-Bereich von 7,1 bis 10, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9,5, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9, wobei ein Feststoff (als Niederschlag) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst, und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist;
      • (iv) Abtrennen des Feststoffes von der gemäß (iii.2) erhaltenen Lösung;
      • (v) Zugabe einer phosphathaltigen Verbindung zum gemäß (iv) abgetrennten Feststoff, bevorzugt in wässriger Lösung, wobei die wässrige Lösung bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6-8 aufweist, unter Erhalt einer Lösung umfassend den Cofaktor und Erhalt eines zweiten Feststoffs, welcher das Metallkation des Salzes gemäß (ii) und die phosphathaltige Verbindung umfasst;
      • (vi) Abtrennen der gemäß (v) erhaltenen Lösung umfassend den Cofaktor vom zweiten Feststoff.
    • 17. Cofaktor, erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren gemäß einer der Ausführungsformen 1 bis 16.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Referenzbeispiele, Vergleichsbeispiele und Beispiele näher erläutert.
  • Beispiele
  • Materialien:
    Name Abkürzung, chemische Formel
    Cofaktor Pyridoxalphosphat PLP
    Nicotinamidadenindinukleotid NAD+
    Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NADP+
    Adenosintriphosphat ATP
    Thiaminpyrophosphat TPP
    Eingesetzte Salze der dritten Nebengruppe Ytrium(III)trichlorid YCl3
    Lanthan(III)trichlorid LaCl3
    Scandium(III)trichlorid ScCl3
    Puffer 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure HEPES
    Phosphatpuffer
  • Referenzbeispiel 1: Versuchsvorschrift für Cofaktoren-Fällung mit Metallkationen von Lanthanoiden, Yttrium und Scandium
    • • Es wurden 50 mM HEPES Pufferlösung angesetzt.
    • • Der HEPES Puffer wurde mit einem Cofaktor versetzt, sodass ein 5 mM Stammlösung entsteht und auf pH 5 einstellt.
    • • Jeweils eine 40 mM Stammlösung der verschiedenen Salze von Y3+, Sc3+ und La3+ wurde hergestellt, wobei die Cofaktor-Konzentrationen auf 5 mM, 2,5 mM, 1,25 mMund 0,25 mM eingestellt wurden.
    • • Anschließend wurden die Salzlösungen ebenfalls auf pH 5 eingestellt.
    • • Die Salzlösungen der dritten Nebengruppe wurden mit der 4-fachen Konzentration im Vergleich zum Cofaktor in den meisten Fällen eingesetzt. Es wurden darüber hinaus aber auch Versuche bis runter zum äquimolaren Einsatz von Cofaktor zu Metallsalz durchgeführt.
    • • Die Cofaktor-Stammlösung wurde mit demselben Volumen der Salzlösung gemischt (s.o. 8-fache Konzentration im Vergleich zum Cofaktor) und der pH-Wert auf 5,0, 7,5 oder 9,0 eingestellt.
    • • Anschließend wurde der Niederschlag abzentrifugiert (für 5 min bei 14k rpm).
    • • Der Überstand wurde abpipettiert und mittels Fotometer analysiert.
  • Referenzbeispiel 2: Versuchsvorschrift für das Wiederauflösen von Cofaktoren der Lanthanoide, Yttrium und Scandium haltigen Niederschläge
    • • Der Niederschlag aus der Fällung wurde von der Mutterlauge abgetrennt.
    • • Anschließend wurde der Niederschlag mit demselben Volumen wie die Mutterlauge mit einer pH 4,5 bis 5,0 NaH2PO4 Lösung (cPuffer: 8-fachen Überschuss bezogen auf die Konzentration vom Cofaktor) versetzt und anschließend für 24 h bei 25 °C oder 45 °C geschüttelt.
    • • Anschließend wurde wieder der Niederschlag abzentrifugiert (für 5 min bei 14k rpm) und der Überstand mittels Fotometer analysiert.
  • Beispiel 1: Fällen der Cofaktoren
  • Gemäß der Vorschrift aus Referenzbeispiel 1 wurden die Cofaktoren NADP+, NAD+, PLP, ATP und TPP mit einer der Salzlösungen versetzt und dadurch gefällt. Die bis zeigen, wieviel von den verschiedenen Cofaktoren gefällt werden konnte. Alle Angaben sind in Prozent angegeben, jeweils bezogen auf 100% Menge des jeweiligen eingesetzten Cofaktors.
  • 1.1 ATP
  • Für den Cofaktor ATP wurde gefunden, dass für Kationen der Elemente Y ( ) und La ( ) eine nahezu vollständige Fällung bei den getesteten pH-Werten erreicht werden konnte, wohingegen Sc abhängig vom pH-Wert zwischen 65 bis 95% des ATP unter den Bedingungen fällen konnte (vgl. ). Entsprechend eigneten sich insbesondere Y3+ und Ln3+ für die Fällung von ATP.
  • 1.2 NAD
  • Für den Cofaktor NAD wurde festgestellt, dass für Metallkationen der Elemente Y ( ) und La ( 5) eine optimale Ausfällung insbesondere bei pH-Wert 9 möglich war und es bei pH-Werten unterhalb von 9 zu schlechteren Ergebnissen für die Fällung von um die 45% kam. Eine Ausnahme stellt hier Y3+ bei pH 7,5 da, da hier nur etwas schlechtere Ergebnisse im Vergleich mit pH 9 erreicht wurden konnten (ca. 75% bis 95% Fällung des Cofaktors). Bei Sc3+ konnten abhängig vom pH-Wert zwischen 65 bis 95% des NAD unter den Bedingungen gefällt werden (vgl. ).
  • Darüber hinaus musste beim Wiederauflösen festgestellt werden (siehe Beispiel 4, 4.3), dass es zu einer Zersetzung der Proben des NADs kommt, wenn beim Fällen ein pH-Wert von 9 verwendet wird, sodass vor allem Y3+ und Sc3+ sich für die Fällung von NAD eigneten, da diese bei pH 7,5 die besten Ergebnisse lieferten.
  • 1.3 NADP+
  • Für den Cofaktor NADP+ wurde festgestellt, dass für Metallkationen der Elemente Y ( ) und La ( ) proportional zum fallenden pH-Wert die Resultate sich verschlechterten, wohin gegen bei Sc3+ beim fallendem pH-Wert sich die Ergebnisse verbesserten ( ). Es konnten mit allen Metallen je nach pH-Wert bis zu >95% des Cofaktors gefällt werden. Damit erwiesen sich alle getesteten Metallkationen als sehr geeignet für die Fällung und Wiederauflösung, wobei Y3+ die geringsten Abweichungen der Ergebnisse zwischen pH-7,5 bis 9,0 aufwies.
  • 1.4 TPP
  • In den bis sind die Fällungsversuche für TPP dargestellt. Die Ausbeute war bei pH-Wert 9 am besten bei allen Metallen. Festzuhalten war, dass die Metallkationen von Y und La über 95% des TPPs bei pH 9 fällen könnten, wohingegen Sc3+ Schwankungen unterlag, sodass teilweise nur bis zu 80% und in anderen Versuchsreihen bis zu 98% erreicht wurden (vgl. mit Tab.3 aus Beispiel 4, 4.3). Damit erwiesen sich Y3+ und La3+ als sehr gut geeignet und Sc3+ immer noch als gut, aber etwas weniger gut als Y3+ bzw. La3+, für die Fällung von TPP geeignet.
  • 1.5 PLP
  • Die bis zeigen die Fällungsversuche von PLP mit den verschiedenen getesteten Metallkationen bei pH 9. Hierbei konnten wieder mit Y3+ und La3+ Fällungen von über 95% erzielt werden und für Sc3+ Ergebnisse zwischen ca. 70 bis 85%. Damit eigneten sich vor allem Y3+ und La3+ für die Fällung von PLP, wobei Y3+ sich als noch etwas besser (Ausbeuten von >99%) herausstellte als La3+.
  • Beispiel 2: Zusatz organischer Lösungsmittel in der zur Fällung verwendeten Salzlösung
  • DMSO ist ein häufig verwendeter Lösungsmittelzusatz bei biochemischen Reaktionen, weswegen der Einfluss auf die Fällung untersucht wurde anhand des Cofaktors PLP, mit Y3+ bei einem pH-Wert von 9 ( ). Der Versuch aus Beispiel 1, 1.5 wurde wiederholt, wobei der auf pH 5 eingestellten 40 mM Stammlösung der verschiedenen Salze von Y, Sc und La jeweils definierte Mengen an DMSO zugesetzt wurden, wodurch sich in der Salzlösung Konzentrationen an DMSO im Bereich von 10 bis 50%, jeweils bezogen auf das Gesamtvolumen der Cofaktorlösung, ergaben.
  • Bei Einsatz dieser DMSO-haltigen Salzlösungen zur Fällung von PLP konnte ein starker Einfluss auf die Löslichkeit den Niederschlag von Y3+ mit PLP festgestellt werden, der durch weitere Zugabe von DMSO sich nicht verstärkte. Alle Ergebnisse lagen im Bereich von >75% mit einer geringen Schwankung nach nur geringer Zugabe von DMSO.
  • Beispiel 3: Variation der Konzentration an Metallkation in der zur Fällung verwendeten Salzlösung
  • Der Versuch aus Beispiel 1, 1.5 wurde wiederholt, wobei die Mengen der auf pH 5 eingestellten 40 mM Stammlösung der verschiedenen Salze von Y, Sc und La jeweils reduziert wurden, wodurch für die Fällung jeweils 4 Äquivalente, 2 Äquivalente bzw. 1 Äquivalent, jeweils bezogen auf die Menge an zu fällendem Cofaktor, eingesetzt wurden.
  • Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Versuchsreihe, bei der die Konzentration von Y3+ zum Fällen von PLP schrittweise auf bis zu einem Äquivalent reduziert wurde. Hierbei muss festgehalten werden, dass trotz der Reduktion bis auf äquimolaren Einsatz Y3+ dennoch über 98% PLP gefällt werden konnte und dass es nur zu einem minimalen Anstieg der der Löslichkeit des Cofaktors von < 1% auf 1,5% kam.
  • Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse einer analogen Versuchsreiche wie in Tabelle 1, nur mit dem Cofaktor NADP. Auch hierbei konnte das eingesetzte Y3+ auf 1 Äquivalent reduziert werden, wobei immer noch >96% des Cofaktors gefällt wurden. Im Gegensatz zu PLP wurde hierbei aber kein Anstieg der Löslichkeit durch die Reduktion des eingesetzten Y3+ registriert.
  • Tabelle 1
  • Bestimmte Konzentrationen an in der Lösung verbleibendem PLP nach Fällung mit verschiedenen Konzentrationen bzw. Äquivalenten an YCl3.
    4 eq. 2 eq. 1 eq.
    c[mM] 3,84E-03 9,61E-03 3,81E-02
    Fehler c[mM] 1,62E-03 2,42E-02 1,06E-02
    c[%] 0,15 0,4 1,5
    Fehler c[%] 0,06 1,0 0,4
  • Tabelle 2
  • Bestimmte Konzentrationen an in der Lösung verbleibendem NADP+ nach Fällung mit verschiedenen Konzentrationen bzw. Äquivalenten an YCl3.
    4 eq. 2 eq. 1 eq.
    c[mM] 7,7E-02 6,1E-02 8,7E-02
    Fehler c[mM] 2,7E-03 1,3E-02 1,4E-02
    c[%] 3,1 2,5 3,5
    Fehler c[%] 0,1 0,5 0,6
  • Beispiel 4: Wiederauflösen der Niederschläge
  • Gemäß der Vorschrift aus Referenzbeispiel 2 wurden die Niederschläge, erhalten aus den Beispielen 1, 1.1 bis 1.5, mit einem Phosphatpuffer mit pH 4,5 bis 5,0 versetzt und dadurch die Cofaktoren wieder in Lösung gebracht, sowie die Metalle als Phosphate gefällt. Hierbei wurde ausgenutzt, dass die reinen Phosphatsalze der Metalle unlöslicher sind als die der Cofaktoren, sodass die Triebkraft in der Bildung der Phosphatsalze bestand.
  • 4.1 PLP
  • Die bis zeigen das Wiederauflösen der gemäß Beispiel 1, 1.5 erhaltenen PLP Salze mittels Zugabe von verschiedenen Konzentrationen zwischen 4 bis 20 mM des Phosphatpuffers. Hierbei konnten bei Y3+ und La3+ mehr als 60% wiedergelöst werden, bei allen eingesetzten Konzentrationen. Bei Sc3+ lagen die Ergebnisse nur bei bis zu 60%. Damit erwiesen sich vor allem Y3+ und La3+ als Metallkation zur Fällung, bedingt durch das bessere Wiederauflösen, von PLP als geeignet.
    Durch den geringen Einfluss der Konzentration des Phosphatpuffers auf das Wiederauflösen der Salze wurde zur Vereinfachung bei den anderen Cofaktoren dazu übergegangen, nur den 20 mM Phosphatpuffer zu verwenden (siehe nachfolgend 4.2 etc.).
  • 4.2 TPP
  • Untersucht wurde das Wiederauflösen der gemäß Beispiel 1, 1.4 erhaltenen TPP-Salze, die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. In Tabelle 3 gibt die Die Spalte „Fällung“ gibt an, wieviel von dem eingesetzten Cofaktor gefällt wurde, sowie den berechneten Fehler. „Wiederauflösung“ gibt an wieviel von dem Niederschlag wieder gelöst werden konnte. Da bei einigen Feststoffen festgestellt wurde, dass keine großartige Temperaturabhängigkeit besteht, wurden nicht bei allen beide getesteten Temperaturen aufgenommen.
  • Die Tabelle 3 zeigt deutlich, dass alle eingesetzten Metallsalze den Cofaktor gut fällen konnten. Beim Wiederauflösen konnten die Salze der Metallkationen von Y und La mit dem Cofaktor mit über 90% des gefällten Feststoffes wieder aufgelöst werden, wohingegen nur 25% bis 33% der Salze aus Sc3+ und TPP in derselben Zeit wieder aufgelöst werden konnten. Dadurch war das Wiederauflösen der Salze aus Y3+ und La3+, jeweils mit TPP, deutlich schneller und vollständiger, sodass diese Kombinationen sich besonders gut eigneten.
  • Tabelle 3
  • Fällung und Wiederauflösen von Salzen der Metallkationen von Y, La und Sc mit TPP.
    pH 9 TPP
    La3+ Y3+ Sc3+
    Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen
    [%] [%] [%] [%] [%] [%]
    25° C c(einfacher Schritt) - 91,7 97,9 94,7 98,4 25,0
    Fehler - 4,4 1,2 4,1 0,3 4,9
    c(über 2 Schritte) 91,7 92,4 24,6
    Fehler 4,4 5,3 5,2
    45° C c(einfacher Schritt) 98,8 92,6 96,7 87,6 96,8 33,4
    Fehler 0,08 3,1 0,29 1,9 0,27 4,9
    c(über 2 Schritte) 91,5 84,8 32,4
    Fehler 3,1 2,2 5,1

    „-“ keine Messung
  • 4.3 NAD
  • Untersucht wurde das Wiederauflösen der gemäß Beispiel 1, 1.2 erhaltenen NAD-Salze, die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Tabelle 4 zeigt deutlich, dass bei pH 7,5 sich nur Y3+ und Sc3+ zum Fällen und wiederauflösen von NAD eignet. Da Sc3+ NAD mit über 90% fällen kann und fast 80% des Cofaktorsalzes wieder gelöst werden kann, ist Sc3+ bevorzugt vor Y3+.
  • Tabelle 4
  • Fällung und Wiederauflösen von Salzen der Metallkationen von Y, La und Sc mit NAD
    pH 7,5 NAD
    La3+ Y3+ Sc3+
    Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen
    [%] [%] [%] [%] [%] [%]
    25°C c(einfacher Schritt) - - 64,4 70 91,7 79,4
    Fehler - - 3,8 14 0,3 6,7
    c(über 2 Schritte) - 45,3 72,9
    Fehler - 17,3 7,0

    „-“ keine Messung
  • 4.4 ATP
  • Untersucht wurde das Wiederauflösen der gemäß Beispiel 1, 1.1 erhaltenen ATP-Salze, die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. Die Tabelle 5 zeigt deutlich, dass sowohl La3+ als auch Y3+ sowohl das Fällen und Wiederauflösen des Cofaktors ATP erreichten, mit Ausbeuten von beiden Schritten von jeweils größer 95%. Sc3+ wurde nicht getestet, da das Fällen zwischen 70% und 90% lag, und damit etwas schlechter war als für die anderen beiden Metallsalze. Damit eigneten sich besonders La3+ und Y3+ zum Fällen und Wiederauflösen von ATP.
  • Tabelle 5
  • Fällung und Wiederauflösen von Salzen der Metallkationen von Y, La und Sc mit ATP
    pH 7,5 ATP
    La3+ Y3+ Sc3+
    Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen
    [%] [%] [%] [%] [%] [%]
    25°C c(einfacher Schritt) 98,3 97,3 98,6 95,6 - -
    Fehler 0,9 1,5 0,4 4,9 - -
    c(über 2 Schritte) 95,7 94,2 -
    Fehler 2,4 5,3 -

    „-“ keine Messung
  • 4.5 NADP+
  • Untersucht wurde das Wiederauflösen der gemäß Beispiel 1, 1.3 erhaltenen NADP+-Salze, die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. Die Tabelle 6 zeigt, dass sich vor allem La3+ und Y3+ zum Fällen und Wiederauflösen von NADP+ eigneten, da damit eine Gesamtausbeute über zwei Stufen von über 95% erzielt werden konnte.
  • Tabelle 6
  • Fällung und Wiederauflösen von Salzen der Metallkationen von Y, La und Sc mit NADP+
    pH 9,0 NADP+
    La3+ Y3+ Sc3+
    Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen Fällung Wiederauflösen
    [%] [%] [%] [%] [%] [%]
    25°C c(einfacher Schritt) 96,2 99,9 96,9 99,9 61,3 88;1
    Fehler 0,1 4,5 0,1 6,1 4;1 1;8
    c(über 2 Schritte) 96,2 96,9 54,0
    Fehler 4,6 6,2 5,9
    45°C c(einfacher Schritt) 95,1 95,6 96,0 99,9 44,1 99,9
    Fehler 0,4 4,3 0,02 2,0 15,3 27,3
    c(über 2 Schritte) 91,0 96,0 44,1
    Fehler 4,7 2,1 42,6
  • Figurenliste
    • zeigt die Fällung des Cofactors ATP mit 4 eq. YCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors ATP mit 4 eq. LaCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors ATP mit 4 eq. ScCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors NAD mit 4 eq. YCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors NAD mit 4 eq. LaCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors NAD mit 4 eq. ScCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors NADP+ mit 4 eq. YCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors NADP+ mit 4 eq. LaCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors NADP+ mit 4 eq. ScCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors TPP mit 4 eq. YCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors TPP mit 4 eq. LaCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors TPP mit 4 eq. ScCl3.
    • zeigt die Fällung des Cofactors PLP mit 4 eq. YCl3 bei pH 9.
    • zeigt die Fällung des Cofactors PLP mit 4 eq. LaCl3 bei pH 9.
    • zeigt die Fällung des Cofactors PLP mit 4 eq. ScCl3 bei pH 9.
    • zeigt den Einfluss von DMOS auf die Fällung des Cofaktors PLP mit 4 eq. YCl3 bei pH 9.
    • Wiederauflösen des Y3+/PLP-Salzes unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Phosphatpuffer.
    • Wiederauflösen des La3+/PLP-Salzes unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Phosphatpuffer.
    • Wiederauflösen des Sc3+/PLP-Salzes unter Verwendung verschiedener Konzentrationen an Phosphatpuffer.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • DIN 19263:2007-05 [0015]

Claims (11)

  1. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors aus einer Lösung umfassend (i) Bereitstellen einer Lösung umfassend einen Cofaktor; (ii) Bereitstellen mindestens eines Salzes umfassend ein Metallkation eines Metalls ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan, Actinium, Cer, Praseodym, Neodym, Promethium, Samarium, Europium, Gadolinium, Terbium, Dysprosium, Holmium, Erbium, Thulium, Ytterbium, Lutetium und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen; (iii) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i), wobei ein Feststoff erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist.
  2. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach Anspruch 1, umfassend (iv) Abtrennen des Feststoffes von der gemäß (iii) erhaltenen Lösung.
  3. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach Anspruch 1 oder 2, umfassend (v) Zugabe einer phosphathaltigen Verbindung zum gemäß (iv) abgetrennten Feststoff, bevorzugt in wässriger Lösung; unter Erhalt einer Lösung umfassend den Cofaktor und Erhalt eines zweiten Feststoffs, welcher das Metallkation des Salzes gemäß (ii) bzw. (iii) und die phosphathaltige Verbindung umfasst.
  4. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 1 bis 3 umfassend (vi) Abtrennen der gemäß (v) erhaltenen Lösung umfassend den Cofaktor vom zweiten Feststoff.
  5. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 1 bis 4, wobei (iii) umfasst: (iii.1) Zugeben des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) unter Erhalt einer Lösung, welche Cofaktor und Salz enthält: (iii.2) Einstellen des pH-Werts der in (iii.1) erhaltenen Lösung auf einen pH-Wert ≥ 7, bevorzugt im pH-Bereich von 7 bis 10, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9,5, weiter bevorzugt im Bereich von 7,5 bis 9, wobei ein Feststoff(als Niederschlag) erhalten wird, welcher ein Metallkation des Salzes gemäß (ii) und den Cofaktor umfasst und eine Lösung, welche gegenüber der in (i) bereitgestellten Lösung an Cofaktor abgereichert ist.
  6. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Cofaktor ein phosphatbasierter Cofaktor in seiner reduzierten und/oder oxidierten Form ist, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (NADP: NADP+ für die oxidierte Form, NADPH für die reduzierte Form), Pyridoxalphosphat (PLP), Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD: NAD+ für die oxidierte Form, NADH+H+ für die reduzierte Form), Adenosinpyrophosphat (ATP), Thiaminpyrophosphat (TPP) und Mischungen von zwei oder mehr dieser Cofaktoren, wobei der Cofaktor bevorzugt mindestens NADP ist.
  7. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 1 bis 6, wobei die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung umfassend den Cofaktor ist, welche bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von < 7, bevorzugt im Bereich von 4-6,5, weiter bevorzugt im Bereich von 4,5-5,5, aufweist und/oder wobei die gemäß (i) bereitgestellte Lösung eine wässrige Lösung ist, welche den Cofaktor in einer Konzentration von ≥ 0,25 mmol/l, bevorzugt in einer Konzentration im Bereich von 0,25 bis 10 mmol/l, weiter bevorzugt im Bereich von 0,5 bis 5 mmol/l, weiter bevorzugt im Bereich von 1 bis 5 mmol/l, aufweist, wobei die gemäß (i) bereitgestellte Lösung optional eine Lösung ist, welche nach einer Reaktion von Reaktanden unter Beteiligung des Cofaktors, optional nach Abtrennung eines oder mehrerer Produkte, verblieben ist.
  8. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 1 bis 7, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz ein Metallkation eines Metalls ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Scandium, Yttrium, Lanthan und Mischungen von zwei oder mehr dieser Metallkationen, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Yttrium, Lanthan und Mischungen dieser Metallkationen, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz mindestens Y3+ enthält und/oder wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz ein Anion mit Ausnahme von Phosphat(tri)anion, Hydrogenphosphat(di)anion und Dihydrogenphosphat(mono)anion, bevorzugt mit Ausnahme phosphathaltiger Anionen, umfasst, und bevorzugt ein Anion ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenid (Fluorid, Chlorid, Bromid, Iodid), Carbonat, Nitrat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Anionen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Chlorid, Bromid, Nitrat und Mischungen von zwei oder mehr dieser Anionen, umfasst.
  9. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 1 bis 8, wobei das gemäß (ii) bereitgestellte Salz in Form einer wässrigen Lösung eingesetzt wird, welche bevorzugt einen H-Wert im Bereich von < 7, bevorzugt im Bereich von 4-6,5, weiter bevorzugt im Bereich von 4,5-5,5, aufweist und/oder wobei die Zugabe des Salzes gemäß (ii) zu der Lösung gemäß (i) in einem molaren Verhältnis Metallkation : Cofaktor im Bereich von 0,1:10 bis 10:0,1, bevorzugt im Bereich von 5:1 bis 1:1, erfolgt.
  10. Verfahren zur Abtrennung eines Cofaktors nach einer der Ansprüche 3 bis 9, wobei die gemäß (v) zugesetzte phosphathaltige Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe der phosphathaltigen Verbindungen, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus anorganischem Phosphaten und organischen Phosphaten, weiter bevorzugt aus der Gruppe der anorganischen Phosphate, weiter bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Hydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat und Mischungen von zwei oder mehr dieser phosphathaltigen Verbindungen, wobei die phosphathaltige Verbindung weiter bevorzugt als wässrige Lösung eingesetzt wird, wobei die phosphathaltige Verbindung bevorzugt eine Mischung aus Natriumdihydrogenphosphat und Dinatriumhydrogenphosphat umfasst, welche in wässriger Lösung eingesetzt wird, welche bevorzugt einen pH-Wert im Bereich von 6-8 aufweist.
  11. Cofaktor, erhalten oder erhältlich nach dem Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 10.
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